Nghiên cứu lên men 1,3 propanediol từ glycerol thô

Đã có một vài chiến lược được đưa ra dựa trên sự chuyển hóa hóa học và sinh học để biến đổi glycerol thô thành các sản phẩm có giá trị hơn.. Sử dụng phương pháp lên men gián đoạn và lên

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

-

BẢN TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Đề tài Nghiên cứu lên men 1,3 propanediol từ glycerol thô

Họ và tên học viên: Nguyễn Thu Quỳnh Lớp : CNSH 2009

Chuyên ngành : Công nghệ sinh học

Hà Nội – Năm 2011

TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ

Đề tài: Nghiên cứu lên men 1,3 propanediol từ glycerol thô

Tác giả luận văn: Nguyễn Thu Quỳnh Khóa: CNSH 2009

Người hướng dẫn: GS Madalena Alves

PGS.TS Tô Kim Anh

Nội dung tóm tắt:

a) Lý do chọn đề tài

Hai thập niên vừa qua đã chứng kiến sự phát triển mạnh mẽ của nền kinh tế trên thế giới, cùng lúc đó sự phát triển mạnh mẽ này cũng dẫn đến nhu cầu sử dụng năng lượng mạnh mẽ chưa từng có Việc đảm bảo nguồn năng lượng dài hạn thay thế năng lượng hoá thạch ngày càng trở nên cấp thiết, nhất là khi dầu mỏ đang cạn dần và trở nên đắt đỏ Hiện nay biodiesel là nguồn nhiên liệu triển vọng, có khả năng thay thế hoàn toàn cho nguồn dầu mỏ hóa thạch, 100% biodiesel có thể sử dụng trong các động cơ diesel mà gần như không cần phải sửa đổi động cơ, hệ thống nhiên liệu và chỉ

có một chút ảnh hưởng đến hiệu suất của động cơ Quá trình sản xuất biodiesel là một quá trình đơn giản, sử dụng các phản ứng hóa học ở điều kiện nhiệt độ và áp suất vừa phải, có thể được sản xuất từ các nguồn nguyên liệu dầu thực vật khác nhau Tuy nhiên một trong những vấn đề được đặt ra liên quan đến quá sản xuất biodiesel, là glycerol- sản phẩm phụ được coi là “luồng chất thải” và tốn chi phí cho quá trình xử

lý vứt bỏ nó trong sản xuất biodiesel Cứ mỗi 100 lít biodiesel sản xuất nhờ quá trình chuyển hóa dầu thực vật hay mỡ động vật thì sinh ra 10 lít glycerol thô (10%)

Đã có một vài chiến lược được đưa ra dựa trên sự chuyển hóa hóa học và sinh học để biến đổi glycerol thô thành các sản phẩm có giá trị hơn Đó chính là lý do cho sự hình thành đề tài này

b) Mục đích nghiên cứu của luận văn, đối tượng, phạm vi nghiên cứu

Mục đích của đề tài là sử dụng vi sinh vật có trong bùn hoạt tính từ nước thải nhà

máy bia hay hỗn hợp bùn hoạt tính và Clostridium pasteurianum, bằng phương pháp

lên men gián đoạn và lên men liên tục để kiểm tra khả năng chuyển hóa glycerol thô thành các hợp chất hóa học có giá trị như 1,3 propanediol, butanol

c) Tóm tắt cô đọng các nội dung chính và đóng góp mới của tác giả

- Khảo sát khả năng chuyển hóa glycerol của bùn hoạt tính và chủng C.pasteurianum

ATCC

- Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng tới khả năng chuyển hóa glycerol của bùn hoạt tính và

C.pasteurianum ATCC

- so sánh khả năng chuyển hóa trong kỹ thuật lên men gián đoạn và liên tục

d) Phương pháp nghiên cứu

Sử dụng phương pháp lên men gián đoạn và lên men liên tục để khảo sát khả

năng chuyển hóa glycerol của hỗn hợp bùn hoạt tính và C.pasteurianum ATCC 6013,

phân tích các sản phẩm tạo thành sử dụng các phương pháp sắc kí lỏng cao áp, sắc kí khí Kiểm tra sự có mặt của chủng hoạt động nhờ kĩ thuật PCR và DGGE,

e) Kết luận

Đề tài đã rút ra được một số kết luận như sau:

1 Các vi sinh vật có trong bùn từ nước thải của nhà máy bia có khả năng chuyển hóa hoàn toàn glycerol thô lên đến nồng độ 25g/l thành các sản phẩm có giá trị như butanol, 1,3 propanediol bằng phương pháp lên men gián đoạn và lên men liên tục Lượng 1,3 propanediol thu được bằng hai phương pháp lên men gián đoạn và liên tục

là khoảng 10g/l hay 0,45 g/ g glycerol

2 Bổ sung axit butyric vào môi trường lên men có ảnh hưởng đến quá trình chuyển hóa của bùn hoạt tính và lượng butanol sinh ra tăng lên 3 lần so với môi trường lên men không được bổ sung axit butyric

3 C.pasteurianum ATCC 6013 có khả năng chuyển hóa hoàn toàn glycerol thô

lên đến nồng độ 25g/l bằng phương pháp lên men gián đoạn

4 Hỗn hợp gồm hệ bùn hoạt tính và C.pasteurianum ATCC 6013 có khả năng

chuyển hóa 25g/l glycerol thô thành các sản phẩm có giá trị như butanol, 1,3 propanediol Trong đó có một lượng đáng kể butanol sinh ra so sánh với lên men chỉ

có bùn hoạt tính hoặc C.pasteurianum ATCC 6013

5 Ethanol và butanol chỉ xuất hiện trong thiết bị lên men liên tục gồm hệ bùn hoạt

tính và C.pasteurianum ATCC 6013, và biến mất theo thời gian và thu được duy nhất

axit n-butyric, khoảng sản lượng khoảng 6 g/l ở hai thiết bị lên men liên tục

Hà Nội, ngày 10 tháng 6 năm 2011

Người hướng dẫn

PGS.TS Tô Kim Anh

Mục lục

Trang phụ bìa Trang

LỜI CẢM ƠN - 3

LỜI CAM ĐOAN - 4

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VIẾT TẮT - 5

DANH MỤC CÁC BẢNG - 6

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ - 7

LỜI MỞ ĐẦU - 8

PHẦN I - 9

TỔNG QUAN - 9

I.1 Nhiên liệu sinh học và nhu cầu phát triển - 9

I.2 Glycerol thô, phụ phẩm của quá trình sản xuất biodiesel - 10

I.3 1,3 propanediol và các ứng dụng - 12

I.4 Chuyển hóa glycerol thành 1,3 propanediol nhờ vi sinh vật - 13

I.5 Con đường chuyển hóa glycerol thành 1,3 PDO ở Clostridia. - 15

I.6 Các phương pháp khác sản xuất 1,3 propanediol - 17

I.7 Ảnh hưởng của các điều kiện quá trình tới sự lên men 1,3 PDO bởi Clostridia - 20

PHẦN II - 24

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU - 24

II.1.Vật liệu - 24

II.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU - 25

II.2.1 Chuẩn bị vật liệu cấy - 25

II.2.2 Khảo sát khả năng chuyển hóa glycerol sử dụng bùn hoạt tính trong lên men gián đoạn - 25

II.2.3 Khảo sát khả năng chuyển hóa glycerol sử dụng bùn hoạt tính trong lên men liên tục trong thiết bị Expanded Granular Sludge Blanket (EGSB) - 27

II.3 Phương pháp phân tích - 28

II.3.1 Phân tích các sản phẩm lên men. - 28

II.3.2 Kiểm tra sự có mặt của chủng ATCC 6013 trong hệ bùn - 29

PHẦN III - 32

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN - 32

III.1 Khảo sát các điều kiện chuyển hóa glycerol nhờ bùn hoạt tính trong lên men gián đoạn - 32

III.2 Khảo sát các điều kiện chuyển hóa glycerol nhờ canh trường hỗn hợp bùn hoạt tính

và C.pasteurianum ATCC 6013 trong lên men gián đoạn. - 35

III.3 Khảo sát khả năng chuyển hóa glycerol nhờ quá trình lên men liên tục - 39

III.4 Kiểm tra sự có mặt của C pasteurianum ATCC 6013 trong hệ bùn lên men liên tục 41 PHẦN IV - 44

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ - 44

IV.1.Kết luận - 44

IV.2 Kiến nghị - 45

TÀI LIỆU THAM KHẢO - 46

PHỤ LỤC - 49

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt quá trình thực hiện đề tài tốt nghiệp, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu s ắc tới giáo sư Madalena Alves, nghiên cứu sinh Roberto Andres Gallardo Marusich, phòng thí nghiệm Ứng dụng công nghệ sinh học cho môi trường, Khoa Công nghệ sinh học, trường đại học Minho, Bồ Đào Nha đã hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình nghiên cứu Tôi cũng xin cảm ơn PGS.TS Tô Kim Anh, phòng Hóa sinh, Viện Công nghệ sinh học- Công nghệ thực phẩm, trường đại học Bách Khoa Hà Nội đã đóng góp bản viết luận văn của tôi

Bên cạnh đó, tôi xin cảm ơn các thầy cô thuộc Viện Công nghệ sinh học- Công nghệ thực phẩm đã giúp đỡ và dạy bảo tôi rất nhiều trong quá trình học tập

Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn tới những người thân trong gia đình và bạn bè đã luôn khuyến khích và động viên tối trong suốt quá trình học tập cũng như thời gian thực hiện đề tài

Hà nội ngày 15 tháng 6 năm 2011

Học viên

Nguyễn Thu Quynh

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu luận văn khoa học của tôi Các kết quả nghiên c ứu trong luận văn hoàn toàn trung t hực, các kết quả, số liệu tính toán đƣợc là hoàn toàn chính xác và chƣa đƣợc công bố ở bất kì công trình nghiên cứu nào khác

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VIẾT TẮT

STT Kí hiệu Tên đầy đủ

High performance liquid chromatography Kilo bazo (1kb= 100 bp)

Propanediol Phosphoenolpyruvate Phosphate buffered saline Tris- boric acid- EDTA

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1 Các chủng có khả năng lên men 1,3 propanediol từ glycerol Bảng 2 Môi trường lên men

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ

Hình I.1 Các con đường tạo biodiesel từ dầu thực vật và chất béo động vật

Hình I.2 Con đường chuyển hóa glycerol nhờ vi sinh vật

Hình I.3 Qúa trình chuyển hóa glucose thành glycerol

Hình II.1 Thiết bị Expanded Granular Sludge Blanket (EGSB)

Hình III.1 Sản phẩm lên men thu nhận khi chuyển hóa 5-25g/l glycerol thô chuyển

Hình II I.6 Sản phẩm chuyển hóa glycerol nhờ quá trình lên men liên tục

Hình III.7 Hình ảnh điện di trên gel agarose của các mẫu từ hai thiết bị R1 và R2 Hình III.8 Kết quả DGGE thu được từ các mẫu

LỜI MỞ ĐẦU

Hai thập niên vừa qua đã chứng kiến sự phát triển mạnh mẽ của nền kinh tế trên thế giới, cùng lúc đó sự phát triển mạnh mẽ này cũng dẫn đến nhu cầu sử dụng năng lượng mạnh mẽ chưa từng có Việc đảm bảo nguồn năng lượng dài hạn thay thế năng lượng hoá thạch ngày càng trở nên cấp thiết, nhất là khi dầu mỏ đang cạn dần và trở nên đắt đỏ rước tình hình này, các nước có nhu c ầu cao về năng lượng như Mĩ, Trung Quốc, Ấn Độ, Brasil… đang cố gắng đa dạng hóa nguồn và chủng loại năng lượng, đ ặc biệt là hướng tới việc phát triển các nguồn năng lượng thay thế, trong đó có năng lượng sinh học

Hiện nay biodiesel là nguồn nhiên liệu triển vọng, có khả năng thay thế hoàn toàn cho nguồn dầu mỏ hóa thạch, 100% biodiesel có thể sử dụng trong các động cơ diesel mà gần như không cần phải sửa đổi động cơ, hệ thống nhiên liệu và chỉ có một chút ảnh hưởng đến hiệu suất của động cơ Quá trình sản xuất biodiesel là một quá trình đơn giản, sử dụng các phản ứng hóa học ở điều kiện nhiệt độ và áp suất vừa phải, có thể được sản xuất từ các nguồn nguyên liệu dầu thực vật khác nhau Tuy nhiên một trong những vấn đề được đặt ra liên quan đến quá sản xuất biodiesel,

là glycerol- sản phẩm phụ được coi là “luồng chất thải” và tốn chi phí cho quá trình

xử lý vứt bỏ nó trong sản xuất biodiesel Cứ mỗi 100 lít biodiesel sản xuất nhờ quá trình chuyển hóa dầu thực vật hay mỡ động vật thì sinh ra 10 lít glycerol thô (10%)

Đã có một vài chiến lược được đưa ra dựa trên sự chuyển hóa hóa học và sinh học để biến đổi glycerol thô thành các s ản phẩm có giá trị hơn Phương pháp chuyển hóa sinh học đã giúp cái thiện những bất lợi khi sử dụng xúc tác hóa học ( như là tính đặc hiệu cho sản phẩm kém, phải sử dụng nhiệt độ và áp suất cao, không thể sử dụng nguồn glycerol thô khi bị nhiễm tạp cao….) Đó chính là lý do cho sự hình thành đề tài này

Mục đích của đề tài là khảo sát khả năng sử dụng vi sinh vật có trong bùn

hoạt tính từ nước thải nhà máy bia hay hỗn hợp bùn hoạt tính và Clostridium

pasteurianum ATCC 6013, bằng phương pháp lên men gián đoạn và lên men liên

tục để kiểm tra khả năng chuyển hóa glycerol thô thành các hợp chất hóa học có giá trị như 1,3 propanediol, butanol

PHẦN I TỔNG QUAN

I.1 Nhiên liệu sinh học và nhu cầu phát triển

Hai thập niên vừa qua đã chứng kiến sự phát triển mạnh mẽ của nền kinh tế trên thế giới, cùng lúc đó sự phát triển mạnh mẽ này cũng dẫn đến nhu cầu sử dụng năng lượng mạnh mẽ chưa từng có Phần lớn năng lượng hiện nay có nguồn gốc từ các nhiên liệu đốt cháy, một dạng nhiên liệu gây ô nhiễm, không tái chế được và có hạn Các hội nghị Quốc tế hay khu vực trong thời gian qua đã đề cập rất nhiều đến vấn đề an ninh năng lượng Việc đảm bảo nguồn năng lượng dài hạn thay thế năng lượng hoá thạch ngày càng trở nên cấp thiết, nhất là khi dầu mỏ đang cạn dần và trở nên đắt đỏ Sự gia tăng dân số, tăng trưởng kinh tế, gia tăng năng lượng phục vụ đời sống ngày một cao kéo theo nhu cầu về năng lượng ngày càng tăng, dẫn đến tình trạng môi trường tự nhiên ngày một xấu đi Hiện tượng khí hậu toàn cầu đang nóng dần lên là một trong những thách thức lớn nhất của toàn nhân loại trong thế kỷ này

Hiện nay, nhu c ầu về năng lượng tái sinh đang ngày càng tăng cao Nguyên nhân cơ bản là nguồn năng lượng chính là dầu mỏ đã bước vào những giai đoạn khai thác cuối, được dự đoán là còn khai thác được khoảng 40 năm nữa Giá dầu mỏ trên Thế giới luôn chịu nhiều bất ổn trước các kì biến động kinh tế, chính trị, xã hội

và quân sự nào liên quan tới các nước xuất khẩu dầu mỏ Các nước xuất khẩu dầu

mỏ cũng thường sử dụng con bài này trong chính sách đối ngoại của mình Bên cạnh đó, do đặc điểm tự nhiên, các nguồn khí thải sinh ra từ quá trình đốt cháy dầu

mỏ cũng được coi là một trong những nguyên nhân chính gây ra ô nhiễm môi trường

Ba tổ chức hàng đầu Thế giới chuyên cung c ấp các số liệu tham khảo nhạy cảm về trữ lượng dầu mỏ của Thế giới là BP Statistical Review, USGS (United States Geological Survey) và Oil and Gas Journal đều cho rằng với mức khai thác như hiện nay thì trong vòng 40 năm tới nguồn cung dầu mỏ của Thế giới sẽ hết BP Statistical Review đưa ra con số khoảng 1148 tỉ thùng (tương đương 157 tỉ tấn),

USGS ước tính khoảng 1000 tỉ thùng, còn Oil and Gas Journal ước tình khoảng

1265 tỉ thùng Ngoài trữ lượng đã ước tính được này, USGS cho rằng còn có kho ảng 140 tỉ tấn dầu mỏ còn chưa được phát hiện, tức là Thế giới cũng sẽ có thêm kho ảng 40 năm nữa để dùng dầu mỏ, nhưng với tốc độ khai thác như hiện nay thì những con số này quả thực là rất nhỏ nhoi

Trước tình hình này, các nước có nhu cầu cao về năng lượng như Mĩ, Trung Quốc, Ấn Độ, Brasil… đang cố gắng đa dạng hóa nguồn và loại năng lượng, đặc biệt là hướng tới việc phát triển các nguồn năng lượng thay thế, trong đó có nhiên liệu sinh học

Nhiên liệu sinh học bao gồm: dầu thực vật, bioethanol, biodiesel, biobutanol, khí sinh học, dimetyl ether (DME), ethyl tertiary butyl ether (ETBE) và các s ản phẩm từ chúng…

Biodiesel là một nhiên liệu sinh học có khả năng thay thế hoàn toàn cho nguồn diesel hóa thạch, 100% biodiesel có thể sử dụng trong các động cơ diesel mà gần như không c ần phải sửa đổi động cơ, hệ thống nhiên liệu và chỉ có một chút ảnh hưởng đến hiệu suất của động cơ Quá trình sản xuất biodiesel là một quá trình đơn giản, sử dụng các phản ứng hóa học ở điều kiện nhiệt độ và áp suất vừa phải, có thể được sản xuất từ các nguồn nguyên liệu dầu thực vật khác nhau (Hình I.1a)

Bởi các ưu diểm của biodiesel và chính sách phát triển, sản lượng biodiesel trên thế giới đã tăng lên đáng kể trong những năm gần đây, tăng từ 280 triệu lít năm

2005 lên đến hơn 950 triệu lít trong năm 2006 và vượt quá 1150 triệu lít trong năm

2007 Dự kiến là tổng công suất sản xuất biodiesel ở Mỹ lên đến 7,5 tỷ lít vào năm

2009

I.2 Glycerol thô, phụ phẩm của quá trình sản xuất biodiesel

Một trong những vấn đề hiện gặp phải liên quan đến quá sản xuất biodiesel

là việc tạo ra glycerol- sản phẩm phụ chủ yếu trong quá trình sản xuất biodiesel Với các nhà s ản xuất biodiesel, glycerol thô sinh ra trong suốt quá trình sản xuất biodiezel là một sản phẩm phụ gây trở ngại đối với tài chính và môi trường (hình

1a) Cứ mỗi 100 lít biodiesel sản xuất nhờ quá trình chuyển hóa dầu thực vật hay

mỡ động vật thì sinh ra 10 lít glycerol thô (10%) Glycerol thô sinh ra trong quá trình sản xuất biodiezel có chứa các muối, kim loại nặng, rượu cồn chưa tinh sạch, nên chúng c ần phải được tinh s ạch trước sau đó mới có thể sử dụng trong các ngành sản xuất truyền thống (Hedtke, D 1996)

Hình I.1 Các con đường tạo biodiesel từ dầu thực vật và chất béo động vật

Sự phát triển như vũ bão của công nghiệp biodiesel đã tạo ra một lượng lớn glycerol và kết quả là giá c ủa lo ại nguyên liệu thô này giảm một cách nhanh chóng xuống 10 lần trong vòng 2 năm (Hình I.1b) Sự tác động tiêu c ực của giá glycerol được minh chứng rõ hơn trong chính ngành công nghiệp biodiesel Trước kia nó được xem như là một phụ phẩm mong muốn, đóng góp một giá trị kinh tế đáng kể khi sản xuất biodiesel, thì nay glycerol thô l ại được coi là “luồng chất thải” và tốn chi phí cho quá trình xử lý vứt bỏ nó Về cơ bản, nếu như glycerol vẫn có giá như năm 2004 (hình 1b) thì giá trị của của nó sẽ mang tới lợi nhuận gấp 3 lần so với hiện tại Như vậy phát triển sản xuất để chuyển glycerol thô thành sản phẩm có giá trị hơn vừa là nhu cầu cấp thiết vừa là “cơ hội mục tiêu” cho sự phát triển của chế biến sinh học

Có nhiều phương pháp chuyển hóa glycerol thô thành các s ản phẩm có giá trị gia tăng cao trong đó phương pháp chuyển hóa sinh học glycerol đã giúp cái thiện những bất lợi của các phương pháp hóa học (tính đ ặc hiệu cho sản phẩm kém, phải

sử dụng nhiệt độ và áp suất cao, không thể sử dụng nguồn glycerol thô khi bị nhiễm tạp cao….), trong khi nó có thể tạo ra cơ hội tổng hợp được một chuỗi nhiều loại sản phẩm có giá trị

I.3 1,3 propanediol và các ứng dụng

1,3 propanediol (1,3 PDO) là một trong sản phẩm lên men lâu đời được biết đến và được áp dụng rộng rãi trong công nghiệp, ví dụ như keo dán, chất phủ, polyester béo, chất chống đông 1,3 PDOlà chất không màu, vị hơi ngọt và là một chất lỏng nhớt

1,3 PDO được biết đến lần đầu tiên vào năm 1881 bởi August Freund trong

lên men glycerol bởi hỗn hợp vi sinh vật có chứa Clostridium pasteurianum Do có

hai nhóm hydroxyl ở vị trí 1, 3 nên PDO được sử dụng trong sản xuất polyester và nhựa phân hủy sinh học, lợi thế của các polyester này so với polyhydroxy alkanoate hay polyactide (hai polymer phân hủy sinh học từ các nguồn tái tạo) là tính chất vật

lý có thể dễ dàng thay đổi để đáp ứng sản xuất các sản phẩm nhựa mong muốn (Bio Mat Item, 2000)

Polytrimethylene teraphthalate (PTT) được sản xuất dựa trên acid terephthalic và 1,3 PDO, là một polyester thơm, kết hợp các đ ặc tính tuyệt vời như

có khả năng đàn hồi tốt và có khả năng kháng khuẩn, quá trình sản xuất thân thiện với môi trường PTT được sử dụng trong ngành s ản xuất thảm (Chuah, 1996), dệt may (Brown và Chuah, 1997), phim ảnh hay các hộp đóng gói (Hwo và các cộng sự, 1999) Dupond, công ty phát minh ra nylon, đã nghiên cứu nhiều năm phát triển sản xuất thành công một loại polymer dựa trên 1,3 PDO s ản xuất từ đường ngô, một nguồn nguyên liệu tái tạo Ngoài các ưu điểm như mềm mại, màu sắc sống động, đàn hồi, kháng khuẩn, các hàng dệt may được sản xuất từ polymer này có kích thước của vật liệu có nguồn gốc tự nhiên

1,3 PDO còn được sử dụng trong đạn đ ạo và máy bay chiến đ ấu Đạn đạo polymer được làm từ các vật liệu trong suốt mà thành phần có thể thay đổi để chống tác động và tia UV Polymer có nguồn gốc từ 2,2,4,4- tetramethyl-1-3 cyclobutanediol, dimethyl terephthalate và 1,3 PDO được sử dụng trong chống tác động của mắt kính, ống kính, và kính kiến trúc

1,3 PDO cũng có thể được sử dụng như một chất diệt sinh vật, ví dụ như PCT 3015, với chi phí thấp và hiệu quả cao Bên c ạnh đó, 2 bromo-2 nitro- 1,3 PDO được sử dụng trong phòng ngừa các ô nhiễm sinh học trong công nghiệp, hệ thống điều hòa không khí và độ ẩm (Zeng và Biebl, 2002)

I.4 Chuyển hóa glycerol thành 1,3 propanediol nhờ vi sinh vật

Mặc dù có rất nhiều sinh vật có khả năng chuyển hóa glycerol trong điều kiện hiếu khí (Booth I, 2005) nhưng chỉ có một vài loài vi sinh vật có khả năng lên men glycerol Quá trình lên men chuyển hóa glycerol đã được nghiên c ứu rất cụ thể

đối với một vài loài thuộc nhóm Enterobacteriaceae như Citrobacter freundii và

Klebsiella pneuminiae Sự khác nhau về glycerol ở các loại vi sinh vật này là mối

liên kết chặt chẽ với khả năng tổng hợp sản phẩm có tính khử cao 1,3-propanediol (1,3-PDO) (Bouvet và các cộng sự, 1995)

Theo con đường oxi hóa, glycerol bị khử hydro bởi một NAD-liên kết với enzyme glycerol dehydrogenase (glyDH) tạo thành dihydroxyacetone (DHA), DHA

được photphoryl hóa bởi enzyme DHA kinase thành dihydroxyacetone phosphate,

và tiếp tục thủy phân thành các axit hữu cơ, ethanol, 2,3 butanol, CO2 và H2

Theo con đường khử, glycerol bị khử hydro bởi enzyme glycerol dehyratase hoặc diol dehyratase thành 3-hydroxypropionaldehyde (3-HPA) Sau đó 3-HPA sẽ chuyển thành 1,3 PDO nhờ enzyme 1,3 propanediol dehydrogenase (PDODH) hoặc 1,3 propanediol oxidoreductase (PDOR) và hình thành NAD(P) (Lin,E.C.C, 1976)

Hình I.2 Con đường chuyển hóa glycerol nhờ vi sinh vật

Chỉ có Enterobacteriaceae được ghi nhận là có thể phát triển trong môi

trường glycerol và sinh ra 1,3 –PDO nhờ gly DH lẫn 1,3-PDODH (Bouvet OM và

loài Enterobacte, Clostridium, Lacbabacillus và Bacillus cũng được ghi nhận là có

khả năng lên men glycerol theo kiểu 1,3-PDO phụ trợ Điều cần thiết để thực theo đường hướng 1,3-PDO là trạng thái khử cao của cacbon trong glycerol

Một vài nghiên cứu đã chỉ ra rằng quá trình lên men chuyển hóa glycerol xảy ra khi không có sự tổng hợp 1,3-PDO Ví dụ, các nhà nghiên c ứu đã tìm ra r ằng

Eschirichia coli có khả năng lên men glycerol khi những điều kiện thích hợp được

duy trì gồm có pH axit, tránh tích t ụ khí hydro trong quá trình lên men và các thành

phần môi trường thích hợp ( R Gonzalez et al., và các cộng sự, 2006) Một hệ thống

enzyme ho ạt hóa formate hydrogen-lyase đã được xác định là một nhân tố cần thiết cho quá trình lên men glycerol Trong những nghiên cứu gần đây, các nhà khoa học

đã chứng minh được rằng sự trong chuyển hóa glycerol, việc sử dụng glycerol làm nguồn cacbon cho tổng hợp sinh khối tế bào sẽ song song với quá trình chuyển hóa

(R Gonzalez et at., chưa công bố) Mặc dù sự lên men 1,3-PDO từ glycerol đã được ghi nhận ở một số chủng của Propionibacterium (Bories A và các cộng sự, 2004) và

Anaerobiossprillum (Lee PC và các cộng sự, 2001) cơ chế và các đường hướng

trung gian giữa sự khác nhau trong việc biến đổi glycerol của các vi sinh vật khác nhau này vẫn chưa được khám phá

I.5 Con đường chuyển hóa glycerol thành 1,3 PDO ở Clostridia

Clostridia được sự chú ý nhiều trong những năm gần đây vì khả năng lên

men butanol và aceton cho mục tiêu phát triển biobutanol hoặc sản xuất dung môi

Ngoài ra do Clostridia còn được quan tâm do có khả năng tạo ra hệ các enzym có

khả năng thủy phân cellulose bao gồm α-amylase -glucosidase, glucoamylase, pullulanase, và amylopullulanase-amylase, α-glycosidase (Durre, 2008)

Quá trình lên men 1,3 propanediol của Clostridia hai giai đoạn: giai đoạn sinh axit và giai đoạn sinh dung môi Giai đoạn sinh axit ở Clostridia là quá trình

điển hình của lên men butyrate khi phát triển trên tinh bột hoặc đường Các sản phẩm chính là butyrate (butyric acid), acetate (axit axetic), carbonic và hydrogen Ethanol và aceton được tạo thành với lượng nhỏ Việc tạo ra các axit làm giảm pH môi trường và không phù hợp cho vi khuẩn , làm giảm mật độ tế bào (xảy

ra ở giai đoạn cuối pha tăng trưởng và kết thúc giai đoạn tạo axit) và bắt đầu của

giai đoạn tạo dung môi Việc chuyển hóa butyrate và acetate thành các dung môi làm tăng pH, tạo thuận lợi hơn cho các tế bào Tuy nhiên, dung môi cũng là chất độc đối với các tế bào Các dung môi ảnh hưởng tới protein màng tế bào và phá hủy các màng của tế bào Vì vậy, thường giữ một giới hạn về nồ ng độ dung môi trong dịch lên men, khoảng 2% (Durre, 2008) để đảm bảo an toàn cho tế bào

Bảng 1 Các chủng có khả năng lên men 1,3 propanediol từ glycerol

(Thomas Willke và Klaus Vorlop,2008)

Nhiều nghiên cứu đã được thực hiện để chuyển hóa glycerol nhờ Clostridium

Phần lớn nghiên cứu đã tập trung vào việc tối ưu hóa việc chuyển đổi glycerol thành 1,3 propanediol, một sản phẩm chính của quá trình lên men glycerol ở loài này Các

chủng C butylicum (Forberg C, 1987), C pasteurianum (Biebl, H, 2001),

C.butyricum (Heyndrickx và các cộng sự, 1991) có khả năng sử dụng glycerol như

nguồn cacbon trong điều kiện lên men yếm khí để sản xuất các sản phẩm lên men như 1,3 propanediol, aceton, butanol, ethanol

Các cải tiến qúa trình chuyển hóa bao gồm dừng ho ạt động cuả aldehyde dehydrogenase (Zhang YP và các cộng sự 2006) và biểu hiện các gen dha (Zheng P

propanediol Mặt khác ngoài củng cố quá trình, ngoài cải tạo chủng sản xuất, các nghiên cứu còn tập trung làm sạch cơ chất, phụ gia môi trường, nghiên c ứu các nhân tố ức chế phát triển (Lin Rh và các cộng sự, 2005) Một số nghiên cứu đ ã thu được 100g/lít 1,3 propanediol (Yang G và các cộng sự, 2007).Ngoài việc thu được 1,3 PDO bằng cách sử dụng các vi khuẩn này lên men glycerol cũng thu được

butanol (C pasteurianum) với lượng lớn nhất là 17g/l

I.6 Các phương pháp khác sản xuất 1,3 propanediol

Chuyển hóa glucose thành glycerol

thể được sản xuất theo con đường kỵ khí chuyển đổi các cơ chất hữu cơ khác Việc

sử dụng các nguồn nguyên liệu thay thế là rất quan trọng trong quy mô công nghiệp

Các loài nấm men biến đổi glucose thành glycerol theo con đường

Embden-Mayerhof-Parnasthường được sử dụng cho s ản xuất glycerol là S.cerevisiae,

S.rouxii, T.magnoliae, Candida glycerinogenes và P.farinosa (Shuge và cộng sự,

2001) Nhìn chung, s ản lượng glycerol thu được không đáng kể và quá trình lên men chuyển hóa glucose thành glycerol là một quá trình độc lập, không có lợi ích

về kinh tế

Hình I.3 Qúa trình chuyển hóa glucose thành glycerol

Lên men hai giai đoạn

Lên men hai giai đoạn 1,3 PDO được thực hiện bằng chủng C.freundii (Boenigk và

các cộng sự, 1993), qúa trình lên men được thực hiên bằng hai giai đoạn liên tiếp Ở thùng lên men đầu tiên, sinh khối được hoạt hóa trong điều kiện glycerol bị giới hạn,

ở thùng lên men thứ hai, tốc độ pha loãng được giảm dần để tăng sản lượng 1,3 PDO, lượng 1,3 PDO lớn nhất thu được là 1,38 g/L/h Papanikolaou và các cộng sự

(2000) sử dụng phương pháp lên men hai giai đoạn bằng C.butyricum để tạo ra 1,3 PDO và cho hiệu quả cao hơn C.freundii, là 3,4g/L/h

Ưu điểm của phương pháp này là kiểm soát được điều kiện lên men ở từng giai đoạn và tính linh động của việc sử dụng cơ chất và sản xuất các sản phẩm khác nhau

Haynie và Wagner (1996) đã sử dụng phương pháp lên men hai giai đoạn bằng kết hợp các chủng vi sinh vật khác nhau, chuyển hóa glucose thành glycerol và sau đó chuyển hóa glycerol thành 1,3 PDO

Đồng lên men

Phương pháp đồng lên men là lên men hỗn hợp glycerol và các loại đường thành 1,3 PDO để làm giảm chi phí của quá trình lên men Luthi- Peng và các cộng sự (2002) đã nghiên cứu ảnh hưởng của glucose trong quá trình chuyển hóa glycerol

của Lactobacillus.reutri ATCC 1603 Trong môi trường lên men 200 mM glycerol

và 100 mM glucose, sản lượng 1,3 PDO thu được là 27,02 mM, và trong môi trường không có glucose thì sản lượng 1,3 PDO thu được là 4,61 mM, kết quả thu được cho thấy glucose có ảnh hưởng đáng kể đến quá trình chuyển hóa glycerol

Phương pháp đồng lên men còn được nghiên cứu với E.coli, không có khả

năng chuyển hóa glycerol thành 1,3 PDO (Cameron và các cộng sự, 1998) Tong

và Cameron (1992) nghiên c ứu về E.coli được biến đổi với các gen dha của

K.pneumoniae có khả năng đồng lên men glycerol và glucose Sản lượng 1,3 P DO

được tăng từ 0,46 mol/ mol glycerol lên 0,63 mol/ mol glycerol và glucose, 0,55 mol/mol glycerol và xylose

Điều kiện vi hiếu khí

Thông thường quá trình tổng hợp 1,3 PDO được thực hiện trong điều kiện yếm khí Ở điều kiện hiếu khí, glyceol có thể chuyển thành 3 HPA, gây độc với tế

bào (Slininger và Bothast, 1985) Tuy nhiên K.pneumoniae có thể sản xuất 1,3 P DO

(Cheng và các cộng sự, 2003) với sản lượng từ 0,8- 1,57 g/L/h trong điều kiện vi hiếu khí Nghiên cứu đã chỉ ra rằng O2 như chất nhận điện tử ngo ại bào, có thể làm tăng sản lượng 1,3 PDO Hao và các cộng sự (2008) đưa ra báo cáo về sản xuất 1,3

PDO trong điều kiện hiếu khí bằng 8 chủng khác nhau của Citrobacter và

Klebsiella, quá trình lên men hiếu khí có thể làm giảm giá thành của sản xuất và

giảm sự tích lũy của HPA

Sử dụng các chủng kháng

Qúa trình lên men glyceol thường có hiệu quả không cao do ức chế của cơ

chất, sản phẩm ho ặc cả hai, ví dụ như C.butyricum bị ức chế ở 1053 mM glycerol

và 788 mM 1,3 PDO (Biebl, 1991) Tuy nhiên có một số vi khuẩn có khả năng phát triển các cơ chế cho phép đáp ứng lại các ức chế này Bằng phương pháp chọn lọc,

các chủng đột biến của C.butyricum DSM 5431 có khả năng chuyển hóa hơn 44 %

glycrol và s ản xuất hơn 50 % 1,3 PDO so với chủng ban đầu (Abbad- Andaloussi và

các cộng sự, 1995) C.butyricum E5 được phân lập bởi Petitdemange và các cộng sự (1995) chỉ bị ức chế 66% ở 200 g/l glycerol còn C.buyricum DSM 5431 bị ức chế

hoàn toàn

Kỹ thuật di truyền

Ứng dụng các kỹ thuật di truyền có thể làm nâng cao khả năng sản xuất 1,3 PDO của các chủng Ví dụ như đưa các gen có thể chuyển hóa đường thành glycerol hoặc trực tiếp thủy phân đường vào một chủng sản xuất 1,3 PDO từ glycerol (Sprenger và các cộng sự, 1989) hoặc đưa các gen có thể chuyển hóa glycerol thành 1,3 PDO vào các chủng có khả năng chuyển hóa đường thành glycerol hoặc vào chủng thông thường không có khả năng chuyển hóa glycerol thành 1,3 PDO Một phương pháp khác là đưa các gen có hai khả năng trên vào chủng hoàn toàn không

có khả năng chuyển hóa đường thành glycerol và glycerol thành 1,3 PDO

I.7 Ảnh hưởng của các điều kiện quá trình tới sự lên men 1,3 PDO bởi

Clostridia

Ảnh hưởng của pH

pH của môi trường lên men đóng vai trò quan trọng trong quá trình lên men

pH của môi trường là yếu tố quan trọng cho quá trình hoạt động của vi sinh vật và quá trình lên men Sự thay đổi pH sẽ làm ảnh hưởng đến quá trình phát triển và hoạt động của vi sinh vật cũng như các sản phẩm cuối cùng của quá trình lên men Các nghiên cứu trước đây đã chỉ ra pH của môi trường lên men đóng vai trò quan trọng trong quá trình lên men Aceton- Ethanol- Butanol (Huang và các cộng sự 2004,

Tashiro và các cộng sự 2004)

Như đã đề cập ở trên, quá trình lên men 1,3 PDO ở Clostridia bao gồm hai giai

đoạn, ở giai đoạn sinh dung môi, các axit hữu cơ hình thành trước đây sẽ được chuyển thành các dung môi, điều này làm tăng pH của dịch lên men Các nghiên cứu của Bahl (1982) và Ennis (1987) đã công bố sự sinh các axit hữu cơ tăng lên ở điều kiện pH cao hơn trong khi đó các dung môi hầu như sinh ra ở điều kiện pH thấp hơn và sự bổ sung các axit hữu cơ có thể ngăn ngừa sự thoái hóa c ủa Clostridia trong lên men ABE

Do vậy việc bổ sung các axit hữu cơ như axit butyric giúp duy trì môi trương lên men có pH thấp và làm thay đổi quá trình chuyển hóa từ sinh axit sang sinh dung môi và sau đó là làm tăng sản lượng dung môi sinh ra Tuy nhiên, dải pH phù hợp với việc hình thành dung môi thì phụ thuộc vào từng chủng và điều kiện môi trường lên men được sử dụng

Theo như báo cáo của Bahl và các cộng sự (1982), Tashiro và các cộng sự (2004),

bổ sung các axit hữu cơ như axit butyric hay axit acetic vào các môi trường của C

acetobutylicum, C.beijerinckii và C.saccharoperbutylacetonicum N1-4 làm tăng

sản lượng các dung môi trong quá trình lên men Ví dụ như sản lượng butanol tăng

từ 0,1g/ g glucose lên 0,42 g/ g glucose khi môi trường được bổ sung 5g/l axit butyric (Tashiro và các cộng sự, 2004)

Ảnh hưởng của sản phẩm axit thu được

Sự sinh ra ATP nhờ lên men đòi hỏi phải sử dụng các hợp chất hữu cơ như là chất nhận electron cuối quá trình, và sự giảm các axit hữu cơ giàu năng lượng sinh

ra như là sản phẩm trao đổi chất cuối là nhờ vào đăc tính gây độc tự nhiên tới tế bào của axit Ở dạng phân ly, các axit hữu cơ như là acetate và butyrate có khả năng tham gia vào c ấu trúc màng tế bào và hoạt động như là một móc nối cho phép proton từ môi trường đi vào tế bào (Huesemann và các cộng sự, 1986) Khi nồng độ của các axit dạng phân ly cao tới mức đáng kể, nó gây ra sự sụt giảm gradient pH dọc theo màng tế bào, điều này gây ra sự ức chế toàn bộ các chức năng trao đổi chất trong tế bào (Herrero và các cộng sự, 1985) Ở nồng độ thấp hơn, sự tích tụ của sản phẩm axit cuối và kết hợp với sự giảm pH gây ra sự giảm lũy tiến trong mật độ phát triển cho tới khi sự phát triển của tế bào bị tạm dừng hoàn toàn, mặc dù sự sử dụng

cơ chất và trao đổi của tế bào vẫn còn tiếp tục Đã có đề xuất là sự thay thế quá trình

sản xuất hòa tan trong C acetobutylicum và những chủng liên quan để đáp ứng

thích nghi của tế bào tới các yếu tố ức chế sinh ra do các sản phẩm axit cuối quá trình (George và các cộng sự, 1983) Sự thay thế cho quá trình s ản xuất bằng các dung dịch hòa tan xuất hiện để tạo khả năng ho ạt động như một cơ chế khử độc nhằm cho phép tế bào trách các tác động ức chế có thể xuất hiện khi các s ản phẩm

có tính axit cuối đạt tới mức độ gây độc Sự bắt đầu của quá trình s ản sinh dung môi thường kết hợp với sự giảm pH của môi trường và liên quan tới sự tích tụ của axit ở cuối quá trình s ản xuất Dưới những điều kiện này sẽ có càng nhiều axit tồn tại dưới dạng phân ly xuất hiện Ở pH 6.0, chỉ có 6% tổng lượng axit butyric ở dạng phân ly, trong khi ở pH 4.5 dạng phân ly của axit này chiếm tới 66% Gottchal và Morris (1981) chỉ ra rằng nếu cho thêm acetate và butyrate (đạt nồng độ 10 mM) vào canh

trường lên men với chủng C acetobutylicum với pH duy trì ở 5.0 sẽ tạo cảm ứng

cho việc sinh ra dung môi hòa tan, nó kèm theo s ự giảm mật độ phát triển đặc trưng

và mật độ sản phẩm H2 Kết quả tương tự thu được trong các thí nghiệm khác với C

acetobutylicum, và C beijerinckii Holt và các cộng sự (1984) đã chứng minh rằng

sản xuất dung môi có thể được cảm ứng trong canh trường nuôi C acetobutylicum

với pH duy trì ở mức 7.0 khi mà môi trường được cung cấp nồng độ cao acetate và

butyrate Trong lên men lien t ục ở độ pH thấp thích đáng, việc cung cấp thêm butyrate cũng gây ra biến đổi sinh dung môi (Martin, J.R và các cộng sự, 1982) Monot và các cộng sự (182) chỉ ra rằng, khi nồng độ của axit butyric dạng phân ly đạt tới mức 0.5-0.8 g/lít thì sự phát triển của tế bào bị ức chế và cảm ứng tạo dung môi xảy ra khi nồng độ của dạng phân ly của axit này đ ạt mức 1.5-1.9 g/lít Tuy nhiên, những nhà nghiên cứu này cũng báo cáo rằng sự phát tiển của tế bào và sự sự sản sinh axit bị ức chế khi nồng độ dạng phân ly của axit butyric ở mức 0.2-0.4 g/lít,

và sự sinh dung môi được khởi động khi nồng độ này đạt 0.5-1.5 g/lít (180, 181)

Sự tạo thành axit butyric dừng khi nồng độ dạng phân ly của axit này đạt tới 1.7-1.9 g/lít (161) Tuy nhiên mối quan hệ chặt chẽ giữa nồng độ dạng phân ly c ủa axit butyric trong môi trường ngoài và cảm ứng sinh ra dung môi chưa được kiểm soát ở các hệ thống thử nghiệm khác (67, 99) Monot và cộng sự (1982) đã sử dụng chất

ức chế đặc hiệu liên kết trên màng ATPase để làm giảm pH nội bào, do đó làm tăng nồng độ của axit dạng phân ly trong tế bào Chất này đã tỏ ra có hiệu quả trong việc giảm nồng độ sinh khối tối đa và nâng cao hiệu quả sản xuất dung môi Ảnh hưởng của acetate và butyrate trong việc cảm ứng tạo dung môi cũng được nghiên cứu với phương pháp lên men liên tục, là phương pháp cho phép mức độ dị hóa là nhanh hay chậm nhờ vào sự thay đổi lượng đường cung cấp (Fond và các cộng sự, 1986)

Ở mức độ dị hóa chậm việc bổ sung acetate hay butyrate hay c ả hai hợp chất giúp nâng cao mức độ chuyển hóa sản xuất dung môi bằng nhân tố lên gấp 10 đến 20 lần, nhưng yêu cầu mức độ axit cao hơn nhiều lần so với canh trường với mức độ dị hóa nhanh Trong lên men lien t ục với mức độ dị hóa cao, axit được tái đồng hóa ở nồng

độ thấp và được khuyến cáo là canh trường với tốc độ dị hóa nhanh cacbonhydrat sẽ

tích tụ axit nội bào với nồng độ cao hơn (Fond và các cộng sự, 1986)

Ảnh hưởng của cơ chất

Sự ảnh hưởng giới hạn của chất dinh dưỡng vào lúc bắt đầu và duy trì quá trình sản xuất dung môi đã được chứng minh ở lên men gián đoạn và lên men liên tục Trong lên men gián đoạn (Long và các cộng sự, 1984) và lên men liên t ục (Bahl

H, 1984), duy nhất axit được sản xuất khi nguồn cacbon bị giới hạn Trong lên men gián đoạn, khi glucose ở nồng độ khoảng 7g/lít chưa đạt tới mức nồng độ yêu cầu

để bắt đầu sinh dung môi, kết quả tương tự thu được với phương pháp lên men liên tục

Ảnh hưởng giới hạn của N chưa được sáng tỏ Trong nghiên cứu về ảnh hưởng của N giới hạn trong lên men gián đoạn, Long và các cộng sự quan sát được rằng khi nồng độ NH3 giảm đến một mức làm lượng sinh khối sẽ bị giảm, lượng đường chuyển hóa cũng giảm và còn dư lại trong quá trình lên men Ở nồng độ NH3thấp (9 mM), dưới 1/3 lượng đường có trong môi trường được tiêu thụ và tế bào không thể bắt đầu tạo ra được dung môi Việc mất khả năng sinh dung môi ở điều kiện này xuất hiện bởi không đạt được ngưỡng nồng độ cho phép của sản phẩm axit

Ảnh hưởng của nhiệt độ

Thông thường các vi sinh vật ở điều kiện yếm khí thường hoạt động ở hai giải nhiệt độ: từ 35- 37°C ( mesophilic) và dải nhiệt độ từ 55- 60°C ( themophilic) Các vi sinh vật mesophilic được sử dụng để sản xuất dung môi tránh sự thất thoát dung môi ở nhiệt độ cao, trong khi đó, các vi sinh vật thermophilic được sử dụng

trong lên men biogas (J.Mata- Alvarez, 2000)