Nghiên cứu mối quan hệ tiến hóa giữa các loài ốc cối (conus SPP ) và đa dạng di truyền của loài ốc cối conus textile ở vùng biển nam trung bộ việt nam

DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Các nhóm peptide độc của ốc cối, vùng đặc hiệu và biểu hiện ở các nhóm ốc cối khác nhau Bảng 1.2 Sự khác nhau giữa mã di truyền trong nhân và ngoài ty thể B

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

LÊ THỊ THU HÀ

NGHIÊN CỨU MỐI QUAN HỆ TIẾN HÓA GIỮA CÁC LOÀI ỐC

CỐI (CONUS SPP.) VÀ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA LOÀI ỐC CỐI

CONUS TEXTILE Ở VÙNG BIỂN

NAM TRUNG BỘ - VIỆT NAM

CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

1 TS Đặng Thúy Bình

2 TS Trương Quốc Phong

Hà Nội - 2012

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn tới các thầy cô giáo và cán bộ công tác tại Viện Công nghệ sinh học và thực phẩm, Viện đào tạo sau đại học – Trường Đại học Bách khoa Hà Nội đã dạy dỗ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian học tập

Và cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân và bạn bè đã nhiệt tình động viên, giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và hoàn thiện luận văn này Xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 15 tháng 09 năm 2012

Học viên

Lê Thị Thu Hà

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi dưới sự chỉ bảo của thầy cô hướng dẫn và giúp đỡ của tập thể cán bộ nghiên cứu Bộ môn Sinh học phân

tử - Viện nghiên cứu Công nghệ sinh học và môi trường - ĐH Nha Trang Các số liệu và kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được công bố

Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm với những lời cam đoan trên

Lê Thị Thu Hà

LỜI CẢM ƠN ii

LỜI CAM ĐOAN iii

BẢNG KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT vii

DANH MỤC CÁC BẢNG viii

DANH MỤC CÁC HÌNH viii

MỞ ĐẦU 1

1 Mục đích nghiên cứu của đề tài 2

2 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài 2

CHƯƠNG I – TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1 TỔNG QUAN VỀ CÁC LOÀI ỐC CỐI (CONUS SPP.) VÀ ĐỘC TỐ CỦA CHÚNG 4

1.1 ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI, SINH HỌC VÀ PHÂN BỐ CỦA ỐC CỐI (CONUS SPP.) 4

1.1.1 Hệ thống phân loại ốc cối (Conus spp.) 4

1.1.2 Đặc điểm sinh thái và phân bố 4

1.1.3 Đặc điểm hình thái của ốc cối 5

Hình 1.2: Các dạng hình thái vỏ khác nhau của ốc cối (Conus spp.) 6

1.1.4 Chế độ ăn và phương thức săn mồi 7

1.1.5 Đặc điểm sinh sản của ốc cối 7

1.2 CÁC NGHIÊN CỨU VỀ ĐỘC TỐ CỦA ỐC CỐI (CONUS SPP.) 8

1.2.1 Giới thiệu chung 8

1.2.2 Ứng dụng y học của độc tố ốc cối 8

2 CÁC NGHIÊN CỨU VỀ DI TRUYỀN ỐC CỐI (CONUS SPP.) 10

2.1 CÁC CHỈ THỊ SỬ DỤNG TRONG NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN 10

2.1.1 Chỉ thị hình thái 11

2.1.2 Chỉ thị sinh hóa 12

2.1.3 Các chỉ thị phân tử 12

2.1.3.1 Chỉ thị DNA ti thể 13

2.1.3.2 Chỉ thị RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) 14

2.1.3.3 Chỉ thị RAPD (Randomly Amplified Polymorphic DNA) 15

2.1.3.4 Chỉ thị AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) 16

2.1.3.5 Chỉ thị SSR (Simple Sequence Repeats hay Microsatellite) 16

2.1.3.6 Chỉ thị SNP (Single nucleotide polymorphisms) 17

2.2 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU DI TRUYỀN ỐC CỐI 17

2.2.1 Nghiên cứu cấu trúc hệ gen của ốc cối 17

2.2.2 Nghiên cứu mối quan hệ tiến hóa 19

2.2.3 Mối liên hệ giữa phát sinh loài và chế độ dinh dưỡng ở ốc cối (Conus spp.) 21

2.2.4 Nghiên cứu di truyền ốc cối ở Việt Nam 22

2.2.5 Nghiên cứu di truyền độc tố 23

2.2.6 Nghiên cứu di truyền quần thể ốc cối và động vật thân mềm 24

CHƯƠNG II – VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26

1 ĐỐI TƯỢNG, THU MẪU VÀ PHƯƠNG PHÁP THU MẪU 26

1.1 ĐỐI TƯỢNG VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU 26

1.2 PHƯƠNG PHÁP THU MẪU ỐC CỐI 26

2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27

2.1 TÁCH CHIẾT DNA, KHUYẾCH ĐẠI VÀ GIẢI TRÌNH TỰ 27

2.1.1 Tách chiết DNA 27

2.1.2 Khuyếch đại gen 28

2.1.3 Điện di gel agarose 29

2.1.4 Giải trình tự 29

2.2 PHÂN TÍCH ĐA DẠNG LOÀI VÀ MỐI QUAN HỆ TIẾN HÓA 30

2.2.1 Phân tích đa dạng loài ốc cối 30

2.2.2 So sánh trình tự các loài ốc cối 30

2.2.3 Phân tích đa dạng loài ốc cối Conus textile dựa trên hapotype 30

2.2.4 Phân tích mối quan hệ loài bằng cây tiến hóa (phylogenetic analyst) 30

2.2.5 Phân tích di truyền quần thể loài Conus textile 31

CHƯƠNG III – KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 33

3.1 KẾT QUẢ TÁCH CHIẾT DNA TỔNG SỐ 33

3.2 KẾT QUẢ KHUYẾCH ĐẠI GEN VÀ GIẢI TRÌNH TỰ DNA 34

Hình 3.3: Ảnh chụp kết quả điện di sản phẩm PCR đoạn gen 16S mtDNA (A) và CO1 mt DNA (B) của một số mẫu ốc cối Ký hiệu 1,2: Conus textile; 3,4: C striatus; 5, 6: C vexilum; 7: C bandanus; C: mẫu đối chứng âm; M: DNA marker 35

3.3 XÂY DỰNG CÂY PHÁT SINH LOÀI 35

3.3.1 Cây phát sinh loài dựa trên gen 16S mtDNA 35

3.3.2 Cây phát sinh loài dựa trên gen CO1 mt DNA 38

3.3.3 THẢO LUẬN 44

3.3.3.1 Mối quan hệ loài ốc cối dựa trên các chỉ thị phân tử CO1 và 16S mtDNA 44

3.3.3.2 Mối quan hệ giữa loài và chế độ dinh dưỡng 47

3.4 ĐA DẠNG DI TRUYỀN ỐC CỐI (CONUS TEXTILE) 49

3.4.1 Đa dạng di truyền Conus textile 49

3.4.2 Di tuyền quần thể của ốc cối (Conus textile) tại vùng biển Nam Trung Bộ 50

3.4.3 THẢO LUẬN 52

3.4.3.1 Đa dạng haplotype 52

3.4.3.2 Di truyền quần thể của ốc cối Conus textile tại vùng ven biển Nam Trung Bộ 54

3.5 XÂY DỰNG CƠ SỞ DỮ LIỆU 57

CHƯƠNG IV – KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 58

KẾT LUẬN 58

KIẾN NGHỊ 59

TÀI LIỆU THAM KHẢO 60

TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT 60

TÀI LIỆU TIẾNG ANH 60

PHỤ LỤC 67

So sánh trình tự DNA của một số loài ốc cối có đặc điểm hình thái ngoài giống nhau 67

D-loop Displacement loop

DNA Deoxyribonucleic acid

dNPT Deoxynucleotide triphosphate

ĐVTM Động vật thân mềm

EST Expressed sequence tags

ITS Internal Transcribed Space

kb Kilo base

ML Maximum likelihood

mt DNA Mitochondrial DNA (DNA ti thể)

NADH Nicotinamide adenine dinucleotide

PCR Polymerase Chain Reaction

PIC Polymorphic Information Content (Chỉ số thông tin đa hình của mồi)

PP Posterior probability (độ tin cậy)

RAPD Randomly Amplified Polymorphic DNA (Đa hình các đoạn DNA đƣợc

khuyếch đại ngẫu nhiên)

rDNA Ribosomal DNA

RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism (Đa hình chiều dài đoạn cắt

giới hạn)

SNP Single Nucleotide Polymorphism (đa hình nucleotide đơn)

SSR Simple Sequence Repeats (Sự lặp lại trình tự đơn giản

TBE Tris-Boric acid-EDTA

ESTs Expressed sequence tags

NMDA N-methyl-D-aspartate

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Các nhóm peptide độc của ốc cối, vùng đặc hiệu và biểu hiện ở các nhóm ốc cối khác nhau Bảng 1.2 Sự khác nhau giữa mã di truyền trong nhân và ngoài ty thể

Bảng 2.1 Trình từ các đoạn mồi được sử dụng trong phản ứng PCR

Bảng 2.2 Chu trình nhiệt của phản ứng PCR

Bảng 2.3 Các thông số của quá trình phân tích các trình tự và mô hình tiến hóa của phân tích đa dạng loài ốc cối Bảng 2.4 Các thông số của quá trình phân tích các trình tự và mô hình tiến hóa của phân tích di truyền quần thể Conus textile Bảng 3.1 Các trình tự gen 16S, CO1 mtDNA và chế độ ăn của các loài ốc cối Bảng 3.2 Các nhóm loài ốc cối trên cây phân loại từ các phương pháp MP, ML

Hình 1.1 Hình thái vỏ của ốc cối (Conus spp.)

Hình 1.2 Các dạng hình thái vỏ khác nhau của ốc cối (Conus spp.)

Hình 1.3 Cấu trúc hệ gen ty thể của Conus textile

Hình 1.4 Cấu trúc trình tự DNA ribosome

Hình 2.1 Quy trình tách chiết ADN, khuếch đại gen và giải trình tự

Hình 3.1 Vị trí lấy mẫu mô tách chiết DNA ốc cối

Hình 3.2 Ảnh kết quả điện di DNA tổng số

Hình 3.3 Ảnh chụp kết quả điện di sản phẩm PCR đoạn gen 16S mtDNA (A)

và CO1 mt DNA (B) của một số mẫu ốc cối Hình 3.4 Cây phát sinh loài dựa trên gen 16S mtDNA của ốc cối

Hình 3.5 Cây phát sinh loài dựa trên gen CO1 mtDNA của ốc cối

Hình 3.6 Cây phát sinh loài theo phương pháp BI dựa trên gen CO1 mtDNA

của ốc cối Hình 3.7 Cây phát sinh loài dựa trên gen CO1 mtDNA của ốc cối Conus textile

MỞ ĐẦU

Đa dạng sinh học là một trong những yếu tố đóng vai trò quan trọng trong cuộc sống của con người, là nguồn tài nguyên lớn của mỗi quốc gia Ở một mức độ nào đó nó duy trì sinh quyển, hay cung cấp nguyên vật liệu cơ bản cho các ngành công – nông nghiệp và các nhu cầu thiết yếu khác của con người Tuy nhiên, thực tế hiện nay cho thấy sự gia tăng dân số và các hoạt động khai thác quá mức của con người đã và đang làm cho nguồn tài nguyên thiên nhiên này dần cạn kiệt Việc sử dụng hợp lý và bảo tồn đa dạng sinh học trở nên bức thiết hơn bao giờ hết

Ở nước ta, ốc là một trong những nguồn lợi hải sản có mức độ phong phú về thành phần loài, có giá trị thực phẩm và kinh tế cao Song những năm gần đây, tình trạng khai thác vô tội vạ cộng với sự ô nhiễm môi trường đang làm cho nguồn lợi ốc

có chiều hướng suy giảm nghiêm trọng Nhiều loài thân mềm có giá trị cao có nguy

cơ tuyệt chủng như ốc tù và, ốc đụn, ốc bàn tay, trai tai tượng, ốc vú nàng [ 96 ] Nhiều loài ốc có nguy cơ tuyệt chủng hoặc đe dọa bị tuyệt chủng đã được liệt kê trong danh mục những loài cần được bảo tồn [ 97 ]

Ốc cối là loại động vật thân mềm, có nọc độc, sống chủ yếu sống ở các vùng biển nhiệt đới trong những rạn san hô Chúng được biết đến là những loài có giá trị kinh tế cao nhờ màu sắc và hoa văn đẹp mắt Vỏ ốc cối được khai thác để làm đồ trang sức, mỹ nghệ, đồ lưu niệm được nhiều người ưa chuộng

Ở Việt Nam có hơn 76 loài ốc cối [ 45 ] và khoảng 500 - 700 loài được ghi nhận trên toàn thế giới [ 67,22 ] Ốc cối thường được khai thác để làm hàng mỹ nghệ và còn là nguồn thực phẩm cao cấp ở một số quốc gia như Vanuatu, New Caledonia, Philippines Gần đây, ốc cối còn được biết đến như là một loại dược liệu quí để chữa các cơn đau mãn tính, ung thư và nhiều bệnh khác [ 71,88,79 ] Chính điều này

sẽ làm tăng mối đe dọa cho các loài ốc cối nếu con người tiếp tục khai thác quá mức

mà không có biện pháp bảo vệ

Những nghiên cứu về ốc cối ở Việt Nam phần lớn vẫn được thực hiện ở mức

độ khảo sát, thu thập mẫu và tư liệu liên quan [ 45 ], phân loại, mô tả đặc điểm hình

thái [ 68 ]; xác định độc tính và kiểm chứng tính chất của một số độc tố [ 94 ] Từ năm 2008-2010, Viện Nghiên cứu Công nghệ sinh học và môi trường, Đại học Nha Trang đã tiến hành khảo sát, phân loại, mô tả đặc điểm hình thái, xây dựng môi quan hệ tiến hóa và bước đầu khảo sát độc tính của các loài ốc cối thu tại vùng biển Nam Trung bộ [ 3 ] Tuy nhiên, những nghiên cứu sâu về đặc điểm di truyền, mối quan hệ tiến hóa vẫn còn rât hạn chế Xuất phát từ những lý do trên, tôi đã tiến hành

thực hiện đề tài “Nghiên cứu mối quan hệ tiến hóa giữa các loài ốc cối (Conus

spp.) và đa dạng di truyền của loài ốc cối Conus textile ở vùng biển Nam Trung

Bộ - Việt Nam”

1 Mục đích nghiên cứu của đề tài

Xác định mối quan hệ tiến hóa giữa các loài ốc cối (Conus spp.) và nghiên cứu

đa dạng di truyền, cấu trúc quần thể của loài ốc cối Conus textile ở vùng biển Nam

Trung Bộ, làm cơ sở cho công tác bảo tồn các loài có nguy cơ tuyệt chủng

2 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài

 Ý nghĩa khoa học của đề tài

Ốc cối (Conus spp.) bao gồm khoảng 700 loài, phân bố rộng rãi ở vùng biển

nhiệt đới và vùng biển ấm [ 67 ] Các loài thuộc họ ốc này có chứa tuyến độc tố có thể sản xuất ra các dạng độc tố với sự đa dạng cao (ước tính hơn 70.000 peptide độc tố), tác động đến thụ thể thần kinh của nhiều loài động vật Điều này giúp cho chúng có khả năng săn mồi cao và phân bố rộng Điều đó tạo điều kiện thuận lợi cho biến dị loài và sự hình thành loài mới [ 17 ]

Hiện nay, phân loại ốc cối chủ yếu dựa vào kích thuớc vỏ, kiểu, hoa văn và màu sắc hay vân trên vỏ, cụ thể là những đường gờ hay phần lồi trên vỏ Bên cạnh

đó, mô tả các dải răng kitin cũng được coi là một chỉ tiêu phân loại quan trọng Tuy nhiên, đặc điểm hình thái có thể chịu tác động của môi trường, biến dị cá thể cùng loài (Intraspecific) và khác loài (Interspecific), dễ gây nhầm lẫn trong quá trình phân loại Do đó, việc phân tích mối quan hệ tiến hóa dựa trên việc giải mã thông tin di truyền là việc hết sức cần thiết

 Ý nghĩa thực tiễn của đề tài

Xây dựng cây phát sinh chủng loại của 26 loài ốc cối tìm thấy ở ven biển Nam Trung Bộ - Việt Nam Từ đó xác định đƣợc mối quan hệ loài và chế độ ăn của chúng trong quá trình tiến hóa

Nắm đƣợc các thông số về trình tự và mô hình tiến hóa của phân tích đa dạng các

loài ốc cối (Conus spp.) và di truyền quần thể của loài Conus textile ở vùng biển Nam

Trung Bộ - Việt Nam dựa trên đặc điểm di truyền gen 16S và CO1 của DNA ti thể Những dẫn liệu về nguồn lợi, đa dạng sinh học, cấu trúc quần thể và đa dạng di truyền sẽ là những cơ sở khoa học và nguồn số liệu đầu vào cho việc tƣ vấn, đề xuất các vấn đề về quản lý và sử dụng hợp lý nguồn lợi ốc cối ở vùng biển Việt Nam

CHƯƠNG I – TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1 TỔNG QUAN VỀ CÁC LOÀI ỐC CỐI (CONUS SPP.) VÀ ĐỘC TỐ CỦA

định có khoảng 500 - 700 loài Ốc cối là loại động vật ăn thịt, săn mồi sống và có

nọc độc Thức ăn chính của chúng là cá, giun biển và ĐVTM Nhiều loài trong họ Conidae có vỏ rất đẹp và là mặt hàng mỹ nghệ có giá trị Ngoài ra một số loài trong

họ ốc này có tuyến độc rất nguy hiểm có thể gây chết người Do vậy chúng đã thu hút sự chú ý của các nhà nghiên cứu động vật thân mềm từ hàng trăm năm nay

1.1.1 Hệ thống phân loại ốc cối (Conus spp.)

Hệ thống phân loại của ốc cối đang được dùng phổ biến nhất hiện nay là [ 95 ]:

Ngành: Mollusca (Linnaeus, 1758) Lớp: Gastropoda (Cuvier, 1795) Bộ: Sorbeoconcha (Ponder & Lindberg, 1997) Tổng họ: Conoidea (Fleming, 1822)

Họ: Conidae (Rafinesque, 1815)

Giống: Conus (Linnaeus, 1758)

1.1.2 Đặc điểm sinh thái và phân bố

Ốc cối phân bố khắp nơi trên thế giới, chúng thường phân bố ở vùng vĩ độ giữa 400

Bắc và 400 Nam, một số loài có thể phân bố ở vĩ độ trên 400 như ở Nam Phi, Nam Australia, Nam Nhật Bản và biển Địa Trung Hải Ngoài ra chúng còn phân bố ở các vùng biển nhiệt đới và vùng biển ấm như Philippine, Indonesia, Australia, Mexico, Florida, Hawaii Tuy nhiên, các nghiên cứu cũng cho thấy một

số loài có thể thích ứng với sự thay đổi của điều kiện môi trường như ở vùng biển nóng mũi Cape, Nam Phi hay vùng biển lạnh phía tây Califonia, Hoa Kỳ

Trong khi đó, một số loài cận nhiệt đới được tìm thấy vùng triều dưới độ sâu

10 – 30m và dưới các tảng đá ở vùng triều nông [ 84 ] Một số loài có thể sống ở các rừng ngập mặn, hoặc sống ở vùng nước sâu đến 400 m

Tại Việt Nam, ốc cối phân bố chủ yếu ở các vùng ven biển thuộc khu vực Nam Trung Bộ từ Đà Nẵng đến Kiên Giang và quanh các hải đảo Hylleberg và Kilburm (2003) trong khuôn khổ dự án Tropical Marine Molluscs Program đã công bố 76 loài ốc cối được tìm thấy ở vùng biển Việt Nam dựa trên việc thu thập mẫu, khảo sát các bộ sự tập ở bảo tàng sinh vật biển Việt Nam [ 45 ]

1.1.3 Đặc điểm hình thái của ốc cối

 Đặc điểm hình thái ngoài

Ốc cối có hình dạng như trái tim với các kích cỡ khác nhau, loài có kích cỡ lớn nhất có chiều cao vỏ đến 23cm [ 80 ] Các loài ốc cối thường có màu sắc sặc sỡ với những hoa văn rất đẹp mắt Vỏ thuôn dài, bằng đá vôi, chắc, nặng, xoắn theo chiều kim đồng hồ Đầu có 1 xúc tu (râu), toàn thân được bao bọc trong lớp vỏ dày vững chắc Ốc cối là động vật ăn thịt, chúng ăn mồi sống, chúng thường đi săn mồi và ăn các loại giun, ĐVTM, cá nhỏ và thậm trí cả một số loài ốc cối khác Để phân loại ốc cối người ta thường dựa vào màu sắc hoa văn trên vỏ, các dạng khác nhau của vỏ và các chỉ tiêu phân loại về hình thái được mô tả ở hình 1.1

Hình 1.1: Hình thái vỏ của ốc cối (Conus spp.) [ 92 ]

Bên cạnh đó việc đo đạc các thông số hình thái như chiều cao tháp vỏ, chiều cao vỏ, chiều cao tầng thân và chiều rộng cũng góp phần quan trọng trong việc định

danh các loài ốc cối Vỏ của ốc cối thường có 3 dạng hình thái khác nhau: Hình nón,

hình nón rộng và hình nón hẹp (Hình 1.2)

Hình 1.2: Các dạng hình thái vỏ khác nhau của ốc cối (Conus spp.)

 Đặc điểm cấu tạo trong

Vòi hút (Proboscis): là vũ khí săn mồi của ốc cối Độc tố được tiêm vào con mồi

bằng các răng chứa trong túi răng kitin Vòi hút có thể duỗi dài ra gấp 2 lần cơ thể ốc cối

Súc tu (Siphon): siphon của ốc có chức năng như mũi Đó là một túi có thể

duỗi dài ra và phát hiện ra con mồi trong môi trường nước xung quanh Nó cũng góp phần đưa nước đến mang giúp cho quá trình hô hấp

Chân: Chân có cấu tạo bằng cơ giúp ốc cối di chuyển trên các bề mặt

Miệng: Ốc cối có miệng có thể mở rộng ra phía trước để nuốt con mồi Hệ

thống cơ có thể co duỗi để đưa miệng vào trong vỏ

Mắt: Ốc cối có 2 mắt, nằm ở 2 bên miệng Hiện tại vẫn chưa biết được về khả

năng nhìn của ốc cối hay câu hỏi đặt ra là liệu chúng có đủ ánh sáng khi sống ở các vùng biển sâu hay không

1.1.4 Chế độ ăn và phương thức săn mồi

Ốc cối là động vật ăn thịt (canivorous), có tính chuyên hóa cao, với thức ăn chủ yếu là các loài giun biển (70%), cá nhỏ (15%), ĐVTM (15%), và ngay cả các loài ốc cối khác [ 71,88 ] Chúng có một cơ quan bắt mồi chuyên biệt là dải răng kitin (túi răng kitin) Răng kitin của ốc cối hõm sâu và có gai, giống như những cây lao thu nhỏ Ốc cối chỉ sử dụng răng kitin một lần, một khi răng kitin được sử dụng để tiêm nọc độc vào con mồi, nó sẽ được loại bỏ và ốc cối phải tái tạo lại răng mới [ 93 ] Khi ốc cối nhận ra đối tượng, vòi của chúng sẽ kéo dài ra, nhờ một lực co cơ những mũi tên từ ống vòi được phóng rất nhanh kèm theo một lượng lớn độc tố được phóng thích và làm tê liệt nhanh chóng con mồi Sự tấn công này chỉ xảy ra trong khoảng một phần nghìn giây Chất độc sẽ làm tê liệt con mồi và gây tử vong cho đối tượng trong thời gian rất ngắn Độc tố ốc cối chứa đựng hàng trăm các hợp chất khác nhau và thể hiện sự khác biệt giữa các loài khác nhau Các nhà khoa học cũng chỉ ra rằng, độc tố ốc cối cũng thay đổi tùy theo khẩu phần ăn, tùy theo mùa,

và tùy theo từng vùng địa lí khác nhau [ 91 ]

1.1.5 Đặc điểm sinh sản của ốc cối

Sinh sản của ốc cối vẫn chưa được nghiên cứu rộng rãi, nhưng hầu hết các loài này đều có sự phân chia giới tính và thụ tinh trong Trứng được đẻ một lần trong năm [ 54 ] Mỗi trứng được bao bọc bởi nhiều nang trứng, mỗi nang trứng lại chứa rất nhiều trứng khác nhau

Ấu trùng và con non của ốc cối thường có hai hình thức chính: Dạng ấu trùng Veliger (ấu trùng bơi lội tự do), và dạng con non Juvenile (có hình dáng gần giống

cá thể trưởng thành) Thời kì đầu của quá trình phát triển thường bị hạn chế, bởi số lượng ấu trùng bị hao hụt rất nhiều Do đó, trong quá trình ương nuôi ốc cối thường gặp nhiều khó khăn Thời kì ấu trùng sống ngoài khơi thường kéo dài khoảng từ 1 đến 50 ngày Vòng đời của ốc cối kéo dài khoảng 10 – 15 năm trong tự nhiên, cũng

như trong điều kiện nuôi nhốt

1.2 CÁC NGHIÊN CỨU VỀ ĐỘC TỐ CỦA ỐC CỐI (CONUS SPP.)

1.2.1 Giới thiệu chung

Đặc tính của ốc là loài di chuyển chậm nên dễ bị các loài động vật ăn thịt khác tấn công Do đó, muốn tồn tại và phát triển cơ thể chúng phải có cấu tạo đặc biệt để thích nghi với điều kiện môi trường Cơ quan đó chính là tuyến độc Tuyến độc tiết ra nọc độc giúp chúng bắt những con mồi xa dễ dàng bằng cách tấn công làm tê liệt con mồi, mặt khác tuyến độc còn là vũ khí giúp chúng tự vệ cũng như tiêu diệt kẻ thù

Ốc cối săn mồi bằng một hệ thống nọc độc phát triển cao có thể làm tê liệt con mồi trong vài giây, nhờ vậy đảm bảo sự bắt mồi và tránh để mồi lộ ra lâu có thể bị các con cá lớn hơn giành mất Mỗi loài ốc cối sản sinh ra một loại độc tố riêng, đó là một hỗn hợp của các peptide ngắn, có liên kết disunfua, có khả năng làm bất động con mồi nhanh Độc tố đó tùy thuộc vào loài ốc săn mồi là cá (piscivorus species), ĐVTM (molluscivorus species) hay giun biển (vermivorus species) [ 56 ]

Độc tố không chỉ là một vũ khí để săn mồi mà còn được sử dụng để tự bảo vệ, canh tranh và cho những hoạt động sinh học khác, vì vậy sự phân hóa của độc tố ốc cối là điểu tất nhiên Mạng lưới phức tạp của các tương tác sinh học trong khu hệ sinh học biển đa dạng như vậy tạo cơ hội cho mỗi loài ốc cối tích lũy thành phần độc tố đặc trưng, khác biệt với các loài khác trong quá trình tiến hóa của chúng [ 71 ]

1.2.2 Ứng dụng y học của độc tố ốc cối

Trong vòng 20 năm qua, đã có hơn 2.600 nghiên cứu được tiến hành nhằm đánh giá một cách chính xác về đóng góp quan trọng của các độc tố chiết xuất từ loài ốc cối đối với ngành dược và sinh học tế bào Trong khi nghiên cứu chất độc có thể gây chết người của một loài ốc biển, các nhà khoa học đã phát hiện chất này có tác dụng giảm đau Hiện nay có trên 1000 chuỗi peptid được định danh và xác định được tính chất ức chế các kênh ion của chúng So với nguồn từ trên 50.000 cho đến 100.000 loại peptide trong độc tố ốc cối, đây mới chỉ là một con số nhỏ bé

Các ứng dụng độc tố ốc cối trong sinh học thần kinh và bào chế thuốc đang gia tăng nhanh chóng, như sản xuất thuốc hỗ trợ trong gây mê, thuốc giảm đau,

điều trị một số bệnh (đau mãn tính, động kinh, tim mạch, rối loạn tâm thần, ung thư, đột quỵ) [ 64 ]

Hiện nay đã phát hiện ra các kênh nhạy cảm với điện thế được xếp thành sáu nhóm theo các tính chất điện sinh lý và tính chất dược học, được ký hiệu là L-, N-, P-, Q-, T-, và R- (type) Kênh canxi loại N bao gồm 5 tiểu đơn vị, trong đó, tiểu đơn

vị α2-δ có ái lực mạnh với các độc tố, ví dụ conotoxin MVIIA Độc tố conotoxin MVIIA đi vào cơ thể sẽ liên kết với tiểu đơn vị α2-δ, làm thay đổi cấu hình của tiểu đơn vị này, dẫn tới kìm hãm sự vận chuyển ion canxi qua màng tế bào,

ω-sự truyền tín hiệu của các nơron thần kinh bị khóa Khả năng ngăn chặn này rất chính xác, làm cho tín hiệu đau đớn không tới não được mà thần kinh vẫn làm việc bình thường [ 8,42,74 ] Do vậy, các độc tố ốc cối được sử dụng trong điều trị các cơn đau mạn tính, các bệnh thần kinh như Parkinson, bệnh thuộc hệ thần kinh tự động, ung thư, tim mạch và nhiều bệnh khác

Loại peptide kỵ nước TxVIA tách chiết từ ốc Conus textile là loại δ-conotoxin

đầu tiên được phân lập do tác dụng độc tính lạ thường của nó khi tiêm vào ốc và tôm hùm [ 43 ] Tác dụng của nó là làm chậm sự bất hoạt kênh natri của neuron trong các loài ĐVTM δ-conotoxin EvIA có tác dụng chọn lọc đối với các kênh Nav 1.2, 1.3 và 1.6 và điều này làm cho nó có tác dụng với các neuron của động vật có vú [ 7 ]

Contulakin-G có khả năng yếu hơn 100 lần so với neurotensin đối với thụ thể neurotensin I, nhưng lại có khả năng làm giảm đau nhiều hơn khoảng 100 lần Do khả năng của nó có thể giảm đau mạnh mẽ và trong một dải rộng contulakin-G (CGX-1160) đã được áp dụng rất sớm bởi công ty Cognetix Inc để giảm đau

Cho đến nay, có 6 peptide độc tố ốc cối đã được thử nghiệm lâm sàng, trong

đó, Prialt (tên thường gọi là Ziconitide), ω-conotoxin MVIIA từ Conus magus, đã

được cấp phép sử dụng trong điều trị các cơn đau bởi Cục quản lý thực phẩm và dược phẩm Hoa Kỳ (FDA) vào tháng 12 năm 2004 Ngoài ra, 2 độc tố khác cũng đang được thử nghiệm cận lâm sàng Một loại peptide khác, cũng hoạt động theo cơ

chế như trên, là ω-conotoxin GVIA từ Conus geographus cũng được ứng dụng rộng

rãi trong khoa học thần kinh, với khoảng hơn 2000 nghiên cứu trên giấy tờ, cũng như trong nghiên cứu dược lý học [ 88 ]

Một phần lớn các conopeptide đầu tiên được nghiên cứu ứng dụng đạt đến mức thử nghiệm lâm sàng; trong số 30 peptide đầu tiên được tinh sạch từ tuyến độc tố ốc cối, và ít nhất 10% đã đạt đến Pha I trong thí nghiệm lâm sàng ở người Ứng dụng chủ yếu của các peptide ốc cối là thuốc giảm đau (Bảng 1.1)

Bảng 1.1 Các nhóm peptide dộc của ốc cối, vùng đặc hiệu và biểu hiện ở các

Giảm đau Giảm đau

Chấp nhận FDA 12/04;

Pha 1

[66,83] Thụ thể

Thụ thể nicotinic α-Vc1.1 (ACV-1) Giảm đau Pha 1 [81] Thụ thể NMDA

(N-Methyl-D-aspartate)

Conantokin-G 1007)

(CGX-Động kinh;

giảm đau Pha 1 [62] Kênh K+ κ-PVIIA (CGX-1051) Nhồi máu cơ tim Đang thử nghiệm [60] Kênh Na+ µO-MrVIB (CGX-1002) Giảm đau Đang thử nghiệm [16]

2 CÁC NGHIÊN CỨU VỀ DI TRUYỀN ỐC CỐI (CONUS SPP.)

2.1 CÁC CHỈ THỊ SỬ DỤNG TRONG NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN

Đa dạng di truyền là kết quả của quá trình biến đổi trong vật chất di truyền sinh vật (sự thay đổi nucleotide, gen, nhiễm sắc thể hoặc toàn bộ hệ gen sinh vật) theo các con đường tự nhiên (lai, phân ly, tái tổ hợp, đột biến tự nhiên…) hay tác động của con người (lai – chọn tạo giống, gây đột biến, chuyển gen…) Tất cả các quá trình này tác tạo nên sự biến đổi gen và tấn số allen, dẫn đến những thay đổi trong kiểu hình của sinh vật

Những thông tin về đa dạng di truyền và mối quan hệ giữa các nguồn vật liệu

có vai trò, ý nghĩa hết sức quan trọng và là sức mạnh của công tác cải tạo giống vật nuôi Từ những kết quả đánh giá đa dạng di truyền, các nhà khoa học có thể quy hoạch và bảo tồn các nguồn gen quý, duy trì tính đa dạng sinh học hoặc khai thác,

hỗ trợ trong các chương trình chọn tạo giống thôn qua chọn lựa các cặp bố mẹ nhằm thu được ưu thế lai cao nhất [ 10 ]

Việc nghiên cứu đa dạng di truyền đã được thực hiện từ khá lâu với nhiều phương pháp tiếp cận khác nhau, thông qua các đặc điểm kiểu hình (chỉ thị hình thái), thành phần protein và hoạt chất (chỉ thị hóa sinh) hay sự khác biệt trong DNA (chỉ thị DNA) Mỗi loại chỉ thị đều có những ưu – nhược điểm cũng như khả năng đánh giá mức độ đa dạng di truyền khác nhau Trong đó chỉ thị hình thái được sử dụng sớm nhất và là cơ sở ban đầu trong đánh giá phân loại động vật, còn chỉ thị DNA hiện nay được sử dụng rộng rãi trong đánh giá đa dạng di truyền, là công cụ hữu hiệu trong công tác chọn tạo giốn vật nuôi

2.1.1 Chỉ thị hình thái

Nghiên cứu đa dạng di truyền dựa vào chỉ thị hình thái là phương pháp đánh giá thông qua đặc điểm về hình thái (hình dạng, kích thước, đặc điểm các bộ phận…) Với ưu điểm là dễ dàng tiếp cận nghiên cứu, mà không đòi hỏi thiết bị đặc biệt đắt tiền cũng như quy trình thực hiện phức tạp Hiện nay, phương pháp này vẫn được sử dụng phổ biến và khá hiệu quả trên các đối tượng vật nuôi nói chung và các đối tượng thủy hải sản nói riêng, để giúp các nhà nghiên cứu nhận biết và phân biệt các giống khác nhau bằng mắt thường một cách nhanh chóng Tuy nhiên, việc sử dụng các chỉ thị hình thái trong phân tích đa dạng di truyền có những hạn chế: (1)

Số lượng các chỉ tiêu hình thái có hạn lại chịu tác động rất lớn của môi trường cũng như phụ thuộc vào giai đoạn nhất định của quá trình phát triển cá thể (2) Việc đánh giá mang tính chất thống kê nên cần phải thực hiện với số lượng lớn để đảm bảo tính chính xác (3) Có nhiều tính trạng do đa gen quy định mà không phải toàn bộ các gen đều biểu hiện ra kiểu hình để có thể đánh giá được [ 53 ]

2.1.2 Chỉ thị sinh hóa

Chỉ thị sinh hóa được phát hiện nhờ phương pháp isozyme, dựa trên cơ sở gen quy định sinh tổng hợp protein Isozyme là các enzyme có trình tự amino acid khác nhau nhưng cùng xúc tác cho một kiểu phản ứng hóa học Về mặt di truyền có thể chia isozyme thành hai dạng là isozyme đơn gen (các isozyme này chịu sự kiểm soát của một gen) và isozyme đa gen (các isozyme được mã hóa bởi hai hay nhiều gen)

Do số lượng chỉ thị isozyme không nhiều và sự biểu hiện của chúng phụ thuộc vào giai đoạn sinh trưởng và phát triển của cá thể nên các chỉ thị isozyme được ứng dụng tương đối hạn chế trong đánh giá đa dạng di truyền và phân nhóm ưu thế lai

2.1.3 Các chỉ thị phân tử

Năm 1988, kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) ra đời đã mở đầu cho

cuộc cách mạng của hàng loạt DNA marker mới nhanh chóng thay thế isozyme

DNA marker rất phong phú do sự đa dạng của DNA và chúng không lệ thuộc vào yếu tố môi trường Trong chọn lọc nhờ DNA marker, các gen mục tiêu được phát hiện nhờ vào các marker mà không cần sự biểu hiện thành kiểu hình của gen đó Tuy nhiên các kỹ thuật DNA lại rất đắt tiền, tốn kém đó là lý do khả năng ứng dụng vào nghiên cứu di truyền quần thể còn hạn chế Thêm vào đó ở các nghiên cứu quần thể, sự khác biệt gen giữa hai quần thể đòi hỏi phải phân tích một số lượng lớn các

cá thể (trên 30 cá thể) để cho kết quả tin cậy và chính xác Vì vậy các kỹ thuật DNA vẫn không thể thay thế hoàn toàn isozyme trong các nghiên cứu quần thể

Dựa trên kiểu hình có thể phân loại DNA marker thành 2 loại: (1) Marker

đồng trội: là những marker có thể phân biệt được cá thể đồng hợp tử và cá thể dị

hợp tử, đó là các marker isozyme, microsatellite, PCR nhân RFLP Trong trường

hợp này tần số alen có thể được tính trực tiếp từ dữ liệu kiểu gen (2) Marker trội:

RAPD marker không thể phân biệt những cá thể đồng hợp tử và cá thể dị hợp tử Các ứng dụng về chỉ thị DNA đã cho phép nhanh chóng điều tra sự đa dạng di truyền trong vật nuôi và chọn giống thủy sản, xác định cặp bố mẹ, xác định chủng loài, xây dựng chi tiết bản đồ liên kết gene cho các loài thủy sản Các nghiên cứu sử

dụng chỉ thị di truyền sẽ gia tăng tính chắc chắn khi xác định những gen của mỗi loci có tham gia vào di truyền số lượng giúp hỗ trợ quá trình chọn giống

2.1.3.1 Chỉ thị DNA ti thể

Di truyền ty thể là di truyền theo dòng mẹ Trong thực tế, có đến 99% ty thể của tế bào con thừa hưởng từ mẹ do bào quan này nằm trong tế bào chất của tế bào trứng So với trứng, tinh trùng có một số lượng các ty thể chỉ bằng 0,1% - 1,5%, số lượng này đảm bảo năng lượng giúp tinh trùng vận động trong quá trình thụ tinh Khi tham gia thụ tinh, ty thể của tinh trùng bị loại bỏ nhờ cơ chế phân giải protein phụ thuộc ubiquitin Đôi khi cơ chế này diễn ra không hoàn toàn dẫn đến sự có mặt của hai dòng ty thể của cả bố lẫn mẹ trong cơ thể con, hiện tượng này được gọi là

dị tế bào chất (heteroplasmy)

DNA ty thể không có intron, trong phân tử không có sự tái tổ hợp Tốc độ biến đổi của DNA ty thể nhanh hơn nhiều so với DNA trong nhân, có thể là do ty thể thiếu hụt các cơ chế sửa chữa DNA Tốc độ đột biến cao dẫn đến nhiều biến dị trong ty thể, không chỉ giữa các loài mà còn xảy ra ngay cả trong cùng một loài

Số lượng ty thể có biến đổi về mặt di truyền trong tế bào tùy thuộc không những vào số ty thể nó được thừa hưởng từ mẹ mà còn vào các yếu tố gây đột biến trong môi trường Những biến dị ở genome ngoài nhân không giống nhau giữa các

ty thể trong cùng một tế bào và giữa các tế bào khác nhau Đây là một trong số các

ví dụ cho thấy rằng có rất nhiều biến dị trong mã di truyền của ty thể nhưng không

có hại đối với cơ thể mang đột biến

Trong hầu hết các trường hợp, mã di truyền là phổ biến Tuy thế, vẫn có một số ngoại lệ trong di truyền học ty thể Dưới đây là một số trường hợp mà người ta đã biết

Bảng 1.2: Sự khác nhau giữa mã di truyền trong nhân và ngoài ty thể

Hầu như toàn bộ các phân tử mtDNA được phiên mã, ngoại trừ khu vực kiểm soát khoảng 1KB (D-loop), là nơi mà quá trình sao chép và phiên mã của phân tử được bắt đầu [ 58 ]

Vùng điều khiển của DNA ty thể có tốc độ tiến hóa nhanh gấp 5-10 lần với các gen ty thể khác Trình tự nuleotide của vùng D-loop là một công cụ rất hữu hiệu để đánh giá tính đa dạng di truyền và sự phân hóa bên trong loài và giữa các quần thể cùng loài Chính vì thế mà các gen trong genome ty thể và vùng D-loop đóng một vai trò vô cùng quan trọng trong các nghiên cứu thuộc lĩnh vực phân loại học phân

tử Như vậy, DNA ty thể có thể được coi là một công cụ không thể bỏ qua khi tìm hiểu về mối quan hệ phát sinh chủng loại hay sự tiến hóa của các quần thể

Chỉ thị DNA ti thể khá phổ biến trong di truyền học thủy sản, một trong những

lý do quan trọng khi sử dụng chỉ thị này là để xác định nguồn gốc đàn bố mẹ vật nuôi [ 9 ] Về mặt kỹ thuật, chỉ thị mtDNA tương tự với chỉ thị RFLP, tuy nhiên chỉ thị mtDNA lấy các gen đích là DNA ti thể, khác biệt với việc sử dụng DNA nhân trong RFLP [ 19 ] DNA ti thể có số lượng lớn các allen trên một loci, nhưng giá trị PIC của các đoạn gen chỉ thị trên phân tử mtDNA cao hơn khi dùng chỉ thị allozyme và thấp hơn khi sử dụng các chỉ thị là DNA nhân như RAPDs, microsatellites, AFLPs, and SNPs

2.1.3.2 Chỉ thị RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism)

RFLP được định nghĩa là tính đa hình chiều dài các phân đoạn cắt giới hạn, biểu hiện sự khác nhau về kích thước các phân đoạn được tạo ra khi cắt DNA bằng các enzyme cắt giới hạn khi có sự thay đổi trình tự trên DNA hệ gen hoặc trong các bào quan khác

Nguyên tắc của kỹ thuật này dựa trên độ đặc hiệu của các enzyme cắt hạn chế (Restriction enzyme - RE) đối với vị trí nhận biết của chúng trên DNA hệ gen DNA hệ gen sẽ được cắt bằng các enzyme cắt giới hạn, chạy điện di qua gel agarose, thấm qua màng lai và lai với một mẫu dò DNA (được đánh dấu phóng xạ) liên kết với một locus đặc biệt Sự khác biệt vị trí cắt giữa hai cá thể sẽ tạo ra những phân đoạn cắt khác nhau

RFLP có ưu điểm là marker đồng trội cho phép phân biệt được cá thể đồng hợp và dị hợp Do kích thước DNA khảo sát trong RFLP lớn vì vậy số lượng marker tạo ra nhiều đủ đáp ứng nhu cầu nghiên cứu Tuy nhiên do qui trình thực hiện phức tạp, nguy hiểm đối với sức khoẻ người nghiên cứu (sử dụng phóng xạ đánh dấu), DNA yêu cầu có chất lượng cao đã làm hạn chế việc sử dụng kỹ thuật này Cùng với sự phát triển kỹ thuật PCR, kỹ thuật RFLP trở nên đơn giản hơn Một cặp mồi oligonucleotide có thể dùng khuếch đại một vùng DNA cần khảo sát, sau

đó đoạn DNA được khuếch đại được cắt bằng các RE, điện di và phân tích trên gel nhuộm ethidium bromide hoặc bạc PCR-RFLP bỏ qua bước lai nên giá thành rẻ hơn và ít nguy hiểm hơn phương pháp RFLP [ 58 ]

2.1.3.3 Chỉ thị RAPD (Randomly Amplified Polymorphic DNA)

RAPD được định nghĩa là sự đa hình các đoạn DNA được khuếch đại ngẫu nhiên PCR RAPD thực hiện dựa trên cơ sở sự bắt cặp ngẫu nhiên của các mồi đơn ngắn (10 nucleotide) với mạch khuôn Các đoạn mồi oligonucleotide nếu bắt cặp ngẫu nhiên với cả hai mạch đối diện của mạch khuôn DNA trong khoảng cách có thể khuếch đại được (dưới 3000bp) sẽ cho ra những đoạn DNA có kích thước khác nhau sau khi khuếch đại Sự có mặt của các sản phẩm DNA khác nhau chứng tỏ đã

có một sự tương đồng hoàn toàn hay một phần giữa DNA bộ gen và mồi Các mồi dùng trong RAPD thường ngắn vì vậy dễ dàng tìm được các đoạn tương đồng trên mạch đơn DNA bộ gen Do đó tính đa dạng thu được nhờ RAPD là đáng tin cậy, vì khi có sự thay đổi một base nitơ nào đó thì nó sẽ ngăn cản việc tiếp hợp giữa mồi và DNA mạch khuôn Sự mất đoạn nhiễm sắc thể hoặc sự thêm bớt điểm gắn mồi cũng như sự xen vào của một gen nào đó sẽ làm thay đổi kích thước đoạn DNA được khuếch đại Nguyên tắc phản ứng RAPD cũng như nguyên tắc phản ứng PCR thông thường Tuy nhiên, vì sử dụng mồi ngẫu nhiên nên nhiệt độ bắt cặp của mồi thấp để tạo điều kiện bắt cặp không nghiêm ngặt Nhiệt độ bắt cặp của phản ứng là 30oC- 36oC Chính vì yếu tố đặc hiệu thấp nên kết quả RAPD thường có độ lặp lại không cao và khó tối ưu phản ứng Đây chính là trở ngại lớn nhất của RAPD vì kết quả phụ thuộc rất nhiều yếu tố như thành phần phản ứng PCR (đặc biệt là thành phần

Mg2+ và chất lượng DNA bản mẫu), các thiết bị cũng như thao tác thí nghiệm Ngoài ra RAPD là một marker trội do đó những gen điều khiển tính trạng lặn sẽ khó tìm thấy sự đa hình trong điện di [ 58 ]

2.1.3.4 Chỉ thị AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism)

AFLP được định nghĩa là sự đa hình các đoạn cắt khuếch đại, là kỹ thuật kết

hợp giữa RFLP và PCR AFLP sử dụng enzyme cắt giới hạn cắt DNA bộ gen, sử dụng những phân đoạn DNA làm khuôn cho phản ứng khuếch đại PCR AFLP có thể dùng để phân biệt các cá thể rất gần nhau, thậm chí ngay cả những dòng đẳng gen Sự khác nhau trong chiều dài các đoạn khuếch đại có thể do những thay đổi của các base trong vùng trình tự mồi, hoặc thêm, mất đoạn ở giữa hai vị trí cắt Thông thường, RE sử dụng trong AFLP là một cặp enzyme, một enzyme cắt thường xuyên (tạo ra những trình tự nhỏ) và một enzyme cắt không thường xuyên (nhằm hạn chế số lượng các đoạn cắt) Cặp enzyme thường được dùng nhất là EcoRI - MseI Sau khi cắt bằng cặp enzyme này, một trình tự nối mạch đôi (adaptor) sẽ được gắn vào hai đầu đoạn DNA cắt bằng enzyme ligase Đoạn adaptor gồm 2 phần: phần trình tự lõi và phần trình tự đặc hiệu cho vị trí cắt enzyme Mồi của phản ứng PCR được thiết kế dựa trên trình tự adaptor và chứa một trình tự chọn lọc khoảng vài nucleotide Chỉ những phân đoạn DNA nào chứa cả trình tự adaptor và trình tự nucleotide chọn lọc mới được khuếch đại, chính trình tự chọn lọc sẽ làm giảm sự xuất hiện sản phẩm PCR và làm đơn giản quá trình phân tích [ 58 ]

AFLP nhanh, đơn giản không phức tạp như RFLP nhưng vẫn khảo sát được toàn bộ gen Kỹ thuật này đòi hỏi ít lượng DNA ban đầu, không cần biết trước trình

tự đích và độ lặp lại phản ứng cao, các mồi sử dụng không cần đặc hiệu loài (các mồi thương mại có thể dùng cho hầu hết các loài) Tuy nhiên AFLP là một marker trội, điều này làm hạn chế phân biệt cá thể đồng hợp và dị hợp

2.1.3.5 Chỉ thị SSR (Simple Sequence Repeats hay Microsatellite)

Rải rác ở những vị trí khác nhau trên bộ gen eukaryote là những vùng có tính biến dị cao Những vùng này có chứa các trình tự DNA gọi là VNTR (variable number tandem repeat) còn gọi là các tiểu vệ tinh Các VNTR này đặc trưng bởi số

lần lặp lại của trình tự lõi (đơn vị trình tự) DNA Microsatellite là các VNTR có số đơn vị trình tự lõi từ 1 – 6 bp, số lần lặp lại của microsatellite khoảng 70 lần Do số lần lặp lại của mỗi microsatellite là khác nhau ở mỗi cá thể nên tính đa hình tạo ra khi sử dụng phương pháp này là rất cao Dựa trên trình tự DNA microsatellite được bảo tồn ở các cá thể cùng loài cho phép chúng ta thiết kế mồi để khuếch đại trình tự lặp lại trong toàn bộ kiểu gen, trình tự mồi sử dụng trình tự đặc hiệu ở hai đầu locus microsatellite Kết quả tạo ra các đoạn DNA có chiều dài khác nhau phân tách trên gel polyacrylamide Xác định trình tự đặc hiệu hai đầu locus microsatellite là bước đầu tiên rất quan trọng trong việc phân tích kỹ thuật này Do đó, việc sử dụng microsatellite gặp phải nhược điểm lớn là phải xác định trình tự đặc hiệu cho mỗi locus đa hình Ưu điểm lớn nhất của microsatellite là có tính đa hình cao và là một marker đồng trội [ 58 ]

2.1.3.6 Chỉ thị SNP (Single nucleotide polymorphisms)

Chỉ thị SNP dựa trên so sánh trình tự của từng gốc nucleotide giữa các cá thể tại vị trí xác định, chính vì thế phương pháp này rất chính xác và số lượng đa hình cực kỳ nhiều Theo ước tính gần đây nhất, khoảng 100 – 300 bp của hệ gen có một SNP (cũng có ước tính SNP xảy ra một lần/1000 bp) Do đó, SNP là chỉ thị phân tử phong phú nhất được biết đến cho đến nay [ 34 ]

Nhược điểm chính của phương pháp này là chi phí cho phát triển tốn kém, cần phải sử dụng kỹ thuật xác định trình tự DNA nên chỉ thực hiện được ở các phòng thí nghiệm có đủ trang thiết bị [ 23 ]

2.2 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU DI TRUYỀN ỐC CỐI

2.2.1 Nghiên cứu cấu trúc hệ gen của ốc cối

 Cấu trúc hệ gen ti thể (Mitochondrial DNA – mtDNA) của Conus textile

Bandyopadhyay và cs (2008) tiến hành phân tích trình tự gen DNA ti thể của

ốc cối cho thấy thứ tự gen (gene orders) là tương tự giữa Conus textile và Lophiotoma cerithiformis (loài khác thuộc Conoidean) và Neogastropod Ilyanassa obsoleta (không thuộc tổng họ Conoidea) Tuy nhiên, đoạn chèn (intergenic) giữa

gen coxI and coxII của C textile lớn hơn (165 bp) Nghiên cứu đã chứng minh đoạn

chèn giữa gen này rất hữu dụng trong các nghiên cúu về tiến hóa, cũng nhƣ định danh loài [ 6 ]

Hệ gen ty thể của Conus textile là một phân tử DNA dạng vòng, có chiều dài

15562 nucleotide, mã hóa cho 13 proteins, 2 rRNA và 22 tRNA Trong đó, các gen

mã hóa protein ty thể gồm: cytochrome oxidase 1 – 3 ( coxI, coxII, coxIII); cytochrome b (gen cob); tiểu đơn vị 6 và 8 của ATPasegen atp6 và atp8); các tiểu đơn vị từ 1-6 và tiểu đơn vị 4L của NADH dehydrogenase (các gen nad1-nad6 và nad4L)]; tRNA D, V, L (1), L (2), P, S (1), S (2), H, F, K, A, R, N, I; tiểu đơn vị lớn

và nhỏ của rDNA (rrnS, rrnL) đƣợc mã hóa từ cùng một chuỗi DNA, trong khi đó tRNAs M, Y, C, W, H, G, E và T đƣợc mã hóa từ chuỗi bổ sung (hình 1.3)

Hình 1.3: Cấu trúc hệ gen ty thể của C textile Mũi tên ký hiệu gen CO1 và 16S

Đoạn chèn giữa gen giao động từ 0 – 35 nucleotide với 2 vùng lớn của gen 165

và 126 nucleotide giữa CoxI và CoxII và giữa tRNAphe và CoxIII Trình tự mã hóa

của gen NAD4 và NAD4L trùng lắp bởi 7 nucleotide; NAD4 và tRNAhis

bởi 1 nucleotide; NAD5 và tRNAphe cũng bởi 1 nucleotide ; và tRNARTip và tRNAGin bởi

3 nucleotide [ 6 ]

 Hệ gen ribosome (Ribosome DNA – rDNA)

Ribosomal DNA (rDNA) bao gồm một trình tự lặp lại song song của một phân đoạn đơn vị, một operon, bao gồm các NTS, ETS (External transcribed Space),

vùng gen 18S, ITS1 (Internal Transcribed Space 1), vùng gen 5.8S, ITS2 (Internal Transcribed Space 2) và vùng gen 28S

Hình 1.4: Cấu trúc trình tự DNA ribosome

Các phân tử rRNA là rất cần thiết cho hệ ribosome, tổng hợp protein, và chức năng tế bào Vì vậy, gen ribosome thuộc về các gen được bảo tồn nhất trong các tế bào có nhân điển hình Tuy nhiên, sự tương đồng trong các vùng đệm bên trong (ITS-1 và ITS-2) là rất thấp, vì các khu vực này DNA không đóng góp vào quá trình tổng hợp protein Vì vậy, ít áp lực chọn lọc và sự khác biệt trình tự DNA (đột biến điểm), thậm chí giữa các loài của một gióng, có thể được tìm thấy trong các khu vực này Do các tính năng này dữ liệu phân tử rDNA là rất hữu ích để xác định mối quan

hệ phát sinh loài (cây phả hệ) hoặc phân loại giữa các loài có mối quan hệ gần gũi

2.2.2 Nghiên cứu mối quan hệ tiến hóa

Đối với lớp chân bụng Gastropoda, DNA ty thể đã được chứng minh là công

cụ hữu hiệu trong phân tích đa dạng loài [ 36 ] Các marker chuẩn của DNA ty thể thường được sử dụng là các gen mã hóa cytochrome b, 12S rRNA, 16S rRNA, tRNA-Val và một số vùng không mã hóa như vùng liên gen trnF-cox3, atp6-trnM, cox1-cox2, cox3-trnK, nad1-trnP Việc sử dụng toàn bộ trình tự DNA ty thể cũng nâng cao độ phân giải và độ tin cậy thống kê so với sử dụng từng đoạn gen riêng lẻ Tuy nhiên, cho tới nay mối quan hệ phát sinh chủng loại của các loài thuộc giống ốc cối vẫn chưa được giải quyết một cách triệt để do các marker phân tử của DNA ty thể tỏ ra ít tin cậy khi được áp dụng để xác định vị trí phân loại của các loài mới tách ra [ 31,28,26 ] Vì vậy, trong các nghiên cứu tiến hóa gần đây, các marker DNA ty thể thường được sử dụng kết hợp với các marker nhân có tốc độ tiến hóa thấp hơn và trong một số trường hợp cho thấy mối quan hệ tiến hóa rõ hơn [ 30,22,26,6,67 ] Một số marker nhân đã được khảo sát bao gồm các vùng gen mã hóa 18S rRNA, 28S rRNA, EF1-α, Histone H3, calmodulin…và vùng không mã hóa như đoạn chèn ITS2 (Internal Transcribed Spacer 2)

Duda và Kohn (2005) sử dụng chỉ thị phân tử calmodulin và 16S mtDNA của

138 loài ốc cối từ vùng biển Ấn Độ-Thái Bình Dương, đông Thái Bình Dương và Đại Tây Dương [ 26 ] Kết quả chỉ ra rằng các loài hiện nay là con cháu từ 2 nhánh (lineage) chính và phân hóa ít nhất cách đây 33 triệu năm Sự phân bố địa lý của chúng cho thấy 1 nhóm (clade) bắt nguồn từ biển Ấn Độ-Thái Bình Dương còn nhóm kia ở đông Thái Bình Dương và tây Đại Tây Dương Sự ngăn trở khả năng phát tán giữa vùng biển đông Đại Tây Dương và Ấn Độ Dương, giữa vùng trung tâm và tây Thái Bình Dương có thể đã xúc tiến sự phân hóa rất sớm của 2 nhánh chính của ốc cối: Ấn Độ-Thái Bình Dương và đông Thái Bình Dương + tây Đại Tây Dương Tuy nhiên, cả 2 nhóm đều chứa các loài ở Ấn Độ-Thái Bình Dương và đông Thái Bình Dương + tây Đại Tây Dương, vì vậy sự di cư đã xảy ra giữa các vùng Theo tính toán

có ít nhất 4 sự kiện di cư đã xảy ra tại các thời điểm khác nhau Và trong ít nhất 3 trường hợp, sự xâm nhập giữa các vùng cho thấy có sự vượt qua rào cản đông Thái Bình Dương Các dữ liệu khảo cổ mô tả các nhóm ốc cối riêng biệt phân bố ở vùng biển Ấn Độ-Thái Bình Dương, đông Thái Bình Dương + tây ĐạiTây Dương và đông Đại Tây Dương-vùng Tethys (ngày nay được gọi là Tertiary)

Hơn nữa, chỉ thị nhân ITS2 (đoạn chèn giữa gen mã hóa 5,8S và 28S rRNA)

đã được Nam và cs (2009) sử dụng nhằm đánh giá mối quan hệ tiến hóa của 26 loài

ốc thu thập tại vùng biển thuộc quần đảo Marinduque, Philippines Kết quả cho thấy trình tự ITS2 được bảo tồn giữa các cá thể thuộc cùng một nhóm dinh dưỡng nhưng lại thể hiện sự đa dạng ở mức độ phù hợp cho việc xác định vị trí phân loại của các loài mới phân hóa Hơn nữa, việc sử dụng kết hợp các chỉ thị ty thể (12S rDNA, 16S rDNA và COI) và chỉ thị ITS2 đã chia nhóm ăn ĐVTM thành 3 nhánh rõ ràng

là Conus, Cyclinder và Darioconus [ 67 ]

Các chỉ thị phân tử cũng rất hữu hiệu trong việc phân tách các loài cận giống

(sibling species) Conus praecellens (A Adams, 1854) được mặc nhận thuộc về nhóm các loài có kích thước nhỏ và tháp vỏ cao như Conus pagodus (Kiener, 1845), C memiae (Habe và Kosuge, 1970) và C arcuatus (Broderip and Sowerby, 1829) Bigg và cs (2010) đã kiểm chứng nhóm loài Conus praecellens sử dụng kết

hợp các dữ liệu hình thái, chỉ thị phân tử và chỉ thị độc tố [ 11 ] Dữ liệu phát sinh loài và độc tố đã chỉ ra rằng giả thuyết trên là không chính xác Theo nhóm tác giả,

C praecellens thực chất là thuộc về nhánh gồm các loài Conus stupa (Kuroda, 1956), C stupella (Kuroda, 1956), C acutanguhis (Lamarck, 1810) và một điều gây ngạc nhiên là môt số loài rất khác nhau về mặt hình thái như: Conus mitratus (Sowerby, 1870) và Conus cijlindraceus (Broderip and Sowerby, 1830) Những nghiên cứu sâu về các dạng hình thái vỏ được cho là C praecellens cho thấy chỉ từ các mẫu vật ở Philipine đã có thêm 3 loài mới Conus andremenezi, C miniexcclsus

và C rizali Việc xem xét lại các tính trạng hình thái vỏ và vòng xoắn ốc của ấu trùng đã chỉ ra rằng loài Conus excelsus (Sowerby III, 1908) cũng liên quan đến

những loài trên Kết hợp các dữ liệu khác nhau cho thấy nhánh bao gồm 10 loài trên (được nhóm tác giả gọi là nhánh Tiirriconus) Hiện tại có một số dạng khác biệt trong nhánh này có thể được xem xét phân tách ở mức độ loài

Như vậy, việc sử dụng rộng rãi các chỉ thị phân tử, đặc biệt là việc kết hợp các chỉ thị phân tử DNA ti thể và DNA bộ gen đã góp phần làm sáng tỏ mối quan hệ loài ốc cối nói chung và theo vùng địa lý nói riêng Các nghiên cứu cũng giúp nâng cao hiểu biết về lịch sử tiến hóa, địa sinh học của ốc cối cũng như phân biệt các loài cận giống

2.2.3 Mối liên hệ giữa phát sinh loài và chế độ dinh dưỡng ở ốc cối (Conus spp.)

Ốc cối được biết đến như một giống có hình thức dinh dưỡng chuyên biệt hóa Độc tố của chúng cũng tiến hóa tùy thuộc vào phương thức săn loại mồi là cá, ĐVTM hay giun biển [ 56 ]

Duda và cs (2001) sử dụng chỉ thị phân tử DNA ti thể (16S rDNA) và DNA nhân (Calmodulin) của 76 loài ốc cối cối thu thập từ các vùng biển Ấn Độ - Thái Bình Dương và tây Đại Tây Dương để xác định mối quan hệ loài và tìm hiểu nguồn gốc và lịch sử tiến hóa của sự chuyên biệt hóa các chế độ dinh dưỡng khác nhau [ 28 ] Kết quả cho thấy hình thức dinh dưỡng ăn giun biển di chuyển (errant polychaetes) là hình thức cổ xưa nhất do chúng chiếm phân nửa các nhóm (clade) trên cây tiến hóa Các dạng dinh dưỡng khác như ăn các loài chân bụng và một số

họ giun biển khác như Terebellidae, Nereidae và Amphinomidae được tách ra một lần, trong khi đó các loài ăn cá có thể tách ra từ 2 đến 3 lần trên cây tiến hóa Hình thức dinh dưỡng phân hóa nhất tách ra từ kỷ Miocen Phần lớn các đa dạng được biết đến của ốc cối được phát sinh từ kỷ Miocen và tồn tại đến ngày nay

Ốc cối sử dụng độc tố để làm tê liệt con mồi, vì vậy sự tiến hóa của độc tố bị ảnh hưởng trực tiếp bởi sự tương tác giữa kẻ săn mồi và con mồi (predator-prey interactions) Để xác định nhân tố chọn lọc dẫn đến sự chuyên biệt hóa của độc tố

ốc cối, Duda và cs (2009) khảo sát sự phân bố alen của các locus đa hình của

O-superfamily trên đối tượng Conus ebraeus tại Okinawa, Guam và Hawaii [ 24 ] Nghiên cứu trước đây (Duda và Leison (2009) cho thấy quần thể của loài ốc ăn giun

biển Conus ebraeus không thể hiện cấu trúc di truyền tại vùng biển tây và đông

Thái Bình Dương [ 29 ] Kết quả cho thấy tần suất alen conotoxin khác nhau có ý nghĩa thống kê giữa 3 vùng địa lý với sự khác biệt lớn nhất là tại Hawaii Tuy nhiên, dữ liệu từ DNA ti thể cho thấy 3 quần thể trên không khác biệt về mặt di truyền Các phân tích dựa trên DNA cho thấy giun biển eunicid (eunicid

polychaetes) là nguồn thức ăn chính của C ebraeus tại Guam và Okinawa, trong

khi đó giun biển nereid (nereid polychaetes) là đối tượng chiếm ưu thế trong khẩu phần ăn ở Hawaii Tần suất alen của conotoxin chịu áp lực chọn lọc lớn, sự chọn lọc

có thể từ sự biến dị theo vùng địa lý trong việc chuyên biệt hóa khẩu phần ăn và sự đồng tiến hóa giữa ốc cối và con mồi của chúng

2.2.4 Nghiên cứu di truyền ốc cối ở Việt Nam

Pham và cs (2011) đã sử dụng chỉ thị 16S rDNA để khảo sát mối quan hệ tiến hóa của 18 loài ốc cối ở vùng biển Nam Trung Bộ, Việt Nam (Lý Sơn (Quảng Ngãi), Cù Lao Chàm (Quảng Nam), Bình Thuận, Vân Phong (Khánh Hòa)) Kết quả cho thấy các loài ốc cối thuộc các kiểu dinh dưỡng khác nhau (ăn giun biển, ăn

cá, ăn ĐVTM) phân chia thành 4 nhánh chính Trong đó các loài ốc thuộc nhóm ăn giun biển được phân tách rõ ràng hơn trên cây tiến hóa so với hai nhóm dinh dưỡng còn lại Tuy nhiên, việc sử dụng chỉ thị 16S rDNA vẫn có những hạn chế nhất định trong việc phân tách các loài ốc có quan hệ tiến hóa gần gũi

2.2.5 Nghiên cứu di truyền độc tố

Duda và cs (1999) nghiên cứu sự biểu hiện của gen độc tố thuộc lớp δ and ω

(four-loop conotoxin genes) của 2 loài ốc cối có quan hệ xa (Conus abbreviatus và Conus lividus) [ 30 ] Hai loài trên cùng ăn giun biển nhưng trên các đối tượng khác nhau Nhóm tác giả ghi nhận conotoxin với mức độ tương tự thấp về amino acid thực chất là sản phẩm của các loci mới phân hóa gần đây Các loci này tiến hóa rất

nhanh dưới áp lực chọn lọc ở loài ốc cối ăn cá Conus abbreviatus và tốc độ tiến hóa

của conotoxin cao hơn tất cả các protein đã được biết đến

Nghiên cứu cũng cho thấy sự nhân đôi gen (gene duplication) và đa dạng chọn lọc (diversifying selection) cho kết quả là các conotoxin với chức năng khác nhau, dẫn đến sự đa dạng sinh thái và thành công về mặt tiến hóa của giống ốc cối

Để nghiên cứu sự đa dạng của conotoxin, Espurin và cs (2001) phân tích trình

tự của δ-conotoxin từ 9 loài ốc cối dưới góc độ mối quan hệ phát sinh loài của chúng Sủ dụng trình tự 16S mt DNA, nhóm tác giả xác định δ-conotoxin (phân tích dựa trên đoạn >80) xuất phát từ 3 nhóm loài riêng biệt [ 32 ] Về mặt tiến hóa, 4 cơ chế khác nhau được cho là tác động đến sự đa dạng của δ-conotoxin (1) Sự hình thành loài mới: δ-conotoxin phân hóa từ các loài khác nhau (tỉ lệ tiến hóa của vùng khởi động của các gen đồng dạng chậm hơn vùng rRNA, vùng mã hóa độc tố tiến hóa với tốc độ nhanh hơn); (2) Sự nhân đôi gen: biến dị cùng loài của đa dạng δ- conotoxin được bắt đầu bởi quá trình nhân đôi gen, một vài trong số chúng có thể; (3) Sự tái tổ hợp: δ-conotoxin mới có thể xuất hiện từ sự tái tổ hợp của δ-conotoxin

bố mẹ; (4) Đột biến (Forcal hypermutation: Sự thay đổi đột ngột một số trình tự thường thể hiện trong δ-conotoxin đã được mã hóa Ba cơ chế đầu đã được biết đến

là nhân tố quan trọng trong quá trình tiến hóa của sinh vật, riêng cơ chế cuối cùng được cho là đặc tính quan trọng, khó giải thích và chuyên biệt cho sự đa dạng của peptide ốc cối

Trong hệ gen độc tố của ốc cối, T-superfamily là nhóm peptide lớn và đa dạng cao, phân bố rộng rãi trong tuyết độc tố của hầu hết các kiểu dinh dưỡng chính của

ốc cối Những peptide này cũng có các chức năng rất đa dạng Luo và cs (2006) đã

phát hiện 4 trình tự cDNA mới mã hóa peptide điều hòa ở Conus textile thu từ Hai

Nam (Trung Quốc) [ 61 ] Các trình tự này có chung kiểu liên kết cystein phổ biến ở T-superfamily (CC–CC, với 2 cầu nồi disulfite) Chiều dài peptide theo tính toán chỉ khoảng 9-12 amino acid TeAr193 bao gồm 9 amino acid là một trong những conotoxin ngắn nhất của T – superfamily được tìm thấy Các hình thức phân hóa trình tự và bộ ba mã hóa cys xác định các nhánh chính của T-superfamily, cho thấy các nhánh đó phân chia như thế nào Trình tự vùng tín hiệu (signal region) thể hiện mức độ bảo tồn lớn nhất, trong khi trình tự của các peptide độc trưởng thành (được

mã hóa) hoặc tương tự nhau hoặc rất đa dạng, sự bảo tồn của vùng điều hòa thì ở mức độ trung bình giữa vùng tín hiệu và vùng độc tố Các trình tự gen độc tố trên sẽ giúp cho quá trình nghiên cứu mối quan hệ giữa cấu trúc và chức năng của các peptide độc của ốc cối

2.2.6 Nghiên cứu di truyền quần thể ốc cối và động vật thân mềm

Mức độ khác biệt di truyền giữa các quần thể địa phương của các loài sinh vật biển không xương sống cung cấp bằng chứng quan trọng và gián tiếp, phản ánh mô hình và quy mô phát tán địa phương Hầu hết các loài hải sản có khả năng phát tán

ấu trùng cao cho thấy sự hạn chế trong khác biệt di truyền quần thể bởi vì sự di chuyển gen thường tương quan tích cực với khả năng phát tán [ 38 ] Trong các loài ĐVTM biển, ví dụ loài có ấu trùng phù du có mức độ di chuyển gen cao và thường

ít biểu hiện cấu trúc di truyền quần thể hơn các loài có ấu trùng không trôi nổi và khả năng phát tán thấp [ 52 ]

Duda và Lesion (2009) đã tiến hành nghiên cứu quần thể loài Conus ebraeus,

một loài ốc có vùng phân bố rất rộng ở khu vực Thái Bình Dương dựa trên gen CO1

mt DNA [ 29 ] 92 cá thể ốc cối đươc thu từ 8 vùng phân bố Tổng số 43 haplotype

đã được phát hiện bao gồm haplotype phổ biến xảy ra ở 6 trong 8 quần thể nghiên cứu Phân tích AMOVA và pairwise F cho thấy quần thể tây và trung tâm Thái Bình Dương khác biệt có ý nghĩa thống kê với quần thể đông Thái Bình Dương nhưng không thể hiện rõ cấu trúc quần thể Phân tích Bayesian isolation–migration (IM) cho thấy tây và trung tâm Thái Bình Dương phân tách từ quần thể phía đông từ kỷ

Pleistocene Sự di chuyển gen (gen flow) dọc theo vùng ngăn cách đông Thái Bình Dương được cho là xảy ra theo hướng tây

CHƯƠNG II – VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

1 ĐỐI TƯỢNG, THU MẪU VÀ PHƯƠNG PHÁP THU MẪU

1.1 ĐỐI TƯỢNG VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU

Các loài ốc cối được thu tại đảo Lý Sơn (Quảng Ngãi), Cù Lao Chàm (Quảng Nam), vịnh Vân Phong (Khánh Hòa) và vùng biển Sông Cầu (Phú Yên) từ năm

2008 – 2010

Đối tượng cho nghiên cứu mối quan hệ tiến hóa gồm: C textile, C striatus, C vexillum, C capitaneus, C litteratus, C distans, C quercinus, C magus, C arenatus, C caracteristicus, C tessulatus, C lividus, C generalis, C bandanus, C marmoreus, C betulinus, C imperialis, C varius, C lynceus, C mustelius, C leopardus, C litteratus, C achatinus, C terebra và Conus cf distans

Ốc cối Conus textile được thu ở Lý Sơn (Quảng Ngãi), Cù Lao Chàm (Quảng

Nam), Vân Phong (Khánh Hòa), Sông Cầu (Phú Yên) từ năm 2008-2010 Các mẫu được chọn cho nghiên cứu di truyền quần thể như sau: 15 mẫu từ Vân Phong (năm

2009, 2010), 10 mẫu từ Phú Yên (2010), 10 mẫu từ Lý Sơn (2008) và 5 mẫu từ Cù Lao Chàm (2008)

1.2 PHƯƠNG PHÁP THU MẪU ỐC CỐI

Mẫu ốc cối được thu 2 lần/ năm, đại diện cho mùa mưa và mùa khô (tháng 5 và tháng 10 năm 2010) tại vịnh Vân Phong (Khánh Hòa) và sông Cầu (Phú Yên) Các mẫu thu tại Lý Sơn và Cù Lao Chàm từ năm 2008 được giữ ở -800

C Mẫu được thu theo phương pháp lặn quan sát theo mặt cắt (Transect surveys) và quan sát tự do không theo mặt cắt (free-swimming observations)

Mẫu ốc cối sau khi thu được phân loại sơ bộ, đo kích thước, khối lượng và

chụp ảnh, vận chuyển nhanh về phòng thí nghiệm trong nitơ lỏng, sau đó được lưu giữ ở -700C cho các phân tích tiếp theo

2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 TÁCH CHIẾT DNA, KHUYẾCH ĐẠI VÀ GIẢI TRÌNH TỰ

Tách chiết ADN, khuếch đại gen và giải trình tự được tiến hành theo quy trình như hình 2.1 bao gồm các bước sau:

Hình 2.1: Quy trình tách chiết ADN, khuếch đại gen và giải trình tự 2.1.1 Tách chiết DNA

DNA được tách chiết từ mẫu cơ của từng cá thể ốc cối (thu trực tiếp ngoài biển, giữ trong Nitơ lỏng, sau đó được bảo quản ở -700C) bằng bộ kit WIZARD SV genomic DNA purification (Promega) theo các bước sau:

1 Cắt lớp mô cơ của ốc cối thành từng mảnh nhỏ 0,2 cm2, rửa sạch bằng cồn 700

C, tiếp tục cắt vụn mẫu trên rồi cho vào các ống Eppendorf 1,5ml đã khử trùng

2 Thêm 275µl dung dịch phá tế bào (Digestion Solution Master Mix)

3 Ủ ống mẫu qua đêm trên các block nhiệt ở 550C

Mẫu ốc cối

Tách chiết DNA

Khuyếch đại gen bằng kỹ thuật PCR

Điện di sản phẩm khuyếch đại gen

Đọc và trả lời kết quả

4 Thêm 250µl dung dịch đệm (Wizard SV Lysis Buffer) vào mỗi ống, sau đó đem vortex nhẹ

5 Hút phần dịch nổi ở mỗi ống sang các cột Wizard SV Minicolumn (được đặt trên các ống thu mẫu 1.5ml)

6 Ly tâm 13000 vòng trong 3 phút

7 Chuyển các cột Wizard SV Minicolumn sang các ống thu mẫu 1,5 ml mới

8 Thêm vào 650µl dung dịch rửa (Wizard SV Wash Solution)

9 Ly tâm 13000 vòng 2 phút, loại bỏ phần dung dịch rửa thu được

10 Lặp lại bước rửa này thêm 1 lần nữa

11 Chuyển cột Wizard SV minicolumn sang một ống Eppendorf 1,5 ml mới, sau đó thêm vào 50µl nước sạch nuclease và ủ ở nhiệt độ phòng trong 2 phút

12 Dịch chứa DNA hòa tan được thu nhận bằng ly tâm ở 13000 vòng/phút

13 Thêm tiếp 50µl nước sạch nuclease và lặp lại bước trên thêm 1 lần nữa

14 Cột Wizard SV Minicolumn được loại bỏ Dịch chiết DNA được bảo quản ở -400C cho đến khi sử dụng

2.1.2 Khuyếch đại gen

2 µl của dung dịch tách chiết được dùng cho phản ứng PCR để khuếch đại các đoạn gen 16S mtDNA (16S DNA ti thể), và CO1 mt DNA (Oxidase cytochrom c Subunit 1 củaDNA ti thể) Trình tự các đoạn mồi được trình bày ở bảng 2.1:

Bảng 2.1: Trình từ các đoạn mồi được sử dụng trong phản ứng PCR

Bảng 2.2: Chu trình nhiệt của phản ứng PCR

Các bước Chu trình nhiệt Nhiệt độ, thời gian

(Gen 16S mtDNA)

Nhiệt độ, thời gian (Gen CO1 mtDNA)

1 Biến tính ban đầu 940C trong 3 phút 950C trong 5 phút

2 Biến tính 940C trong 40 giây 940C trong 40 giây

3 Gắn mồi 470C trong 40 giây 420C trong 30 giây

4 Kéo dài chuỗi 720C trong 90 giây 720C trong 1 phút

5 Lặp lại từ bước 2 – bước 4 đến 35 lần

6 Kéo dài chuỗi cuối cùng 720C trong 5 phút 720C trong 5 phút

2.1.3 Điện di gel agarose

Chuẩn bị gel agarose:

1 Cân 0,6g agarose cho vào bình tam giác chứa 40ml TBE 0,5X Đun sôi cách thủy cho đến khi thạch tan hoàn toàn Trong quá trình đun cần lắc đều bình cho thạch tan hết

2 Lấy bình ra để nguội đến nhiệt độ khoảng 60 - 70ºC

3 Thêm vào bình 2  l ethidium bromide, lắc nhẹ bình tránh tạo bọt để trộn đều ethidium bromide vào thạch (hóa chất này độc hại cần tuyệt đối cẩn thận khi sử dụng hóa chất này)

4 Chuẩn bị khuôn đổ thạch, đặt lược 8 giếng vào khuôn, rồi đổ thạch vào khuôn

5 Để thạch nguội và đông đặc ở nhiệt độ phòng Khi thạch đặc thì gỡ lược

6 Đặt thạch vào trong máng điện di, đổ dung dịch TBE 0,5X cho ngập măt thạch Sản phẩm của phản ứng PCR được điện di kiểm tra trên gel agarose 1,5% nhuộm ethidium bromide Kết quả được ghi nhận sử dụng hệ thống ghi ảnh gel tự động Geldoc và phần mềm Quantity One (Bio-rad)

2.1.4 Giải trình tự

Sản phẩm PCR sau đó được tinh sạch bằng bộ kit PCR clean up system (Promega) như hướng dẫn của nhà sản xuất 1 – 2 µl sản phẩm đã được tinh sạch tiến hành phản ứng giải trình tự theo nguyên tắc dye-labelled dideoxy terminator (Big Dye Terminator v.3.1, Applied Biosystems) với các đoạn mồi tương tự như phản ứng PCR theo chương trình nhiệt như sau: 960

C trong 20 giây, 500C trong 20 giây, cuối cùng là 600C trong 4 phút Sản phẩm sau đó được phân tích bằng thiết bị

ABI Prism 3700 DNA analyser (Applied Biosystems) Các trình tự được kết nối bằng kỹ thuật Contig Express trong phần mềm package Vector NTI v 9

2.2 PHÂN TÍCH ĐA DẠNG LOÀI VÀ MỐI QUAN HỆ TIẾN HÓA

2.2.1 Phân tích đa dạng loài ốc cối

Các trình tự của ốc cối được kiểm chứng bằng chương trình BLAST (ancbi.nlm.nih.gov/BLAST/) Các trình tự được dóng hàng bằng phần mềm BioEdit 7.0.1, [ 37 ] sử dụng tính năng Clustax và được kiểm tra lại và chỉnh sửa bằng mắt thường

2.2.2 So sánh trình tự các loài ốc cối

Sự khác biệt di truyền của các cặp trình tự của các loài cần được so sánh tính toán theo công thức (số nucleotide khác biệt/tổng số nucleotide dóng hàng x 100%)

2.2.3 Phân tích đa dạng loài ốc cối Conus textile dựa trên hapotype

Đa dạng di truyền (Genetic diversity) giữa các quần thể được tính bằng tổng số haplotype (k), số lượng của vị trí đa hình – polymorphic sites (s), đa dạng halotype – haplotype diversity (d) và đa dạng nucleoide – nucleotide diversity (π), số đột biến (η)

2.2.4 Phân tích mối quan hệ loài bằng cây tiến hóa (phylogenetic analyst)

Các phân tích được thực hiện dựa trên tập hợp các trình tự gen 16S mtDNA và CO1mtDNA của ốc cối thu tại Lý Sơn, Cù Lao Chàm và vịnh Vân Phong trong năm

2008 và 2010, cụ thể như sau :

Dữ liệu gen 16SmtDNA bao gồm 39 trình tự của ốc cối, trong đó 26 trình tự

từ nghiên cứu hiện tại và 13 trình tự từ Genbank

Dữ liệu gen CO1 mtDNA bao gồm 45 trình tự của ốc cối, trong đó 26 trình tự

từ nghiên cứu hiện tại và 19 trình tự từ Genbank

Trình tự của 2 loài ốc thuộc họ Conoidae là Lophiotoma cerithiformis và Thatcheria mirabilis từ Genbank được sử dụng làm nhóm ngoại trong tất cả các

phân tích [ 67 ]

2.2.5 Phân tích di truyền quần thể loài Conus textile

Các phân tích được thực hiện dựa trên tập hợp các trình tự gen CO1 mtDNA

của ốc cối Conus txxtile thu tại Lý Sơn (Quảng Ngãi), Cù Lao Chàm (Quảng Nam)

Sông Cầu (Phú Yên) và vịnh Vân Phong (Khánh Hòa) từ năm 2008 đến 2010 bao

gồm 28 trình tự trong đó 24 trình tự CO1 của Conus textile từ nghiên cứu hiện tại và

2 trình tự ốc C textile từ Genbank (mã số gen AY588225 và EU812775) Trình tự của 2 loài ốc C furvus và C ammiralis từ Genbank được sử dụng làm nhóm ngoại

Phương pháp phân tích

Phân tích mối quan hệ loài bằng cây tiên hóa và đa dạng di truyền C textile

được tiến hành dựa trên 3 thuật toán parsimony (MP), maximum likelihood (ML) và Bayesain inference (BI) Các phương pháp được phân tích bằng phần mềm PAUP 4.0 [ 87 ] và MyBayes 3.1.2 [ 44 ] Đối với thuật toán MP, 1000 độ lập lại ngẫu nhiên được áp dụng Tuy nhiên với thuật toán ML, độ lặp lại là 100 vì tổng số trình tự ngiên cứu lớn Trước khi tiến hành thuật toán ML và BI, các mô hình tiến hóa đã được kiểm tra bằng phần mềm Modeltest 3.7 [ 78 ] và MrModeltest 2.2 [ 70 ] Mô hình tối ưu và các thông số cơ bản của phân tích tiến hóa ốc cối và đa dạng di

truyền Conus textile được trình bày ở bảng 2.3 và 2.4

Đối với thuật toán BI, các mô hình thay thế được tính toán Chương trình được chạy trên 4 kênh với 1 triệu thế hệ, với tần suất tính toán trên 100 thế hệ Phân tích được lặp lại 2 lần để xác định độ chính xác của phương pháp phân tích Giá trị tin cậy (posterior probability (PP) được biểu hiện trên các nhánh của cây tiến hóa [ 44 ]

Giá trị bootstrap (BT) được tính toán để xác định tính chính xác của thuật toán

MP với độ lập lại 100 Do sự hạn hẹp về thời gian và số lượng trình tự quá lớn, chúng tôi áp dụng phương pháp successive approximation approach [ 86 ] đối với thuật toán

ML, xác định cây tiến hóa dựa trên mô hình tiến hóa và so sánh kết quả thu được với phương pháp phân tích MP và ML Cây đa dạng loài được soạn thảo và trình bày bằng phần mềm TreeView 1.6.6 [ 75 ]