Nghiên cứu hoàn thiện và ứng dụng kỹ thuật đánh giá tác động hoạt hóa in vitro tế bào lympho người của một số chế phẩm sinh học

Dưới quan điểm miễn dịch CD cũng là kháng nguyên của tế bào mang nó, còn về mặt phân loại thì CD giúp ta phân biệt giai đoạn của một lympho T, đồng thời phân biệt các nhóm T khác nhau… C

-

HOÀNG THỊ HUYỀN TRANG

NGHIÊN CỨU HOÀN THIỆN VÀ ỨNG DỤNG KỸ THUẬT ĐÁNH GIÁ

TÁC ĐỘNG HOẠT HÓA IN VITRO TẾ BÀO LYMPHO NGƯỜI

CỦA MỘT SỐ CHẾ PHẨM SINH HỌC Chuyên ngành: Công nghệ sinh học

LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

1 TS Lê Văn Đông

2 GS.TS Đặng Thị Thu

Hà Nội – Năm 2012

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan rằng luận văn này là kết quả nghiên cứu do bản thân tôi thực hiện cùng với sự cộng tác của các đồng nghiệp Những số liệu và kết quả trình bày trong luận văn là hoàn toàn trung thực, khách quan và không vi phạm bản quyền của bất kỳ tác giả nào khác

Học viên

Hoàng Thị Huyền Trang

LỜI CẢM ƠN

Trước tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất tới TS.BS Lê Văn Đông, phó chủ nhiệm bộ môn Miễn dịch, Học viện Quân Y, GS.TS Đặng Thị Thu – Giảng viên cao cấp - Viện Công Nghệ sinh học & Công Nghệ Thực Phẩm -Trường Đại Học Bách Khoa Hà Nội đã tận tình hướng dẫn, góp ý và động viên cũng như tạo điều kiện thuận lợi về cơ sở vật chất, phòng thí nghiệm cho tôi trong quá trình thực hiện luận văn tốt nghiệp này

Trong quá trình thực tập và thực hiện đề tài tại phòng thí nghiệm, tôi đã nhận được sự hướng dẫn và giúp đỡ nhiệt tình của Ths Đỗ Minh Trung và toàn thể cán

bộ nhân viên phòng thí nghiệm miễn dịch - Trung tâm nghiên cứu ứng dụng sinh y dược học, Học viện Quân Y, nhân dịp này tôi muốn gửi lời cảm ơn chân thành nhất

vì sự giúp đỡ quý báu đó

Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn đến Viện Công nghệ sinh học & Công Nghệ Thực Phẩm, Viện đào tạo sau đại học – Đại học Bách Khoa Hà Nội, đặc biệt là các thầy, cô giáo đã dạy dỗ và chỉ bảo tôi nhiều kiến thức và kinh nghiệm quý báu trong quá trình học tập giúp tôi hoàn thành luận văn này

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới gia đình, bạn bè, đồng nghiệp cơ quan công tác Khoa Vi sinh Y học, Bệnh viện 103 đã luôn bên cạnh động viên, chia sẻ những khó khăn và tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp tôi hoàn thành khóa học và thực hiện tốt luận văn tốt nghiệp này

Xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày tháng năm 2012

Học viên

Hoàng Thị Huyền Trang

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ADN Acid Deoxyribo Nucleic

AIDS Acquired Immune Deficiency Syndrome

Hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải APC Antigen Prensenting Cell

Tế bào trình diện kháng nguyên

CMI Cell Mediated Immunity

Đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào

CD Cluster of Differentiation

Cụm biệt hóa CSF

Colony stimulating factor Yếu tố kích thích tạo colony tế bào (bào lạc)

CSIF Cytokine synthesis inhibitor factor

Yếu tố ức chế tổng hợp cytokine DMSO Dimethyl Sulphoxide

ĐƯMD Đáp ứng miễn dịch

FCS Fetal bovine serum

Huyết thanh bê bào thai FDA Food and Drug Administration

Cục quản lý dược phẩm và thực phẩm Mỹ GM-CSF Granulocyte monocyte colony stimulating factor

Yếu tố kích thích tạo colony bạch cầu hạt đơn nhân

HIV Human immunodeficiency virus

Virus gây suy giảm miễn dịch ở người

IL-2R Interleukin-2 receptor

Tế bào giết được hoạt hóa bởi lymphokine MHC Major Histocompatibility complex

Phức hợp hòa hợp tổ chức chủ yếu MIF Macrophage inhibition factor

Yếu tố ức chế đại thực bào MAF Macrophage activation factor

Yếu tố hoạt hóa đại thực bào

Nguyên phân

NK Natural killer cell

Tế bào giết tự nhiên PBS Phosphate Buffered Saline

PBMC Peripheral blood mononuclear cells

Tế bào đơn nhân máu ngoại vi

PHA Phytohaemagglutinin

Tế bào hồng cầu SIg Surface immunoglobulin

TDTH Delayed type hypersensitivity T cell

Tế bào T quá mẫn muộn TCR T cell receptor

Thụ thể tế bào T TIL Tumour Infitrating lymphocytes

Tế bào lympho thâm nhiễm vào khối u TNF Tumor necrosis factor

Yếu tố hoại tử u

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1: Thành phần môi trường nuôi tế bào 32Bảng 3.1: Đáp ứng của tế bào với nồng độ Interleukin-2 khác nhau do Việt

Nam sản xuất 54Bảng 3.2: Đáp ứng của tế bào với nồng độ Interleukin-2 khác nhau do Trung

Quốc sản xuất 55Bảng 3.3: Nồng độ 9 cytokine tạo thành trong dịch nuôi cấy tế bào tại các thời

điểm khác nhau 60Bảng 3.4: Biến đổi nồng độ của các cytokine của tế bào lympho Th1 có nồng độ

thay đổi 63

DANH MỤC CÁC HÌNH VỄ, ĐỒ THỊ

Hình 1.1: Tế bào lympho và các tế bào máu khác 3

Hình 1.2: Tế bào lympho khi nhuộm bằng phương pháp Wright 4

Hình 1.3: Các tế bào máu và cấu trúc của hệ miễn dịch 5

Hình 1.4: Nguồn gốc và quá trình tuần hoàn của của các tế bào lympho trong cơ thể 7

Hình 1.5: Sơ đồ Venn tóm tắt một số đáp ứng miễn dịch được điều chỉnh bởi các cytokin 13

Hình 1.6: Biểu đồ tổng quan về chu kỳ tế bào 15

Hình 1.7: Cấu trúc tinh thể của interleukin 2 21

Hình 1.8: Sơ đồ chuyển hóa MTT 29

Hình 2.1: Sơ đồ tổng quát quy trình đánh giá tác dụng hoạt hóa tế bào lympho người của chế phẩm sinh học bằng kỹ thuật MTT 38

Hình 3.1: Ảnh hưởng của chất chỉ thị đỏ phenol 43

Hình 3.2: Hình thái tế bào sau các thời điểm nuôi cấy 44

Hình 3.3: Sự thay đôi về hình thái tế bào 45

Hình 3.4: Kết quả nhuộm Giemsa hình thái tế bào đáp ứng với Interleukin-2 (IL-2) và chất kích thích phân bào PHA 46

Hình 3.5: Kết quả nghiên cứu so sánh IL-2 Trung Quốc khi bổ sung 2% PHA 49

Hình 3.6: Đáp ứng của tế bào với nồng độ PHA khác nhau 50

Hình 3.7: Sự tạo thành tinh thể formazan của tế bào lympho 52

Hình 3.8: Hoạt tính gây đổi mầu cơ chất MTT 52

Hình 3.9: Đáp ứng của tế bào với nồng độ IL-2 khác nhau 56

Hình 3.10: Đáp ứng của tế bào theo thời gian bảo quản chế phẩm IL-2 58

Hình 3.11: Nồng độ 9 cytokine tạo thành trong dịch nuôi cấy tế bào 61

Hình 3.12: Nồng độ 9 cytokine tạo thành trong dịch nuôi cấy tế bào khi bổ sung IL-2 62

Hình 3.13: Biến đổi nồng độ của 3 cytokine của tế bào lympho Th1 có nồng độ thay đổi 64

Hình 3.14: Biến đổi nồng độ của 2 cytokine của tế bào lympho Th2 có thay đổi nồng độ 65

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN

LỜI CẢM ƠN

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH VỄ, ĐỒ THỊ

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 3

1.1 TẾ BÀO LYMPHO 3

1.2 ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI TẾ BÀO LYMPHO 4

1.3 CÁC LOẠI TẾ BÀO LYMPHO 5

1.3.1 Tế bào lympho B 6

1.3.2 Tế bào lympho T 7

1.3.2.1 Nguồn gốc, đặc điểm 7

1.3.2.2 Chức năng của lympho bào T 9

1.3.3 Tế bào giết tự nhiên (Natural Killer: NK) 11

1.4 CYTOKINE 11

1.4.1 Tính chất chung 11

1.4.2 Chức năng sinh học 14

1.4.3 Cơ chế hoạt động 14

1.4.4 Vai trò hoạt hóa các tế bào lympho của cytokine 14

1.4.4.1 Sự hoạt hoá tế bào lympho T 15

1.4.4.2 Sự hoạt hoá tế bào lympho B 16

1.4.5 Phân loại cytokine 16

1.4.5.1 Phân loại theo cấu trúc 16

1.4.5.2 Phân loại theo chức năng 17

1.4.6 Một số cytokine 17

1.4.6.1 Interleukin 1 (IL-1) 17

1.4.6.2 Interleukin 10 (IL-10) 18

1.4.6.3 Interleukin 13 (IL-13) 18

1.4.6.4 Các interferon (IFN) 19

1.4.6.5 Các yếu tố hoại tử u (TNF: Tumor necrosis factors) 20

1.4.7 Ứng dụng của cytokine trong điều trị 20

1.5 INTERLEUKIN 2 21

1.5.1 Sự tạo thành interleukin 2 21

1.5.2 Tính chất của interleukin 2 22

1.5.3 Chức năng miễn dịch 23

1.5.4 Sử dụng interleukin 2 (IL-2) trong điều trị lâm sàng 24

1.6 CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG HOẠT HÓA TẾ BÀO LYMPHO NGƯỜI CỦA CHẾ PHẨM SINH HỌC 27

1.6.1 Kỹ thuật đánh giá khả năng tồn tại của tế bào 27

1.6.2 Kỹ thuật đo sự hợp nhất của các nucleotide phóng xạ 28

1.6.3 Kỹ thuật MTT 29

CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 31

2.1 VẬT LIỆU 31

2.1.1 Đối tượng 31

2.1.2 Vật liệu 31

2.1.3 Hóa chất và môi trường 31

2.1.4 Thiết bị máy móc 32

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 33

2.2.1 Phương pháp tách tế bào lympho 33

2.2.2 Phương pháp nhuộm và đếm tế bào bằng xanh trypan 34

2.2.3 Phương pháp nuôi cấy tế bào 35

2.2.4 Thử nghiệm tăng sinh tế bào lympho in vitro bởi chế phẩm sinh học interleukin 2 tái tổ hợp 35

2.2.5 Phương pháp nhuộm Giemsa 36

2.2.6 Kỹ thuật MTT 37

2.2.7 Thử nghiệm chế tiết cytokin thứ cấp 38

2.2.8 Phương pháp phân tích số liệu 41

CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 42

3.1 KẾT QUẢ THỬ NGHIỆM TĂNG SINH TẾ BÀO LYMPHO IN VITRO 42

3.1.1 Xác định ảnh hưởng của chất chỉ thị đỏ phenol 42

3.1.2 Kết quả sự thay đổi hình thái và số lượng tế bào theo thời gian nuôi cấy 44

3.1.4 Xác định ảnh hưởng của nồng độ PHA kích thích phân bào khi kết hợp

với IL-2 48

3.1.5 Kết quả đánh giá sự tồn tại và tăng sinh tế bào bằng kỹ thuật MTT 51

3.1.6 Phương thức đáp ứng của tế bào phụ thuộc liều chế phẩm IL-2 53

3.1.7 Phương thức đáp ứng của tế bào theo thời gian bảo quản chế phẩm IL-2 tái tổ hợp 57

3.2 KẾT QUẢ THỬ NGHIỆM CHẾ TIẾT CYTOKINE THỨ CẤP 59

KẾT LUẬN 67

TÀI LIỆU THAM KHẢO 68

IL-2 còn được gọi là tác nhân điều biến miễn dịch, hiện được sử dụng nhiều trong y học như một liệu pháp miễn dịch để điều trị ung thư, HIV, các bệnh nhiễm trùng, dị ứng, nhiễm virus mạn tính, đánh giá phản ứng của cơ thể trong quá trình cấy ghép mô, nội tạng và như một tá dược trong vacxin Trong đó để chữa trị ung thư là một trong những ứng dụng quan trọng nhất của IL-2

Do có những ứng dụng quan trọng trong y-dược nên cùng với việc phát hiện

ra các dòng tế bào phụ thuộc IL-2, các thử nghiệm sản xuất IL-2 trong các hệ thống

in vitro cũng được tiến hành Nhờ vào công nghệ gen hiện đại, hiện đã có những sản

phẩm IL-2 tái tổ hợp với chất lượng tốt và bán dưới dạng thương phẩm Một số hãng dược phẩm danh tiếng như NOVATIS đã sản xuất thành công IL-2 tái tổ hợp

để sử dụng trong chữa trị một số loại bệnh ung thư (ung thư thận, ung thư hắc tốmelanoma…) IL-2 đã được chấp nhận sử dụng trong điều trị ở nhiều quốc gia trên thế giới như Mỹ, Vương quốc Anh (United Kingdom) [4][32]

Ở Việt Nam, chế phẩm IL-2 tái tổ hợp của người đã được nghiên cứu và sản xuất cũng như nghiên cứu xác định hoạt tính sinh học trên tế bào [4] Tuy nhiên đây

là một chế phẩm mới, do đó cần phải đánh hoạt tính sinh học của sản phẩm trên tế bào lympho người trước khi đưa vào sử dụng

Từ cơ sở thực tiễn và lý luận trên, chúng tôi tiến hành đề tài: ―Nghiên cứu hoàn thiện và ứng dụng kỹ thuật đánh giá tác động hoạt hóa in vitro tế bào lympho người của một số chế phẩm sinh học” Nhằm đánh giá hoạt tính sinh học

cũng như so sánh hình thức tác dụng để có thể đánh giá cụ thể về tác dụng của chế phẩm sinh học IL-2 tái tổ hợp tạo ra tại Việt Nam

Mục tiêu nghiên cứu:

- Xây dựng và tối ưu hóa quy trình đánh giá hoạt động hoạt hóa, tăng sinh

in vitro các tế bào lympho người

- Ứng dụng quy trình đã sử dụng đánh giá hoạt tính sinh học của Interleukin-2 tái tổ hợp của người do Việt Nam sản xuất lên các tế bào

lympho người in vitro

Nội dung đề tài:

Để giải quyết các mục tiêu trên chúng tôi tiến hành các nội dung sau:

- Nghiên cứu khả năng kích thích hoạt hóa tăng sinh các tế bào lympho khi nuôi trong môi trường bổ sung chế phẩm sinh học IL-2 tái tổ hợp và đánh giá mức độ hoạt hóa tăng sinh của tế bào thông qua quan sát hình thái tế bào và đo lường mức độ hoạt động của ti thể sinh enzyme chuyển hóa chất mầu MTT

- Nghiên cứu cơ chế tác động và khả năng kích thích các tế bào lympho sinh ra các cytokine thứ cấp của chế phẩm sinh học IL-2 tái tổ hợp

CHƯƠNG I TỔNG QUAN

1.1 TẾ BÀO LYMPHO

Các tế bào lympho (lymphocyte) là những tế bào bạch cầu chịu trách nhiệm chính trong đáp ứng miễn dịch Đặc điểm chính của chúng về phương diện miễn dịch là tính đa dạng, tính đặc hiệu ký ức, nhận biết những gì là của bản thân và không phải của bản thân Được hình thành từ các mô bạch huyết là một mạng lưới các sợi và các tế bào (các hạch lympho, lách, tuyến ức, amydal, các mảng Peyer, và đôi khi ở trong tủy xương), do đó, chúng phân tán khắp cơ thể và là một trong những tế bào có số lượng cao nhất ở động vật có vú [57]

Ở người lớn trung bình có 1012

tế bào lympho Các tế bào lympho chiếm khoảng 20-30% tổng số bạch cầu máu ngoại vi và có khả năng di chuyển vào kẽ mô

và các cơ quan dạng lympho [3]

Hình 1.1: Tế bào lympho và các tế bào máu khác

Đại thực bào (mầu hồng/tím), Tế bào lympho T (mầu xanh), và

các tế bào Hồng cầu (hình đĩa lõm) Nguồn: http://www.astrographics.com

1.2 ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI TẾ BÀO LYMPHO

Hình 1.2: Tế bào lympho khi nhuộm bằng phương pháp Wright

Nguồn: http://abrahame.wikispaces.com/08+Immunology

Các tế bào lympho thường có kích thước nhỏ (7-8µm), nhưng cũng có những

tế bào lympho kích thước lớn hơn (10-20µm) [58]

Nhân (cấu trúc trung tâm) của tế bào lympho bao gồm một tập hợp dày đặc các chất nhiễm sắc bên trong Nhân của tế bào lympho có mầu tím/xanh đậm khi nhuộm bằng phương pháp nhuộm của Wright [6] Màng nhân có giới hạn rõ, nhân thường tròn, nhưng có thể có răng cưa và nằm lệch tâm bên trong một lượng tương đối nhỏ tế bào chất có mầu xanh nhạt [13] Chuỗi Polyribosome là một đặc điểm nổi bật của các tế bào lympho và có thể quan sát được dưới kính hiển vi Các ribosome này tham gia vào quá trình tổng hợp protein cho phép các tế bào lympho sản sinh ra một lượng lớn các cytokines và các globulin miễn dịch [6]

Không giống như các tế bào bạch cầu khác như tế bào bạch cầu ái kiềm

(basophils), bạch cầu trung tính (neutrophil) và tế bào bạch cầu ái toan (eosinophils), tế bào chất của tế bào lympho thường không chứa hạt Tuy nhiên, ở dạng tế bào lympho lớn có thể có tương đối nhiều tế bào chất và các tế bào chất này bao gồm vài hạt nhỏ màu đỏ/tím sáng, đối lập với các hạt của các tế bào trong tủy

xương [57][58] Dưới kính hiển vi đối pha thấy lympho bào chuyển động chậm chạp kiểu amip [1]

Hình 1.3: Các tế bào máu và cấu trúc của hệ miễn dịch 1.3 CÁC LOẠI TẾ BÀO LYMPHO

Dựa vào sự khác nhau trong quá trình biệt hóa, khác nhau về hình thái, chức

thành các quần thể và dưới quần thể Nhờ sự phát triển của các kháng thể đơn dòng nên việc định danh xếp loại các quần thể tế bào lympho ngày càng được bổ sung Cho đến nay, hai quần thể chính của tế bào lympho được thừa nhận đó là quần thể lympho bào T và lympho bào B [1]

Về mặt hình thái khi quan sát dưới kính hiển vi thường thì không thể phân biệt được các tế bào lympho với nhau, nhưng khi quan sát dưới kính hiển vi điện tử

dễ dàng thấy bề mặt tế bào B xù xì, có nhiều mấu, đó là các phân tử kháng thể bề mặt SIg (surface immunogobulin) Kháng thể bề mặt này sẽ dùng để sao ra các kháng thể mà tế bào B sẽ sinh ra trong quá trình phát triển sau này [1][3][5]

Trên bề mặt tế bào T nhẵn nhụi hơn (không có SIg ở tế bào T) nhưng lại có phân tử glycoprotein tương ứng, đó là thụ thể của tế bào T, dùng để nhận biết kháng nguyên và phân tử MHC, thụ thể này đặc hiệu với kháng nguyên nên tương tác giữa

tế bào T và kháng nguyên là tương tác đặc hiệu [1][2][4]

Sự tương tác của tế bào T hoặc tế bào B sẽ kích thích tế bào lympho bước vào các pha G1, S, G2 và M của chu trình tế bào

1.3.1 Tế bào lympho B

Từ tế bào gốc, các tiền tế bào B của loài chim đều phân chia biệt hóa ở túi Fabricius (Bursa Fabricius) nên được gọi là lympho bào B và hoạt động của chúng phụ thuộc vào túi Fabricius Ở người, người ta tìm thấy các tế bào tiền thân của lympho B trong gan bào thai và trong tủy xương của người trưởng thành, sau đó các tiền lympho B trưởng thành ngay trong tủy xương (chữ B cũng đúng với vị trí trưởng thành chủ yếu của các tế bào này ở động vật có vú là tủy xương: Bone marrow)

Dưới kính hiển vi điện tử các tế bào lympho B có bề mặt xù xì, nổi gai: đó là các globulin miễn dịch bề mặt (Surface immunoglobulin: SIg) Có thể phát hiện các SIg một cách dễ dàng bằng các kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang Về phương diện chức năng, các globulin này đóng vai trò là các thụ thể dành cho kháng nguyên Có khoảng 1,5 x 105

phân tử kháng thể trên màng của một tế bào B Mỗi một phân tử

có một vị trí kết hợp kháng nguyên Tất cả các tế bào thuộc dòng biệt hóa từ một tế bào B ban đầu sẽ kết hợp đặc hiệu cùng với một loại kháng nguyên [1][3][5]

Tế bào lympho B là tế bào sinh kháng thể và chịu trách nhiệm đáp ứng miễn dịch dịch thể Sau khi kháng nguyên xâm nhập và được các đại thực bào hoặc chính các tế bào lympho B xử lý, các tế bào lympho B sẽ được thông tin và biến thành những tế bào mẫn cảm Sau đó những tế bào này trở thành những nguyên tương bào

và phát triển thành những quần thể không những tại hạch lympho khu vực mà còn

đi đến các hạch khác trong toàn cơ thể Một số các nguyên tương bào sẽ chuyển thành tế bào plasma (tương bào) để sản xuất ra kháng thể Mỗi dòng tế bào plasma chỉ sản xuất ra một kiểu globulin miễn dịch Quá trình tăng sinh và biệt hóa lympho

B thành tế bào plasma (sản xuất kháng thể) diễn ra có kèm theo sự thay đổi SIg [1][5]

trường phù hợp để tăng sinh và biệt hóa, trưởng thành, sau đó di cư vào vùng tủy

ức, tiếp tục chín và được tung ra máu để định cư lần hai ở các cơ quan bạch huyết: hạch, lách, niêm mạc … Trong máu, lympho bào T có tỷ lệ và số lượng cao hơn hẳn lympho bào B, rất phù hợp với chức năng nhận biết kháng nguyên, trực tiếp bao bọc

và loại trừ kháng nguyên của chúng

Giống như các lympho B, các lympho T cũng có các thụ thể trên màng dành cho kháng nguyên Tuy nhiên khác với các phân tử globulin miễn dịch gắn trên màng tế bào B (SIg) đó là các thụ thể của tế bào T chỉ nhận diện kháng nguyên khi kháng nguyên đó kết hợp với phân tử MHC của chính tế bào đó Việc tế bào T nhận diện kháng nguyên kết hợp với phân tử MHC của bản thân chỉ ra một sự khác nhau

cơ bản giữa đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào và đáp ứng miễn dịch dịch thể

Các dòng tế bào lympho T được biệt hóa hoặc ở các giai đoạn trưởng thành khác nhau có thể được phân biệt nhờ sự xuất hiện của các phân tử trên màng tế bào

và các phân tử này được nhận biết bởi các kháng thể đơn dòng đặc hiệu Các phân

tử protein trên màng tế bào này được coi là ―dấu ấn‖ bề mặt của tế bào Các dấu ấn này có nhiều tên gọi nhưng đến nay đã thống nhất chọn tên cho các protein đó là cụm biệt hóa có ký hiệu là CD (C= Cluster class: cụm; D= Differentiation, determinant: biệt hóa, xác định), kèm theo con số nói lên thứ tự phát hiện ra nó Dưới quan điểm miễn dịch CD cũng là kháng nguyên của tế bào mang nó, còn về mặt phân loại thì CD giúp ta phân biệt giai đoạn của một lympho T, đồng thời phân biệt các nhóm T khác nhau…

Có thể phân biệt các tiểu quần thể tế bào T với nhau nhờ sự có mặt của một trong hai phân tử trên màng là CD4 hay CD8 Các tế bào T mang dấu ấn CD8 (TCD8+) thường có chức năng như những tế bào T gây độc (Tc) Các tế bào T mang dấu ấn CD4 (TCD4+) thường có chức năng là các tế bào T hỗ trợ (Th)

1.3.2.2 Chức năng của lympho bào T [1]

Lympho bào T với nhiều phân nhóm (dưới nhóm), thực hiện được các chức năng cơ bản và toàn diện nhất của đáp ứng miễn dịch mà lympho bào B không thể làm được đầy đủ Đó là:

tế bào Th chế tiết nhiều cytokine khác nhau, thường được gọi là các lymphokine, đóng vai trò trung tâm trong quá trình hoạt hóa tế bào B, tế bào Tc và nhiều tế bào khác tham gia vào đáp ứng miễn dịch

- Các tế bào T mang dấu ấn CD8 (TCD8+) nhận diện các kháng nguyên kết hợp với phân tử MHC lớp I và thường có chức năng như những tế bào T gây độc (Tc) Tế bào Tc được hoạt hóa nhờ vào sự tương tác giữa phức hợp kháng nguyên-phân tử MHC trên bề mặt tế bào của bản thân cơ thể đã bị biến đổi (ví dụ các tế bào

đã nhiễm virus) khi có mặt các lymphokine thích hợp Các tế bào Tc đã hoạt hóa được gọi là các tế bào T gây độc có khả năng giết chết các tế bào đã bị biến đổi

Các lympho bào T có hai vai trò quan trọng trong miễn dịch chống virus Đầu tiên, thông qua giải phóng ra các lymphokines thích hợp, chúng sắp đặt lại đáp

kháng thể, điều hòa sự viêm nhiễm tại nơi nhiễm trùng, hỗ trợ sự phát triển của tế bào T có hoạt tính kháng virus Chức năng thứ hai của tế bào T là chúng có khả năng nhận diện một cách đặc hiệu virus – các tế bào nhiễm trùng và thậm chí phá hủy các tế bào trước khi các thế hệ virus sau được giải phóng hoặc cung cấp các lymphokines có thể hạn chế sự sao chép của virus Tất cả những chức năng xoay quanh sự nhận diện các kháng nguyên của virus trên bề mặt các tế bào APC [13]

B, Vai trò thụ thể (cấu trúc và chức năng của thụ thể TCR- T cell receptor) [1][13]

Phân tử CD4 và CD8 giúp Th và Tc tiếp cận đúng tế bào trình diện kháng nguyên: bằng MHC lớp I hay là MHC lớp II Còn việc trực tiếp nhận biết kháng nguyên lại do các thụ thể của tế bào T, ký hiệu là TCR (T cell receptor) Mỗi một dòng tế bào T lại biểu hiện một thụ thể với kháng nguyên lên trên bề mặt của chúng

Về cấu trúc thụ thể của tế bào T (TCR) bao gồm một heterodimer của hai protein màng tách rời gọi là chuỗi α và β, mang các gốc glucid, cùng nối liên chuỗi (và nội chuỗi) bằng các cầu disulphua (S-S) Đặc biệt, mỗi chuỗi cũng bao gồm một vùng hằng định (C; constant), có tận cùng bằng nhóm –COOH và vùng biến đổi (V; variable) có tận cùng nhóm –NH2: chính vùng biến đổi đã giúp mỗi quần thể

Th, Tc chỉ nhận ra một kháng nguyên phù hợp Và cũng có sự sắp xếp lại gen khi tổng hợp vùng V Do vậy, TCR được xếp vào đại gia đình Ig

Giống như Ig, vùng biến đổi liên kết với vùng hằng định bởi sự sắp xếp lại gen, ngoài ra với tổ hợp đa dạng được tạo ra trong vùng CDR3 (như với Ig, nằm ở

vị trí giao nhau của các vùng hằng định và biến đổi) bằng cách chèn một (đối với các chuỗi α) hoặc hai (đối với các chuỗi β) phân đoạn bổ sung nhỏ Do đó, giống như với Ig, hầu hết tính đa dạng trong TCR xảy ra ở vùng CDR3, nơi được cho rằng

có liên quan mật thiết với việc peptide liên kết chặt chẽ với phân tử MHC Không giống như các tế bào B, tế bào T không biến đổi vùng hằng định của thụ thể kháng nguyên, nơi mà có thể được hiểu là do thụ thể chỉ cung cấp tín hiệu để hoạt hóa tế bào T

1.3.3 Tế bào giết tự nhiên (Natural Killer: NK)

NK là một tiểu quần thể tế bào có khả năng diệt một số tế bào đích: tế bào u,

tế bào vật chủ bị nhiễm virus Chức năng quan trọng của tế bào NK có lẽ là kiểm soát miễn dịch, ngăn chặn sự di cư của tế bào u qua máu, bảo vệ cơ thể chống lại sự nhiễm virus Tế bào NK hoạt hóa tiết ra một số chất như gamma interferon, TNF, GM-CSF tác động lên các tế bào khác [1]

1.4 CYTOKINE

Tham gia vào đáp ứng miễn dịch có nhiều loại tế bào khác nhau, chủ yếu là các tế bào dạng lympho, các tế bào viêm và các tế bào tạo máu khác Những tương tác phức tạp xảy ra giữa các tế bào này với nhau được thực hiện thông qua một nhóm các protein được gọi chung là các cytokine để nói lên vai trò của chúng trong các tương tác tế bào với tế bào Thuật ngữ ―cytokin‖ bao gồm nhiều loại chất điều hòa được sinh ra trong khắp cơ thể bởi các tế bào có nguồn gốc phôi sinh học đa dạng [1][20]

Về cơ bản, cytokine là những phân tử nhỏ hay là các phân tử protein tín hiệu nội bào, chúng có thể được phân loại như là các protein hoặc glycoprotein điều hòa

có trọng lượng phân tử thấp (khoảng 8 đến 30 kDa, trung bình khoảng 25 kDa) được chế tiết bởi các tế bào bạch cầu và nhiều loại tế bào khác trong cơ thể đáp ứng với một số kích thích Các cytokine tham gia vào sự điều hòa phát triển của các tế bào miễn dịch, đồng thời có một số cytokine có tác động trực tiếp lên ngay bản thân

Hầu hết các cytokine được tổng hợp một lần nữa trước khi chúng được tiết ra trong đáp ứng miễn dịch khi bị kích thích Do đó, điều tiết sự hình thành cytokine

có thể diễn ra ở các giai đoạn phiên mã, dịch mã và giải phóng của quá trình

Mỗi cytokine có một thụ thể đặc hiệu cho chúng trên màng các tế bào đích làm khởi động các con đường dẫn truyền tín hiệu vào bên trong tế bào và cuối cùng dẫn đến thay đổi biểu hiện gence của tế bào đích và các yếu tố phiên mã của chúng, dẫn đến việc sản sinh ra các cytokine khác, gia tăng số lượng thụ thể bề mặt đối với các phân tử khác hoặc ức chế các tác động riêng của chúng bằng cách ức chế ngược

Tế bào đích của cytokine được thể hiện bởi sự có mặt của các thụ thể dành cho cytokine trên bề mặt tế bào Thông thường ái lực giữa cytokine và thụ thể dành cho cytokin rất cao Chính vì có ái lực cao mà cytokine có tác động sinh học ngay cả ở các nồng nộ rất thấp tới mức picomole [58]

Tác dụng của một cytokin cụ thể lên một tế bào nhất định phụ thuộc vào cytokine, sự đa dạng về các yếu tố ngoại bào của chúng, sự hiện diện và sự đa dạng của các thụ thể bổ sung trên bề mặt tế bào và các tín hiệu xuôi được hoạt hóa bởi các thụ thể liên kết trong đó hai yếu tố sau cùng có thể thay đổi tùy theo loại tế bào Các cytokin được đặc trưng bởi sự lặp lại, trong đó nhiều cytokine có chức năng tương tự nhau Các cytokine khi kết hợp với các kháng thể gây ra tác dụng miễn dịch mạnh hơn khi tác động đơn lẻ [15]

Hình thức hoạt động của các cytokin có thể phân thành các loại sau [1]:

- Kiểu tự tiết (autocrine): Chúng có tác động trở lại lên chính tế bào tiết ra chúng

- Kiểu cận tiết (paracrine): chúng có tác động lên các tế bào lân cận xung quanh

- Kiểu nội tiết (endocrine): vào máu, tác động lên tế bào đích ở xa nơi chế tiết (giống như hormon)

- Tác động trực tiếp: cytokine đóng vai trò cầu nối trực tiếp giữa tế bào tiết với

tế bào đích

Các cytokine điều hòa cường độ và thời gian của đáp ứng miễn dịch bằng cách điều hòa sự tiết các kháng thể hoặc các cytokin khác [58]

Tác dụng của các cytokine có thể theo kiểu đa dụng (pleiotropy), có nghĩa là các cytokine gây ra các hoạt tính sinh học khác nhau trên các tế bào đích khác nhau Ngược lại, tác động theo kiểu đồng dụng (redundancy) là các cytokine khác nhau có thể gây ra một tác động sinh học tương tự nhau cho cùng một loại tế bào đích Các cytokine có thể có tác động hiệp đồng (synergy) với nhau có nghĩa là khi hai cytokine cùng tác động thì gây ra hiệu quả lớn hơn tổng tác động của từng cytokine khi tác động riêng lẻ; hoặc đối kháng (antogonism), tức là một cytokine này có tác dụng ức chế một cytokine khác [1][58]

Hình 1.5: Sơ đồ Venn tóm tắt một số đáp ứng miễn dịch đƣợc điều chỉnh bởi

các cytokin

Sơ đồ hình 1.7 cho thấy, mỗi một đáp ứng được kích thích bởi một vài cytokin (kiểu đồng dụng), và mỗi một cytokin có khả năng kích thích một vài đáp ứng khác nhau (kiểu đa dụng) [46]

Hoạt động của một cytokine trên một tế bào đích tương ứng nhìn chung sẽ điều hòa sự xuất hiện của các thụ thể dành cho cytokin và xuất hiện các cytokine mới, những cytokine mới này sẽ tác động lên các tế bào khác tạo nên một phản ứng dây chuyền Bằng cách đó đáp ứng đặc hiệu của một lympho bào với một kháng nguyên sẽ ảnh hưởng đến hoạt tính của hàng loạt tế bào cần thiết cho việc sinh ra một đáp ứng miễn dịch hữu hiệu

1.4.2 Chức năng sinh học

Hiện nay đã biết có trên 90 cytokine khác nhau, do nhiều loại tế bào khác nhau tiết ra và có rất nhiều tác dụng sinh học đan xen nên có nhiều cách đặt tên và phân loại cytokine Do đó, việc xác định chính xác một chức năng sinh học thuộc một cytokine cụ thể là rất khó khăn Chức năng sinh học chung nhất của các cytokine là trung gian trao đổi thông tin giữa các tế bào để: Kích thích phát triển các dòng tế bào khác nhau của cơ thể (tế bào miễn dịch, tế bào máu…); Hoạt hóa các tế bào nhằm kích thích sự trưởng thành, biểu lộ các thụ thể trên bề mặt tế bào; Gây độc làm tổn thương, ức chế tế bào… [1]

1.4.3 Cơ chế hoạt động

Cytokin sau khi gắn với thụ thể tương ứng, tế bào đích sẽ được khởi động sao chép, dịch mã gen, chế tiết các thụ thể để tiếp nhận thêm cytokine; đồng thời sản xuất cytokin mới để tác động lên các tế bào khác [1]

1.4.4 Vai trò hoạt hóa các tế bào lympho của cytokine

Các tế bào lympho T và B chưa chín, hay các tế bào lympho nghỉ ngơi, là các tế bào còn đang ở giai đoạn G0 của chu trình tế bào và không nằm trong vòng tuần hoàn Sự hoạt hoá đưa tế bào ở giai đoạn nghỉ ngơi vào chu trình tế bào, trải qua giai đoạn G1 để vào pha gian kỳ (pha S), trong giai đoạn này ADN được nhân lên Quá trình chuyển từ giai đoạn G1 đến pha S đóng một vai trò cực kỳ quan trọng trong chu trình tế bào Khi một tế bào đã đạt đến pha S nó hoàn thành chu trình tế bào, chuyển qua giai đoạn G2 và vào thời kỳ phân bào (M)

Hình 1.6: Biểu đồ tổng quan về chu kỳ tế bào

Vòng tròn ngoài: I = Kỳ trung gian; M = nguyên phân Vòng tròn trong: M = nguyên phân; G1= pha G1; G2= pha G2; S= pha S

Không nằm trong vòng nào: G0 = pha G0/ pha nghỉ Quá trình hoạt hoá các lympho bào B và T diễn ra theo trình tự bằng các tín hiệu sớm đẩy các tế bào nghỉ ngơi từ G0 sang G1 sớm và tạo cho tế bào khả năng thu nhận các tín hiệu thúc đẩy tiếp theo Các tín hiệu này có tác dụng đưa tế bào từ giai đoạn G1 vào pha S và cuối cùng là vào giai đoạn phân chia và biệt hoá (giai đoạn G2 và M)

Cytokine đóng vai trò rất quan trọng đối với quá trình đáp ứng miễn dịch của

cơ thể, biểu hiện qua số lượng và chức năng của các cytokine tham gia điều hòa tương tác các tế bào miễn dịch [1]

1.4.4.1 Sự hoạt hoá tế bào lympho T [1]

Quá trình hoạt hoá các tế bào T nghỉ ngơi từ giai đoạn G0 để vào giai đoạn G1 sớm đòi hỏi phải có hai tín hiệu mở đường Tín hiệu thứ nhất đến từ quá trình tương tác giữa phức hợp kháng nguyên-phân tử hoà hợp mô với thụ thể của tế bào T

và tín hiệu thứ hai từ tế bào phụ trợ dưới dạng chất đồng kích thích IL-1 Các sự

kiện này truyền một tín hiệu qua màng nguyên sinh chất dẫn đến sự phiên mã của một số gene trong đó có các gene mã hoá IL-2 và thụ thể dành cho IL-2 Nhiều nghiên cứu cho thấy rằng mối tương tác giữa IL-2 và thụ thể của nó đóng vai trò như là yếu tố thúc đẩy để đẩy tế bào từ giai đoạn G1 vào pha S của chu trình tế bào

và vì thế buộc tế bào phải hoạt hoá

Khi một tế bào T đã được hoạt hoá nó bắt đầu sản xuất và chế tiết các cytokine khác nhau có các chức năng hoạt động khác nhau

1.4.4.2 Sự hoạt hoá tế bào lympho B [1]

Trong đáp ứng miễn dịch lần đầu, một tế bào B nghỉ ngơi được hoạt hoá bởi kháng nguyên và các cytokine khác nhau của tế bào Th sẽ tiến triển từ trạng thái G0 vào chu trình tế bào rồi sau đó là tăng sinh và biệt hoá để rồi tạo ra các tế bào plasma làm nhiệm vụ chế tiết kháng thể Quá trình hoạt hoá một tế bào B nghỉ ngơi cần phải có sự gắn của kháng nguyên vào kháng thể đã có sẵn trên màng tế bào và cũng cần phải có các tín hiệu đồng kích thích được tạo ra bởi IL-1 và IL-4 Các tế bào cũng có thể được hoạt hoá bằng các chất kích thích phân bào đối với tế bào B,

là các lipopolysaccharide, hoặc bằng kháng thể kháng IgM gắn vào IgM trên bề mặt

tế bào cùng với tín hiệu đồng kích thích là IL-4 Sự tương tác của kháng nguyên và kháng thể có sẵn trên màng tế bào đã được chứng minh là đóng vai trò như một tín hiệu mở đường đẩy tế bào B nghỉ ngơi ở giai đoạn G0 vào gia đoạn G1 sớm và ở giai đoạn này thì tế bào bắt đầu đáp ứng với IL-4 Ở thời điểm này sự tương tác của IL-4 với các tế bào B đóng vai trò như một tín hiệu mở đường chuyển tế bào từ giao đoạn G1 sớm sang G1 muộn Interleukin-4 còn có chức năng như một tín hiệu thúc đẩy đưa tế bào B qua điểm giới hạn G1 vào pha S của chu trình tế bào

1.4.5 Phân loại cytokine

1.4.5.1 Phân loại theo cấu trúc [59]

Dựa trên sự tương đồng về cấu trúc có thể phân loại các cytokine thành bốn nhóm:

- Nhóm bốn chuỗi xoắn α (the four-α-helix bundle family): Các cytokin thuộc nhóm này có cấu trúc ba chiều với bốn chuỗi xoắn α Trong nhóm

này, lần lượt được chia thành 3 nhóm nhỏ:

o Nhóm Interleukin-2: Là nhóm lớn nhất, bao gồm một vài cytokin không thuộc miễn dịch như erythropoietin (EPO, chất kích thích

tủy xương tạo hồng cầu) và trombopoietin (TPO)

o Nhóm interferon (IFN)

o Nhóm Interleukin - 10

- Nhóm Interleukin 1: gồm Interleukin1 và Interleukin 18

- Nhóm Interleukin 17: tuy tính chất chưa được xác định hoàn thiện nhưng các cytokine thuộc nhóm này có tác dụng đặc biệt trong quá trình thúc

đẩy sự tăng sinh của các tế bào T có tác dụng gây độc tế bào

1.4.5.2 Phân loại theo chức năng [59]

Dựa vào lâm sàng và nghiên cứu thực nghiệm, có thể phân chia cytokine thành hai loại:

- Loại 1: bao gồm các cytokine miễn dịch có khả năng nâng cao đáp ứng miễn dịch tế bào như IFN-γ, TGF-β…

- Loại 2: Thiên về đáp ứng kháng thể như Interleukin-4, Interleukin-10, Interleukin-13…

1.4.6 Một số cytokine

1.4.6.1 Interleukin 1 (IL-1)

Gồm Interleukin 1-α và Interleukin 1-β là những cytokine được chế tiết ra bởi nhiều loại tế bào khác nhau như đại thực bào, bạch cầu đơn nhân, các tế bào lympho B, các tế bào có tua, các tế bào sợi, nguyên bào sừng, các tế bào hình sao, tế bào biểu mô và nội mô khi đã bị kích thích IL-1 đóng vai trò trung tâm trong điều hòa miễn dịch và đáp ứng viêm của cơ thể khi bị nhiễm trùng Các cytokine này làm tăng sự biểu hiện của các yếu tố kết dính trong các tế bào nội mô để chuyển dịch các tế bào bạch cầu có tác dụng chống lại tác nhân gây bệnh tới vị trí lây nhiễm và

(gây sốt: có tác dụng ức chế sự phát triển của vi sinh vật, tăng cường đáp ứng miễn dịch), ngủ gật và chán ăn Do đó, IL-1 còn được gọi là chất gây sốt nội sinh IL-1 cũng có vai trò quan trọng trong điều hòa tạo máu [1][37]

1.4.6.2 Interleukin 10 (IL-10)

IL-10 được biết đến như một yếu tố ức chế tổng hợp cytokine (CSIF: cytokine synthesis inhibitor factor), một cytokine chống viêm và là một cytokine điều hòa miễn dịch quan trọng, được mã hóa bởi gen IL-10 [40] IL10 được sinh ra chủ yếu bởi bạch cầu đơn nhân và một lượng nhỏ các tế bào lympho có tác dụng đa hướng trong điều hòa miễn dịch và viêm

Ảnh hưởng của IL-10 trong các tế bào miễn dịch in vitro

Tế bào trình diện kháng nguyên và tế bào lympho là những tế bào đích chính của IL-10 IL-10 có tác dụng ức chế các tế bào TCD4, ức chế sự tăng sinh cũng như

sự tổng hợp cytokine của các tế bào này Theo đó, IL-10 ảnh hưởng đến sự hình thành IL-2 cũng như IL-4 và IL-5 của các tế bào TCD4 Trong hệ thống miễn dịch, IL-10 ức chế đáp ứng của cả hai tiểu quẩn thể Th1 và Th2 trong đó ảnh hưởng lên các tế bào Th1 là những tế bào thiết yếu có ảnh hưởng đến miễn dịch qua trung gian

tế bào, viêm qua trung gian tế bào chống lại các vi sinh vật ngoại bào là mạnh nhất

Nó ức chế sự biểu hiện của tiểu quần thể Th1 sản xuất cytokin, chuyển Th thành Th2 là những tế bào chịu trách nhiệm đặc biệt về hiệu quả sản xuất IgE, IgA [1][14]

Bên cạnh đó, IL-10 còn có tác dụng làm giảm MHC lớp II trên bề mặt đại thực bào, giảm trình diện kháng nguyên của các bạch cầu đơn nhân/ đại thực bào và các tế bào gai, làm tăng khả năng tồn tại, tăng sinh và sản xuất kháng thể của các tế bào B, kích thích tế bào mast, ức chế sự tạo thành các cytokine tiền viêm [14][31]

bệnh về dị ứng và điều hòa đáp ứng miễn dịch IL-13 thực hiện chức năng của mình thông qua các phức hợp thụ thể đặc hiện trên bề mặt tế bào [33][34][35][54]

1.4.6.4 Các interferon (IFN)

Interferon (IFN) là một nhóm các protein tự nhiên được tạo ra bởi rất nhiều loại tế bào khác nhau của hệ miễn dịch nhằm chống lại các tác nhân ngoại lai như virus, vi khuẩn, ký sinh trùng Chúng giúp các tế bào liên kết với nhau và đóng vai trò quan trọng trong cửa ngõ miễn dịch, là hàng rào bảo vệ đầu tiên của cơ thể chống lại virus và sự phát triển bất thường của tế bào Interferon là một phần của hệ thống miễn dịch không đặc hiệu và được kích hoạt bởi gia đoạn đầu của quá trình cảm nhiễm trước khi hệ miễn dịch đặc hiệu có thời gian kích hoạt

Tác dụng chính của interferon là ức chế virus sao chép và sự phát triển của khối u Ngoài ra, chúng còn có chức năng tăng biểu lộ MHC lớp I và lớp II, tăng hoạt tính của tế bào giết tự nhiên (NK) và điều biến đáp ứng của kháng thể Tăng biểu lộ phân tử MHC lớp I giúp tăng khả năng nhận biết và tiêu diệt các tế bào bị nhiễm, còn tăng biểu lộ MHC lớp II giúp tăng quá trình bộc lộ peptid của virus với

tế bào T help, những tế bào này sẽ tiết ra các cytokin (như nhiều các interferon và interleukin hơn) là những tín hiệu kích thích các tế bào miễn dịch khác phối hợp tác động [52]

Interferon-γ là một cytokine dimer hòa tan thuộc nhóm interferon týp 2 tham gia vào miễn dịch bẩm sinh và miễn dịch thu được để chống lại sự lây nhiễm vi khuẩn nội bào, virus và kiểm soát khối u IFN-γ được sinh ra chủ yếu bởi các tế bào diệt tự nhiên (tế bào NK) và bởi các tế bào Th1 CD4, tế bào lympho độc CD8 (CTL: cytotoxic T lymphocyte)[25]

IFN-γ có tác dụng điều hòa miễn dịch đối với nhiều loại tế bào khác nhau, nó

có tác dụng ức chế trên các tế bào Th2, mở rộng ảnh hưởng lên sự phân giải của TNF-α ở các nang của đại thực bào gây ra bởi các nội độc tố và làm tăng sự biểu lộ của các phân tử MHC lớp I và lớp II trên các đại thực bào và các tế bào biểu mô IFN-γ kích thích sản sinh IL-1 từ các bạch cầu đơn nhân, điều hòa ngược IL-2 gây

các tế bào đơn nhân dẫn đến điều chỉnh theo hướng đi lên của quá trình phiên mã TNF-α Do đó, IFN-γ thúc đẩy đáp ứng gây độc qua trung gian tế bào trong khi ức chế dị ứng viêm và tổng hợp kháng thể IgE IFN-γ quy định các phân tử lớp II trên các tế bào đơn nhân/ đại thực bào, các tế bào tua và làm tăng khả năng trình diện kháng nguyên của chúng [19]

1.4.6.5 Các yếu tố hoại tử u (TNF: Tumor necrosis factors)

Các yếu tố hoại tử u là một nhóm các cytokin gây chết tế bào bào gồm hai thành viên chính là:

Các yếu tố hoại tử u (TNF hay TNF-α) là một bạch cầu đơn nhân- dẫn xuất

gây độc tế bào có liên quan đến sự suy giảm khối u, sốc nhiễm khuẩn và bệnh suy dinh dưỡng [18][29]

Được sinh ra bởi các bạch cầu đơn nhân và đại thực bào, cùng với IL-1, TNF-α hoạt động trên rất nhiều loại tế bào khác nhau bao gồm các tế bào T, tế bào

B, bạch cầu đa nhân trung tính, các nguyên bào sợi, tế bào nội mô và các tế bào tủy xương làm cho các tế bào này chế tiết ra nhiều yếu tố khác nhau cần thiết cho sự phát triển của một đáp ứng viêm hữu hiệu TNF-α có tác dụng kích thích IL-1, tăng các phân tử kết dính và MHC lớp I trên tế bào nội mạc, tăng chất gây sốt, kích thích các yếu tố kích thích bạch cầu hạt (G-CSF: Granulocyte colony stimulating factor), chúng còn có tác dụng độc tế bào và kích thích tiết IFN-γ [12]

Lymphotoxin-α hay còn được biết đến là TNF-β, là một cytokin bị ức chế

bởi interleukin 10 [45] Là một polypeptid có liên quan về mặt hóa học được chế tiết bởi các tế bào T hoạt hóa có tác dụng giết chết các tế bào ung thư (là một yếu tố gây độ tế bào) mà không ảnh hưởng đến các tế bào bình thường, nó có tác dụng sinh học tương tự và liên quan rất nhiều đến phản ứng viêm tại chỗ [1][58]

1.4.7 Ứng dụng của cytokine trong điều trị

Với sự phát triển mạnh mẽ của công nghệ sinh học phân tử, hiện nay trên thế giới đã sản xuất được nhiều cytokine, thụ thể hòa tan giành cho cytokine với lượng lớn để sử dụng trong phòng và điều trị một số bệnh: kháng thể kháng IL-2, kháng

IL-1 để ức chế Th trong điều trị kéo dài thời gian sống dư của mảnh ghép Sử dụng interferon trong điều trị chống virus IL-10 được sử dụng trong ức chế miễn dịch ghép, bệnh tự miễn do rối loạn tế bào T Kháng thể đơn dòng kháng IL-4 nhằm ức chế sản xuất IgE trong điều trị bệnh dị ứng, sử dụng IL-2 trong điều trị chống ung thư ác tính, nhiễm virus mạn tính và như một tá dược trong vacxin….[1][32]

1.5 INTERLEUKIN 2

Interleukin 2 (IL-2) là một interleukin, một yếu tố polypeptide sinh trưởng, một loại phân tử cytokine tín hiệu trong hệ thống miễn dịch do các tế bào lympho T hoạt hóa tổng hợp nên và có trọng lượng phân tử thường thấy là 15,5 kD IL-2 thu hút các tế bào bạch cầu chịu trách nhiệm trong đáp ứng miễn dịch, là một phần của phản ứng miễn dịch tự nhiên của cơ thể khi bị nhiễm vi sinh vật, và trong phân biệt giữa các yếu tố ngoại lai và tự thân [4]

1.5.1 Sự tạo thành interleukin 2

Hình 1.7: Cấu trúc tinh thể của interleukin 2

Tế bào Th là các tế bào chính sản xuất IL-2 và quá trình sản sinh này gắn liền với sự hoạt hóa của chính các tế bào Th Sự hoạt hoá tế bào Th cần có hai tín hiệu: một tín hiệu được tạo ra bởi sự tương tác giữa tế bào Th với phức hợp kháng nguyên-phân tử hoà hợp mô chủ yếu trên tế bào trình diện kháng nguyên (hoặc với một chất kích thích phân bào) và tín hiệu đồng kích thích thứ hai tạo ra bởi mối tương tác với IL-1 do các tế bào trình diện kháng nguyên sản xuất ra Trong vòng

24 đến 48 giờ hoạt hoá các tế bào Th bắt đầu tổng hợp và chế tiết IL-2 và bộc lộ các thụ thể trên màng có ái lực cao dành cho IL-2

Mặc dù IL-2 được mã hoá bởi một gene duy nhất nhưng việc glycosyl hoá sau khi đã phiên mã phân tử IL-2 đã làm cho chúng khác nhau về kích thước và có tính không thuần nhất Các dạng IL-2 đã được glycosyl hoá khác nhau không khác nhau về chức năng nhưng có thể ảnh hưởng đến thời gian bán huỷ của IL-2 trong cơ thể

1.5.2 Tính chất của interleukin 2

IL-2 là interleukin đầu tiên được tìm thấy có tính chất giống như hormone trung gian hòa tan của hệ thống miễn dịch, có khả năng duy trì được đáp ứng tăng sinh của tế bào T và có khả năng kích thích tăng sinh kéo dài khi nuôi cấy các tế bào T và hoạt hoá chúng bằng kháng nguyên hoặc các chất kích thích phân bào thông thường (ở cả tế bào Th và tế bào Tc) [38] Sau khi gắn vào thụ thể có ái lực cao dành cho IL-2, IL-2 nhanh chóng đi vào trong tế bào sau đó kích thích hàng loạt các yếu tố nội bào và cuối cùng gây tăng sinh tế bào IL-2 gián tiếp ảnh hưởng đến chính nó bằng cách liên kết với các thụ thể IL-2 được biểu hiện bởi các tế bào lympho [4]

Bất kỳ tế bào T nào bộc lộ thụ thể có ái lực cao với IL-2 đều có thể đáp ứng lại IL-2 và tăng sinh bất chấp tính đặc hiệu kháng nguyên của nó Các tế bào lympho T ở giai đoạn nghỉ của chu trình tế bào không bộc lộ các thụ thể dành cho IL-2 ái lực cao và vì vậy khi có kích thích của IL-2 do các tế bào lân cận tiết ra nó cũng không tăng sinh mà chỉ sau khi các tế bào T đã được hoạt hoá bởi kháng nguyên hoặc các chất kích thích phân bào thì mới trang bị thêm cho tế bào thụ thể dành cho IL-2 với ái lực cao

Khi mối tương tác đặc hiệu giữa thụ thể trên tế bào T và phức hợp kháng nguyên-phân tử hoà hợp mô chủ yếu vẫn tiếp tục thì thụ thể dành cho IL-2 ái lực cao vẫn bị kích thích cho xuất hiện Chỉ khi mối tương tác này dừng lại thì sự biểu

lộ các thụ thể dành cho IL-2 cũng giảm đi, và bằng cách này sự điều hoà việc xuất

hiện của các thụ thể dành cho IL-2 ái lực cao sẽ điều biến sự mở rộng của một clone

tế bào thông qua IL-2

IL-2 cũng là cytokine đầu tiên cho thấy tác động gián tiếp của nó thông qua thụ thể IL-2 và nó cũng là interleukin đầu tiên được nhân dòng, biểu hiện trong thư viện cDNA Như vậy, mặc dù được đánh mã là interleukin 2 nhưng nó vẫn là phân

tử interleukin đầu tiên có thụ thể và gene được khám phá [21][24][30][43][44]

IL-2 là một thành viên của nhóm các cytokin gồm IL-4, IL-7, IL-9, IL-15 và IL-21, nó chuyển tín hiệu thông qua một phức hợp riêng biệt gồm có thụ thể IL-2 alpha (CD25), thụ thể IL-2 beta (CD122) và một chuỗi gamma chung (γc) là những yếu tố được sử dụng chung bởi tất cả các thành viên của nhóm cytokine này IL-2 thực hiện chức năng sinh lý của mình thông qua sự tương tác hoạt động với các phức hợp thụ cảm được tạo ra từ ba tiểu phần α, β và δ (IL-2Rα, - β và – δ) [4]

1.5.3 Chức năng miễn dịch

IL-2 rất cần thiết cho sự tăng trưởng và thực hiện chức năng của các tế bào

T Thông thường, IL-2 được cơ thể sinh ra trong một phản ứng miễn dịch [11][42] Kháng nguyên liên kết với các thụ thể tế bào T (TCR) kích thích sinh ra IL-2, và sự biểu hiện của các thụ thể IL-2 là IL-2R Sau đó, tương tác giữa IL-2/IL-2R kích thích sự tăng trưởng, sự khác biệt và sự tồn tại của kháng nguyên - các tế bào T gây độc tế bào kháng nguyên được lựa chọn thông qua kích hoạt sự biểu hiện của các gen cụ thể [9][10] [45] Như vậy, IL-2 rất cần thiết cho sự hình thành trí nhớ miễn dịch của các tế bào T, một trong những đặc tính quan trọng và đặc trưng của hệ miễn dịch [4]

IL-2 cũng rất cần thiết trong quá trình tế bào T phát triển trong tuyến ức đối với sự trưởng thành của một tập hợp các tế bào T được gọi là tế bào T điều hòa (T-regs) [40][48][49] Sau khi rời khỏi tuyến ức, chức năng của T-regs là ngăn chặn các tế bào T khác nhận diện và chống lại các ―kháng nguyên tự thân‖ mà có thể dẫn đến kết quả ―tự miễn dịch‖ Bằng cách trên, T-regs ngăn ngừa các tế bào đáp ứng không sản sinh ra IL-2, do đó IL-2 rất cần thiết trong nhận biết giữa những yếu tố tự thân và không tự thân Về chức năng, IL-2 kích thích sự sinh sôi của các tế bào

lympho phụ thuộc IL-2 và đóng vai trò như một chất điều hòa miễn dịch đối với các

tế bào lympho B, macrophages và các tế bào giết tự nhiên NK (natural killer cells) [4] IL-2 có khả năng kích thích sự sinh sôi, biệt hóa và tồn tại của các tế bào lympho độc nhận biết kháng nguyên đặc thù (antigen-selected cytotoxic T cells) thông qua việc hoạt hóa biểu hiện của một số gen đặc trưng [4]

1.5.4 Sử dụng interleukin 2 (IL-2) trong điều trị lâm sàng

IL-2 có liên quan đến rất nhiều bệnh khác nhau và đã được tiến hành thí nghiệm trong nhiều thử nghiệm lâm sàng như một liệu pháp miễn dịch để điều trị ung thư, nhiễm virus mạn tính và như một tá dược trong vacxin

Từ khi tác nhân này được sử dụng rộng rãi vào năm 1984, một lượng lớn các liều và kế hoạch sử dụng IL-2 được khảo sát trong nhiều nghiên cứu lâm sàng IL-2

đã được chấp nhận sử dụng trong điều trị ở nhiều quốc gia trên thế giới như Mỹ, Vương quốc Anh (United Kingdom) Viện tiêu chuẩn và kiểm soát sinh học quốc gia của Vương quốc Anh (United Kingdom) đã đưa ra tiêu chuẩn quốc tế đối với IL-2 Công ty Prometheus Laboratories đã sản xuất ra một loại IL-2 tái tổ hợp có tên thương mại là Proleukin để sử dụng trong lâm sàng Tuy nhiên, FDA cũng đã chỉ ra rằng việc sử dụng IL-2 trong điều trị HIV là không có hiệu quả Nhưng điều

đó không có nghĩa là chúng không có hiệu lực trong việc cải thiện số lượng tế bào

T Nhiều người khi trải qua liệu pháp điều trị bởi IL-2 được cải thiện đáng kể về số

lượng tế bào T cũng như sức khỏe tổng thể [32]

 Trong điều trị ung thư ác tính [32]

Điều trị hệ thống là giải pháp thường được sử dụng trong những trường hợp ung thư ác tính giai đoạn cuối Tuy nhiên, hoạt tính gây độc tế bào của các thuốc lại thường không đầy đủ vì vậy cần lựa chọn những liệu pháp thay thế Từ khi các vật liệu tái tổ hợp trở nên sẵn có trong ứng dụng lâm sàng thì liệu pháp miễn dịch được

sử dụng như một phương thức trong điều trị ung thư ác tính hiện nay Liệu pháp miễn dịch cơ bản dựa trên điều trị với các tác nhân đã được thiết kế để nâng cao khả năng đáp ứng miễn dịch của vật chủ để chống lại các mô ác tính, để đảo ngược các

tác nhân ức chế miễn dịch có liên quan đến căn bệnh ác tính, và để tăng cường khả năng sinh miễn dịch của các tế bào ung thư

Interleukin 2 (IL-2) là một cytokin có nhiều những đặc tính kích thích miễn dịch và có khả năng hỗ trợ tăng sinh của tế bào lympho T Hơn nữa, IL-2 làm tăng hoạt tính gây độc của các tế bào giết tự nhiên (NK-Natural killer), gây ra sự hình thành của các tế bào lymphokine-activated killer (LAK), kích thích sự tăng sinh và tạo ra globulin miễn dịch của các tế bào lympho B, đem lại tính chất gây độc tế bào của các tế bào bạch cầu đơn nhân và thúc đẩy sự sản sinh, giải phóng của nhiều loại cytokine thứ cấp bao gồm các tác nhân hoại tử khối u (TNF- tumour necrosis factor)

và interferon - γ (IFN- γ) Nhiều thử nghiệm đã cho thấy rằng, khi sử dụng IL-2 riêng lẻ hoặc kết hợp có khả năng tạo tế bào LAK kết quả là làm giảm đáng kể sự di căn được hình thành ở gan và phổi trong nhiều thử nghiệm ung thư ở động vật Thêm vào đó, sự kết hợp giữa IL-2 và interferon α (IFN- α) có tác dụng hiệp đồng chống ung thư (antitumour), và gia tăng hoạt tính chống ung thư cũng đã được ghi nhận khi IL-2 được kết hợp với TNF hay các tác nhân điều chỉnh miễn dịch khác như axit flavonc acctic hoặt các thuốc gây độc tế bào Ở những bệnh nhân ung thư, IL-2 có thể được sử dụng riêng lẻ hoặc kết hợp với các tác nhân khác hoặc cùng với

ex vivo hoạt hóa tế bào lympho như tế bào LAK hoặc các tế bào tumour-infitrating lymphocytes (TIL)

 Trong điều trị nhiễm HIV [32]

Sử dụng IL-2 trong điểu trị với những bệnh nhân nhiễm HIV và AIDS (Hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải_Aquired immune deficiency syndrome) đã được nghiên cứu trong nhiều năm Một trong những nguyên nhân gây suy giảm chính do virus HIV làm giảm một lượng tế bào Th CD4 và do đó IL-2 (được biết đến trước tiên như là tác nhân tăng trưởng tế bào T) có thể có giá trị trong điều trị lây nhiễm HIV Những nghiên cứu mô tả tác động động của liều dưới da của IL-2 được tinh sạch từ tế bào lympho người trên những bệnh nhân suy giảm miễn dịch cho thấy có sự thay đổi trong các phản ứng thử nghiệm này cũng khả năng nâng cao

tính phản ứng invitro với OKT3 (một kháng thể trực tiếp chống lại các tế bào T) Và

trong nghiên cứu sử dụng IL-2 IL-2 tái tổ hợp (rIL-2) ghi nhận sự suy giảm một phần của một dạng ung thư mô Kaposi‘s sarcoma ở một nhóm nhỏ các bệnh nhân AIDS Những thay đổi này xảy ra ở cả những bệnh nhân không có triệu chứng huyết thanh dương tính với AIDS và bệnh nhân AIDS Những kết quả này cho thấy rằng điều trị bằng rIL-2 mà không có tính độc hệ thống, nâng cao tình trạng miễn dịch của những bệnh nhân trên

Những nghiên cứu trong phòng thí nghiệm để đánh giá hiệu quả của rIL-2 lên đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào đặc hiệu với HIV (peptide gp41) cũng cho thấy rằng một lượng không đầy đủ các IL-2 nội sinh xuất hiện trong những cá nhân có triệu chứng và không có triệu chứng tăng đáp ứng kháng gp41; có triệu chứng gp41, không đáp ứng peptide (peptide non-responders) để làm tăng đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào kháng virus

 Điều trị nhiễm vi khuẩn Mycobacterial với IL-2 [32]

Gần đây, nhiễm trùng Mycobacterial nổi lên như một thách thức trong lâm sàng, đặc biệt là ở những bệnh nhân AIDS và những cá nhân tổn thương miễn dịch khác như nghiện rượu, thuốc lá Lao là một bệnh nguy hiểm đặt những người có khả năng miễn dịch bình thường ở những cá nhân nói trên vào tình trạng nguy hiểm Sự phát triển của phản ứng đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào mạnh là một đặc tính của quần thể tế bào Th1 CD4+, có thể có tác dụng tích cực trong kiểm soát và

loại trừ bệnh Mycobacterial

Giá trị của phương pháp điều trị bằng rIL-2 tái tổ hợp đối với M leprae là

một tác nhân gây bệnh phong đã được ghi nhận trên lâm sàng và cận lâm sàng Loại trừ tận gốc bệnh phong phụ thuộc nhiều vào sức mạnh của đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào, một đặc tính đặc biệt của T CD4+

và đại thực bào đã được kích hoạt Trong các thử nghiệm nghiên cứu trên mô hình chuột cho thấy, liệu pháp sử dụng Interleukin 2 tái tổ hợp (rIL-2 ) làm suy giảm các dòng vi khuẩn được tìm thấy trong các hạch lympho và trong gan chuột được điều trị bằng rIL-2

Những nghiên cứu về hiệu quả của liệu pháp rIL-2 ở bệnh nhân phong giai đoạn u hạt (lepromatous) cho liệu pháp rIL-2 làm tăng khả năng diệt các vi sinh vật

này gấp năm lần, đảo ngược một cách có hiệu quả trong điều chỉnh tình trạng miễn dịch của những bệnh nhân này do đó có tác dụng trong cải thiện tác động lâm sàng [32]

1.6 CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG HOẠT HÓA TẾ BÀO LYMPHO NGƯỜI CỦA CHẾ PHẨM SINH HỌC

Trên in vitro, để đánh giá hoạt động hoạt hóa và tăng sinh của tế bào có thể

sử dụng các phương pháp khác nhau như đánh giá hình thái và hoạt động chuyển hóa của tế bào

Các phương pháp sinh học được sử dụng: đếm tế bào bằng dùng hoặc không dùng thuốc nhuộm, đo sự giải phóng protein được đánh dấu 51Cr sau khi ly giải tế bào, đo sự hợp nhất của các nucleotide phóng xạ ([3

H]thymidine hoặc [125I]iododeoxyuridine) trong quá trình tăng sinh của tế bào và kỹ thuật MTT

1.6.1 Kỹ thuật đánh giá khả năng tồn tại của tế bào [55]

Các tế bào sống có lớp màng ngoài còn nguyên vẹn thường được đặc trưng bởi khả năng không bắt mầu thuốc nhuộm mà các tế bào chết hoặc ác tế bào bị hư hại không có được khả năng này Dựa vào khả năng bắt mầu thuốc nhuộm của các

tế bào, có thể dễ dàng đánh giá được tỉ lệ tế bào sống/tế bào chết theo thời gian nuôi

Có thể đánh giá sự tồn tại của tế bào sử dụng các phương pháp nhuộm khác nhau như:

- Sử dụng các đầu dò (probes) đối với màng tế bào như Propidium iodide (PI), 7-amino actinomycin D (7-AAD) hay dùng PI hoặc 7-AAD với các tế bào được gắn với các kháng thể gắn với PE Phân tích kết quả bằng phương pháp đếm tế bào dòng chảy

- Sử dụng các đầu dò (probes) thuộc về trạng thái sinh lý Khả năng tồn tại của

tế bào có thể được đánh giá trực tiếp thông qua sự hiện diện của tế bào chất esterases có thể tách đôi khỏi đầu dò không gắn huỳnh quang hòa tan trong lipid để thu được một sản phẩm huỳnh quang Sản phẩm này được tích lại và giữ ở bên

trong tế bào nếu màng tế bào nguyên vẹn Do đó tế bào chết không phát huỳnh quang hoặc phát huỳnh quang nhạt Những biến đổi trong hấp thụ hoặc lưu giữ thuốc nhuộm giữa các tế bào hoặc ở các điều kiện khác nhau ảnh hưởng đến hiệu quả của các probe cụ thể

- Đánh giá sự tồn tại của tế bào sử dụng kính hiển vi: Sử dụng phương pháp nhuộm trypan để phân biệt tế bào sống không bắt mầu thuốc nhuộm

1.6.2 Kỹ thuật đo sự hợp nhất của các nucleotide phóng xạ ([ 3 H]thymidine hoặc [ 125

I]iododeoxyuridine) (Kỹ thuật hấp thu Thymidine – Thymidine uptake assay) [56][57]

Thymidine (được gọi chính xác là deoxythymidine hay cũng có thể được gọi

là deoxyribosylthymine, và thymine deoxyriboside) là một hợp chất hóa học, chính xác hơn là một pyrimidine deoxynucleoside Deoxythymidine là một ADN nucleoside T bắt cặp với deoxyadenosine (A) trong chuỗi ADN đôi Trong sinh học tế bào, nó được sử dụng để đồng hóa tế bào trong pha S Thymidine hầu như chỉ tìm thấy ở trong ADN nhưng cũng tồn tại trong vòng T của tARN

Về thành phần, deoxythymidine là một nucleoside được tạo thành bởi deoxyribose (một đường 5 – pentose sugar) kết hợp với pyrimidine base thymine Deoxythymidine có thể phosphoryl hóa với một, hai hoặc ba nhóm axit phosphoric, tạo nên tương ứng các dTMP, DTDP hoặc DTTP (deoxythymidine mono- di- hoặc triphosphate)

Nghiên cứu về tăng sinh tế bào dựa trên kỹ thuật đồng nhất thymidine thường được sử dụng trong miễn dịch, ung thư, tế bào gốc và nghiên cứu về dược

để đánh giá khả năng của các hợp chất tự nhiên và tổng hợp kích thích hoặc ức chế

sự tăng sinh của các tế bào lympho và các tế bào khác

Nguyên lý của kỹ thuật tăng sinh tế bào dựa vào đo sự hợp nhất của các tiền chất ADN được đánh dấu phóng xạ, 3

C-MTT (mầu vàng) Formazan (mầu tím)

vào màng lọc bằng các thiết bị thu tế bào ADN đã đánh dấu được gắn với tế bào được thu nhận trên giấy lọc Các tấm giấy lọc này sẽ được chuyển vào trong các ống scintilation có trộn thêm scintilation Sử dụng máy đo scintilation để đo sự đồng nhất phóng xạ

Ưu điểm: Trực tiếp xác định sự tăng sinh của các tế bào khối u bạch huyết và các tế bào lai

Nhược điểm: Tạo gánh nặng trong xử lý chất thải phóng xạ

1.6.3 Kỹ thuật MTT [36]

Kỹ thuật MTT được Tim Mosmann đưa ra từ năm 1983 là một kỹ thuật đo màu định lượng để khảo sát sự tồn tại và tăng sinh tế bào động vật Kỹ thuật này dựa trên nguyên lý: Các tế bào sống và chuyển hóa có ti thể hoạt động sinh ra các enzyme mitochondrial dehydrogenase khử muối tetrazolium MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromine; công thức hóa học: C18H16BrN5S) tạo ra tinh thể formazan có mầu tím Lượng MTT được chuyển hóa hay lượng formazan được tạo ra tỷ lệ thuận với hoạt tính của các enzyme mitochondrial dehydrogenase hay hoạt động chuyển hóa của tế bào sống có trong môi trường nuôi cấy

Vòng tetrazolium được tách ra khi mitochondria hoạt động và phản ứng này chỉ xảy ra ở những tế bào sống

Hình 1.8: Sơ đồ chuyển hóa MTT