Nghiên cứu lựa chọn vi sinh vật probiotic tiềm năng ứng dụng trong sản xuất thức ăn chăn nuôi

16 chủng vi sinh vật probiotic bao gồm 11 chủng Lactobacillus, bốn chủng Bacillus và chủng nấm men Saccharomyces boulardii PLCP đã được nghiên cứu khả năng sinh axit theo phương pháp c

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

- -

LÊ THỊ HỒNG VÂN

NGHIÊN CỨU LỰA CHỌN VI SINH VẬT PROBIOTIC TIỀM

NĂNG ỨNG DỤNG TRONG SẢN XUẤT THỨC ĂN

CHĂN NUÔI

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Chuyên ngành: Công nghệ Thực Phẩm

HÀ NỘI, 9/2016

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

- -

LÊ THỊ HỒNG VÂN

NGHIÊN CỨU LỰA CHỌN VI SINH VẬT PROBIOTIC TIỀM

NĂNG ỨNG DỤNG TRONG SẢN XUẤT THỨC ĂN

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN 5

LỜI CAM ĐOAN 6

TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ 7

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN 9

DANH MỤC BẢNG BIỂU 10

DANH MỤC HÌNH ẢNH 11

LỜI MỞ ĐẦU 12

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 15

1.1 Giới thiệu về probiotic 15

1.1.1 Lịch Sử và định nghĩa probiotic 15

1.1.1.1 Lịch sử probiotic 15

1.1.1.2 Định nghĩa về probiotic 16

1.1.2 Vai trò và cơ chế hoạt động của probiotic 16

1.1.2.1 Vai trò của probiotic đối với vật chủ 16

1.1.2.2 Cơ chế hoạt động của probiotic 17

1.1.3 Ứng dụng của probiotic 21

1.1.3.1 Ứng dụng trong y học 21

1.1.3.2 Ứng dụng trong trồng trọt 22

1.1.3.3 Ứng dụng trong bảo vệ môi trường 22

1.1.3.4 Ứng dụng cải thiện chất lượng nước 23

1.1.3.5 Ứng dụng trong nuôi trồng thủy sản 23

1.1.3.6 Ứng dụng trong chăn nuôi gia súc và gia cầm 25

1.2 Các vi sinh vật probiotic 26

1.2.1 Vi khuẩn Bacillus 26

1.2.1.1 Đặc điểm vi khuẩn Bacillus 26

1.2.1.2 Một số đặc điểm probiotic có lợi của vi khuẩn Bacillus 27

1.2.1.3 Vai trò của vi khuẩn Bacillus đối với lợn 28

1.2.2 Vi khuẩn Lactobacillus 29

1.2.2.1 Đặc điểm vi khuẩn Lactobacillus 29

1.2.2.2 Một số vi khuẩn Lactobacillus 29

1.2.2.3 Vai trò của vi khuẩn Lactobacillus đối với lợn 32

1.2.3 Nấm men Saccharomyces boulardii 32

1.2.3.1 Đặc điểm Saccharomyces boulardii 32

1.2.3.2 Một số đặc điểm probiotic có lợi của nấm men Saccharomyces boulardii 33

1.2.3.3 Vai trò của nấm men Saccharomyces boulardii đối với lợn 34

1.3 Giới thiệu về vi sinh vật gây bệnh 34

1.3.1 Samonella 34

1.3.1.1 Đặc điểm của vi khuẩn Salmonella 34

1.3.1.2 Đặc điểm gây bệnh của Salmonella trên lợn 35

1.3.2 Staphylococcus aureus 35

1.3.2.1 Đặc điểm vi khuẩn Staphylococcus aureus 35

1.3.2.2 Đặc điểm gây bệnh của Staphylococcus aureus trên lợn 36

1.3.3 Escherichia coli 36

1.3.3.1 Đặc điểm của vi khuẩn Escherichia coli 36

1.3.3.2 Đặc điểm gây bệnh của Escherichia coli trên lợn 37

1.4 Một số nghiên cứu đánh giá in vivo về hiệu quả sử dụng hỗn hợp probiotic trên động vật thử nghiệm trong nước và nước ngoài 37

CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 40

2.1 Vật Liệu 40

2.1.1 Chủng vi sinh vật 40

2.1.2 Hóa chất – môi trường 41

2.2 Phương pháp nghiên cứu 42

2.2.1 Phương pháp bảo quản giống vi sinh vật 42

2.2.1.1 Phương pháp bảo quản trên môi trường thạch nghiêng 42

2.2.1.2 Phương pháp bảo quản trong dung dịch glycerol 10% 43

2.2.2 Phương pháp quan sát hình thái và xác định mật độ tế bào 43

2.2.2.1 Phương pháp quan sát hình thái tế bào 43

2.2.2.2 Phương pháp xác định mật độ tế bào bằng pha loãng và đếm khuẩn lạc trên đĩa thạch 43

2.2.3 Phương pháp xác định khả năng sinh axit 44

2.2.4 Phương pháp xác định khả năng sinh enzymes 45

2.2.5 Phương pháp xác định khả năng kháng khuẩn của Probiotic 45

2.2.6 Xác định khả năng sống sót của các chủng vi sinh vật probiotic trong điều kiện đường ruột 47

2.2.7 Phương pháp xác định khả năng phối hợp giữa các chủng vi sinh vật probiotic lựa chọn 47

2.2.9 Phương pháp tính toán và xử lý số liệu 48

CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 49

3.1 Đặc điểm, khả năng sinh enzyme và axit của vi sinh vật nghiên cứu 49

3.1.1 Đặc điểm của vi sinh vật nghiên cứu 49

3.1.2 Khả năng sinh enzyme của các chủng vi khuẩn Bacillus 51

3.1.3 Khả năng sinh axit của các chủng vi khuẩn Lactobacillus 52

3.2 Khả năng kháng một số vi sinh vật gây bệnh kiểm định của các chủng vi sinh vật probiotic nghiên cứu 55

3.3 Khả năng sống sót của các chủng vi sinh vật probiotic trong điều kiện đường ruột 59

3.3.1 Khả năng sống sót của các chủng vi khuẩn Lactobacillus trong điều kiện đường ruột 59

3.3.2 Khả năng sống sót của các chủng vi khuẩn Bacillus trong điều kiện đường ruột 61

3.3.3 Khả năng sống sót của S boulardii PLCP trong điều kiện đường ruột 63

3.4 Khả năng phối hợp giữa các chủng L acidophilus VAST, Bacillus sp D7 và S boulardii PLCP 64

3.4.1 Khả năng ức chế của dịch nuôi cấy đối với các vi sinh vật probiotic lựa chọn 65

3.4.2 Khả năng ức chế lẫn nhau và ức chế vi sinh vật gây bệnh của hỗn hợp vi sinh vật probiotic lựa chọn trong môi trường lỏng 66

PHẦN IV: KẾT LUẬN VÀ HƯỚNG NGHIÊN CỨU TIẾP THEO 70

KẾT LUẬN 70

HƯỚNG NGHIÊN CỨU TIẾP THEO 70

TÀI LIỆU THAM KHẢO 71

PHỤ LỤC MỘT SỐ HÌNH ẢNH ………77

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành khóa học thạc sĩ của mình, trước hết em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến PGS.TS Hồ Phú Hà – Bộ môn Công Nghệ Thực Phẩm, Viện Công Nghệ Sinh Học và Công Nghệ Thực Phẩm, Trường Đại Học Bách Khoa Hà Nội đã tin tưởng giao đề tài, tận tình chỉ bảo, hướng dẫn em trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thành luận văn

Trong thời gian học tập và nghiên cứu tại trường em được sự dạy dỗ, giúp đỡ tận tình của các thầy cô trong Viện Công Nghệ Sinh Học và Công Nghệ Thực Phẩm cũng như các thầy cô trong trường Nhân dịp này em xin được bày tỏ lời cảm ơn chân thành tới các thầy cô

Cuối cùng, em xin cảm ơn gia đình, bạn bè đã quan tâm, ủng hộ và tạo mọi điều kiện để em hoàn thành tốt luận văn này

Hà Nôi, Tháng 9 năm 2016

Học Viên

Lê Thị Hồng Vân

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan, luận văn này là kết quả nghiên cứu và làm việc của tôi, các nội dung nghiên cứu kết quả trình bày trong luận văn là trung thực, rõ ràng Nếu có bất kỳ vấn đề gì xảy ra tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm

Hà Nôi, Tháng 9 năm 2016

Tác giả luận văn

Lê Thị Hồng Vân

TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ

Đề tài: “Nghiên cứu lựa chọn vi sinh vật probiotic tiềm năng ứng dụng trong

sản xuất thức ăn chăn nuôi”

Tác giả luận văn: Lê Thị Hồng Vân Khóa: 2015B

Nghiên cứu này nhằm đánh giá và lựa chọn chủng vi sinh vật probiotic tiềm năng hướng tới ứng dụng trong sản xuất thức ăn chăn nuôi 16 chủng vi sinh vật

probiotic bao gồm 11 chủng Lactobacillus, bốn chủng Bacillus và chủng nấm men

Saccharomyces boulardii PLCP đã được nghiên cứu khả năng sinh axit theo

phương pháp chuẩn độ Therner (0

T), khả năng sinh enzyme tiêu hóa được xác định theo phương pháp chấm điểm, hoạt tính kháng khuẩn được xác định theo phương pháp khuếch tán đĩa thạch và khả năng tồn tại của các chủng vi sinh vật trong điều kiện đường ruột được xác định theo phương pháp cho vi sinh vật probiotic tiếp xúc với môi trường dịch dạ dày và ruột non giả lập và định lượng khả năng sống sót phương theo phương pháp pha loãng liên tiếp và trang đếm trên đĩa thạch

Kết quả thu được là 11 chủng Lactobacillus có khả năng sinh axit (cao nhất trong khoảng từ 18.05 – 19.04g/l) Bốn chủng Bacillus có khả năng sinh enzyme protease, chỉ chủng Bacillus sp D7 có khả năng sinh 3 loại enzyme tiêu hóa

(protease, amylase, cellulase) với đường kính vùng thủy phân từ 15.5 - 18.5mm Hoạt tính kháng khuẩn của 9/16 chủng vi sinh vật probiotic thử nghiệm đã tích cực

chống lại Salmonella Typhimurium, Staphylococcus aureus và Escherichia coli Khả năng sống sót của các vi sinh vật probiotic thử nghiệm trong điều kiện tiêu hóa giả lập là tương đối cao (trung bình đạt 80%)

Ba chủng vi sinh vật probiotic tiềm năng: L acidophilus VAST, S boulardii PLCP và Bacillus sp D7 được lựa chọn và phối hợp ở dạng lỏng vẫn đảm bảo được

khả năng sống sót và ức chế vi sinh vật gây bệnh kiểm định, điều này chứng minh tiềm năng lớn cho chế phẩm sinh học động vật và là cơ sở để thực hiện các nghiên cứu sâu hơn ứng dụng trong sản xuất thức ăn chăn nuôi

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN

NA/NB Nutrient agar/borth

MYP Mannitol Egg Yolk Polymyxin

SDA – C Sabouraud Dextrose Agar with Chloramphenicol

PCA – BCP Plate Count Agar with Bromocresol purple

BHI Brain Heart Infusion Agar

CMC Carboxymethyl cellulose

DANH MỤC BẢNG BIỂU

1 Bảng 3.1 Một số đặc điểm của vi sinh vật nghiên cứu 49 - 50

2 Bảng 3.2 Khả năng sinh enzyme của các chủng vi khuẩn

3 Bảng 3.4 Khả năng kháng một số vi sinh vật gây bệnh kiểm

định của các chủng vi sinh vật probiotic nghiên cứu

55

4 Bảng 3.5 Khả năng kháng vi sinh vật gây bệnh kiểm định của

dịch nuôi cấy vi khuẩn Lactobacillus

58

6 Bảng 3.6 Khả năng ức chế của dịch nuôi cấy đối với vi sinh

vật probiotic lựa chọn

66

DANH MỤC HÌNH ẢNH

1 Hình 1.1 Cơ chế tác dụng của vi khuẩn probiotic trên hệ thống

miễn dịch

19

2 Hình 1.2 Sơ đồ biểu diễn các phương thức hoạt động của

probiotic trong ruột

20

3 Hình 1.3 Vòng đời hình thành bào tử Bacillus 27

4 Hình 1.4 Cơ chế S boulardii chống lại vi khuẩn gây bệnh

6 Hình 3.2 Khả năng sống sót của các chủng vi khuẩn

Lactobacillus trong điều kiện đường ruột

59

7 Hình 3.3 Khả năng sống sót của các chủng vi khuẩn Bacillus

trong điều kiện đường ruột

61

8 Hình 3.4 Khả năng sống sót của S boulardii PLCP trong điều

kiện đường ruột

63

9 Hình 3.5 Hiệu quả ức chế S Typhimurium của hỗn hợp vi

sinh vật probiotic lựa chọn trong môi trường lỏng

67

10 Hình 3.6 Hiệu quả ức chế E coli của hỗn hợp vi sinh vật

probiotic lựa chọn trong môi trường lỏng

68

LỜI MỞ ĐẦU

Chăn nuôi là ngành kinh tế quan trọng của nền nông nghiệp Việt Nam và là nguồn cung cấp thực phẩm chủ yếu cho con người Đây cũng là ngành kinh tế giúp cho nông dân tăng thu nhập, giải quyết được nhiều công ăn việc làm cho người lao động Trong những năm vừa qua ngành chăn nuôi Việt Nam luôn giữ mức tăng trưởng cao do đó có tiềm năng xuất khẩu rất lớn

Tuy nhiên, ngành chăn nuôi Việt Nam đang gặp phải rất nhiều khó khăn như: rớt giá, bệnh dịch, sử dụng chất cấm và dư lượng kháng sinh, vv … Thực tế, trong quá trình chăn nuôi lợn để giảm giá thành sản xuất một số nhà chăn nuôi đã dùng chất cấm Salbutamol để tạo nạc và sử dụng thuốc kháng sinh để ngừa dịch bệnh và sử dụng thuốc kích thích tăng trưởng trong giai đoạn cuối (xuất chuồng)

Theo thống kê của Cục An Toàn Thực Phẩm – Bộ Y Tế năm 2015 thì một trong những nguyên nhân khiến các vụ ngộ độc thực phẩm ngày càng gia tăng là do các sản phẩm thịt gia súc, gia cầm không đạt tiêu chuẩn Nguyên nhân chính là trong lĩnh vực chăn nuôi việc hướng dẫn và quản lý sử dụng thuốc kháng sinh còn lỏng lẻo, dư lượng kháng sinh trong thức ăn hỗn hợp là tương đối cao Ngoài ra, những hạn chế trên của ngành chăn nuôi còn là một rào cản lớn cho các nhà sản xuất thực phẩm ở Việt Nam có thể tiếp cận xuất khẩu vào các thị trường khó tính như: Mỹ, Châu Âu, Nhật Bản Vì vậy việc tìm kiếm, áp dụng các giải pháp để hạn chế được những khó khăn ngành chăn nuôi đang phải đối mặt đã và đang thu hút được sự quan tâm của các doanh nghiệp sản xuất thực phẩm cũng như các nhà khoa học Probiotic là thức ăn bổ sung vi sinh vật có lợi ảnh hưởng đến động vật chủ bằng cách cải thiện sự cân bằng đường ruột của nó [28, 41] Phương thức hoạt động của probiotic là cạnh tranh loại trừ tức là cạnh tranh dinh dưỡng và cạnh tranh vị trí bám dính trên biểu mô ruột, qua đó tạo nên một hàng rào vật lý ngăn cản sự phát triển của các vi khuẩn gây bệnh Ngoài ra, các vi sinh vật probiotic cũng sản xuất ra các

chất có khả năng ức chế vi sinh vật gây bệnh như: axit hữu cơ, H2O2, bacteriocin, vv

… và một số loại enzyme tiêu hóa

Probiotic được bổ sung vào thức ăn chăn nuôi nhằm mục đích giảm đến mức tối thiểu sự phát tán của vi sinh vật có hại trong đường ruột, tăng khả năng tiêu hóa cho vật nuôi, hạn chế các bệnh về đường tiêu hóa và hạn chế được việc sử dụng kháng sinh góp phần làm tăng chất lượng sản phẩm vật nuôi, an toàn vệ sinh thực phẩm, nâng cao sức khỏe cộng đồng

Trên thế giới, nhiều nghiên cứu sản xuất chế phẩm vi sinh, probiotic bổ sung vào thức ăn chăn nuôi đang được phát triển mạnh mẽ do những hiệu quả to lớn của

nó trong việc tăng năng suất vật nuôi, nâng cao hiệu quả sử dụng thức ăn, hạ giá thành sản xuất và đảm bảo vệ sinh an toàn sản phẩm Nhiều loại vi khuẩn, nấm men

đã được phân lập, nuôi cấy và bào chế dưới dạng chế phẩm vi sinh, probiotic bổ sung vào thức ăn nhằm cải thiện khả năng tiêu hóa, hấp thu, nâng cao sức đề kháng

và thay thể sử dụng sáng sinh trong thức ăn chăn nuôi Bên cạnh đó thì nhiều nghiên cứu về vai trò cũng như hiệu quả của vi sinh vật trên động vật thử nghiệm như: lợn,

gà, dê, cừu, vv … đã được thực hiện và thu được kết quả ứng dụng cao

Ở Việt Nam, việc nghiên cứu sản xuất chế phẩm vi sinh, probiotic bổ sung vào thức ăn chăn nuôi bắt đầu được chú trọng và phát triển trong khoảng gần 10 năm trở lại đây Tuy nhiên, các nghiên cứu hầu như đang dừng lại ở phân lập lựa chọn chủng, các chế phẩm được sản xuất thường ở dạng đơn chủng và ít có nghiên cứu

tương tác giữa các chủng ở dạng lỏng Do vậy chúng tôi chọn đề tài: “Nghiên cứu

lựa chọn chủng vi sinh vật probiotic tiềm năng ứng dụng trong sản xuất thức

ăn chăn nuôi” nhằm lựa chọn những chủng vi sinh vật tiềm năng có đặc tính

probiotic thích hợp và nghiên cứu sự phối hợp của các chủng vi sinh vật probiotic trong cùng một chế phẩm hướng tới tạo chế phẩm probiotic cho động vật cụ thể là

sử dụng cho lợn

Mục đích của đề tài:

Lựa chọn một số chủng vi sinh vật probiotic từ bộ sưu tập sẵn có mà mỗi chủng

vi sinh vật này có ít nhất một tính chất có lợi như: sinh enzyme, sinh axit, kháng lại

vi sinh vật gây bệnh, sống sót được trong điều kiện đường ruột để ứng dụng trong sản xuất thức ăn chăn nuôi

Nội dung nghiên cứu:

Nội dung 1: Xác định khả năng sinh axit và enzyme của các chủng vi sinh vật probiotic nghiên cứu

Nội dung 2: Nghiên cứu khả năng kháng một số vi khuẩn gây bệnh của các chủng vi sinh vật probiotic nghiên cứu

Nội dung 3: Khảo sát khả năng sống sót của các chủng vi sinh vật probiotic trong điều kiện đường ruột

Nội dung 4: Nghiên cứu khả năng phối hợp giữa các chủng vi sinh vật probiotic được lựa chọn

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Giới thiệu về probiotic

1.1.1 Lịch Sử và định nghĩa probiotic

1.1.1.1 Lịch sử probiotic

Về mặt lịch sử, những nghiên cứu về probiotic bắt đầu vào đầu thế kỷ 20, năm

1906 Henry Tissier đã phát hiện và quan sát thấy trẻ em bị tiêu chảy là do trong phân của họ có một số lượng thấp các vi khuẩn đặc trưng hình trứng hoặc hình chữ

Y Những vi khuẩn này “nứt đôi” được, trái lại lại có rất nhiều ở trẻ em khỏe mạnh Ông cho rằng những vi khuẩn này có thể dùng điều trị cho bệnh nhân bị tiêu chảy

để giúp khôi phục lại hệ đường ruột khỏe mạnh [16, 38]

Năm 1907, Elie Metchnikoff - người Nga, đạt giải Nobel đã chứng minh được

rằng việc tiêu thụ Lactobacillus bulgaricus hạn chế được các nội độc tố của hệ vi

sinh vật đường ruột Ông giải thích được điều bí ẩn về sức khỏe của những người sống ở Bulgary, họ sống rất khỏe mạnh và tuổi thọ cao nguyên nhân có thể là do họ tiêu thụ một lượng rất lớn các sản phẩm sữa lên men và điều này được ông báo cáo trong sách “Sự kéo dài cuộc sống” - The Prolongation of life năm 1908 [16, 43]

Có thể nói, Tisser và Metchnikoff là người đầu tiên đưa ra những đề xuất mang tính khoa học về probiotic và làm cơ sở cho những nghiên cứu tiếp theo về probiotic [16]

Năm, 1930 Minoru Shirota phân lập được Lactobacillus casei và phát triển đồ

uống để tăng cường sức khỏe tại Nhật Bản Sau đó 5 năm, một trong các đồ uống lên men đặt tên là “Yakult” từ sữa được cho là hỗ trợ sức khỏe đường ruột được sản xuất [38]

Năm 1965, thuật ngữ “Chế phẩm sinh học” lần đầu tiên được sử dụng bởi Lilly

và Stillwell được mô tả như là các vi sinh vật thúc đẩy sự tăng trưởng của các vi sinh vật khác Chín năm sau 1974, Parker nói về một thực phẩm bổ sung cho gia súc

và mô tả probiotic là “sinh vật và các chất góp phần cân bằng vi khuẩn đường ruột” [38, 43, 46]

Ngày nay, các sản phẩm có chứa probiotic được tiêu thụ rộng rãi và phổ biến trên khắp thế giới, và được coi là những nguồn thực phẩm chính giúp tăng cường sức khỏe cho con người cũng như vật nuôi [43]

1.1.1.2 Định nghĩa về probiotic

Từ “Probiotic” được bắt nguồn từ Hy Lạp có nghĩa là “dành cho cuộc sống” Probiotic là những vi sinh vật như vi khuẩn hay nấm men mà có thể thêm vào thực

phẩm với mục đích điều chỉnh quần thể sinh vật đường ruột của sinh vật chủ [50]

Probiotic còn được định nghĩa là các vi sinh vật sống có lợi cho sức khỏe con người khi được tiêu thụ với một lượng vừa đủ [41, 46]

Năm 1989, Fuller đã chỉ ra bản chất của vi khuẩn Probiotic và định nghĩa lại là

“Probiotic là một thức ăn bổ sung vi sinh vật có lợi ảnh hưởng đến động vật chủ bằng cách cải thiện sự cân bằng đường ruột của nó” [16, 36]

Năm 1992 Havenaar đã mở rộng định nghĩa về probiotic: probiotic được định nghĩa là “sự nuôi cấy riêng lẻ hay hỗn hợp các vi sinh vật sống mà có ảnh hưởng có lợi cho sinh vật chủ bằng cách cải thiện những đặc tính của vi sinh vật bản địa” [16]

Theo định nghĩa của Tổ chức Y Tế thế giới và Tổ chức lương nông thế giới (WHO/FAO, 2001) thì probiotic là “Những vi sinh vật sống mà khi tiêu thụ vào cơ thể với một lượng đầy đủ sẽ có lợi về mặt sức khỏe cho người sử dụng” [30]

1.1.2 Vai trò và cơ chế hoạt động của probiotic

1.1.2.1 Vai trò của probiotic đối với vật chủ

Probiotic đóng vai trò tác động đến vi khuẩn đường ruột làm thay đổi cấu trúc quần thể vi sinh vật đường ruột theo chiều hướng có lợi cho vật chủ [38]

Vi khuẩn probiotic đóng vai trò điều hòa hoạt động trao đổi chất của vi sinh vật đường ruột giúp hệ vi sinh vật đường ruột phát triển bình thường, tăng cường khả năng tiêu hóa và hấp thu dinh dưỡng từ các loại thức ăn [41]

Probiotic có thể làm giảm pH của bộ phận tiêu hóa và có thể theo cách đó sẽ gây cản trở cho hoạt động tiết ra enzyme của sinh vật đường ruột và làm tăng vi khuẩn

có lợi và giảm vi khuẩn gây hại [41] Do probiotic có thể ức chế và/hoặc tiêu diệt các loại vi sinh vật có hại nhờ khả năng sinh axit và các chất kháng khuẩn khác Do

đó, làm tăng sức đề kháng và khả năng chống chịu với các điều kiện bất lợi đối với

vật nuôi, phòng chống các bệnh dịch thường gặp

Vai trò làm tăng cường khả năng miễn dịch, một số chủng probiotic được xem như một phương tiện ức chế cạnh tranh kháng viêm cho đường ruột [58]

 Đẩy mạnh sự báo hiệu cho tế bào chủ để làm giảm đáp ứng viêm

 Tạo đáp ứng miễn dịch để làm giảm dị ứng

 Cải thiện hệ vi sinh vật đường ruột, ngăn ngừa tiêu chảy và táo bón

Trong nghiên cứu về con người và động vật sơ bộ, các nhà nghiên cứu đã chứng minh hiệu quả của một số chủng vi khuẩn lactic có khả năng làm giảm nồng độ Cholesterol trong huyết thanh, làm giảm huyết áp cao [41]

Ngoài ra probiotic còn rất an toàn với động vật và thân thiện mới môi trường Probiotic là chế phẩm bổ sung vi sinh vật sống hữu ích, và khi sử dụng probiotic sẽ không tạo ra các chất tồn dư trong các sản phẩm chăn nuôi có hại cho sức khỏe người tiêu dùng

1.1.2.2 Cơ chế hoạt động của probiotic

Có rất nhiều giải thích khác nhau về cơ chế hoạt động của probiotic, phần lớn các tài liệu về probiotic đều giải thích rằng probiotic có khả năng: cạnh tranh loại trừ với các vi khuẩn gây bệnh, sản sinh ra các enzyme tiêu hóa, hấp thụ trực tiếp các chất hữu cơ hòa tan trung gian bởi các vi khuẩn, và tăng cường các phản ứng miễn

dịch chống lại các vi sinh vật gây bệnh Ngoài ra, Probiotic có khả năng kháng khuẩn và tác dụng kháng virus [34]

Khả năng cạnh tranh loại trừ là đặc tính đấu tranh sinh tồn điển hình và phổ biến của các vi sinh vật Do đó, tương tác vi sinh đóng một vai trò quan trọng trong sự cân bằng giữa các vi sinh vật có lợi cạnh tranh và vi sinh vật gây bệnh Hình thức cạnh tranh loại trừ thường thấy ở các vi sinh vật đường ruột là cạnh tranh dinh dưỡng và cạnh tranh vị trí bám dính Các vi sinh vật probiotic cư ngụ và nhân lên trong ruột, khóa chặt các vị trí thụ cảm và ngăn cản sự bám dính của các vi sinh vật

khác như: E.coli, Salmonella … Một số nấm men probiotic như: Saccharomyces

cereviese; S boulardii , … không chỉ cạnh tranh vị trí bám dính của các vi khuẩn

khác mà còn gắn kết các vi khuẩn có roi (phần lớn là những vi khuẩn gây bệnh) thông qua các cơ quan thụ cảm manose và đẩy chúng ra khỏi vị trí bám dính ở niêm mạc ruột [34]

Tuy nhiên, cạnh tranh dinh dưỡng là phương thức cạnh tranh gay gắt nhất do sự sinh trưởng và sinh sôi lớn của loài này là sự đe dọa lớn đến loài khác về nguồn cơ chất để phát triển Như vậy, cạnh tranh dinh dưỡng đóng vai trò quan trọng trong việc đảm bảo sự ổn định của hệ vi sinh vật bên trong đường ruột và bên ngoài môi trường nuôi Probiotic có khả năng cạnh tranh về mặt dinh dưỡng đối với các vi khuẩn gây bệnh và sẽ hạn chế được sự phát triển, lây lan của các chủng vi sinh vật

đó Vi khuẩn có hại bị loại bỏ có nghĩa là loại bỏ được đối thủ cạnh tranh chất dinh dưỡng và năng lượng dùng cho vi khuẩn probiotic và cho vật chủ

Khả năng tăng cường các phản ứng miễn dịch thông qua các mô bạch huyết đường ruột lớn nhất về kích thước so với các khu vực khác của cơ thể động vật chủ Chức năng của hệ miễn dịch là bảo vệ chống sự nhiễm trùng bởi các tác nhân gây bệnh nhờ đó thúc đẩy hiệu quả miễn dịch và tạo nên sự ổn định của hàng rào bảo vệ ruột

Hình 1.1: Cơ chế tác dụng của vi khuẩn Probiotic trên hệ thống miễn dịch [43]

Cơ chế tác dụng của vi khuẩn probiotic trên hệ thống miễn dịch chưa được hiểu biết đầy đủ và có một số cơ chế được trình bày bởi các hiệu ứng giả định trong điều chỉnh và đáp ứng của hệ miễn dịch Đầu tiên các tế bào vi khuẩn probiotic đi qua lớp niêm dịch đi vào trong thụ thể (TLR), sau đó đi qua các tế bào biểu mô và xuống lớp màng nhày Tại đây, probiotic tác động lên các tế bào tua (DC) được hoạt hóa và di chuyển về các mô thuộc hệ bạch huyết tìm tế bào bạch huyết (lympgo) và

tế bào này hoạt động để nhận biết các tế bào trung gian miễn dịch (T) nhằm điều hòa và kích thích các đáp ứng miễn dịch Do đó, vi sinh vật probiotic làm giảm sự bài tiết của tế bào bạch huyết tham gia vào phản ứng miễn dịch (TH1), giảm sự hoạt hóa tự nhiên được sản xuất ra bởi tế bào tua (IL12), giảm các tế bào trình bày kháng nguyên viêm e TNF và giảm Cytokine quan trọng trong hệ miễn dịch bẩm sinh TFN-  Như vậy, probiotic là một phương tiện sản sinh ra các kháng thể chống lại các tác nhân gây bệnh và đẩy mạnh sự báo hiệu cho các tế bào chủ đến làm giảm đáp ứng viêm, tạo đáp ứng miễn dịch để làm giảm dị ứng để duy trì sự cân bằng nội môi miễn dịch Vi khuẩn probiotic có khả năng huy động các tế bào miễn dịch, hoạt

hóa các đáp ứng miễn dịch thích hợp nhờ một cơ chế phức tạp bắt đầu bằng sự tương tác giữa tế bào probiotic và tế bào của hệ miễn dịch [43]

Một số vi khuẩn probiotic được coi là ứng viên có tác dụng kháng virus Mặc dù

cơ chế hoạt động kháng virus chưa được hiểu một cách đầy đủ, nhưng một số

nghiên cứu đã chỉ ra rằng các chủng Pseudomonas sp, Vibrios sp, Aeromonas sp,…

phân lập từ các trại giống cá hồi cho thấy hoạt động kháng virus chống nhiễm virus gây hoại tử tạo máu (IHNV) với hơn 50% giảm mảng bám [34]

Vi sinh vật probiotic có khả năng kháng khuẩn, làm giảm số lượng vi khuẩn gây bệnh để ngăn chặn các mầm bệnh bằng cách tiết ra các chất kháng khuẩn ức chế cả

vi khuẩn Gram dương và Gram âm Đó là các axit hữu cơ như: axit lactic, axit acetic, vv và đặc biệt là bacteriocin – nhóm peptide hay protein được tổng hợp nhờ ribosome có hoạt tính kháng vi sinh vật

Hình 1.2: Sơ đồ biểu diễn các phương thức hoạt động của Probiotic trong ruột

[43]

Cơ chế hoạt động của probiotic trong ruột dựa trên khả năng của vi khuẩn probiotic (B) để ràng buộc các mầm bệnh (C) trong tế bào biểu mô ruột (A) Hoạt động chống lại các tác nhân gây bệnh của probiotic bao gồm: sản sinh ra axit lactic

(D), làm giảm độ pH, tương tác với các chất độc được sản sinh bởi mầm bệnh (E), sản sinh ra hydro peroxide H2O2 (F) và tổng hợp bacteriocin (G) Trong vị trí tại ruột có thể được cải thiện bằng cách tăng khả năng của vi khuẩn probiotic để bám dính vào niêm mạc ruột [43]

Ngoài ra, các chủng Lactobacillus có khả năng sinh bacteriocin, là một loại

protein có khả năng tiêu diệt các vi khuẩn khác làm thay đổi tính thấm của màng tế bào, nhiều loại bacteriocin còn có khả năng phân giải AND, ARN và tấn công vào peptidoglycan để làm suy yếu thành tế bào Bacteriocin sẽ tấn công các vi khuẩn gây bệnh và ức chế sự phát triển của chúng [23]

Trong các nghiên cứu về in vitro cho thấy rằng các chủng vi khuẩn

Lactobacillus có hiệu quả trong việc loại bỏ hoặc ức chế các hoạt động của vi khuẩn

gây bệnh Probiotic sản sinh các chất chuyển hóa nhất định như axit lactic làm giảm

pH có vai trò quyết định trong việc ức chế sự phát triển của vi khuẩn gây bệnh Nhưng cũng có những trường hợp vi khuẩn gây bệnh bị ức chế không chỉ do pH mà

còn do chất kháng khuẩn tiết ra bởi vi khuẩn Lactobacillus Ngoài ra, còn tiết ra

H2O2 cũng là một yếu tố quan trọng và đã được xác định là có tác dụng ức chế sự

tăng trưởng và phát triển của E coli 0157: H7 Dịch nổi trên bề mặt sau khi ly tâm

từ môi trường có chứa L rhamnosus Lcr35 có tác dụng ức chế chín loại vi khuẩn gây bệnh: E coli (ETEC), E coli (EPEC), Klebsiella pneumoniae, Shigella flexneri,

Salmonella typhimurium, Enterobacter cloacae, Pseudomonas aeruginosa, Enterococcus faecalis và Clostridium difficile [43]

1.1.3 Ứng dụng của probiotic

1.1.3.1 Ứng dụng trong y học

Trong y học probiotic được dùng để bổ sung vào đường ruột nhằm làm sạch đường ruột, ức chế vi sinh vật gây bệnh, cân bằng hệ sinh thái của các vi sinh vật trong đường ruột, loại bỏ các quá trính lên men bất lợi do các vi sinh vật có hại gây nên, làm cho chức năng của đường ruột hoạt động tốt hơn và tăng hệ số hấp thu và

sử dụng chất dinh dưỡng trong thức ăn

Ngoài ra, các hoạt chất sinh học từ probiotic như: axit amin, các enzyme, các nucleotit, các axit nucleic, các vitamin, đặc biệt là biotin có tác dụng tăng các quá trình chuyển hóa của tế bào, kích thích và tăng cường khả năng miễn dich, tăng sức

đề kháng chống lại sự sâm nhập của vi khuẩn có hại

1.1.3.2 Ứng dụng trong trồng trọt

Chế phẩm probiotic có tác dụng với nhiều loại cây trồng bao gồm: cây lương thực, cây ăn quả, cây hoa màu, vv… và ở mọi giai đoạn sinh trưởng phát triển khác nhau Những nghiên cứu về tác dụng của probiotic với cây trồng cho thấy chúng có thể:

 Kích thích sự nảy mầm, ra hoa, kết quả và quá trình chín của quả

 Cải thiện hệ vi sinh vật của đất, ngăn chặn các mầm bệnh

 Tăng cường khả năng hấp thụ chất dinh dưỡng của cây trồng và kéo dài được thời gian bảo quản, tăng chất lượng các sản phẩm tươi sống làm cho hoa trái tươi lâu

Dùng chế phẩm probiotic trong đất có thể tái lập quần thể hệ vi sinh vật mới có lợi cho cây trồng, đặc biệt là hệ vi sinh vật vùng rễ Cây trồng sẽ phát triển tốt ở đất, nơi mà các vi sinh vật có ích chiếm vai trò chủ yếu, giúp cho cây trồng nâng cao được hiệu suất quang hợp và sử dụng phân bón, đặc biệt là phân bón hữu cơ

1.1.3.3 Ứng dụng trong bảo vệ môi trường

Do có tác dụng tiêu diệt các vi sinh vật gây thối (sinh ra các loại khí H2S, SO2,

NH3 …) nên khi phun chế phẩm probiotic vào rác thải, cống rãnh, chuồng trại chăn nuôi sẽ khử mùi hôi một cách nhanh chóng Đồng thời số lượng ruồi, muỗi, ve, các loại côn trùng bay khác giảm hẳn về số lượng, rác hữu cơ được xử lý bằng chế phẩm EM chỉ sau một ngày có thể hết mùi và tốc độ mùn hóa diễn ra rất nhanh Trong các kho bảo quản nông sản việc sử dụng chế phẩm EM có tác dụng ngăn chặn quá trình gây thối, mốc, nhiều nghiên cứu cho thấy chế phẩm EM có thể giúp cho hệ vi sinh vật tiết ra các enzyme phân hủy như: lignin peroxidase, enzyme

amylase, protease, cellulase Các enzyme này có khả năng phân hủy các hóa chất nông nghiệp còn tồn dư và thậm chí cả dioxin, ở Belarus việc sử dụng chế phẩm

EM liên tục có thể loại trừ ô nhiễm phóng xạ [49]

1.1.3.4 Ứng dụng cải thiện chất lượng nước

Chế phẩm probiotic giúp giảm nồng độ các chất hữu cơ trong nước, giảm hàm lượng BOD, giảm độc do amoni, nitrat và khí hydrosunfua, khống chế được vi khuẩn gây bệnh Các vi sinh vật trong chế phẩm probiotic có thể cải thiện chất lượng nước bởi chúng có thể sử dụng các chất hữu cơ dư thừa hoặc các chất khí như

H2S để làm chất dinh dưỡng thông qua các enzyme ngoại bào [44]

1.1.3.5 Ứng dụng trong nuôi trồng thủy sản

Chế phẩm probiotic được ứng dụng trong nuôi trồng thủy sản trong thời gian 10 năm trở lại đây và hiệu quả của việc sử dụng chế phẩm này rất tốt Hiện nay, các

loài sinh vật: Bacillus, Lactobacillus, nhóm vi khuẩn quang dưỡng … được sử dụng

chủ yếu để sản xuất các chế phẩm này Những nghiên cứu trước đây cho thấy rằng các loài vi khuẩn này không độc hại, dễ nuôi cấy, dễ tồn tại trong môi trường nước

 Cải thiện môi trường nước nuôi :

Chế phẩm probiotic được bổ dung vào môi trường nước nuôi thủy sản có tác dụng cải thiện chất lượng nước

Trong nuôi trồng thủy sản, lượng thức ăn dư thừa do động vật thủy sản hấp thụ không hết chiếm số lượng rất lớn, đây là nguyên nhân chính gây ô nhiễm môi trường nước Đặc biệt trong nuôi tôm, tôm chỉ hấp thụ được 1/3 tổng lượng dinh dưỡng đầu tư vào ao nuôi và phần còn lại bị mất vào hệ thống ao nuôi [39, 45] Hơn nữa, các chất bài tiết từ các loài thủy sản sinh vào môi trường nước chiếm khoảng 70-80% lượng protein chúng đã tiêu hóa, phần lớn trong số đó 80% ở dưới dạng dễ hòa tan trong nước, đặc biệt là amoniac [57]

Các chất thải, bao gồm: thức ăn dư thừa và các sản phẩm bài tiết có thể phì nhưỡng cho ao nuôi và kết quả là sự phát triển bùng nổ của tảo độc gây ra hiện

tượng thiếu oxy trong nước Chế phẩm probiotic được bổ sung vào môi trường nước

có chứa các vi khuẩn có khả năng sinh enzyme ngoại bào như: protease, amylase có thể phân giải các chất hữu cơ và các chất bài tiết thành CO2 và nước, chuyển các chất độc hại như: NH3, H2S, NO2- thành các chất không độc như NO3-, NH+4 giúp làm giảm mùi hôi của môi trường nước, ổn định pH và màu nước ao [6]

Ngành nuôi trồng thủy sản đang đối mặt với các loại bệnh dịch, nguyên nhân

chủ yếu là do các loại vi khuẩn Aeromonas sp, Pseodomonas sp, Vibrio sp Để hạn

chế các loại dịch bệnh này các nhà nuôi trồng thủy sản đã sử dụng kháng sinh để phòng bệnh dẫn đến việc tồn dư kháng sinh trong sản phẩm vật nuôi, chế phẩm probiotic có vai trò quan trọng đối với tốc độ sinh trưởng và khả năng kháng bệnh cho đối tượng nuôi Hiện nay, trong nuôi trồng thủy sản đã phân lập được nhiều loại

probiotic như: Carnobacterium piscicola, Latobacillus plantarum, Pediococcus

acidilactici, vv… Các chủng vi sinh vật có thể cạnh tranh vị trí bám dính và dinh

dưỡng bên trong đường ruột nhờ khả năng chịu mặn, chịu kiềm, chịu axit của đường ruột Ngoài ra, các chủng probiotic này được chú ý hơn nhờ khả năng sinh ra các chất ức chế (bacteriocin, sideropheres, lysozymes, hydrogen peroxides, …) và tổng hợp được các chất kháng sinh tương ứng như: piscocolin, plantarin, pediococin (PA -1) có tính sát khuẩn cao, đặc biệt là đối với vi khuẩn gây bệnh như:

là biện pháp tăng hiệu quả sản xuất có ý nghĩa thực tiễn [19]

Chế phẩm probiotic giúp tôm cá sinh trưởng mạnh hơn do các vi khuẩn trong chế phẩm này chính là nguồn cung cấp các enzyme tiêu hóa, một số vitamin và axit

béo có tác động tích cực đến quá trình chuyển hóa của cá tôm Nhờ đó tôm cá sẽ hấp thụ thức ăn tốt hơn, có sức chống chịu với các điều kiện môi trường và tăng sức

đề kháng

Ngoài ra, chế phẩm probiotic còn được biết đến với khả năng kháng virus, một

số nghiên cứu cho thấy các chủng vi sinh vật trong chế phẩm probiotic có khả năng kháng một số tác nhân virus gây bệnh trên động vật thủy sản, trong đó khả năng kháng virus gây bệnh trên tôm sú như IHNV và OMV Như vậy, chế phẩm probiotic còn có thể giúp cho nuôi trồng thủy sản chống chọi với tác nhân gây bệnh nguy hiểm nhất là virus

1.1.3.6 Ứng dụng trong chăn nuôi gia súc và gia cầm

Hiện nay, probiotic là một cách tiếp cận thay thế và hiệu quả để quản lý thuốc kháng sinh sử dụng cho gia súc và gia cầm, probiotic giúp cải thiện và cân bằng hệ

vi sinh vật đường ruột Khi các vi sinh vật probiotic đi vào đường ruột của vật nuôi

sẽ bám dính và xâm chiếm hệ tiêu hóa sản sinh ra nhiều axit lactic và một số hợp chất kháng khuẩn khác nhằm ức chế các vi sinh vật có hại [46]

 Sinh trưởng vật nuôi:

Một số nghiên cứu cho rằng trong thức ăn của vật nuôi, nếu cải thiện bằng cách

bổ sung probiotic vào thức ăn thông qua tỷ lệ chuyển đổi thức ăn thì sẽ có tác dụng tích cực đối với sự phát triển của vật nuôi Giúp cho vật nuôi tăng cân hàng ngày và tăng tổng trọng lượng cơ thể lợn, gà vv … [19]

 Trong sản xuất thịt:

Probiotic bổ sung vào thức ăn của vật nuôi làm tăng sản lượng thịt và khả năng giữ nước của thịt Ngoài ra, probiotic làm giảm tỷ lệ mắc bệnh và tử vong của thỏ phát triển trong giai đoạn vỗ béo [19]

 Trong sản xuất sữa:

Probiotic được bổ sung vào thức ăn của vật nuôi dưới dạng chế phẩm sinh học

có tác dụng làm tăng sản lượng sữa tiếp theo, chất béo và hàm lượng protein

Bổ sung Sacchromyces cervisiaes làm tăng sản lượng sữa ở bò sữa, chủ yếu là

do tăng số lượng vi khuẩn và làm suy thoái chất xơ cũng như những thay đổi của axit béo dễ bay hơi trong dạ cỏ [19]

 Trong sản xuất trứng:

Probiotic bổ sung vào thức ăn vật nuôi làm tăng chất lượng trứng và sản lượng trứng Ngoài ra, probiotic còn có khả năng làm giảm Cholesterol huyết tương, làm giảm ô nhiễm trứng, làm dày vỏ trứng dẫn đến tăng trọng lượng quả trứng và huyết thanh canxi [19]

1.2 Các vi sinh vật probiotic

Hiện nay, các chủng vi sinh vật probiotic thường dùng trong chăn nuôi chủ yếu

là ba nhóm: vi khuẩn Lactobacillus, vi khuẩn Bacillus và nấm men Mỗi nhóm vi sinh vật này có các đặc tính sinh học khác nhau Nhóm vi khuẩn Lactobacillus được

chú trọng đến khả năng sinh axit hữu cơ và một số chất kháng khuẩn khác, nhóm vi

khuẩn Bacillus được chú trọng đến khả năng sinh enzyme phân giải các cơ chất như

tinh bột, cellulase và kích thích tiêu hóa, nấm men được chú trọng với khả năng sản sinh một số axit hữu cơ và hấp thu chất độc cũng như cạnh tranh vị trí bám dính trên biểu mô ruột với vi sinh vật gây bệnh

1.2.1 Vi khuẩn Bacillus

1.2.1.1 Đặc điểm vi khuẩn Bacillus

Vi khuẩn Bacillus là trực khuẩn, Gram (+), đứng đơn lẻ hoặc thành chuỗi ngắn

Vi khuẩn hô hấp hiếu khí bắt buộc nhưng một số khác lại là kỵ khí, có khả năng di động, sinh bào tử hình bầu dục nhỏ hơn tế bào vi khuẩn và nằm giữa tế bào Bào tử phát triển bằng cách nảy chồi do sự nứt của bào tử, không kháng axit, có khả năng

chịu nhiệt, chịu ẩm, tia tử ngoại, tia phóng xạ Vi khuẩn Bacillus phân bố rộng rãi

trong đất, nước và không khí do chúng có khả năng hình thài nội bào tử và đời sống hiếu khí [6]

Lên men không sinh hơi các loại đường: glucose, maltose, manitol, saccharose, xylose, arabinose Kết quả các phản ứng sinh hóa: Indoli (-), VP (+), Nitrat (+), H2S (-), catalase (+), amylase (+), casein (+), có khả năng di động và hiếu khí

1.2.1.2 Một số đặc điểm probiotic có lợi của vi khuẩn Bacillus

 Khả năng tạo bào tử

Bào tử của vi khuẩn được sản sinh một cách tự nhiên và có khả năng sống sót trong điều kiện môi trường nghèo dinh dưỡng

Hình 1.3: Vòng đời hình thành bào tử Bacillus [21]

Quá trình hình thành bào tử: các vi khuẩn Bacillus xâm phập vào chu trình đảo

ngược của sự phát triển và kể từ khi bắt đầu quá trình hình thành bào tử cần 8 giờ để hoàn thành Trong điều kiện nghèo dinh dưỡng các tế bào sinh dưỡng (VC) sẽ trải qua một loạt các thay đổi về hình thái và tạo ra một tiền bào tử (F) trong tế bào mẹ của các bọc bào tử, sau 8 giờ tế bào mẹ bị teo dần và tách khỏi bào tử con (S) [6, 21]

Bản thân bào tử bị mất nước và nếu được tiếp xúc với các chất dinh dưỡng thích hợp sẽ nảy mầm trong vài phút, các bào tử này kết hợp với nước vỡ ra và loại bỏ lớp vỏ của bào tử , và tự kết nối lại thành tế bào sinh dưỡng Tùy thuộc vào loài bào

tử mà bào tử có hình cầu hoặc hình elip [21]

 Khả năng sinh enzyme tiêu hóa

Vi khuẩn Bacillus sinh trưởng và phát triển trên các môi trường dinh dưỡng có

khả năng sản sinh một số chất có hoạt tính sinh học, điển hình là khả năng sinh enzyme như: protease, amylase, cellulase, vv … Các enzyme này đóng vai trò rất lớn đối với thức ăn của động vật, do nó làm tăng khả năng tiêu hóa – đồng hóa thành phần thức ăn có nguồn gốc thực vật và động vật, nâng cao tỷ lệ chuyển đổi thức ăn và gây tăng trưởng tối ưu trên động vật [33]

 Khả năng kháng khuẩn

Bacillus có khả năng ức chế sự phát triển của vi khuẩn gây bệnh và cải thiện sức

khỏe của động vật do vi khuẩn này thường cạnh tranh với vi khuẩn gây bệnh về nguồn thức ăn, năng lượng, muối khoáng và môi trường sống Nhiều chủng vi

khuẩn B subtilis được xác định là có khả năng chế ngự mầm bào tử của nấm bằng

cách trạnh tranh dinh dưỡng

Ngoài ra, một số vi khuẩn Bacillus có khả năng sinh tổng hợp một số chất kháng

sinh như: subtilisin, gramicidin, tyrothricin, pumilin, vv … đây là các chất kháng sinh được bổ sung vào thức ăn chăn nuôi để ức chế vi khuân gây bệnh và kích thích tiêu hóa cũng như tăng trọng của vật nuôi

 Khả năng sống sót trong đường tiêu hóa

Vi khuẩn Bacillus có khả năng sống sót cao trong điều kiện axit và kiềm của hệ

tiêu hóa do vi khuẩn này có khả năng nảy mầm trong đường tiêu hóa, nhưng vẫn chưa được giải thích rõ ràng về hình thức: tế bào, bào tử hoặc cả hai [55]

1.2.1.3 Vai trò của vi khuẩn Bacillus đối với lợn

Nhiều nghiên cứu về việc bổ sung Bacillus như là một chất phụ gia bổ sung vào

thức ăn chăn nuôi đã được đánh giá về hiệu quả của nó đối với hiệu suất tăng trưởng, khả năng tiêu hóa chất dinh dưỡng, khí thải phân, thời gian tiêu thụ và lượng nước để làm sạch khu vực nuôi của lợn [60]

Bổ sung vi khuẩn Bacillus trong chế độ ăn uống của lợn có vai trò cải thiện đáng

kể sự tăng trọng lượng của cơ thể lợn trong chất khô và nitơ tiêu hóa Ngoài ra, làm giảm đáng kể lượng khí NH3 phát tán từ phân chuồng và việc giảm khí thải amoniac

có thể do khả năng tiêu hóa các chất dinh dưỡng cao bởi các enzyme tiêu hóa từ vi

khuẩn Bacillus và sản xuất phân hữu cơ thấp hơn góp phần bảo vệ môi trường Nhu

cầu về nước và thời gian sử dụng trong việc làm sạch khu vực nuôi lợn đã giảm xuống đáng kể, do đó đem lại hiệu quả kinh tế cao và làm giảm ô nhiễm môi trường [60]

Ngoài ra, quan sát thấy khi nuôi thử nghiệm với chế độ ăn uống có bổ sung chế phẩm probiotic thì chất lượng thịt của lợn cải thiện đáng kể, màu sắc cảm quan của thịt lợn tốt hơn, giảm tổn thất nhỏ giọt và tăng cường khả năng giữ nước của thịt [17]

1.2.2 Vi khuẩn Lactobacillus

1.2.2.1 Đặc điểm vi khuẩn Lactobacillus

Vi khuẩn Lactobacillus không đồng nhất về mặt hình thái Tế bào hình que, kích thước và hình dạng các vi khuẩn Lactobacillus rất khác nhau và sự thay đổi về hình

dạng hay kích thước của tế bào thường xảy ra trong quá trình sinh trưởng [6]

Vi khuẩn Lactobacillus là vi khuẩn Gram (+), không có khả năng tạo bào tử, đa

số không di động Kỵ khí bắt buộc nhưng phát triển tốt hơn trong điều kiện không

có oxy, có khả năng lên men glucose tạo axit lactic, CO2 và ethanol [46, 59]

1.2.2.2 Một số vi khuẩn Lactobacillus

 Lactobacillus acidophilus

Vi khuẩn L acidophilus được phát hiện năm 1900 bởi Ernst Moro, là trực

khuẩn, Gram (+) Có khả năng chuyển động và có khả năng lên men một số loại đường như: glucose, fructose, galactose, mannose, maltose, lactose, sacchrose để tạo thành axit lactic Không có khả năng lên men các loại đường như: xylose,

arabinose, rahamnose, glycerol, mannitol, sorbitol, dulcitol, inositol và nhiệt độ phát triển tổi ưu là 370C

L acidophilus được cho là vi khuẩn có khả năng lên men và giúp hỗ trợ tích

cực quá trình tiêu hóa thức ăn Làm giảm pH đường ruột làm tăng khả năng hấp thu các chất và canxi Sinh axit lactic làm giảm pH của dạ dày ức chế nhiều loại vi khuẩn gây bệnh đường ruột Ngoài ra vi khuẩn này còn sản sinh ra các hydrogen peroxide, bacteriocin, vv … có tác dụng kháng khuẩn

L acidophilus thường được sử dụng với vai trò điều trị và phòng ngừa rối loạn

tiêu hóa liên quan đến bệnh tiêu chảy, ngoài ra vi khuẩn này không chỉ có chức

năng tốt cho hệ tiêu hóa mà còn làm tăng khả năng miễn dịch và khả năng ức chế E

coli gây bệnh tiêu chảy ở gia súc [35]

 Lactobacillus plantarum

L plantarum là vi khuẩn Gram (+) được tìm thấy trong các hệ tiêu hóa của

người, không có khả năng di động Nhiệt độ thích hợp cho quá trình sinh trưởng phát triển là 300C, có khả năng chịu được nồng độ muối cao NaCl 5,5%

L plantarum có khả ăng sống sót trong điều kiện đường ruột tương đối cao,

nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng vi khuẩn này có tác động tích cực trên cả viêm ruột

và khả năng di chuyển tự nhiên trong đường ruột Khi phòng và trị liệu sử dụng trên

chuột thì khuynh hướng di truyền bệnh viêm ruột L plantarum làm giảm mức độ tiền viêm của các cytokine, ngoài ra L plantarum ngăn chặn sự bám dính của E

coli vào màng nhày, làm giảm độc tố do E coli tiết ra [15]

 Lactobacillus casei

L casei là trực khuẩn, Gram (+), có kích thước rất ngắn, có thể tạo thành chuỗi

Vi khuẩn này có khả năng lên men được các loại đường glucose, fructose, mannose, galactose, maltose Nhiệt độ thích hợp cho sự sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn

là 370C

Cũng giống như vi khuẩn L acidophilus, L casei có khả năng sinh axit lactic

làm giảm pH của đường ruột và ngăn cản sự phát triển của vi sinh vật có hại Có

nhiều nghiên cứu đã chứng minh việc sử dụng L casei có tác động tích cực để điều trị các bệnh tiêu chảy do ức chế các tác động gây viêm của E coli trên động vật

chủ, làm giảm nhẹ các triệu trứng và tiến triển của các bệnh nhiễm trùng đường tiêu

hóa do S aureus và S Typhimurium gây ra thông qua cơ chế kích thích hệ miễn

dịch niêm mạc

 Lactobacillus rhamnosus

Vi khuẩn L rhamnosus được phân lập và tìm ra bởi Sherwood Gorbach và Bary

Goldin, là trực khuẩn có dạng hình que, Gram (+) chủ yếu tồn tại trong hệ thống tiêu hóa của con người và cũng có thể tìm thấy trong nước tiểu Vi khuẩn này có khả năng nhóm lại trong chuỗi, không tạo bào tử và không di động

L rhamnosus được coi là một probiotic hiệu quả trong việc điều trị hoặc phòng

ngừa các bệnh tiêu hóa và nhiễm trùng, do nó có khả năng ức chế E coli và

Salmonella một trong những nguyên nhân gây bệnh tiêu chảy trên lợn Hoạt động

kháng khuẩn của vi khuẩn này có liên quan đến việc sản sinh ra các peptide kháng khuẩn hoặc các bacteriocin Các peptide này được sản sinh trong giai đoạn logarit

và cân bằng

 Lactobacillus brevis

L brevis là trực khuẩn ngắn, Gram (+), không có khả năng di động và có khả

năng lên men các loại đường như: arbinose, xylose, glucose, fructose, galactose, maltose Trong quá trình lên men ngoài tạo axit lactic vi khuẩn này còn tạo axit axetic, rượu, CO2 và tạo hương; nhiệt độ thích hợp cho sự sinh trưởng và phát triển

là 300C

L brevis được sử dụng để điều trị viêm âm đạo, nhiễm trùng đường tiết niệu, vi

khuẩn này có vai trò thúc đẩy chức năng miễn dịch tốt hơn và hỗ trợ hệ tiêu hóa L

brevis sản sinh ra axit lactic và một số hợp chất khác và có khả năng sống sót trong

điều kiện đường ruột là tương đối cao do vậy mà vi khuẩn này có thể ức chế một số

vi khuẩn gây bệnh Ngoài ra, L brevis thông qua cơ chế cạnh tranh loại trừ làm tăng

sinh và tái tạo các ống tiêu hóa trong ruột làm cho vi sinh vật có hại không có không gian để có thể bám dính trên biểu mô ruột

1.2.2.3 Vai trò của vi khuẩn Lactobacillus đối với lợn

Việc sử dụng thuốc kháng sinh để phòng tránh bệnh cho lợn không đúng cách gây ra hiện tượng kháng kháng sinh, nhờn thuốc và tồn dư lượng kháng sinh tương đối cao trong sản phẩm thịt gây mất vệ sinh an toàn thực phẩm Các nghiên cứu gần

đây cho rằng các chủng vi khuẩn Lactobacillus được bổ sung cho lợn có thể thay

thế được việc sử dụng kháng sinh [52]

Các chủng vi khuẩn Lactobacillus có thể điều chỉnh pH của dạ dày, ức chế và

tiêu diệt được các vi sinh vật gây bệnh cho động vật ở đường tiêu hóa Nhờ đó, cải thiện cân bằng vi khuẩn đường ruột cũng như điều hòa miễn dịch ở niêm mạc ruột

và duy trì chức năng rào cản đường ruột đem lại lợi ích sức khỏe cho lợn

Cơ chế có liên quan đến hiệu quả ức chế các vi sinh vật gây bệnh trong đường

tiêu hóa của động vật có thể được giải thích như sau: các vi khuẩn Lactobacillus sản

xuất ra các chất kháng khuẩn có tác dụng ức chế các sinh vật gây bệnh đường tiêu hóa và vi khuẩn có hại khác Ngoài ra, vi khuẩn này còn có khả năng cạnh tranh vị trị bám dính trên biểu mô ruột với các vi sinh vật có hại khác [32]

1.2.3 Nấm men Saccharomyces boulardii

1.2.3.1 Đặc điểm Saccharomyces boulardii

Nấm men S boulardii có hình dạng tròn, bầu dục, sinh sản bằng hình thức nảy

chồi và tạo bào tử túi, hô hấp hiếu khí tùy tiện Có khả năng lên men đường glucose, saccharose, rafinose, xylose; không lên men lactose, manitol, maltose vv… không hình thành hợp chất phân giải tinh bột

Nhiệt độ thích hợp cho sự sinh trưởng và phát triển của S boulardii là 28 –

300C, pH tối ưu cho nấm men khoảng 4,5 – 5,6 Ở pH 4 tốc độ tích lũy sinh khối

giảm, pH 3 – 3,5 sự sinh sản của nấm men ngừng lại Mức độ hấp thụ chất dinh dưỡng vào tế bào, hoạt động của hệ thống enzyme cũng như sự sinh tổng hợp probiotic đều bị ảnh hưởng bởi pH nên chất lượng nấm men sẽ giảm

1.2.3.2 Một số đặc điểm probiotic có lợi của nấm men Saccharomyces boulardii

Nấm men S boulardii được sử dụng để điều trị bệnh nhân bị kháng thuốc kháng

sinh, sự kháng thuốc này xảy ra theo cả chiều dọc và chiều ngang do việc chuyển gen giữa các vi khuẩn Hệ tiêu hóa của động vật có vú là điều kiện thuận lợi cho việc chuyển giao vật liệu di truyền giữa các loài vi khuẩn [22]

Nấm men có khả năng ức chế các vi sinh vật gây bệnh đường ruột theo ba cơ chế sau:

Hình 1.4: Cơ chế S boulardii chống lại vi khuẩn gây bệnh nhiễm trùng [22]

Hình a: Cơ chế nấm men chống lại Vibrio cholerae, S boulardii tạo ra 120 kDa

protein có tác động ảnh hướng đến niêm mạc ruột và ức chế độc tố bệnh tả (CT),

kích thích adenylate cyclase (AC) và tiết clorua, sau đó S boulardii liên kết với

(CT)

Hình b: Cơ chế nấm men chống lại E coli, S boulardii di chuyển về đường ruột

niêm mạc và làm giảm phosphoryl hóa của MLC liên quan đến sự kiểm soát của các mối nối chặt chẽ cũng như kích hoạt của MAPK và NF – JB liên quan đến sự tổng hợp của cytokine proinflammatory IL – 8 và TNF – a

Hình c: Cơ chế nấm men chống lại Clostridium difficile, S boulardii tiết ra protease (>50 kDa) có thể làm tan độc tố A, B và protein của Clostridium difficile,

ức chế con đường tín hiệu – các liên quan tổng hợp – 8 IL, S boulardii kích thích

sản xuất thuốc kháng độc A IgA

Ngoài ra, một số thử nghiệm lâm sàng kết hợp với nghiên cứu thực nghiệm về

vai trò của S boulardii chứng minh rằng S boulardii là một tác nhân sinh học có

khả năng điều trị nhằm ngăn chặn và/hoặc điều trị một số bệnh đường tiêu hóa, cụ thể là các hoạt động phòng ngừa và/hoặc điệu trị tiêu chảy có liên quan đến kháng sinh [37, 54]

1.2.3.3 Vai trò của nấm men Saccharomyces boulardii đối với lợn

Nhiều nghiên cứu đã phát hiện ra rằng S boulardii có thể làm giảm bớt những

tác động căng thẳng của lợn con trong quá trình cai sữa bằng cách thúc đẩy điều tiết phản ứng miễn dịch và có vai trò bảo vệ trên chức năng bảo vệ ruột

Các nghiên cứu thử nghiệm trên lợn con được điều trị bằng Saccharomyces

cerevisiae boulardii có khả năng làm tăng tỉ lệ tăng trọng lên 39,9% và nhờ các LPS

làm giảm tỷ lệ tử vong của lợn con đến 20% so với kiểm chứng [20]

1.3 Giới thiệu về vi sinh vật gây bệnh

1.3.1 Samonella

1.3.1.1 Đặc điểm của vi khuẩn Salmonella

Vi khuẩn Salmonella là trực khuẩn, hình que, Gram (-), không tạo bào tử Là vi

sinh vật yếm khí không bắt buộc hiện diện trong đường ruột, lông của người và động vật Chúng phát triển tốt ở nhiệt độ 60

C – 420C, và thích hợp nhất ở 35 – 370C,

ở 18 – 400 C vi khuẩn có thể sống đến 15 ngày [5]

Salmonella có khả năng tạo nội độc tố Endotoxin và tạo độc tố đường ruột

enterotoxin max ở pha cân bằng Ở 370C, pH 7 tạo độc tố cytotoxin phá vỡ tế bào giúp vi khuẩn xâm nhập vào cơ thể nhanh chóng Hiện nay đã tìm thấy hơn 2000

chủng Salmonella: có nhóm gây bệnh cho người (S typhi, S paratyphi, S

paratyphic), nhóm gây bệnh cho động vật (S.gallinarum thường có ở gà, S.dublin có

ở mèo, S abortus có ở ngựa, S choleraesuis có ở lợn) và nhóm gây bênh cho cả

người và động vật[8]

1.3.1.2 Đặc điểm gây bệnh của Salmonella trên lợn

Salmonella thường gây ra các bệnh như: thương hàn, phó thương hàn và bệnh

bạch lỵ trên gia súc và gia cầm Hai chủng điển hình gây bệnh cho lợn là S

cholerasuis và S Typhimurium, bệnh xảy ra ở mọi lứa tuổi của vật nuôi nhưng phổ

biến nhất là ở lợn con theo mẹ, lợn con sau cai sữa và lợn đang phát triển từ 12 – 14 tuần tuổi [11]

Bệnh xảy ra ở lợn dưới hai dạng cấp tính và mãn tính:

Cấp tính: xảy ra trên lợn con theo mẹ với các triệu chứng như: tiêu chảy phân vàng, nhiều nước, sốt (400C – 410C) Sau vài ngày vi khuẩn thâm nhập vào phổi gây viêm phổi, có thể xuất huyết ở vùng da mỏng, sau 5 -6 ngày mắc bệnh Lợn con suy nhược nặng, nằm liệt và có thể bị co giật nhẹ rồi chết, tỷ lệ chết có thể lên đến 100%

Mãn tính: thường xảy ra ở lợn lớn, bệnh tích trên lợn con: thành ruột dày, chứa nhiều chất nhày, niêm mạc ruột bong róc, xuyết huyết nhiều nơi, màng treo ruột sưng và xuất huyết, phổi có khi viêm và xuất huyết

1.3.2 Staphylococcus aureus

1.3.2.1 Đặc điểm vi khuẩn Staphylococcus aureus

S aureus là vi khuẩn Gram (+), các tế bào thường liên kết với nhau thành

hình chum nho Là vi sinh vật yếm khí tùy tiện, ít hoặc không cạnh tranh với các vi khuẩn khác như vi khuẩn lactic Không di động và không tạo bào tử, có pH khá rộng trong khoảng 4 – 9,8; khoảng pH tối ưu là 6 – 7, bị kìm hãm ở pH < 4,8 và có khả năng sống ở nồng độ muối cao khoảng 9 -10% Nhiệt độ thích hợp nhất cho sự phát triển là 370C và có thể tồn tại 16 giờ ở 600C, pH 7,3 [5]

Tạo enterotoxin chịu nhiệt tốt (600C trong 26 giờ): Tổng hợp bên trong tế bào khi vi khuẩn còn sống, chỉ tiết ra ngoài và gây độc khi tế bào đã chết, thường bền nhiệt, độc tính yếu và tạo ngoại độc tố tổng hợp bên trong tế bào và thải ra ngoài môi trường Có bản chất protein, dễ bị mất họat tính do nhiệt, axit, có độc tính mạnh

và ngoại độc tố loại α phân giải hồng cầu, β thoái hóa và tiêu diệt tế bào

1.3.2.2 Đặc điểm gây bệnh của Staphylococcus aureus trên lợn

S aureus thường gây ra các bệnh viêm da ở lợn và chủ yếu là ở lợn dưới 8 tuần

tuổi, vi khuẩn này sau khi xâm nhập vào cơ thể lợn thường làm tổn thương da và gây: viêm da, nhiễm trùng và nặng có thể dẫn đến các biến chứng khác hoặc giết chết lợn

Bệnh viêm da thưởng xảy ra khi có điều kiện thuận lợi vi khuẩn sẽ nhân lên và tấn công lợn Đầu tiên, nó gây sưng, viêm, loét lớp biểu bì của da sau đó lan xuống lớp thượng bì và làm viêm loét nang lông làm cho tuyến bã nhờn của nang lông tiết

ra nhiều quá mức và kết hợp với dịch nhờn tiết ra từ những vết loét sẽ làm cho tổn thương lây lan càng nhanh và loét càng nặng

Khi dịch tiết trên bề mặt da khô lại, làm cho da bị co rút và hình thành nên các vết nứt sâu và ngày các lan rộng và tại các vết loét dịch rỉ viêm tiết ra càng nhiều thì tình trạng mất nước, mất điện giải và mất protein huyết thanh càng nặng Ngoài ra, khi vi khuẩn này tấn công vào lợn thì nó sẽ tiết ra độc tố tấn công vào gan và thận gây ra những tổn thương cho cơ quan này

1.3.3 Escherichia coli

1.3.3.1 Đặc điểm của vi khuẩn Escherichia coli

E coli là vi là trực khuẩn, Gram (-), kích thước trung bình 2 – 3µm Trong điều

kiện không thích hợp vi khuẩn có thể rất dài như sợi chỉ và rất ít chủng E coli có vỏ nhưng hầu hết có lông và có khả năng di động Ngoài ra, một số chủng E coli còn

tạo ra các enterotoxin mạnh: nội độc tố - tổng hợp bên trong tế bào và chỉ tiết ra ngoài và gây ngộ độc khi tế bào đã chết

1.3.3.2 Đặc điểm gây bệnh của Escherichia coli trên lợn

E coli được xem là vi sinh vật hiện diện trong ruột động vật, được thải ra ngoài

theo đường phân nên rất dễ gặp trong đất và nước Khả năng gây bệnh của E.coli rất

đa dạng và phong phú, vi khuẩn này thường gây ra các bệnh tiêu chảy cho động vật

với các triệu chứng khác nhau, điển hình là lợn nguyên nhân do E coli là vi khuẩn sống thường trực trong đường ruột của lợn và trong nguồn nước bị nhiễm E coli Vi

khuẩn này có khả năng gây bệnh khi sức đề kháng của con vật giảm sút, thường gây bệnh trên lợn mới sinh, lợn sau cai sữa

Trên lợn thịt thường nhiễm bệnh khi thay đổi nguồn thức ăn hoặc do nước uống

bẩn Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng các trường hợp tiêu chảy ở lợn con là do E

coli gây ra Do tính chất đề kháng cao với nhiều loại kháng sinh nên việc sử dụng

kháng sinh để kiểm soát E coli trở nên kém hiệu quả

Ở lợn mới sinh, bệnh có thể xuất hiện phổ biến ở lợn từ 1 – 10 ngày tuổi làm lợn lười bú, tiêu chảy phân lỏng, phân từ màu vàng chuyển sang màu nâu, cơ thể bị mất nước, ủ rũ, lông xù, đi xiêu vẹo, niêm mạc mắt nhợt nhạt, mắt có gỉ và đôi khi bị sưng, suy yếu và chết trong vòng vài ngày sau khi xuất hiện các triệu chứng tiêu chảy

Ở lợn cai sữa, bệnh có thể xuất hiện sau 5 – 10 ngày do thay đổi khẩu phần ăn,

vi khuẩn E coli bám vào thành ruột tích tụ và phát triển nhanh chóng gây cản trở sự

hấp thu dinh dưỡng, đồng thời tiết ra độc tố về đường ruột gây ra tiêu chảy Lợn biếng ăn, suy yếu, còi cọc, đi phân lỏng và chết do mất nước (tỷ lệ tử vong có thể lên đến 50%)

1.4 Một số nghiên cứu đánh giá in vivo về hiệu quả sử dụng hỗn hợp probiotic

trên động vật thử nghiệm trong nước và nước ngoài

Thí nghiệm được thực hiện trên đàn lợn lai D x YL sau cai sữa từ 28 – 56 ngày

với các khẩu phần bổ sung probiotic (gồm Bacillus subtillis, Lactobacillus spp., S

cerevisiae với số lượng 1010 CFU/g cho mỗi loại vi sinh vật, bổ sung vào thức ăn với liều 200 – 300 g/tấn); bổ sung kháng sinh (chứa 10% avilamycin, bổ sung với