Nghiên cứu điều kiện thu nhận chế phẩm beta glucan và diterpenoid từ nấm đầu khỉ nhằm ứng dụng trong chế biến thực phẩm

Đây là loại nấm quý chứa đầy đủ các chất dinh dưỡng Amino axit amin, đường, Lipit, nguyên tố khoáng, Vitamin và đặc biệt được tập chung nghiên cứu các chất có hoạt tính sinh học cao như

i

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành Luận văn Thạc sĩ này, bên cạnh sự cố gắng nỗ lực của bản thân, tôi đã nhận được sự động viên và giúp đỡ rất lớn của nhiều thầy, cô giáo, gia đình và bạn bè

Với lòng biết ơn sâu sắc tôi xin chân thành gửi lời cảm ơn tới GS.TS Hoàng Đình Hòa – Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội và Ths Nguyễn Đức Tiến – Viện Cơ điện Nông nghiệp và Công nghệ sau thu hoạch, là những người

đã tận tình hướng dẫn, định hướng và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình nghiên cứu

và hoàn thành Luận văn

Tôi xin chân thành gửi lời cảm ơn tới toàn thể cán bộ nghiên cứu Viện Cơ điện Nông nghiệp và Công nghệ sau thu hoạch đã giúp đỡ, hướng dẫn và tạo điều kiện cho tôi trong quá trình nghiên cứu

Tôi xin chân thành gửi lời cảm ơn tới các thầy cô Viện Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm – ĐHBKHN đã tận tình giảng dạy, chỉ bảo và tạo điều kiện giúp đỡ tôi trau dồi kiến thức chuyên môn và cuộc sống

Tôi xin chân thành cảm ơn các bạn đồng môn lớp 13B.CNSH đã cùng tôi đồng hành, cùng tôi trải qua những năm Học viên dưới mái trường ĐHBKHN thân yêu

Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn tới những người thân trong gia đình và toàn thể bạn bè đã luôn là điểm tựa tinh thần vững chắc, chăm lo, động viên tôi, giúp tôi hoàn thành tốt Luận văn

Hà Nội, ngày 23 tháng 09 năm 2015

Nguyễn Thị Lan Anh

ii

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan: Kết quả của luận văn này là kết quả nghiên cứu của tôi được thực hiện dưới sự hướng dẫn khoa học của GS.TS Hoàng Đình Hòa trường Đại học Bách Khoa Hà Nội, cùng sự giúp đỡ của tập thể các cán bộ nghiên cứu, học viên, sinh viên đang làm việc tại phòng thí nghiệm Viện Cơ điện Nông nghiệp và Công nghệ sau thu hoạch

Nội dung luận văn có tham khảo và sử dụng các tài liệu, thông tin được đăng tải trên các tác phẩm, tạp chí và trang web theo danh mục tài liệu tham khảo của luận văn

Tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm với sự cam đoan trên

Hà Nội, ngày 23 tháng 09 năm 2015

Nguyễn Thị Lan Anh

iii

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

LỜI CAM ĐOAN ii

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT vii

DANH MỤC CÁC BẢNG viii

DANH MỤC CÁC HÌNH ix

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Giới thiệu về nấm Đầu khỉ (Hericium erinaceus) 3

1.1.1 Khái niệm, phân loại nấm Đầu khỉ 3

1.1.2 Đặc điểm hình thái và phân bố của nấm Đầu khỉ 4

1.1.3 Thành phần dinh dưỡng 5

1.1.4 Hoạt chất sinh học trong nấm Đầu khỉ 6

1.2 Beta-Glucan 9

1.2.1 Sơ lược về β-Glucan 9

1.2.2 Tính chất của β-glucan 11

1.2.3 Hoạt tính sinh học của β-glucan 11

1.3 Cyathane Diterpenoid 14

1.3.1 Sơ lược về Cyathane Diterpenoid 14

1.3.2 Tính chất của Cyathane Diterpenoid 16

1.3.3 Hoạt tính sinh học của Cyathane Diterpenoid 16

1.4 Thu nhận các hoạt chất sinh học từ nấm Đầu khỉ 17

1.4.1 Chiết xuất 17

1.4.2 Chiết xuất bằng sóng siêu âm 18

1.4.3 Cô đặc 22

1.4.4 Sấy chân không thu nhận sản phẩm 23

1.4.5 Chế phẩm nấm Đầu khỉ chiết xuất 24

1.5 Tình hình sản xuất và nghiên cứu nấm Đầu khỉ 25

1.5.1 Tình hình sản xuất và nghiên cứu nấm Đầu khỉ trên thế giới 25

iv

1.5.2 Tình hình sản xuất và nghiên cứu về nấm Đầu khỉ ở Việt Nam 27

CHƯƠNG II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 30

2.1 Vật liệu 30

2.1.1 Mẫu thực vật 30

2.1.2 Hóa chất 30

2.1.3 Dụng cụ và thiết bị 30

2.2 Phương pháp nghiên cứu 31

2.2.1 Phương pháp xác định độ ẩm 31

2.2.2 Phương pháp xác định phần trăm chất khô hòa tan 31

2.2.3 Định lượng β-glucan bằng phương pháp phenol-sulfuric 32

2.2.4 Định lượng Diterpenoid bằng phương pháp chiết phân đoạn 34

2.2.5 Phương pháp phân tích và xử lý số liệu 35

2.2.6 Lựa chọn nguyên liệu và điều kiện xử lý nguyên liệu để chiết xuất Diterpenoid và β-glucan từ nấm Đầu khỉ 35

2.2.6.1 Ảnh hưởng của nguồn nguyên liệu tới khả năng chiết xuất Diterpenoid và β-glucan từ nấm Đầu khỉ 35

2.2.6.2 Ảnh hưởng của kích thước nguyên liệu tới khả năng chiết xuất Diterpenoid và β-glucan từ nấm Đầu khỉ 36

2.2.7 Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng tới khả năng chiết xuất Diterpenoid và β-glucan từ nấm Đầu khỉ 36

2.2.7.1 Ảnh hưởng của dung môi tới khả năng chiết xuất Diterpenoid và β-glucan từ nấm Đầu khỉ 36

2.2.7.2 Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi/nguyên liệu (DM/NL) tới khả chiết xuất Diterpenoid và β-glucan từ nấm Đầu khỉ 36

2.2.7.3 Ảnh hưởng của cường độ sóng siêu âm tới khả chiết xuất Diterpenoid và β-glucan từ nấm Đầu khỉ 36

2.2.7.4 Ảnh hưởng của thời gian xử lý sóng siêu âm tới khả chiết xuất Diterpenoid và β-glucan từ nấm Đầu khỉ 36

v

β-glucan từ nấm Đầu khỉ 37 2.2.8 Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng tới chất lượng chế phẩm Heri-Ultra

T 37

Diterpenoid tổng và Tủa β-glucan tổng từ nấm Đầu khỉ 37

Heri-Ultra T 37 CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 38 3.1 Lựa chọn nguyên liệu và điều kiện xử lý nguyên liệu để chiết xuất Diterpenoid và β-glucan từ nấm Đầu khỉ 38 3.1.1 Ảnh hưởng nguồn nguyên liệu tới khả năng chiết xuất Diterpenoid và β-glucan từ nấm Đầu khỉ 38 3.1.2 Ảnh hưởng của kích thước nguyên liệu tới khả năng chiết xuất Diterpenoid và β-glucan từ nấm Đầu khỉ 39 3.2 Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng tới khả năng chiết xuất Diterpenoid và β-glucan từ nấm Đầu khỉ 41 3.2.1 Ảnh hưởng của dung môi tới khả năng chiết xuất Diterpenoid và β-glucan từ nấm Đầu khỉ 41 3.2.2 Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi/nguyên liệu (DM/NL) tới khả năng chiết xuất Diterpenoid và β-glucan từ nấm Đầu khỉ 44 3.2.3 Ảnh hưởng của cường độ sóng siêu âm tới khả năng chiết xuất Diterpenoid và β-glucan từ nấm Đầu khỉ 47 3.2.4 Ảnh hưởng của thời gian xử lý sóng siêu âm tới khả năng chiết xuất Diterpenoid và β-glucan từ nấm Đầu khỉ 49 3.2.5 Ảnh hưởng của nhiệt độ tới khả năng chiết xuất Diterpenoid và β-glucan từ nấm Đầu khỉ 51 3.3 Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng tới chất lượng chế phẩm Heri-Ultra T 54

vi

3.3.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ cô đặc chân không tới khả năng thu Cao

Diterpenoid tổng và Tủa β-glucan tổng từ nấm Đầu khỉ 54

3.3.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ sấy chân không tới chất lượng chế phẩm Heri-Ultra T 56

3.4 Đề xuất quy trình công nghệ sản xuất chế phẩm nấm Đầu khỉ chiết xuất (Heri – Utra T) bằng sóng siêu âm 57

CHƯƠNG IV KẾT LUẬN & KIẾN NGHỊ 68

4.1 Kết luận 68

4.2 Kiến nghị 68

TÀI LIỆU THAM KHẢO 70

PHỤ LỤC 76

vii

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Heri-Ultra T Chế phẩm nấm Đầu khỉ chiết xuất bằng sóng siêu âm HIV Virus gây hội chứng suy giảm miễn dịch ở người

HWE Chiết xuất nước nóng_Hot water extraction

LDL Lipoprotein tỷ trọng thấp_Low density lipoprotein NGF Yếu tố tăng trưởng thần kinh_Nerve growth factor

NK cell Tế bào giết tự nhiên_Natural killer cell

TNF Nhân tố hoại tử khối u_Tumor necrosis factor

UAE Chiết xuất hỗ trợ sóng siêu âm_Ultrasound assisted

extraction

viii

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Vị trí phân loại nấm Đầu khỉ……… 3 Bảng 1.2 Thành phần dinh dƣỡng của nấm Đầu khỉ trong 100g nấm khô…… 5 Bảng 1.3 Một số loại β-glucan……… ……… 10 Bảng 1.4 Sản lƣợng và tốc độ chiết xuất Polysaccharide từ ba loại nấm bằng UAE và HWE (tất cả đƣợc tính theo %, w/w của nấm nguyên liệu)………… 22

ix

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Nấm Đầu khỉ……… 3

Hình 1.2 Công thức cấu tạo Erinacines (A – I) phân lập từ nấm Đầu khỉ…… 8

Hình 1.3 Liên kết β-1,3 glicoside và β-1,6 glicoside……… 10

Hình 1.4 Liên kết β-1,3 glicoside; β-1,6 glicoside và β-1,3:β-1,6 glicoside của β-glucan……… 10

Hình 1.5 Cấu trúc lõi Cyathane Diterpenoid……… 15

Hình 1.6 Cấu trúc một số hợp chất tự nhiên thuộc nhóm Cyathane Diterpenoid……… 15

Hình 1.7 Quá trình hình thành, phát triển và nổ vỡ của bọt khí……… 20

Hình 1.8 Một số hệ thống thiết bị chiết xuất bằng sóng siêu âm……… 21

Hình 1.9 Một số dạng chế phẩm nấm Đầu khỉ chiết xuất……… 25

Hình 2.1 Nấm Đầu khỉ nguyên liệu khô……… 30

Hình 3.1 Ảnh hưởng nguồn nguyên liệu nấm Đầu khỉ đến hàm lượng Diterpenoid và β-glucan 38

Hình 3.2 Ảnh hưởng kích thước nguyên liệu nấm Đầu khỉ đến hàm lượng Diterpenoid và phần trăm chất khô hòa tan trong dịch chiết 40

Hình 3.3 Ảnh hưởng kích thước nguyên liệu nấm Đầu khỉ đến hàm lượng β-glucan và phần trăm chất khô hòa tan trong dịch chiết 40

Hình 3.4 Ảnh hưởng của dung môi đến hàm lượng Diterpenoid và phần trăm chất khô hòa tan trong dịch chiết nấm Đầu khỉ……… 42

Hình 3.5 Ảnh hưởng của dung môi đến hàm lượng β-glucan và phần trăm chất khô hòa tan trong dịch chiết nấm Đầu khỉ……… 43

Hình 3.6 Ảnh hưởng của tỷ lệ EtOH 80%/nguyên liệu đến hàm lượng Diterpenoid và phần trăm chất khô hòa tan trong dịch chiết nấm Đầu khỉ…… 45

Hình 3.7 Ảnh hưởng của tỷ lệ nước cất/nguyên liệu đến hàm lượng β-glucan và phần trăm chất khô hòa tan trong dịch chiết nấm Đầu khỉ……… 45

x

Hình 3.8 Ảnh hưởng của cường độ sóng siêu âm đến hàm lượng Diterpenoid và phần trăm chất khô hòa tan trong dịch chiết nấm Đầu khỉ……… 48 Hình 3.9 Ảnh hưởng của cường độ sóng siêu âm đến hàm lượng β-glucan và phần trăm chất khô hòa tan trong dịch chiết nấm Đầu khỉ……… 48 Hình 3.10 Ảnh hưởng của thời gian xử lý sóng siêu âm đến hàm lượng Diterpenoid và phần trăm chất khô hòa tan trong dịch chiết nấm Đầu khỉ…… 50 Hình 3.11 Ảnh hưởng của thời gian xử lý sóng siêu âm đến hàm lượng β-glucan

và phần trăm chất khô hòa tan trong dịch chiết nấm Đầu khỉ……… 50 Hình 3.12 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hàm lượng Diterpenoid và phần trăm chất khô hòa tan trong dịch chiết nấm Đầu khỉ……… 52 Hình 3.13 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hàm lượng β-glucan và phần trăm chất khô hòa tan trong dịch chiết nấm Đầu khỉ……… 52 Hình 3.14 Ảnh hưởng của nhiệt độ cô đặc chân không đến hàm lượng Cao Diterpenoid tổng và độ ẩm còn lại trong cao chiết nấm Đầu khỉ……… 55 Hình 3.15 Ảnh hưởng của nhiệt độ cô đặc chân không đến hàm lượng Tủa β-glucan tổng và độ ẩm còn lại trong cao chiết nấm Đầu khỉ……… 55 Hình 3.16 Ảnh hưởng của nhiệt độ sấy chân không tới chất lượng chế phẩm Heri-Ultra T chiết xuất từ nấm Đầu khỉ……… 57 Hình 3.17 Sơ đồ tạo chế phẩm nấm Đầu khỉ chiết xuất bằng sóng siêu âm (Heri-

Ultra T)……… 58

HV: Nguyễn Thị Lan Anh_CB130691 1

MỞ ĐẦU

Ngày nay, nhu cầu về thực phẩm không chỉ dừng lại ở yêu cầu về số lượng, chất lượng mà hướng tới tính an toàn, khả năng phòng và chữa bệnh Vì thế xu hướng sản xuất các chế phẩm thực phẩm đang rất được quan tâm do chúng chứa những thành phần có hoạt tính sinh học cao Các hoạt chất sinh học này được tách chiết từ các nguồn gốc khác nhau như động vật, thực vật, vi sinh vật, nấm Trong đó, việc tách chiết các hoạt chất sinh học từ nấm và đặc biệt là các loại nấm ăn, nấm dược liệu hiện đang được các nhà khoa học đặc biệt quan tâm

Nấm Đầu khỉ (Hericium erinaceum) là loại nấm dược liệu được tìm thấy

trong tự nhiên ở khắp các vùng ôn đới phía Bắc, bao gồm Châu Âu, Đông Á và Bắc Mỹ Đây là loại nấm quý chứa đầy đủ các chất dinh dưỡng (Amino axit amin, đường, Lipit, nguyên tố khoáng, Vitamin) và đặc biệt được tập chung nghiên cứu các chất có hoạt tính sinh học cao như : Polysaccharides (β-glucan)

và Diterpenoid (erinacine A-P), có tác dụng rất tốt trong việc hỗ trợ phòng chống

và điều trị bệnh dạ dày, phòng chống ung thư, chống khối u, cải thiện tình trạng suy giảm trí nhớ ở người cao tuổi, tăng trí nhớ, phòng chống và điều trị bệnh Alzheimer, tăng cường hệ miễn dịch, khả năng chống oxy hóa, kháng khuẩn

Trên thị trường hiện nay, các sản phẩm nấm Đầu khỉ hầu hết đều nhập ngoại từ Trung Quốc, Hàn Quốc có giá thành cao Mặt khác, tại Việt Nam, với nguồn nguyên liệu dồi dào, phong phú nhưng chủ yếu chỉ bán dưới dạng nguyên liệu thô, giá trị kinh tế còn thấp, các cơ sở chế biến nấm còn hạn chế, chưa có cơ

sở nào sản xuất chế phẩm nấm trích ly nguyên liệu Vì vậy, việc nghiên cứu chiết xuất hoạt chất sinh học và tạo sản phẩm chế phẩm từ nấm Đầu Khỉ để làm nguyên liệu cho chế biến thực phẩm, dược phẩm là cần thiết Tạo tiền đề cho phát triển ngành công nghiệp sản xuất hợp chất tự nhiên và khai thác hiệu quả hoạt chất sinh học từ nấm, nâng cao giá trị gia tăng của nấm dược liệu

Nhận thấy tiềm năng ứng dụng to lớn của chế phẩm chiết xuất từ nấm Đầu khỉ, Viện Cơ điện Nông nghiệp và Công nghệ Sau thu hoạch đã được Bộ khoa

học công nghệ giao thực hiện đề tài: “Nghiên cứu công nghệ, thiết bị trích ly

HV: Nguyễn Thị Lan Anh_CB130691 2

một số hoạt chất sinh học từ nấm dược liệu và ứng dụng trong sản xuất thực phẩm chức năng” mã số KC07.09/11/15, do ThS Nguyễn Đức Tiến làm chủ

nhiệm Trong nội dung nghiên cứu của đề tài có chuyên đề về tách chiết β-glucan

và Diterpenoid từ nấm Đầu khỉ Được phép của ông chủ nhiệm đề tài, tôi thực

hiện chuyên đề ―Nghiên cứu điều kiện thu nhận chế phẩm Beta Glucan và Diterpenoid từ nấm Đầu khỉ nhằm ứng dụng trong chế biến thực phẩm‖

Nội dung nghiên cứu gồm:

- Lựa chọn nguyên liệu và điều kiện xử lý nguyên liệu để chiết xuất Beta Glucan và Diterpenoid từ nấm Đầu khỉ

- Nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất các hoạt chất Beta Glucan và Diterpenoid từ nấm Đầu khỉ bằng sóng siêu âm

- Nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thu nhận hoạt chất Beta Glucan và Diterpenoid từ dịch chiết xuất

- Nghiên cứu đưa ra quy trình chiết xuất Beta Glucan và Diterpenoid từ nấm Đầu khỉ bằng sóng siêu âm

HV: Nguyễn Thị Lan Anh_CB130691 3

CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Giới thiệu về nấm Đầu khỉ (Hericium erinaceus)

1.1.1 Khái niệm, phân loại nấm Đầu khỉ

Nấm Đầu khỉ có tên khoa học là Hericium erinaceus thuộc họ Hericiaceae

là một loài nấm ăn và sử dụng như một loại dược liệu Nấm Đầu khỉ còn có tên gọi khác là nấm Hầu Thủ, nấm Lông Nhím, Lion’s mane (Châu Âu), Yamabushitake (Nhật) (hình 1.1) [20]

Loài (Species) H erinaceus

HV: Nguyễn Thị Lan Anh_CB130691 4

Năm 1964 Donk đã xác lập xếp Hericium erinaceum vào họ nấm tua Hericiaceae Chi Hericium phá gỗ (sống trên gốc cây, gỗ đốn hạ, …) Bào tử vỏ

hơi dày, nhẵn, hầu như không có tổ chức cuống và tán, tua bào tầng rất dài, mà

loài Hericium erinaceum là điển hình Ngoài ra các loài thuộc chi Hericium có

phổ hoạt chất đặc thù giống nhau, hầu hết các loài nấm thuộc chi này được trồng làm dược phẩm và là dược liệu qúy [10]

1.1.2 Đặc điểm hình thái và phân bố của nấm Đầu khỉ

Quả thể Nấm Đầu khỉ thường hình cầu hoặc hình ellip, mọc riêng rẽ hoặc thành chùm, không phân nhánh có kích thước 5 - 30cm Nấm Đầu khỉ có nhiều sợi dài dạng lông dày đặc, rũ xuống như đầu khỉ, lúc già tua dài và chuyển sang màu vàng trông như bờm sư tử [13][23]

Quả thể non tua ngắn, khi trưởng thành tua dài 3 - 6cm đường kính từ 1,8

- 3mm Quả thể khi non có màu trắng đến trắng ngà, thịt màu trắng, khi già nấm ngả sang màu vàng đến vàng sậm Quả thể cắt dọc mô thịt có màu trắng kem, khi

để lâu ngoài không khí ngả sang màu nâu đến nâu vàng, có hương thơm dễ chịu Bào tử sinh ra trên bề mặt các sợi tua Bào tử màu trắng, kích thước 6 -7mm, hình cầu hay gần cầu, trơn hay hơi nhăn [13][23]

Nấm Đầu khỉ không thể tự sản xuất được thức ăn riêng của nó mà lấy chất dinh dưỡng từ vật chủ, sinh trưởng và phát triển trên thân cây hoặc cành lớn, trên cây sống và cả gỗ mục từ cuối tháng 8 đến tháng 12 Chúng là loài nấm ôn đới chỉ phát triển được ở những nơi khí hậu mát mẻ Nhiệt độ thích hợp để nấm phát triển là 18 - 24ºC, nhiệt độ tối ưu nuôi trồng là 20ºC [12][13] [44]

Nấm Đầu khỉ được tìm thấy trong tự nhiên ở khắp các vùng ôn đới phía Bắc, bao gồm châu Âu, châu Á và Bắc Mỹ Theo ghi nhận của các nhà khoa học thì nấm xuất hiện ở 435 địa phương trên 23 quốc gia châu Âu và có trong sách đỏ của 13 các quốc gia như Anh, Pháp Ở một số nước châu Á như Trung Quốc, Nhật Bản loại nấm này lại khá phổ biến được sử dụng như một loại nấm ăn và dược liệu Tại Việt Nam nấm Đầu khỉ được trồng thử nghiệm ở nhiều nơi, chủ yếu là

HV: Nguyễn Thị Lan Anh_CB130691 5

những vùng có khí hậu mát mẻ nhƣ Đà Lạt, Lâm Đồng, Hà Tĩnh, Hải Phòng, Hƣng Yên, Hà Nội [12][23]

1.1.3 Thành phần dinh dƣỡng

Nấm Đầu khỉ đƣợc biết đến cách đây hàng trăm năm trong truyền thống

ẩm thực của Trung Quốc và Nhật Bản Nấm Đầu khỉ là loại thực phẩm bổ dƣỡng,

có mức cung cấp năng lƣợng vừa phải, thành phần dinh dƣỡng cân đối, giàu chất khoáng và vitamin Tuy nhiên ở các điều kiện nuôi trồng khác nhau sẽ khác nhau

về thành phần dinh dƣỡng, hàm lƣợng amino acid Các kết quả phân tích của Mizuno và cộng sự về thành phần của nấm Đầu khỉ trồng tại Trung Quốc và Nhật Bản đƣợc thể hiện ở bảng sau [31][32]:

Bảng 1.2 Thành phần dinh dưỡng của nấm Đầu khỉ trong 100g nấm khô

Thành phần Nấm ở Cát Lâm,

Trung Quốc

Nấm ở Nagano, Nhật Bản Tro

335 Cal

9.01 g 27.67 4.56 40.15 18.66

4370 117.2 8.0 Vitamin B1

Vitamin B2

Vitamin B6

0.69 mg 1.89

-

3.83 mg 3.14 0.41

HV: Nguyễn Thị Lan Anh_CB130691 6

-

-

0.15

- 16.17 451.4

Vitamin B1 và B2 nổi trội ở cả 2 loại sản phẩm nấm, song có lẽ nấm Nhật Bản giàu các loại vitamin hơn, nhất là provitamin D, có khả năng chuyển hóa thành các vitamin D2 và D3 giúp điều hòa trao đổi phospho-calcium, chống bệnh còi xương ở trẻ em, bệnh loãng xương, yếu xương Đáng lưu ý là trong thu hái, chế biến, việc phơi khô nấm tươi, làm hương vị nấm ngon hơn, hợp với khẩu vị hơn so với nấm tươi [3]

Nấm Đầu khỉ khá phong phú nguồn khoáng chất, giàu vitamin K, P, Mg,

…, với hàm lượng P chiếm khá cao,đặc biệt có cả Ge, một kim loại cực hiếm có hoạt tính chống ung thư Đặc biệt trong nấm Đầu khỉ có sự hiện diện đầy đủ 7 trong

số 16 loại acid amin thiết yếu cần cho cơ thể người và động vật [2][31]

1.1.4 Hoạt chất sinh học trong nấm Đầu khỉ

Từ đầu thế kỷ XX các nghiên cứu về nấm Đầu khỉ không chú trọng vào đặc điểm sinh dưỡng, nuôi trồng mà chuyển sang nghiên cứu về các thành phần hóa học, các hoạt tính sinh học của nấm và tác dụng Các nghiên cứu đã chỉ ra các hoạt động sinh học quan trọng của nấm, bao gồm: kích thích sinh tổng hợp yếu tố tăng trưởng thần kinh (NGF - nerve growth factor), ức chế khả năng gây độc của β-amyloid peptide, bảo vệ chống lại sự chết tế bào thần kinh gây ra bởi

sự oxy hóa, hoạt động kháng u, tăng cường miễn dịch, chống lại sự gây độc tế bào của các tế bào ung thư, hoạt động kháng khuẩn, tác dụng hạ đường huyết, hoạt động kháng HIV Cho đến nay đã thống kê được một số nhóm hợp chất hữu

cơ có hoạt tính sinh học chính như: Polysaccharides, Diterpenoid (Erinacines), Hericenone, acid béo, phenol, và và một số chất khác [20]

a Nhóm Polysaccharide

HV: Nguyễn Thị Lan Anh_CB130691 7

Hàm lượng Polysaccharides trong quả thể nấm Đầu khỉ chiếm tới 18,59% chủ yếu thuộc nhóm β-glucan Các Polysaccharide thô tan trong nước, được thu

từ quả thể nấm Đầu khỉ bằng cách chiết xuất nước nóng và kết tủa với ethanol sau đó chúng được phân đoạn bằng DEAE-cellulose và sắc ký cột Sepharose CL-6B Kết quả thu bốn phân đoạn Polysaccharide tên HEF-NP Fr I, HEF-NP Fr II, HEF-AP Fr I, và HEF-AP Fr II Trong đó HEF-AP Fr II đã được chứng minh có chức năng trung gian kích hoạt các đại thực bào, chẳng hạn như sản xuất oxit nitric và biểu hiện các cytokine (IL-1β và TNF-α) HEF-AP Fr II là Polysaccharide có khối lượng phân tử thấp 13 kDa có cấu trúc xoắn ba cấu tạo bởi liên kết β-1,3-nhánh β-1,6-glucan [25]

Một phân tích HPLC cho thấy Polysaccharides trong quả thể nấm bao gồm sáu loại monosaccharide, cụ thể là glucose (68,4%), arabinose (11,3%), xylose (7,8%), mannose (5.2%), ribose (2,7%) và galactose (2,5%) [18]

Các Polysaccharides của nấm Đầu khỉ như: xylan, glucoylan, heteroxyglucan và phức hợp protein của chúng có các đặc tính cải thiện đáp ứng sinh học, có lợi cho khả năng miễn dịch Trong nghiên cứu thực nghiệm kháng ung thư của Polysaccharides ở nấm Đầu khỉ có 5 loại Polysaccharides được phân lập là Flo-a-α; Flo-a-β; Flo-b; FIIo-1 và FIII-2b có hoạt tính kháng ung thư và tác dụng kéo dài thời gian sống Polysaccharides chiết xuất từ nấm Đầu khỉ rất phong phú, trong đó hợp chất chính có hoạt tính kháng u, tăng cường miễn dịch

là β-1,3/1,6-D-Glucan [32][33]

b Nhóm Diterpenoid

Erinacines (A-P) là những hợp chất Cyathane Diterpenoid được phân lập từ quả thể và sợi nấm nuôi cấy của nấm Đầu khỉ đã được chứng minh có hoạt tính kích thích sinh tổng hợp NGF từ tế bào hình sao và đã được đề xuất làm thuốc chữa chứng rối loạn thoái hóa thần kinh như bệnh Alzheimer và tái tạo các dây thần kinh ngoại biên[19][21][24] [28][46] Tuy nhiên, cơ chế mà Erinacine bảo vệ thần kinh chống lại tổn thương do thiếu máu lên não vẫn chưa được hiểu rõ [26]

HV: Nguyễn Thị Lan Anh_CB130691 8

Theo Eun Woo Lee và cộng sự đã phân lập Diterpenoids erinacines H và I từ nấm Đầu Khỉ có tác dụng tốt đối với hệ thống thần kinh trong hỗ trợ điều trị bệnh Alzheimer ngăn cản quá trình lão hóa và phục hồi các neuron thần kinh Cấu trúc của các hợp chất đã được xác định bằng cách phân tích các dữ liệu quang phổ Erinacine

H cho thấy hoạt động kích thích sinh tổng hợp NGF của các tế bào hoạt động astroglial ở chuột Số NGF (31,5 ± 1,7 pg/ml) tiết vào môi trường với sự có mặt 33,3 mg/ml erinacine H lớn hơn năm lần so với trường hợp không cung cấp hợp chất này [24]

Hình 1.2 Công thức cấu tạo Erinacines (A – I) phân lập từ nấm Đầu khỉ

Yếu tố tăng trưởng thần kinh NGF là một hoạt chất trong não có vai trò thúc đẩy sự tăng trưởng và phát triển của tế bào thần kinh Yếu tố này đóng một

HV: Nguyễn Thị Lan Anh_CB130691 9

vai trò quan trọng trong sự phát triển và tồn tại của các tế bào thần kinh trong cả

hệ thống thần kinh trung ương và ngoại vi NGF thấp hơn so với mức bình thường có thể là dấu hiệu liên quan đến giai đoạn đầu của bệnh Alzheimer và chứng mất trí Deterpenoid erinacine đã thể hiện tiềm năng đáng kể trong việc kích thích tổng hợp NGF, khả năng này như là tác nhân để điều trị các bệnh thoái hóa thần kinh như bệnh Alzheimer hoặc bệnh Parkinson [34]

c D-threitol, D-arabinitol và palmitic acid

Wang và cộng sự nghiên cứu nhóm hoạt chất sinh học này có tác dụng hạ

đường huyết, giảm nồng độ cholesterol xấu đồng thời cũng là tác nhân chống oxy hóa Các thử nghiệm trên chuột cho thấy liều dùng có tác dụng là 100 mg/kg trọng lượng cơ thể [43]

1.2 Beta-Glucan

1.2.1 Sơ lược về β-Glucan

glucan là một Polysaccarit của D-glucose được tạo nên từ các liên kết glycoside β-glucan trong tự nhiên thường có trong thành tế bào thực vật, hạt ngũ cốc, nấm men, nấm và vi khuẩn Với các dẫn chất (1,3)-β-D-glucan, cấu tạo phân

β-tử có thể chỉ là 1 mạch thẳng tạo bởi các liên kết 1→3 hay có thể ―phân nhánh‖ bởi các liên kết 1→6 hay 1→4 Người ta thường gọi chúng là các (1,3/1,6)-β-D-glucan hay (1,3/1,4)-β-D-glucan [47]

Kiểu cấu tạo mạch của các (1,3)-β–D-glucan có sự phân biệt khá lớn theo nguồn gốc sinh vật của chúng Các (1,3)-β–D-glucan của vi khuẩn thường là một

mạch thẳng (ví dụ như curdlan của loài vi khuẩn Agrobacterium biobar) Các

(1,3)-β–D-glucan của nấm thường là một mạch phân nhánh dạng xương cá với mạch nhánh ngắn nối vào mạch chính bằng dây nối 1→6, (ví dụ như

schizophyllan của nấm Schizophyllum commune) Các (1,3)-β–D-glucan của nấm

men có cấu tạo tương tự như của nấm nhưng có mạch nhánh dài hơn Các (1,3)- β-D-glucan của thực vật bậc cao là một mạch thẳng 1→3 trên đó xen kẽ nhánh

1→4 [40][41]

HV: Nguyễn Thị Lan Anh_CB130691 10

Hình 1.3 Liên kết β-1,3 glicoside và β-1,6 glicoside

Hình 1.4 Liên kết β-1,3 glicoside; β-1,6 glicoside và β-1,3:β-1,6 glicoside của

β-glucan

HV: Nguyễn Thị Lan Anh_CB130691 11

1.2.2 Tính chất của β-glucan

β-glucan không hòa tan trong ethanol, aceton nhưng lại tan trong NaOH

và (CH3)2SO, tan ít trong nước Sự hòa tan này do sự giảm bậc trong cấu trúc hóa học dưới tác động của chất oxy hóa mạnh Dung dịch nước của các β-glucan ở nồng độ cao có độ nhớt cao Do có cấu trúc mạch xoắn dài nên dung dịch (1,3)- β–D-glucan trong nước cũng có tính chất tạo gel Mức độ hòa tan và khả năng tạo gel của (1,3)-β–D-glucan phụ thuộc vào khối lượng phân tử và mức độ phân nhánh của chúng [7]

1.2.3 Hoạt tính sinh học của β-glucan

Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng β-glucan với liên kết (1,3/1,6) có hoạt tính sinh học cao hơn β-glucan với liên kết (1,4/1,6) Sự khác nhau về độ phân nhánh, trọng lượng phân tử và bậc cấu trúc β-glucan sẽ ảnh hưởng đến tính hòa tan, hoạt động và hoạt tính sinh học của chúng β-glucan càng phân nhánh mạnh hoạt tính sinh học càng cao Một số hoạt tính sinh học nổi trội của β-glucan như là khả năng tăng cường miễn dịch, hoạt tính chống khối u, chống viêm, kháng khuẩn, hạ cholestrol, trị đái tháo đường, hạ đường huyết, … Thông thường con người sử dụng 100 mg một ngày để hỗ trợ khả năng miễn dịch và làm giảm cholesterol Nếu bạn đang điều trị và muốn bổ sung β-glucan vào liều thuốc của bạn, bạn có thể bổ sung 200-500 mg một ngày Nếu bạn mắc phải tiểu đường, ung thư hoặc bệnh khác nghiêm trọng, bạn có thể sử dụng đến 300-500 mg một ngày trong một năm và sau đó giảm xuống duy trì ở liều lượng 100 mg thông thường Nó không

có tác dụng phụ nào cả, ngay cả ở liều cao và có thể sử dụng chung với thuốc theo toa [29][47]

a Khả năng tăng cường miễn dịch

Đặc tính sinh học quan trọng được chú ý nhiều nhất của β-glucan là khả năng tăng cường miễn dịch Nó được xem là chất tăng cường miễn dịch tự nhiên mạnh mẽ nhất mà khoa học từng biết đến Cơ thể người có các tế bào bạch cầu lớn hay còn gọi là đại thực bào (macrophages), bạch cầu trung tính (neutrophils)

và các tế bào khác được tìm thấy trong tất cả các mô của cơ thể Các tế bào này

HV: Nguyễn Thị Lan Anh_CB130691 12

giúp diệt vi khuẩn, tế bào lạ xâm nhập cơ thể, các tế bào đã và đang chết, các tế bào đột biến và các chất độc khác trong máu Bạch cầu là những tế bào quan trọng nhất trong hệ thống miễn dịch của cơ thể người Ví dụ, các tế bào giết tự nhiên (natural killer-NK) giúp tiêu diệt các tế bào ung thư và các tế bào nhiễm bệnh đi kèm Những tế bào quan trọng trong hệ thống miễn dịch này bằng cách nào đó được kích hoạt và tăng cường bởi β-glucan β-glucan giúp tăng cường miễn dịch bằng cách kích hoạt các tế bào đại thực bào, tăng gấp đôi số lượng của chúng trong 24 giờ β-glucan hữu ích trong điều trị nhiều bệnh liên quan đến miễn dịch [29]

Tại Đại học Tulane tại New Orleans vào năm 1987, các nhà nghiên cứu cho thấy β-glucan tăng cường sản xuất interleukin-1 (IL-1) và interleukin-2 (IL-2) ở chuột Mức độ huyết tương của IL-1 và IL-2 được đo sau khi chuột được cung cấp β-glucan Kết quả cho thấy, 1,3-β-glucan tăng cường tạo ra IL-1 và IL-

2 và việc tăng cường sản xuất lymphokine có thể được duy trì đến 12 ngày (Mức lymphokine cao sẽ kích thích hệ miễn dịch) [29]

Năm 1989, tại Nhật Bản đã tiêm thử nghiệm β-glucan chiết xuất từ nấm

(Sclerotinia) lên chuột, kết quả cho thấy: β-glucan giúp tăng cường hoạt động

của tế bào NK có trong lá lách Khi tế bào NK gắn kết với β-glucan đã làm tăng

tỷ lệ gắn kết của tế bào lympho và các tế bào bị hư hại cần xử lý Nói một cách đơn giản, beta glucan giúp các tế bào NK mạnh hơn và hiệu quả hơn [29]

b Hoạt tính chống khối u

Đặc tính sinh học quan trọng của β-glucan là khả năng phòng chống khối u β-glucan gắn kết với các receptor trên bề mặt đại thực bào và kích hoạt chúng Khi ở trạng thái kích hoạt, chúng nhận ra và tiêu diệt các tế bào đột biến và có hoạt tính kháng ung thư một cách rõ rệt trên dòng tế bào ung thư

Yan và cộng sự viện nghiên cứu Ung thư Mỹ đã chỉ ra rằng các glucan ở dạng hòa tan gắn kết với các bạch cầu tại thụ thể của receptor 3 (CR3), làm mồi cho receptor khởi đầu quá trình mất nhân gây độc tính của các bạch cầu khi bạch cầu CR3 gắn kết với khối u mặt ngoài bổ thể 3 (iC3b) Như vậy, sự gắn

(1,3)-β-D-HV: Nguyễn Thị Lan Anh_CB130691 13

kết của các (1,3)-β–D-glucan vào CR3 của bạch cầu sẽ kích thích bạch cầu tiêu diệt các tế bào khối u có lớp vỏ iC3b [45]

Các β-glucan làm tăng sản xuất đại thực bào, bạch cầu và các tế bào tiêu diệt ung thư của cơ thể cũng như tăng hoạt tính của các tế bào T-helper, làm tăng IL-1, and TNFα Các yếu tố này có tác dụng trên việc ngăn cản sự phát triển khối

u trên động vật thử nghiệm Tại Đại học Joseph Fourier ở Pháp β–D-glucan từ

Laetisaria (một loại nấm Basidiomycete) đã được nghiên cứu về tác dụng đối với

khối u rắn Sarcoma 180 ở chuột Các polysaccharide hạn chế mạnh mẽ sự phát triển khối u với một tỷ lệ gần như 100% [29]

c Hoạt tính kháng khuẩn

Các nghiên cứu in vitro cho thấy một số β–D-glucan có tác dụng làm gia

tăng các hoạt tính chức năng của đại thực bào kích thích tiết TNFα, làm hoạt hóa chức năng kháng khuẩn của bạch cầu đơn nhân và bạch cầu trung tính, làm tăng đáp ứng miễn dịch bởi gia tăng sản xuất cytokin tiền viêm và sản xuất chemokin Các đặc tính này giúp cơ thể chống lại sự nhiễm khuẩn cũng như tiêu diệt các tác nhân gây bệnh

Năm 1990, Virus sốt rét (Plasmodium berghi) đã được tiêm vào những con

chuột và glucan giúp ngăn ngừa cái chết ở hầu hết những con chuột được tiêm trong khi những con chuột không được tiêm đều đã chết Các kết quả nghiên cứu cho thấy glucan hỗ trợ khả năng miễn dịch của hệ thống phòng ngự nơi vật chủ chống lại virus gây bệnh sốt rét [29]

Tại Bệnh viện Quốc gia tại Oslo năm 1998 Nghiên cứu tiêm β-glucan vào

chuột trước khi chúng bị nhiễm vi khuẩn chết người Mycobacterium bovis

Những con chuột được điều trị với β-glucan cho thấy con số thấp hơn đáng kể của các vi khuẩn trong cơ thể và đặc biệt là trong lá lách và gan Các kết quả cho

thấy β-glucan có tác dụng bảo vệ chống lại vi khuẩn Mycobacterium bovis [29]

d Hoạt tính hạ cholesterol

Nghiên cứu thử nghiệm tại Trung tâm Nghiên cứu lâm sàng Chicago trên

268 người (đàn ông và phụ nữ) có hàm lượng cholesterol cao đã được cho sử

HV: Nguyễn Thị Lan Anh_CB130691 14

dụng β-glucan Kết quả chứng minh rằng các đối tượng mắc phải hiện tượng tăng cholesterol huyết (hypercholestemia) ở mức độ nhẹ đến vừa phải có thể làm giảm lượng LDL và cholesterol bằng cách hấp thụ một nhóm các sterol thực vật và beta glucan chứa trong thực phẩm như là một phần của một chế độ ăn ít chất béo bão hòa và cholesterol [29]

e Khả năng hạ đường huyết

Năm 1989 tại Nhật Bản, một nghiên cứu những ảnh hưởng của việc cho glucan vào chuột Brattleboro bị bệnh tiểu đường nhóm 1 Nhận thấy rằng β-glucan có khả năng ức chế bệnh tiểu đường loại 1 và 2 (mellitus and insulinitis) β-glucan cũng làm tăng lượng bạch huyết cầu trong máu của chuột thử nghiệm Thí nghiệm này đã tạo tiền đề cho các nghiên cứu trên người với bệnh tiểu đường

β-và rối loạn đường máu khác [29]

Nhật Bản năm 1992, một nghiên cứu nữa trên chuột về bệnh tiểu đường nhóm 2 (insulinitis) đã được thử nghiệm Tỷ lệ bệnh tiểu đường đã giảm từ 43,3% xuống còn 6,7%, tỷ lệ insulinitis đã giảm từ 82,4% xuống 26,3% chỉ đơn giản bằng cách cho chuột uống β-glucan chiết xuất từ nấm Hương mà không điều trị gì khác Hầu hết tất cả các con chuột không bị mắc lại bệnh tiểu đường ngay

cả khi ngưng cung cấp chất bổ sung, điều này cho thấy β-glucan không phải chỉ đơn thuần làm giảm mà còn đã chữa lành hẳn bệnh [29]

1.3 Cyathane Diterpenoid

1.3.1 Sơ lược về Cyathane Diterpenoid

Diterpenoid là một nhóm hợp chất có bộ khung 20 Carbon và tuân theo quy tắc liên kết isoprene trong phân tử (4 phân tử isoprene) [7]

HV: Nguyễn Thị Lan Anh_CB130691 15

Cyathane Diterpenoid là các sản phẩm tự nhiên đƣợc phân lập từ rất nhiều loại nấm, quả thực vật, có cấu trúc vòng ngƣng tụ là bộ khung lõi carbon 3 vòng (5-6-7) đặc trƣng, với hai trung tâm carbon bậc 4 tại nút giao 2 vòng ngƣng tụ B-

C (hình 1.5) [30]

Hình 1.5 Cấu trúc lõi Cyathane Diterpenoid

Số lƣợng các sản phẩm tự nhiên đã đƣợc phân lập trong nhóm hợp chất này đã lên tới 100 nhóm chất bao gồm: các Allocyathins, Erinacines, Sarcodonins, Scabronines, Striatals, Cyanthiwigins, Cyafrins,… tất cả đều có bộ khung carbon đƣợc bảo tồn theo bộ khung Cyathane Diterpenoid (hình 1.6) [30]

Hình 1.6 Cấu trúc một số hợp chất tự nhiên thuộc nhóm Cyathane Diterpenoid

HV: Nguyễn Thị Lan Anh_CB130691 16

Trong bộ khung Cyathane 20 carbon có một số nét đặc trưng như: tại vị trí carbon bậc 4 bất đối xứng C6 và C9 có chứa nhóm methyl trên vòng ngưng tụ, sự hiện diện của một chuỗi bên isopropyl tại vị trí C3 và một nguyên tử carbon ngoài vòng liên kết với C12 [30]

1.3.2 Tính chất của Cyathane Diterpenoid

Đặc tính chung của các Cyathane Diterpenoid là không bay hơi kể cả ở nhiệt độ cao, tan trong các dung môi hữu cơ (eter ethyl, cloroform, ethanol…), không tan trong nước trừ khi chúng kết hợp với đường tạo thành glycoside Sự oxi hoá thường hay xảy ra nhiều hơn ở các nhóm trong phân tử và ta thấy xuất hiện nhiều phản ứng tạo eter hoặc lacton Các tương tác giữa các nhóm không liên kết trực tiếp với nhau thường làm cho khung Carbon bị biến dạng và dẫn tới nhiều chuyển hóa khác nhau [7]

1.3.3 Hoạt tính sinh học của Cyathane Diterpenoid [30]

Các Diterpenoid có hoạt tính sinh học vô cùng phong phú Một loạt các sự oxy hóa và chưa bão hòa về bộ khung ba vòng, dẫn đến một loạt các hoạt động sinh học của nhóm hợp chất này, bao gồm: khả năng kháng khuẩn, chống viêm, chống ung thư và các điều chỉnh dinh dưỡng thần kinh

Các hoạt động sinh học của các sản phẩm tự nhiên Cyathane Diterpenoid rất khác nhau giữa các phân tử khác nhau trong lớp

Năm 1970, Ayer và cộng sự đã phân lập được hợp chất đầu tiên trong nhóm

Cyathane Diterpenoid từ nấm tổ chim Cyathus helenae Bao gồm Cyathin A3 và Allocyathin B3 đặc trưng bởi hoạt tính kháng khuẩn Những năm sau đó, một loạt các Cyathane Diterpenoid khác đã được lập, bao gồm cả Allocyathin B2 từ các

nguồn nấm C helenaeand khác nhau Các hợp chất này đều thể hiện hoạt tính

kháng khuẩn đối với cả vi khuẩn gram dương và gram âm

Một số hợp chất của nhóm Cyanthiwigin đã thể hiện hoạt động chống lại sự gây độc tế bào người trên các khối u, cũng như tế bào bạch cầu ở chuột P388 và

tế bào u A549 phổi và các hoạt động chống HIV

HV: Nguyễn Thị Lan Anh_CB130691 17

Tuy nhiên, các hoạt động sinh học quan trọng nhất được báo cáo của Cyathane Diterpenoid là khả năng sinh tổng hợp các NGF Các hợp chất điển

hình như các Glaucopines và Cyrneines đã được phân lập từ nấm Sarcodon glaucopus và Sarcodon cyrneus, các Erinacines được phân lập từ các loài Hericium, đặc biệt từ nấm Đầu khỉ (H erinaceum)

1.4 Thu nhận các hoạt chất sinh học từ nấm Đầu khỉ

1.4.1 Chiết xuất

Chiết xuất là phương pháp sử dụng dung môi để lấy các chất tan ra khỏi các mô thực vật Sản phẩm thu được của quá trình chiết xuất là một dung dịch của các chất hòa tan trong dung môi Có ba quá trình quan trọng đồng thời xảy ra trong chiết xuất là [48]:

- Sự hòa tan của chất tan vào dung môi

- Sự khuyếch tán của chất tan từ nguyên liệu vào dung môi

- Sự dịch chuyển của các phân tử chất tan qua vách tế bào thực vật

Các yếu tố ảnh hưởng lên ba quá trình này (bản chất của chất tan, dung môi, nhiệt độ, áp suất, cấu tạo của vách tế bào, kích thước bột dược liệu ) sẽ quyết định chất lượng và hiệu quả của quá trình chiết xuất

Hầu hết các phân tử sinh học đều nằm trong các tế bào, để tách chúng bằng cách phá vỡ thành tế bào cho dung môi hòa chất nội bào và khuếch tán chúng ra môi trường chiết Hiện nay, nguyên tắc phá vỡ tế bào chủ yếu bằng phương pháp cơ học và thẩm thấu hóa học Hiệu quả của từng phương pháp dựa trên mức hoạt động của enzym trong tế bào được giải phóng ra và mức độ phá vỡ

tế bào

Phương pháp cơ học phá vỡ vật lý, giải phóng các chất bên trong tế bào vào môi trường xung quanh Các thiết bị phá vỡ tế bào gồm có máy đồng nhất, máy nghiền bi và khuấy trộn Quá trình phá vỡ tế bào được thực hiện bằng hiệu ứng va chạm của các tế bào dưới tác dụng của áp suất, dẫn đến sự phá vỡ tế bào, giải phóng các phần tử bên trong Phá vỡ tế bào bằng phương pháp cơ học chi phí năng lượng cao

HV: Nguyễn Thị Lan Anh_CB130691 18

Phương pháp hóa học tách các chất bên trong tế bào vi sinh vật bằng cách thẩm thấu hóa màng ngăn bên ngoài tế bào Sử dụng các dung môi hữu cơ: toluen, ether, phenylethyl alcohol, DMSO, benzene, methanol, tác động để tạo thành các kênh dẫn qua màng tế bào hoặc sử dụng các men như glycanases beta (1-6) và beta (1-3), protease và mannase Các protein cơ bản, như protamine hoặc cationic polysaccharide chitosan cũng có thể gây thẩm thấu hóa tế bào Hạn chế chính của phương pháp chiết xuất hóa học là tốc độ chiết xuất chậm, giá thành cao và yêu cầu phải loại bỏ các dung môi chiết tách từ sản phẩm cuối cùng Ngoài ra phương pháp này thường chỉ chiết xuất được các chất bao ngoài hoặc gần bề mặt tế bào

Ngoài các phương pháp kỹ thuật chiết cổ điển như trên, các kỹ thuật chiết mới như chiết với sự hỗ trợ của sóng siêu âm, chiết chất lỏng quá tới hạn, chiết dưới áp suất cao v.v đã được phát triển để nâng cao hiệu quả cũng như chất lượng chiết xuất Ngày nay, siêu âm là một lĩnh vực đang được nghiên cứu và có tiềm năng phát triển rất lớn trong y học, thực phẩm nói chung cũng như áp dụng vào quá trình chiết xuất các hoạt chất sinh học từ thực vật nói riêng [48]

1.4.2 Chiết xuất bằng sóng siêu âm

Định nghĩa sóng siêu âm: Siêu âm là sóng cơ học hình thành do sự lan

truyền dao động của các phần tử trong không gian có tần số lớn hơn giới hạn trên ngưỡng nghe của con người, tức là trên 16 kHz [15]

Phân loại sóng siêu âm: Dựa vào tần số, cường độ sóng siêu âm việc sử

dụng siêu âm được chia thành hai nhóm [15]:

- Năng lượng thấp (công suất thấp, cường độ thấp, tần số cao) tần số cao hơn 100 kHz ở mức cường độ dưới 1 W/cm2 Siêu âm cường độ thấp sử dụng mức công suất quá nhỏ do sóng siêu âm gây ra không làm thay đổi bản chất, thuộc tính của nguyên liệu sóng đi qua Được ứng dụng trong kỹ thuật phân tích (thành phần, cấu trúc, trạng thái vật lý) thực phẩm cho kết quả nhanh chóng, chính xác, không phá hủy cấu trúc sản phẩm

HV: Nguyễn Thị Lan Anh_CB130691 19

- Năng lượng cao (công suất cao, cường độ cao, tần số thấp từ 18 đến 100 kHz) ở mức cường độ cao trên 1 W/cm2, thường từ 10 – 1000 W/cm2 Ảnh hưởng vật lý, cơ học, hóa học của sóng siêu âm trong vùng này có khả năng làm thay đổi tính chất nguyên liệu (phá vỡ cấu trúc, tăng cường hoặc ức chế một số phản ứng hóa học nhất định) Các sóng âm thanh cường độ cao có thể gây ra áp lực cao bên trong các loại thực phẩm dạng lỏng, hình thành các bọt khí, tạo ra các dòng bọt khí cực nhỏ (microbubbles) chuyển động nhanh rồi nổ vỡ dữ dội Ứng dụng trong nhiều lĩnh vực đặc biệt là nghiên cứu chế biến thực phẩm để tạo nhũ tương, phá vỡ các tế bào, sự chiết xuất, đồng hóa, lọc, kết tinh, rã đông, và lạnh đông, trong khi một số nhóm nghiên cứu trên thế giới đang nghiên cứu khả năng vô hoạt hệ vi sinh vật và enzyme trong thực phẩm

Nguyên lý tác động của sóng siêu âm:

Cơ chế xâm thực khí của sóng siêu âm: Khi sóng siêu âm truyền vào môi

trường chất lỏng, các chu trình kéo và nén liên tiếp được tạo thành Trong điều kiện bình thường, các phân tử chất lỏng ở rất gần nhau nhờ liên kết hóa học Khi có sóng siêu âm, trong chu trình nén các phân tử ở gần nhau hơn và trong chu trình kéo chúng

bị tách ra xa Áp lực âm trong chu trình kéo đủ mạnh để thắng các lực liên kết giữa các phân tử, những vùng này áp lực thay đổi và hình thành bọt khí nhỏ Trong chu trình dao động sóng, diện tích bề mặt bọt khí tăng lên theo thời gian, làm tăng sự khuếch tán khí Sóng siêu âm rung động những bọt khí này, tạo nên hiện tượng ―sốc

sóng” Bọt khí ổn định trong chu trình sóng có thể lôi kéo những bọt khí khác vào

trong trường sóng, kết hợp lại với nhau và tạo thành dòng nhiệt nhỏ [15][42] Các bọt khí tạm thời có kích thước thay đổi rất nhanh, chỉ qua vài chu trình chúng bị vỡ ra, hình thành nên những điểm có nhiệt độ và áp suất cao đạt được trong bọt khí nổ [37] Hiện tượng xâm thực khí mở đầu cho rất nhiều phản ứng do có sự hình thành các ion

tự do trong dung dịch, thúc đẩy các phản ứng hóa học, hỗ trợ trích ly các chất tan [15]

HV: Nguyễn Thị Lan Anh_CB130691 20

Hình 1.7 Quá trình hình thành, phát triển và nổ vỡ của bọt khí

Hiện tượng vi xoáy: Sóng siêu âm cường độ cao truyền vào trong chất

lỏng sẽ gây nên sự kích thích mãnh liệt Tại bề mặt tiếp xúc giữa 2 pha lỏng/rắn hay khí/rắn, sóng siêu âm gây nên sự hỗ loạn cực độ do tạo thành những vi xoáy Hiện tượng này làm tăng cường sự truyền khối đối lưu và thúc đẩy xảy ra sự khuếch tán ở một vài trường hợp mà sự khuấy trộn thông thường không đạt được [42]

Hiệu quả chiết xuất các hợp chất hòa tan khi sử dụng sóng siêu âm cường

độ cao tăng lên nhờ sự tạo thành các bọt khí trong dung môi khi sóng truyền qua Dưới tác dụng của sóng, các bọt khí bị kéo nén, sự tăng áp suất, tăng nhiệt làm chúng hấp thụ năng lượng tới mức cực đại sẽ nổ tung dữ dội, tạo nên hiện tượng

―sốc sóng‖ Khi sự nổ vỡ của các bọt khí ở gần bề mặt pha rắn, xảy ra mất đối xứng sinh ra các tia dung môi có tốc độ cao bắn vào thành tế bào, do đó làm tăng

sự xâm nhập của dung môi vào tế bào và làm tăng bề mặt tiếp xúc giữa pha rắn

và lỏng Điều này làm tăng sự chuyển khối và phá vỡ cấu trúc tế bào Sự nổ vỡ của các bọt khí làm tăng sự thoát của các chất nội bào vào dung môi Năng lượng

âm thanh được chuyển thành năng lượng cơ học dưới dạng sóng xung có áp lực khoảng vài nghìn at (50MPa) Năng lượng này làm tan rã tế bào khi động năng của nó lớn hơn độ bền của màng tế bào Ngoài ra, gradient vận tốc rất lớn làm gia tăng quá trình phá vỡ và cắt đứt tế bào [15][42]

Những tác dụng chính của siêu âm trong quá trình chiết xuất [36]:

- Tăng mạnh tính thẩm thấu của dung môi chiết xuất

HV: Nguyễn Thị Lan Anh_CB130691 21

- Làm tăng diện tích tiếp xúc giữa hai pha bằng cách phân tán chúng thành

những hạt nhỏ

- Tăng cường sự xáo trộn của hỗn hợp (thay cho kỹ thuật khuấy trộn)

- Có tác dụng làm nóng cục bộ nên tăng tính hòa tan của dung môi

- Tăng tốc độ của các phản ứng hóa học;

- Làm sạch và khử khí trong chất lỏng;

- Khử hoạt động của các vi sinh vật và men;

- Tăng tốc độ các quá trình chiết xuất;

Hiệu ứng nổ bọt khí trong lòng chất lỏng do siêu âm có khả năng tạo ra các tác động lý hóa: Khử khí, đồng nhất hóa, phân tán, kết tụ từng phần, oxy hóa, nhũ tương hóa, trùng hợp/khử trùng hợp các chất cao phân tử Đa số các tác động này đều hỗ trợ rất tốt cho quá trình chiết xuất Nhiều nước (Đức, Anh, Trung Quốc, Ấn Độ, Nhật, Nga, .) đã ứng dụng hiệu ứng nổ bóng khí trong nông nghiệp để chiết xuất các hợp chất tự nhiên như: chiết xuất lá, rễ cây sâm, cây cỏ thảo, nhiều loại cây dược liệu quý với quy mô công nghiệp làm giảm thời gian chiết xuất 2 đến 3 lần, chỉ sử dụng 50 - 70% lượng dung môi, hiệu suất chiết tách tăng lên 30 - 50% so với phương pháp chiết xuất truyền thống [39]

Hình 1.8 Một số hệ thống thiết bị chiết xuất bằng sóng siêu âm

Một nghiên cứu so sánh khả năng thu nhận Polysaccharide từ ba loại nấm bằng chiết xuất có hỗ trợ sóng siêu âm (UAE) (dung môi chiết: nước, tỷ lệ nguyên liệu/dung môi là 1/30, cường độ sóng siêu âm: 21,7 w/cm2, tần số 20 KHz tại 50ºC trong 60 phút) và chiết xuất nước nóng thông thường (HWE) (dung môi chết: nước, tỷ lệ nguyên liệu/dung môi là 1/30, tại 100ºC trong 120 phút) đã được báo cáo Kết quả được trình bày trong bảng 1.3 [14]

HV: Nguyễn Thị Lan Anh_CB130691 22

Bảng 1.4 Sản lượng và tốc độ chiết xuất Polysaccharide từ ba loại nấm bằng UAE và HWE (tất cả được tính theo %, w/w của nấm nguyên liệu)

Kết quả cho thấy phương pháp UAE cho sản lượng Polysaccharide cao hơn nhiều so với chiết HWE, rút ngắn thời gian chiết gấp 3 lần, tốc độ chiết

nhanh và triệt để hơn

1.4.3 Cô đặc

Cô đặc là phương pháp dùng để nâng cao nồng độ các chất hoà tan trong dung dịch gồm 2 hai nhiều cấu tử Quá trình cô đặc của dung dịch lỏng - rắn hay lỏng - lỏng có chênh lệch nhiệt độ sôi rất cao thường được tiến hành bằng cách tách một phần dung môi (cấu tử dễ bay hơi hơn); đó là các quá trình vật lý - hoá lý Tùy theo tính chất của cấu tử khó bay hơi (hay không bay hơi trong quá trình đó), ta có thể tách một phần dung môi (cấu tử dễ bay hơi hơn) bằng phương pháp nhiệt độ (đun nóng) hoặc phương pháp làm lạnh kết tinh Quá trình cô đặc gồm các phương thức sau [4]:

- Cô đặc áp suất thường (thiết bị hở): Nhiệt độ sôi và áp suất không đổi;

thường được dùng trong cô đặc dung dịch liên tục để giữ mức dung dịch cố định, nhằm đạt năng suất cực đại và thời gian cô đặc ngắn nhất

- Cô đặc áp suất chân không: Dung dịch có nhiệt độ sôi thấp ở áp suất chân

không Dung dịch tuần hoàn tốt, ít tạo cặn và sự bay hơi dung môi diễn ra liên tục

- Cô đặc nhiều nồi: Số nồi không nên quá lớn vì nó làm giảm hiệu quả tiết

kiệm hơi Người ta có thể cô chân không, cô áp lực hay phối hợp cả hai phương

HV: Nguyễn Thị Lan Anh_CB130691 23

pháp Đặc biệt có thể sử dụng hơi thứ cho mục đích khác để nâng cao hiệu quả kinh tế

- Cô đặc liên tục: Cho kết quả tốt hơn cô đặc gián đoạn Tuỳ theo điều kiện

kỹ thuật và tính chất của dung dịch, ta có thể áp dụng chế độ cô đặc ở áp suất chân không, áp suất thường hoặc áp suất dư

1.4.4 Sấy chân không thu nhận sản phẩm

Phương pháp sấy chân không được áp dụng để sấy các loại vật liệu có chứa nhiều hàm lượng tinh dầu, hương hoa, dược phẩm, hoạt chất sinh học; các nông sản thực phẩm có yêu cầu nhiệt độ sấy thấp nhằm giữ nguyên chất lượng và màu sắc, không gây phá hủy, biến tính các chất Đặc biệt phương pháp sấy chân không được dùng để sấy các loại vật liệu khô chậm khó sấy (như gỗ sồi, gỗ giẻ ) nhằm mang lại chất lượng sản phẩm sấy cao đáp ứng được các yêu cầu sử dụng trong và ngoài nước, rút ngắn đáng kể thời gian sấy [5]

Dựa vào tác nhân sấy hay cách tạo ra động lực quá trình dịch chuyển ẩm

mà chúng ta có hai phương pháp sấy: phương pháp sấy nóng và phương pháp sấy lạnh [5]

- Phương pháp sấy nóng : Trong phương pháp sấy nóng, tác nhân sấy và vật liệu sấy được đốt nóng Do tác nhân sấy được đốt nóng nên độ ẩm tương đối giảm dẫn đến phân áp suất hơi nước trong tác nhân sấy giảm Mặt khác do nhiệt

độ của vật liệu sấy tăng lên nên mật độ hơi trong các mao quản tăng và phân áp suất hơi nước trên bề mặt vật cũng tăng Như vậy, trong hệ thống sấy nóng có hai cách để tạo ra độ chênh phân áp suất hơi nước giữa vật liệu sấy và môi trường Cách thứ nhất là giảm phân áp suất của tác nhân sấy bằng cách đốt nóng nó và cách thứ hai là tăng phân áp suất hơi nước trong vật liệu sấy Như vậy, nhờ đốt nóng cả tác nhân sấy và vật liệu sấy hay chỉ đốt nóng vật liệu sấy mà hiệu phân

áp giữa hơi nước trên bề mặt vật và phân áp của hơi nước tác nhân sấy tăng dẫn đến làm tăng quá trình dịch chuyển ẩm từ trong lòng vật liệu sấy ra bề mặt và đi vào môi trường

HV: Nguyễn Thị Lan Anh_CB130691 24

Phương pháp sấy lạnh: Khác với phương pháp sấy nóng, để tạo ra sự chênh lệch áp suất hơi nước giữa vật liệu sấy và tác nhân sấy, người ta giảm phân

áp suất hơi nước trong tác nhân sấy bằng cách giảm dung ẩm trong tác nhân sấy

và độ ẩm tương đối Phân áp suất của môi trường không khí bên ngoài giảm xuống, độ chênh áp suất của ẩm trong vật sấy vào môi trường xung quanh tăng lên Ẩm chuyển dịch từ trong vật ra bề mặt sẽ chuyển vào môi trường Nhiệt độ môi trường của sấy lạnh thường thấp (có thể thấp hơn nhiệt dộ của môi trường bên ngoài, có khi nhỏ hơn 0ºC

1.4.5 Chế phẩm nấm Đầu khỉ chiết xuất

Theo các nhà khoa học trên thế giới nấm Đầu khỉ chứa rất nhiều hoạt chất sinh học có có lợi cho sức khỏe con người Với phương pháp truyền thống, loại thảo dược này có trong các bài thuốc đông y và sắc lấy nước uống Ngày nay, với sự phát triển của công nghệ sinh học và đặc biệt là sự phát triển của các sản phẩm thực phẩm chức năng Các dạng thương phẩm của nấm Đầu khỉ trên thị trường chủ yếu dưới hình thức bột nấm, dạng khô, hoặc kết hợp cùng các loại nấm khác tạo thành dạng viên nén

Sản phẩm chế phẩm nấm Đầu khỉ chiết xuất trên thị trường phổ biến hiện nay là các sản phẩm được sản xuất từ Trung Quốc, Nhật Bản, Hàn Quốc… Chứa hàm lượng hoạt chất sinh học thuộc nhóm Polysaccharides (β-1,3-1,6-D-glucan) là 20-50%, phổ biến nhất là loại sản phẩn chế phẩm nấm Đầu khỉ chiết xuất có Polysaccharides 20% với chức năng công bố là tăng cường miễn dịch, chống ung thư, chống khối u và điều trị bệnh Alzheimer

Hiện nay các sản phẩm trà và các dạng trà như trà túi lọc, trà hòa tan…Có

bổ sung thêm các hoạt chất sinh học từ nấm như nấm linh chi, nấm hương, nấm sò… Rất đa dạng và phổ biến trên thị trường Các sản phẩm trà từ nấm Đầu khỉ còn rất mới, trên thị trường chưa có một thương hiệu nào về sản phẩm này

HV: Nguyễn Thị Lan Anh_CB130691 25

Dạng viêm nang Kết hợp với các loại

nấm khác

Dạng bột

Hình 1.9 Một số dạng chế phẩm nấm Đầu khỉ chiết xuất

1.5 Tình hình sản xuất và nghiên cứu nấm Đầu khỉ

1.5.1 Tình hình sản xuất và nghiên cứu nấm Đầu khỉ trên thế giới

Ngay từ đầu thế kỷ thứ 19 nấm Đầu khỉ được biết đến như một loại nấm ăn mang giá trị dinh dưỡng cao, đồng thời còn là nguồn dược liệu quý Tới năm

1960 nấm Đầu khỉ được nuôi trồng thành công, nhưng phải hơn 40 năm sau tức

là gần 10 năm trở lại đây mới phát triển

Tính đến năm 1991, tổng sản lượng nuôi trồng nấm Đầu khỉ trên thế giới là 66.000 tấn nấm tươi, chỉ chiếm 1,2% so với tổng lượng nấm trên toàn thế giới, và còn rất thấp đối với nhu cầu của thị trường Nói chung, từ năm 1981 đến 1997 sản lượng trồng nấm Đầu khỉ tăng lên ít, trong những báo cáo về tình hình nuôi trồng nấm trên thế giới sản lượng vẫn bị xếp chung vào cùng các loài nấm khác Nhận thấy tiềm năng về mặt sinh học của nấm Đầu khỉ, là thực phẩm có giá trị dinh dưỡng cao, được chiết xuất thành các chế phẩm y dược Một số nước châu

Âu, châu Mỹ bắt đầu quan tâm đến việc nuôi trồng loài nấm này như Hoa Kỳ, Pháp… Sản lượng nấm Đầu khỉ trên trên thế giới tăng một cách đáng kể trong năm 2003, đứng đầu về sản lượng nuôi trồng là Trung Quốc với sản lượng 30.500 tấn, tiếp theo là Nhật Bản với sản lượng 1.821 tấn Năm 2004, sản lượng nấm Đầu khỉ tăng mạnh ở Hoa Kì với sản lượng lên tơi 42.500 tấn [22]

HV: Nguyễn Thị Lan Anh_CB130691 26

Hiện nay công nghệ chiết xuất các hợp chất có hoạt chất sinh học (Polysaccharides và Diterpenoid) từ nấm Đầu khỉ đang được áp dụng ở các nước phát triển chủ yếu bằng công nghệ chiết xuất bằng nước và các dung môi khác nhau, có hỗ trợ sóng siêu âm và enzyme do nó nhiều tính ưu việt: Cho hiệu suất trích ly hoạt chất cao, thời gian trích ly ngắn và trích ly ở nhiệt độ thấp, tiết kiệm năng lượng, giữ được các đặc tính hoạt chất sinh học của nấm cũng đã được chứng minh

Năm 1995, nghiên cứu lựa chọn phương pháp chiết xuất Polysaccharides

từ nấm Đầu khỉ bằng các dung môi khác nhau: nước, dung dịch ammonium oxalate 0,5% và NaOH 1N đã được thực hiện, kết quả cho thấy chiết bằng dung môi NaOH 1N thu năng suất Polysacchrides cao nhất là 30,8% và xác định được thành phần Polysacchrides bao gồm: D-mannose, D-galactose, U-glucose và D-xylose [27]

Năm 1994 – 1996, Kawagishia chiết xuất nấm Đầu khỉ bằng dung môi ethanol 85% thu dịch chiết, sau đó phân đoạn dịch chiết với ethyl acetate và nước, phân đoạn ethyl acetate sau đó được tiến hành chạy sắc ký silica gel và HPLC Kết quả phân lập được các Diterpenoid bao gồm: Erinacines A, B, C, E, F

và G đã được chứng minh có hoạt động sinh học kích thích sinh tổng hợp NGF [19][21]

Năm 2005 một nghiên cứu tại Đài Loan đã chứng minh hiệu quả giúp điều hòa hạ đường huyết của dịch chiết từ nấm Đầu khỉ Xác định nấm có các tác động tốt và hiệu quả tới cơ thể người, bao gồm các tác dụng: chống oxy hóa, giảm mức lipid và giảm lượng đường trong máu Các thành phần chính của dịch chiết xuất là D-threitol, D-arabinitol và palmitic acid được xác định từ sắc ký và quang phổ Dịch chiết methanol của nấm Đầu khỉ sau khi loại bỏ dung môi thu được chế phẩm (gọi tắt là HEM) dùng bổ sung thêm vào chế độ ăn uống Các tác dụng hạ đường huyết của HEM được nghiên cứu trên chuột Những con chuột được bổ sung HEM (liều lượng 100mg/1 kg trọng lượng cơ thể) có lượng đường

HV: Nguyễn Thị Lan Anh_CB130691 27

trong máu và nồng độ cholesterol toàn phần thấp hơn những con đối chứng không bổ sung HEM [43]

Năm 2009, Lee và cộng sự đã đưa ra quy trình chiết xuất nấm Đầu khỉ bằng nước nóng, thu hồi Polysaccharide bằng phương pháp tủa với ethanol 95%, nhóm Polysaccharide này có khối lượng phận tử thấp 13 kDa, có cấu trúc xoắn

ba tạo thành bởi liên kết β-1,3-1,6-glucan có chức năng kích hoạt các đại thực bào và kháng u mạnh [25]

Năm 2009 một nghiên cứu tại Trung Quốc đã sử dụng phương pháp siêu

âm trong chiết xuất Polysaccarides từ nấm Đầu khỉ trong điều kiện tỷ lệ nguyên liệu/dung môi nước là 1/15, 50ºC, 20 phút, chiết xuất 2 lần Kết quả cho thấy khả năng chiết xuất vượt trội, thời gian chiết được rút ngắn 4-5 lần, tốc độ chiết cao hơn 40% so với phương pháp chiết xuất nước nóng thông thường [11]

Năm 2010, nghiên cứu chiết xuất Polysaccharides từ nấm Đầu khỉ, sử dụng hỗn hợp enzyme cellulase và pectinase (tỷ lệ khối lượng 1:2) Các điều kiện quá trình thủy phân được xác định bằng cách kiểm tra đơn yếu tố và sau đó tối ưu hóa điều kiện quá trình, xác định được: pH 4,2, nhiệt độ 50ºC, thời gian phản ứng

90 phút và 2,0% enzyme, thu lượng Polysaccharidese là 4.38% So với các phương pháp khác, phương pháp chiết xuất có hỗ trợ bằng enzyme là phương pháp chiết Polysaccharides đơn giản, nhanh chóng và cho tỷ lệ chiết xuất cao [38]

1.5.2 Tình hình sản xuất và nghiên cứu về nấm Đầu khỉ ở Việt Nam

Với một nước khí hậu nhiệt đới như Việt Nam thì việc nuôi trồng nấm Đầu khỉ có rất nhiều khó khăn Nhưng nhờ vào áp dụng khoa học kỹ thuật và nuôi trồng nấm trong một môi trường khắt khe lần đầu tiên vào năm 1998, viện nghiên cứu Đà Lạt đã thành công trong nuôi trồng loài nấm này, nhưng sản lượng nấm ít chỉ đáp ứng cho các đề tài nghiên cứu

Cuối năm 2000, chi nhánh công ty Đông Nam dược Bảo Long tại Hà Tây cũng đã thử nghiệm nuôi trồng ở nhiệt độ 17 - 25ºC và thu được kết quả khả quan Năm 2001, Lê Xuân Thám (viện hạt nhân Đà Lạt) kết hợp với trường Đại

HV: Nguyễn Thị Lan Anh_CB130691 28

học thành phố Hồ Chí Minh đã chọn lọc và nuôi trồng ra quả thể hoàn chỉnh tại thành phố Hồ Chí Minh

Tổng sản lượng các loại nấm ăn và nấm dược liệu của Việt Nam hiện nay đạt trên 100.000 tấn/năm, kim ngạch xuất khẩu khoảng 40 triệu USD/năm Trong

đó nấm Hương, Linh chi, Đầu khỉ được nuôi trồng phổ biến ở các địa phương: Sơn La, Sapa, Hà Nội, Hưng Yên, Vĩnh Phúc, Ninh Bình, Hồ Chí Minh, Đà Lạt… sản lượng khoảng 10.000 tấn khô /năm [3]

Ngành trồng nấm ở nước ta đã phát triển nhanh trong 10 năm qua, nhưng vẫn chưa trở thành một ngành công nghiệp như ở các nước khác, do đầu ra cho sản phẩm còn hạn chế Cụ thể thiếu công nghệ chuyển nấm ăn và nấm dược liệu

ở dạng nguyên liệu thô trở thành nguyên liệu tinh để cung cấp cho các cơ sở chế biến thực phẩm, dược phẩm và mỹ phẩm, chế phẩm nấm chiết xuất từ nấm Đầu khỉ dùng cho chế biến thực phẩm, dược phẩm và mỹ phẩm trong nước chủ yếu nhập khẩu Hiện trong nước chưa thấy cơ sở nào sản xuất chế phẩm nấm chiết xuất nguyên liệu Trong khi đó một số nước phát triển như Trung Quốc, Nhật, Đài Loan… đã nhập khẩu nấm nguyên liệu thô để chế biến thành các loại chế phẩm nấm chiết xuất làm nguyên liệu cho các cơ sở chế biến trong nước và xuất khẩu có giá trị cao Vậy sản xuất chế phẩm nấm chiết xuất là hết sức cần thiết, đồng thời gia tăng giá trị của nấm

Trong nước hiện chưa thấy có cơ sở sản xuất nào ứng dụng công nghệ chiết xuất bằng sóng siêu âm thu các hoạt chất sinh học từ nấm Đầu khỉ Công nghệ sử dụng sóng siêu âm chiết xuất các hoạt chất sinh học của nấm hiện mới chỉ ứng dụng trong các phòng thí nghiệm

Năm 2010, Nguyễn Đình Lục và cộng sự Viện Cơ điện nông nghiệp và Công nghệ sau thu hoạch, đề tài cấp bộ ― Nghiên cứu thiết kế, chế tạo thiết bị siêu âm công suất 1,5KW và ứng dụng trong làm sạch, chiết xuất các hợp chất tự nhiên từ củ họ gừng‖ chủ yếu ở Lâm Đồng, Đà Lạt, Sapa, Sơn La và các địa phương khác trong nước, trong những bước đầu đã thiết kế mẫu thiết bị phát siêu

âm (ultrasonic generator) có dải tần số 20  40 kHz, công suất đến 1,5kW và ứng

HV: Nguyễn Thị Lan Anh_CB130691 29

dụng trong chiết xuất hợp chất Curcumin từ củ nghệ vàng với cường độ 75 W/l, tần số 25kHz và làm tăng hiệu suất (10-20)% và giảm thời gian chiết 4-5 lần

Năm 2011, Nguyễn Đức Tiến và cộng sự Viện Cơ điện nông nghiệp và Công nghệ sau thu hoạch đã nghiên cứu chiết xuất hoạt chất sinh học của nấm Đầu khỉ, nấm Linh chi, Nấm Hương đã khảo sát chiết xuất bằng công nghệ sóng siêu âm và công nghệ chiết soxhlet thông thường, bước đầu cho thấy tiềm năng phát triển công nghệ chiết xuất sóng siêu âm có nhiều tính ưu việt hơn, nhưng do trong khuôn khổ của đề tài Cấp tỉnh, điều kiện nghiên cứu và thời gian có hạn và trang thiết bị hiện có của cơ sở sản xuất, nên hiện mới chỉ có công nghệ chiết xuất hoạt chất sinh học của nấm nghiên cứu bằng hệ thống chiết soxhlet được áp dụng vào sản xuất các sản phẩm cao nấm Linh chi, trà nấm Linh chi và Cao nấm Hương tại cơ sở sản xuất ―Hợp tác xã sản xuất nấm ăn, nấm dược liệu cựu chiến binh – xã Long Hưng – Huyện Văn Giang - Tỉnh Hưng Yên‖ hiện đang được sản xuất ở quy mô 10 kg/mẻ Công nghệ chiết xuất hoạt chất sinh học từ nấm bằng sóng siêu âm cho thấy tiềm năng phát triển ứng dụng vào sản xuất hiện đang định hướng cho nghiên cứu về công nghệ và thiết bị để đáp ứng cho nhu cầu của sản

xuất Chính vì vậy chúng tôi tiến hành tiếp đề tài ―Nghiên cứu điều kiện thu nhận chế phẩm Beta Glucan và Diterpenoid từ nấm Đầu khỉ nhằm ứng dụng trong chế biến thực phẩm.‖ bằng phương pháp chiết xuất sử dụng sóng

siêu âm

HV: Nguyễn Thị Lan Anh_CB130691 30

CHƯƠNG II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu

2.1.1 Mẫu thực vật

Nguồn nấm Đầu khỉ (Hericium erinaceus): Thu mua tại cơ sở trồng nấm

Hưng Yên - Hà Nội, Vĩnh Yên – Vĩnh Phúc, Đơn Dương - Lâm Đồng, Đà Lạt – Lâm Đồng

Nấm Đầu khỉ dạng tươi, thu hoạch vào tháng 11 - 12/2013, được làm khô bằng sấy ở nhiệt độ 60ºC, nấm khô độ ẩm ≤ 12% Nấm mua về có màu vàng đậm, cuống nấm màu trắng ngà Trung bình 100g nấm khô có khoảng 20 – 25 cái nấm Sử dụng tai nấm và cuống nấm cho các nghiên cứu Mẫu được xử lý nghiền nhỏ tùy vào yêu cầu nghiên cứu rồi đem bảo quản kín trong túi nilon ở nơi thoáng mát để tránh ẩm mốc

Hình 2.1 Nấm Đầu khỉ nguyên liệu khô

2.1.2 Hóa chất

Hoá chất: Ethanol 96% (EtOH 96%) (Trung Quốc), nước cất (Việt Nam), D-glucose tinh khiết (Fisher – Mỹ), phenol (Trung Quốc), sulfuric acid (96%) (Trung Quốc), ethyl acetate (Trung Quốc)

2.1.3 Dụng cụ và thiết bị

Các thiết bị dùng trong phòng thí nghiệm thuộc Viện Cơ điện Nông nghiệp và Công nghệ sau thu hoạch, 126 Trung Kính, Trung Hòa, Cầu Giấy, Hà Nội

- Dụng cụ: Bình tam giác, bình định mức, ống nghiệm, pipet, đĩa peptri

-Thiết bị: Máy sấy (Grot DZ 47-63, Trung Quốc), máy đo mật độ quang

(Zuzi 4110ED Spectrophotometer, Đức), Máy siêu âm TJS-3000 V6.0 (Việt