Nghiên cứu đặc tính enzyme xylanase của nấm mốc aspergillus niger, tách dòng và biểu hiện gene mã hóa xylanase trên escherichia coli BL21

Để thủy phân hoàn toàn xylan tự nhiên cần có các esterase [29] để loại bỏ liên kết của các axit acetic và axit phenolic với xylose và xylanase là hệ enzyme thủy phân xylan đang rất được

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

-

NGUYỄN THỊ THƯƠNG THƯƠNG

ĐỀ TÀI: NGHIÊN CỨU ĐẶC TÍNH ENZYME XYLANASE CỦA NẤM MỐC ASPEGILLUS NINER, TÁCH DÒNG VÀ BIỂU HIỆN GENE MÃ HÓA XYLANASE TRÊN ESCHERICHIA COLI BL21

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

TS TRẦN LIÊN HÀ

HÀ NỘI - 2010

LỜI CẢM ƠN

Trước tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Trần Liên Hà – phòng Vi sinh và kỹ thuật di truyền, Viện Công nghệ Sinh học- Công nghệ Thực phẩm, trường đại học Bách Khoa Hà Nội đã tận tình chỉ bảo, truyền thụ cho tôi kiến thức cũng như lòng say mê khoa học trong suốt quá trình nghiên cứu và thực hiện

đề tài

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến các thầy giáo, cô giáo trong Viện Công nghệ sinh học – Công nghệ thực phẩm đã truyền đạt cho tôi những kiến thức khoa học vô cùng bổ ích trong suốt quá trình học tập

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn các thành viên trong phòng thí nghiệm Vi sinh và kỹ thuật di truyền, phòng thí nghiệm công nghệ sinh học thuộc Viện Công nghệ sinh học – Công nghệ thực phẩm, trường đại học Bách Khoa Hà Nội đã nhiệt tình giúp đỡ và hướng dẫn mỗi khi tôi gặp khó khăn trong làm thí nghiệm

Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình, bạn bè và người thân, những người đã luôn động viên, khích lệ và là chỗ dựa vững chắc cho tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu

Hà Nội ngày 27/10/2010

Học viên: Nguyễn Thị Thương Thương

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

3 CTAB Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide

7 EDTA Ethylen diamin tetra acetate

21 E coli Escherichia coli

22 A niger Aspergillus niger

DANH MỤC BẢNG BIỂU

1 Bảng 1.1 Các vi sinh vật sing tổng hợp xylanase 20

2 Bảng 1.2 Đặc tính của một số xylanase từ vi sinh vật 21

3 Bảng 2.1 Trình tự cặp mồi sử dụng cho phản ứng nhân gen

PCR

37

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ

1 Hình 1.1 Cấu trúc của arabinoxylan của cỏ Graminiae 10

2 Hình 1.2 Vị trí tấn công của các enzyme vào xylan của cỏ 12

3 Hình 1.3 Cấu trúc không gian 3 chiều của xylanase họ 10 từ

Bacillus haloduans

15

4 Hình 1.4 Cấu trúc không gian 3 chiều của xylanase họ 11 16

5 Hình 1.5 Cơ chế phản ứng thủy phân của xylan bởi xylanase

của Bacillus circulans

17

6 Hình 2.1 Cấu trúc vector tách dòng, biểu hiện pRSET A 31

7 Hình 2.2 Qui trình tinh sạch xylanase tái tổ hợp 46

8 Hình 3.1 Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất lên quá trình sinh

11 Hình 3.4: Điện di đồ DNA tổng số của chủng B7 51

12 Hình 3.5: Điện di đồ sản phẩm của phản ứng PCR khuếch đại

gene mã hóa xylanase

54

13 Hình 3.6: So sánh trình tự gen mã hoá enzym xylanse của

chủng B7 với đoạn gen mã hoá enzym xylanse được công bố

trên cơ sở dữ liệu NCBI với mã số EU423881.1

56

14 Hình 3.7: Trình tự nucleoti của gen xynB của nấm mốc

Aspergillus niger

58

15 Hình 3.8: Qui trình thực hiện phản ứng PCR khuếch đại vùng

cds của gen xylanase

59

16 Hình 3.9: Vị trí cắt của các enzym giới hạn trên gen xylanase

của nấm mốc Aspergillus niger B7

60

17 Hình 3.10: Điện di đồ sản phẩm phản ứng PCR khuếch đại

exon của gen xylanase

61

18 Hình 3.11:Điện di đồ sản phẩm phản ứng PCR khuếch đại cds

của gen xylanase

23 Hình 3.16: Điện đi đồ cắt kiểm tra plasmid tái tổ hợp sau khi

tinh sạch với hai enzym XhoI và NcoI

68

24 Hình 3.17: Kết quả kiểm tra plasmid tái tổ hợp bằng PCR với

cặp mồi XynF1, XynR2

27 Hình 3.20: Hoạt tính xylanase trong dịch phá tế bào 72

28 Hình 3.21: Hoạt tính xylansae trong dịch nổi 73

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 8

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 10

1.1 Xylan và phức hệ enzyme phân cắt xylan 10

1.1.1 Xylan 10

1.1.2 Phức hệ enzyme phân cắt xylan 11

1.2 Khái niệm và phân loại xylanase 13

1.2.1 Khái niện về xylanase 13

1.2.2 Phân loại xylanase 14

1.2.3 Cấu trúc của xylanase 15

1.2.4 Cơ chế xúc tác của xylanase 16

1.3 Nguồn thu xylanase từ tự nhiên 18

1.3.1 Sinh tổng hợp xylanase từ vi khuẩn 18

1.3.2 Sinh tổng hợp xylanase từ nấm mốc 19

1.4 Ứng dụng trong một số lĩnh vực 22

1.4.1 Sản xuất cồn nhiên liệu 22

1.4.2 Sản xuất thức ăn chăn nuôi 22

1.4.3 Sản xuất bánh 22

1.4.5 Tẩy trắng giấy và bột giấy 23

1.4.6 Các chất hoạt động bề mặt 23

1.5 Xylanase tái tổ hợp 24

1.5.1 Hệ thống vật chủ được sử dụng trong tách dòng và biểu hiện gene mã hóa xylanase từ nấm mốc 25

1.5.2 Một số nghiên cứu liên quan ở Việt Nam 29

CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 31

2.1 Chủng vi sinh vật, tế bào chủ, vector sử dụng 31

2.2 Hóa chất và thành phần môi trường nuôi cấy 32

2.3 Thiết bị 33

2.4 Nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp xylanase của chủng 34

2.5 Phương pháp tách chiết DNA 34

2.5.1 Tách chiết DNA tổng số 34

2.5.2 Tách chiết DNA plasmid 35

2.6 Phương pháp PCR 36

2.7 Phương pháp điện di trên gel agarose 39

2.8 Phương pháp tinh sạch DNA bằng bộ kit MINELUTE (QUIAGEN) 40

2 9 Phương pháp cắt DNA bằng enzyme cắt giới hạn 41

2.10 Phương pháp gắn DNA bằng enzyme T4-ligase 41

2 11 Phương pháp chuẩn bị tế bào khả biến 42

2.12 Phương pháp biến nạp vào E coli bằng sốc nhiệt 43

2.13 Phương pháp xác định hoạt tính enzyme xylanase 43

2.14 Thu hồi và tinh sạch enzyme tái tổ hợp 44

CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 47

3.1 Nghiên cứu một số đặc tính của chủng 47

3.1.1 Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến hoạt tính xylanase 47

3.1.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính xylanase 48

3.13 Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính xylanase 49

3.2 Tách dòng gene mã hóa enzyme xylanase từ chủng nấm mốc Aspergillus niger B7 50

3.2.1 Tách chiết DNA của chủng 50

3.2.2 Khuếch đại gene mã hóa xylanase từ chủng Aspergillus niger B7 51

3.2.3 Khuếch đại cds của gene xylanase 57

3.2.6 Gắn cds gene xylanase vào vector pRSET A bằng enzyme T4 -ligase 64

3.2.4 Biến nạp vetor tái tổ hợp vào tế bào khả biến E coli TOP10 66

3.3 Biểu hiện gene xylanase trong E coli BL21 70

3.4 Mức độ biểu hiện xylanase 70

3.5 Định tính hoạt tính xylanase 72

3.6 Định lượng hoạt tính xylanase bằng phản ứng DNS 73

KẾT LUẬN 74

KIẾN NGHỊ 75

TÀI LIỆU THAM KHẢO 76

MỞ ĐẦU

Hiện nay trên trái đất, mỗi năm thực vật sản sinh ra một lượng sinh khối khổng lồ ước tính đạt tới bốn mươi tỷ tấn Tất cả mọi hoạt động của con người cũng như các loài động vật đều cần đến thực vật Chúng là nguồn lương thực để nuôi sống con người và động vật đồng thời là nguồn cung cấp nguyên, nhiên vật liệu cho các ngành công nghiệp [3] Để thay đổi tính chất của vật liệu đầu vào cho phù hợp với sản phẩm mong đợi người ta phải tìm cách thay đổi cấu trúc của thành tế bào

thực vật Tuy nhiên thành tế bào thực vật lại có cấu tạo khá vững chắc bởi cellulose,

hemicellulose và lignin, trong đó cellulose chiếm (35-50%), hemicellulose chiếm (20-30%), lignin chiếm (20-30%) theo trọng lượng khô [33] Chỉ tính riêng hemicellolose, hàng năm lượng hemicellulose được tạo thành là 3,9 tỷ tấn Nhưng hầu hết lượng hemicellulose không được sử dụng một cách hiệu quả bởi nếu muốn

sử dụng hiệu quả hemicellulose cần phải thủy phân triệt để xylan một loại polysaccharide chiếm phần lớn trong thành phần hemicellulose Tuy nhiên để phá hủy chúng thì người ta thường sử dụng các hóa chất mạnh như axit mạnh, hay kiềm mạnh Do đó chi phí để sản xuất các sản phẩm thường cao và nhất là gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến môi trường sinh thái Chính vì vậy yêu cầu đặt ra là phải thay thế

bằng các phương pháp an toàn hơn đối với môi trường [30]

Để thủy phân hoàn toàn xylan tự nhiên cần có các esterase [29] để loại bỏ liên kết của các axit acetic và axit phenolic với xylose và xylanase là hệ enzyme thủy phân xylan đang rất được quan tâm hiện nay [34] Xylanase có tiềm năng ứng dụng lớn trong đời sống hàng ngày của con người: (1) làm tác nhân tẩy trắng bột giấy và

sử dụng trong công nghiệp sản xuất giấy; (2) trong công nghiệp thực phẩm nó được

sử dụng là chất bổ sung vào bánh mỳ, nước hoa quả, rượu trắng; (3) bổ sung vào thức ăn động vật để tăng giá trị dinh dưỡng; (4) nâng cao khả năng sử dụng sinh khối (biomass) trong côngnghiệp sản xuất nhiên liệu sinh học [36]

Tuy được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực của cuộc sống, nhưng việc sử dụng xylanase còn hạn chế do hiệu suất sinh tổng hợp của các chủng vi sinh vật tự nhiên sinh enzyme này chưa cao Xuất phát từ những yêu cầu đặt ra chúng tôi thực hiện

đề tài “ Nghiên cứu đặc tính enzyme xylanase của nấm mốc Aspergillus niger,

tách dòng và biểu hiện gene mã hóa xylanase trên Escherichia coli BL21”

Xylan là một polysaccharide hỗn tạp có chứa các nhóm phụ là các gốc acetyl, 4-O-methyl-D-glucuronosyl và α-arabinofuranosyl liên kết với bộ khung được tạo bởi các gốc xylopyranose Bộ khung này được liên kết với nhau theo kiểu β-1,4-glycozide Lignin bao quanh xylan, liên kết với xylan bằng liên kết este bằng các gốc của axit 4-O-methyl-D-glucuronic[6, 29]

Hình 1.1: Cấu trúc của arabinoxylan của cỏ Graminiae [10]

Với các cây gỗ mềm, các nhóm phụ của xylan chủ yếu là axit 4-O-methyl glucuronic và arabinose Chúng liên kết với bộ khung xylan bằng liên kết α-1,3-glycozit Hiếm khi thấy các nhóm acetyl trong xylan của gỗ mềm Tỷ lệ arabinose

so với xylose thường là 0,6 [11]

Hemicellulose trong gỗ cứng có nhóm phụ là axit 4- O-methyl glucuronic, axit acetic và axit uronic Bộ khung của xylan gỗ cứng này gồm các gốc β-1,4-D-xylopyranose, trung bình cứ 10 – 20 gốc xylose thì có một axit 4- O-methyl glucuronic liên kết với nó theo kiểu α-1,2-glycozit Xấp xỉ 60-70% các đơn vị xylose được este hóa với axit acetic ở nhóm hydroxyl của carbon thứ 2 hoặc thứ 3

và trung bình thì cứ mười đơn vị xylose thì có một nhóm axit uronic liên kết với gốc xylose theo kiểu α-1,2-glycoside [6, 11, 36] Xylan có tiềm năng to lớn để chuyển đổi thành sản phẩm cuối cùng hữu ích, tuy nhiên để chuyển đổi hoàn toàn xylan đòi hỏi cần phải có một hệ enzyme để phân cắt [34]

1.1.2 Phức hệ enzyme phân cắt xylan

Có nhiều phương pháp có thể được sử dụng để thủy phân hoàn toàn xylan Sử dụng kiềm mạnh hoặc axit mạnh là những biện pháp đang được sử dụng phổ biến hiện nay bởi hiệu quả thủy phân và giá trị kinh tế Nhưng vấn đề ô nhiễm môi trường đang ngày càng gia tăng, đòi hòi các nhà khoa học phải tìm tòi, nghiên cứu

ra phương pháp thủy phân polysaccharide nói chung và xylan nói riêng bằng enzyme sinh học Phân huỷ sinh học xylan là sự kết hợp hoạt động của nhiều loại enzyme [30] trong đó endo-β-1,4-xylanase (β-1,4-D-xylanxylanohydrolase, EC 3.2.1.8) thực hiện nhiệm vụ phân cắt mạch chính xylan bằng việc thủy phân ngẫu nhiên khung xylan tạo ra các oligosaccharide Sau đó exo-β-1,4-D-xylosidase (β-1,4-D-xylan xylohydrolase EC 3.2.1.37) thủy phân các oligosaccharide thành các monomer Các nhóm bên có mặt trong xylan được giải phóng bởi α-L-arabinofuranosidase, α-D-glucuronidase, galactosidase và acetyl xylan esterase [13]

Hình 1.2 Vị trí tấn công của các enzyme vào xylan của cỏ [31]

Exo-β-1,4-D-xylosidase (EC 3.2.1.37) xúc tác thủy phân oligosaccharide bằng cách loại bỏ xylose từ đầu không khử Có nhiều công bố về

β-1,4-D-xylo-Bacillus sp [11] và một số nấm [26] sinh tổng hợp β-xylosidase nội bào Enzyme

α-Arabinofuranosidase (EC 3.2.1.55) thủy phân nhóm cuối cùng không khử arabinofuranosyl của arabinan, arabinoxylan và arabinogalactan Một lượng lớn các

α-L-vi sinh vật bao gồm nấm, xạ khuẩn và các loài α-L-vi khuẩn được công bố là có khả

năng sinh tổng hợp α-arabinosidase Rhodothermus marinus là loài chịu nhiệt có

sinh enzyme lớn nhất với hoạt độ 6,6 U/ml [9] Enzyme α-D-glucuronidase (EC 3.2.1.1) thủy phân liên kết α-1,2-glycosidic giữa xylose và D-glucuronic axit hoặc liên kết ete với 4-O-methyl [18]

Sự thủy phân liên kết α-1,2 -glycosidic bền vững đóng vai trò quan trọng trong thủy phân xylan Tương tự như liên kết giữa cacbonhydrat và lignin, dạng liên kết 4-O-methyl-glucuronidase với xylose là hàng rào trong sự phá hủy gỗ Có nhiều

vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp α-glucuronidase [14]

Để thủy phân hoàn toàn xylan tự nhiên cần có các esterase để loại bỏ liên kết của các axit acetic và axit phenolic với xylose Esterase phá vỡ liên kết của xylose với axit acetic (acetyl xylan esterase (EC 3.1.1.6), các gốc chuỗi bên arabinose với axit ferulic (feruloyl esterase) và gốc chuỗi bên arabinose với axit p-coumaric (p-coumaroyl esterase) Phân cắt các nhóm acetyl, feruloyl và p-coumaroyl từ xylan thì thuận lợi cho sự loại bỏ lignin Chúng có thể góp phần làm hòa tan lignin bởi sự phân cắt các liên kết este giữa lignin và hemicellulose Nếu sử dụng cùng với xylanase và các enzym phân hủy xylan khác trong tẩy trắng bột giấy, các esterase

có thể phá vỡ và làm lỏng lẻo một phần cấu trúc của thành tế bào [6]

Enzyme quan trọng nhất trong hệ thống enzyme thủy phân cơ chất xylan là enzyme xylanase [31] Vì nó là enzyme khởi đầu cho hệ thống phản ứng phân cắt các liên kết của xylan

1.2 Khái niệm và phân loại xylanase

1.2.1 Khái niện về xylanase

Theo Hội hóa sinh và sinh học phân tử thế giới (the International Union of Biochemistry and Molecular Biology) enzym có mã số EC 3.2.1.8 [31] có:

¾ Tên được công nhận là: endo-β-1,4-xylanase

¾ Phản ứng: thủy phân phía trong của các liên kết β-1,4-D-xylosidic trong xylan

¾ Các tên khác gồm có: endo-β-1,4-xylan 4-xylanohydrolase; xylanase; xylanase; β-1,4-xylanase; endo-1,4-xylanase; endo-β-1,4-xylanase; endo-1,4-β-D-xylanase; 1,4-β-xylan xylanohydrolase; β-xylanase; β-1,4-xylan xylanohydrolase; endo-1,4-β-xylanase; β-D-xylanase

endo-1,4-¾ Tên hệ thống: 4-β-D-xylan xylanohydrolase

1.2.2 Phân loại xylanase

Enzyme xylanase thường được tìm thấy ở thực vật và vi sinh vật Chúng được phân chia thành hai nhóm dựa vào sự tương đồng về đặc tính lý hóa như là khối lượng phân tử, điểm đẳng điện và các đặc tính xúc tác khác nhau của chúng:

- Enzyme endo-xylanase họ 10 gồm các enyzyme có nguồn gốc từ thực vật, nấm mốc và vi khuẩn có khối lượng phân tử cao với giá trị pI thấp (trước đây gọi là

họ F)

- Enzyme endo-xylanse họ 11 gồm các enzyme có nguồn gốc từ nấm mốc và vi khuẩn có khối lượng phân tử thấp với giá trị pI cao được (trước đây gọi là họ G) [32, 20]

Sự khác biệt về đặc tính xúc tác giữa các họ xylanase là endo-xylanase của họ

10 có khả năng thủy phân các liên kết glycozit cạnh các điểm nhánh và hướng về đầu không khử còn endo-xylanase thuộc họ 11 không có khả năng đó [18] Trong khi endo-xylanase của họ 10 cần hai gốc xylopyranosyl không thay thế giữa các nhánh thì endo-xylanase của họ 11 cần có ba gốc xylopyranosyl liên tiếp không thay thế

Ngoài việc phân loại enzyme xylanase làm 2 nhóm lớn, nhiều nhà khoa học cũng đã tiến hành nghiên cứu, phân chia enzyme xylanase thành những nhóm nhỏ hơn Sapag và cộng sự [32] chia xylanase họ 11 thành 6 nhóm chính Nhóm I, II và III chứa chủ yếu các enzyme của nấm mốc Các enzyme nhóm I và II thường là các

enzyme có khối lượng khoảng 20 kDa được sinh tổng hợp từ các họ Ascomyceta và

Basidiomyceta Các enzyme nhóm I có giá trị pI bazơ trong khi đó nhóm II có giá

trị pI ở phía axit Các enzyme của nhóm III chủ yếu được tạo ra bởi các nấm yếm khí Trong khi đó, các xylanase của vi khuẩn được chia thành ba nhóm là A, B và C

Nhóm A là các xylanase được sinh tổng hợp bởi họ Actinomycetaceae và

Acillaceae, hoàn toàn là những vi khuẩn hiếu khí gram dương Nhóm B và C thì

chứa các enzyme chủ yếu từ các vi khuẩn yếm khí gram dương, những loài thường sống trong dạ cỏ [32]

1.2.3 Cấu trúc của xylanase

Cấu trúc bậc ba của endoxylanase họ 10 và 11 được xác định cho hàng loạt

các enzyme [44], từ cả vi khuẩn và nấm mốc Endo-xylanase 1BCX từ Bacillus

circulans có nét đặc trưng của họ 11 [18] Nếp gấp domain xúc tác là do hai nếp gấp

β tạo thành (A và B) chủ yếu là bởi các mặt β đối song và một chuỗi xoắn α ngắn và tương tự như một phần bàn tay phải được đóng lại [32] Sự khác nhau trong hoạt động xúc tác của các endo-xylanase của họ 10 và 11 được cho là do sự khác nhau trong cấu trúc bậc ba của chúng Cấu trúc bậc 3 của endo-xylanase chủ yếu được sắp xếp từ các mảnh β Cấu trúc toàn thể của domain xúc tác của xylanase họ 10 như là một cái thùng hình trụ được tạo thành từ 8 mảnh β

tử isoleusin [18]

Hình 1.4 Cấu trúc không gian 3 chiều của xylanase họ 11

Xylanase có thể liên kết với từ ba đến năm vònng xylopyranose ở gần vị trí

xúc tác Meagher và các cộng sự [25] nhận thấy rằng Xyn 2 của Trichoderma reesei

có thể liên kết với năm vòng xylopyranose, trong khi đó thì Xyn 1 chỉ có thể liên kết với 3 vòng xylopyranose ở gần vị trí xúc tác Các vị trí cho các gốc xylopyranose liên kết được xác định bởi sự có mặt của tyrosine chứ không phải bởi tryptophan [7, 45]

1.2.4 Cơ chế xúc tác của xylanase

Hàng loạt các mô hình đã được đưa ra để giải thích cơ chế hoạt động của xylanase Hoạt động của xylanase dẫn đến sự thủy phân xylan Sự thủy phân nhìn chung có thể là kết quả của sự duy trì hay nghịch chuyển của trung tâm anomeric của các monomer đường khử của cacbonhydrat Đề xuất này bao gồm một hoặc hai trạng thái chuyển tiếp hóa học [40] Sự dịch chuyển glycosyl thường dẫn đến trong

sự thay thế tính ái nhân ở cacbon bão hòa của trung tâm anomeric và diễn ra với sự duy trì hoặc nghịch chuyển của cấu hình anomeric Hầu hết các enzyme thủy phân polysaccharide kiểu như cellulase và xylanase được biết đến với sự thủy phân các

cơ chất của chúng với sự duy trì của cấu hình anomeric của C1 Có sự liên quan của

cơ chế dịch chuyển kép cho sự duy trì anomeric của sản phẩm [29] Cơ chế dịch chuyển kép bao gồm các đặc điểm:

9 Xúc tác axit với việc thêm một proton vào cơ chất

9 Một nhóm carboxyl của enzyme ở trạng thái hoạt động

9 Một liên kết trung gian cộng hóa trị glycosyl xuất hiện giữa enzyme với cacbonhydrat này trong đó cấu hình anomeric của đường tham gia liên kết này đối lập với đường của cơ chất

9 Các tương tác không phải là cộng hóa trị được tạo ra với tỷ lệ tăng lên [29] (hình 1.5)

xylanase của họ 11 thể hiện một cơ chế cắt trong mạch ngẫu nhiên hơn là theo một quy luật nhất định [18]

Endo β-1,4-xylanase phá vỡ cấu trúc dạng rắn của thành tế bào bằng cách

phân hủy liên kết β-1,4-xylan trong đoạn polysaccharide-β-1,4-xylan thành xylose

1.3 Nguồn thu xylanase từ tự nhiên

Xylanase được sinh tổng hợp chủ yếu bởi các vi sinh vật, nhiều loại vi khuẩn

và nấm được công bố là có khả năng sản xuất xylanase [3, 40, 46] Tuy nhiên, có nhiều nghiên cứu về xylanase có nguồn gốc từ thực vật, ví dụ, sự sinh tổng hợp endo-xylanase trong quả lê Nhật Bản trong suốt giai đoạn chín của quả Cleemput

và các cộng sự [9] đã tinh chế được một loại endo-xylanase với khối lượng phân tử

là 55 kDa từ bột mì của cây lúa mì châu Âu Một số loài động vật thân mềm dưới nước cũng có khả năng sinh tổng hợp xylanase

1.3.1 Sinh tổng hợp xylanase từ vi khuẩn

Vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp nhiều các enzyme sử dụng cho các quá trình công nghiệp trong đó có xylanase vì đặc tính bền nhiệt của nó Một số loài sinh tổng hợp xylanase với hoạt độ cao ở pH kiềm và nhiệt độ cao là

Bacillus sp Bacillus SSP-34 có khả năng sinh tổng hợp xylanase với hoạt độ 506

U/ml trong môi trường tối ưu Trước đó thì Ratto và các cộng sự đã công bố

Bacillus circulans tổng hợp lên xylanase có hoạt độ 400 U/ml Nó hoạt động tối

ưu ở pH 7,0 và 40% hoạt độ được duy trì ở pH 9,2 Streptomyces cuspidosporus

sinh tổng hợp được xylanase có hoạt độ 49 U/ml trong môi trường xylan [23, 35]

Bacillus sp NCL 87-6-10 tổng hợp được xylanase với hoạt độ 93 U/ml trong

môi trường có cảm ứng zeolit và có hiệu quả hơn khi sử dụng Tween 80 Một

chủng khác là Bacillus circulans AB16 tổng hợp xylanase có hoạt độ 19,28 U/ml khi sinh trưởng trên môi trường rơm rạ Streptomyces sp QG-11-3 có khả năng

sinh enzyme xylanase có hoạt độ 96 U/ml [34, 35] Các sinh vật khác sinh tổng hợp xylanase được đưa ra ở bảng 1.1

1.3.2 Sinh tổng hợp xylanase từ nấm mốc

Các enzyme xylanase được sinh tổng hợp từ nấm mốc thường có pH tối ưu thấp hơn so với các xylanase có nguồn gốc từ vi khuẩn Giá trị pH tối ưu của xylanase từ nấm mốc thủy phân xylan thì thường dao động từ pH 3,0 đến 8,0 và ổn định ở pH 5,0 [34] (bảng 1.2)

Giá trị pH tối ưu của xylanase vi khuẩn nhìn chung cao hơn so với pH tối ưu của xylanase từ nấm Trong công nghệ sản xuất giấy và bột giấy, để sử dụng xylanase từ nấm mốc cần phải hạ pH xuống thấp do đó mà xylanase từ nấm mốc ít được dùng hơn so với vi khuẩn Tuy nhiên trong nhiều ngành công nghiệp khác, như công nghiệp sản xuất đồ uống, công nghiệp sản xuất cồn nhiên liệu, thì đây lại

là một ưu thế rất lớn của xylanase nấm mốc vì môi trường cho enzyme hoạt động là môi trường axit Gomes và các cộng sự [13] đã công bố thu được hoạt độ xylanase

là 188,1 U/ml với pH tối ưu 4,5 từ Trichoderma viride Tương tự với T viride, T

reesei cũng được biết đến với khả năng sinh tổng hợp xylanase cao với hoạt độ 960

U/ml Giống như Trichoderma sp, Schizophillum commune cũng là một trong

những loài tổng hợp xylanase cao với hoạt độ xylanase là 1244 U/ml Nằm trong nhóm nấm mùn trắng, một loài nấm phá hủy thành tế bào thực vật có tiềm năng là

Phanerochaete chrysosporium sản xuất xylanase có hoạt độ 15-20 U/ml trong môi

trường nuôi cấy Aspergillus niger có hoạt độ xylanase là 76,6 U/ml sau 5,5 ngày

lên men Nấm sinh tổng hợp xylanase có một số các hạn chế đó là khi sản xuất enzyme trên môi trường lỏng ở quy mô công nghiệp thì hoạt độ thu được thường thấp hơn thực tế Điều này là do khi tiến hành lên men trong môi trường lỏng các ứng suất xảy ra trong thiết bị lên men làm sinh khối của nấm dễ bị phá vỡ dẫn đến việc làm giảm lượng enzyme thu được [34]

Bảng 1.1 Các vi sinh vật sinh tổng hợp xylanase [34]

Bacillus circulans AB 16 19,28

Streptomyces sp QG-11-3 96

Thermoactinomyces thalophilus sub group C 42

Bảng1 2 Đặc tính của một số xylanase từ vi sinh vật [34]

Điều kiện tối ưu Độ bền

Vi sinh vật

KLPT (KDa)

Vmax (µmol / phút /

1.4 Ứng dụng trong một số lĩnh vực

1.4.1 Sản xuất cồn nhiên liệu

Sự tiêu thụ nhanh chóng nguồn năng lượng hóa thạch đang cần sự thay thế từng bước một với các nguồn thay thế, nguồn này phải thân thiện với môi trường và phải góp phần bảo vệ trái đất thoát khỏi sự khủng hoảng [31] Để thu được bioethanol cần biến đổi nguyên liệu từ thực vật qua các bước như: tiền xử lý bằng hóa chất, sau đó thủy phân lignocellulose biopolymer thành các đường khử (sử dụng enzyme hoặc hóa chất), rồi lên men các đường khử thành rượu, và cuối cùng

là chưng cất và tinh chế bioethanol [36, 40] Tuy nhiên, tiền xử lý và sử dụng hóa chất để thủy phân làm giá thành sản xuất cồn còn cao và gây ảnh hưởng lớn tới môi trường Do đó mà các nhà nghiên cứu đang cố gắng sử dụng công nghệ enzyme để thực hiện quá trình này, việc nghiên cứu tạo ra các loại enzyme có hoạt lực cao, và phối hợp sử dụng các enzyme như xylanase, cellulase, laccase đang được đẩy mạnh nghiên cứu

1.4.2 Sản xuất thức ăn chăn nuôi

Một ứng dụng quan trọng của xylanase là được dùng để bổ sung vào thức ăn chăn nuôi Sự có mặt của xylanase trong thức ăn chăn nuôi làm giảm độ nhớt trong đường tiêu hóa, giảm rối loạn tiêu hóa, tăng cường hấp thu thức ăn, nhờ vậy cải thiện hệ vi sinh vật đường ruột, giúp phân thải ra khô hơn [10, 26, 41]

Ngoài xylanase, một số enzyme khác cũng được bổ sung vào thức ăn chăn nuôi, bao gồm: mananase, ß – glucanase và cellulase, α – amylase, protease và phytase [3] Các loại enzyme này đều được sử dụng rộng rãi trong nhiều năm qua trên toàn thế giới từ Châu Âu, đến Châu Mĩ và Châu Á

thực phẩm thương mại truyền thống của Nhật như là sake (một loại rượu từ gạo) và shoyu koji (từ đậu nành và hạt lúa mì) [41] Người ta chỉ ra rằng hiệu quả phân giải thành tế bào đậu tương và lúa mì cải thiện giá trị sử dụng các vật liệu thô và làm giảm lượng bã ép lọc đậu tương Multifect và Enzeko là tên thương mại của một số các xylanase thương mại cũ được sử dụng trong công nghệ làm bánh Novozyme đưa ra một số các enzyme xylanase mới, có thể là kết hợp với các enzyme khác, để cải thiện bột nhào, đặc biệt là trong các nhà máy bánh mỳ Một số các enzyme xylanase thương mại như Celluclast BG, Fungamyl Super AX, Fungamyl Super

MA and the Pentopan®

1.4.5 Tẩy trắng giấy và bột giấy

Sự tiến bộ trong ứng dụng của công nghệ sinh học tới công nghệ sản xuất giấy và bột giấy đã có những phát triển có ý nghĩa qua những năm gần đây Một trong những ứng dụng thành công nhất là việc sử dụng endo-1,4-β-D-xylanase cho bước tiền xử lý quá trình tẩy trắng bằng Clo và Clo dioxit Dựa trên nghiên cứu của một lượng lớn các phòng thí nghiệm và nhà máy, nó đang được thiết lập để tiền xử

lý cho bột giấy kraft với xylanase [2] đã nâng cao một cách có ý nghĩa khả năng tẩy trắng của bột giấy bằng cách sử dụng các tác nhân tẩy trắng bằng Clo tiếp theo Lợi ích có ý nghĩa nhất của việc tẩy trắng tìm thấy từ việc tiền xử lý bằng xylanase là làm nó sáng hơn, giảm lượng hóa chất tẩy trắng cần thiết mà vẫn cho độ sáng cao,

và giảm lượng hợp chất Clo hữu cơ trong nước thải tẩy trắng Hiệu quả của tiền xử

lý bằng xylanase dựa trên các tác nhân tẩy trắng có chứa oxy được nghiên cứu với một bột giấy kraft gỗ mềm Bột giấy được tiền xử lý với một dung dịch chứa xylanase 12%

Xử lý enzym cũng làm loại bỏ một lượng nhỏ của lignin làm giảm giá trị kappa của bột giấy đi 3% Sự tăng tính nhớt có thể là do các phân tử polysaccharide khối lượng phân

tử cao được làm giàu, diễn ra khi xylan được loại bỏ [31]

1.4.6 Các chất hoạt động bề mặt

Alkyl glycoside là một trong những chất quan trọng nhất của các chất hoạt động bề mặt Về phương diện thương mại, chúng được sản xuất từ các đường đơn

như là glucose và một rượu béo Nhưng sự glycosyl hóa sử dụng polysaccharide thì

dễ dàng thực hiện hơn trong sản xuất công nghiệp, bởi vì sự thủy phân của polysaccharide và các bước tiếp theo có thể được bỏ qua Xylanase từ

Aureobasidium pullulans được sử dụng cho sự glycosyl hóa của xylan, 1-octanol

and 2-ethyl hexanol thành octyl-β-D-xylobioside, xyloside and xylobioside tương ứng

2-ethylhexyl-β-D-1.5 Xylanase tái tổ hợp

Trong tự nhiên, có rất nhiều các loài vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp enzyme xylanase, tập trung chủ yếu ở các loài vi khuẩn và nấm mốc [31] Các enzyme xylanase có nguồn gốc từ vi khuẩn thường có tính chịu nhiệt và pH cao hơn so với enzyme xylanase có nguồn gốc từ nấm mốc [34] Chính vì vậy, nấm mốc thường được dùng làm nguồn sinh tổng hợp xylanase sử dụng trong các ngành công nghiệp như thực phẩm hoặc cồn nhiên liệu , trong khi đó vi khuẩn lại là nguồn sinh enzyme phù hợp cho ngành công nghiệp giấy Mặc dù tính chịu nhiệt có thể tốt cho quá trình sản xuất của các enzym bền nhiệt, nhưngnó thường không có tính thực tế bởi năng suất thấp và quá trình lên men có nhiệt độ cao cần các trang thiết bị đặc biệt Kỹ thuật gene đã tạo ra được các sản phẩm mang tính thương mại nhờ việc chuyển gene vào các cơ thể chủ thích hợp để sản xuất (Baba và cộng sự, 1994) [33] Một loạt các nghiên cứu gần đây đã tách dòng và biểu hiện xylanase trong các vật chủ vi khuẩn, nấm men và nấm mốc khác nhau Một số ví dụ, xylanase được tách

dòng vào trong E coli bao gồm A oryzae (Kimura và cộng sự, 2002), A pullulans (Ohta và cộng sự, 2001), Bacillus lyticus (Srivastava và cộng sự, 2001),

Clostridium thermocellum (Fernandes và cộng sự, 1999) and Caldocellum saccharolyticum (Lüthi và cộng sự, 1990) Một số xylanase từ T lanuginosus IOC-

4145 (Damaso và cộng sư, 2003) và A niger (Berrin và cộng sự, 2000) được biểu hiện trong Pichia pastoris [31] Sự biểu hiện của các protein ngoại lai vào trong hệ

thông prokaryote được sử dụng một cách rộng rãi nhất bởi khả năng biểu hiện ở mức cao, cả trong những nghiên cứu cơ bản và trong sản xuất thương mại Thêm

vào đó, tốc độ sinh trưởng nhanh và sự dễ dàng trong việc nuôi cấy của E coli

khiến nó rất được quan tâm và trở thành loài được sử dụng để biến nạp gene chủ

yếu dùng để sản xuất các sản phẩm chuyển gen hiện nay Ngoài E coli nấm men

cũng được sử dụng khá nhiều để biểu hiện gene

1.5.1 Hệ thống vật chủ được sử dụng trong tách dòng và biểu hiện gene mã hóa xylanase từ nấm mốc

1.5.1.1 Tách dòng trong E coli

E coli được sử dụng rộng rãi trong tách dòng gene và biểu hiện dị hợp

(heterologous expression) protein tái tổ hợp bao gồm cả xylanase từ nấm mốc (bảng) Đây chủ yếu là do dễ dàng tách dòng DNA, lựa chọn được nhiểu vector tách

dòng Trong nhiều trường hợp, việc tiết protein dị hợp (heterologous protein) từ E

coli vào trong môi trường nuôi cấy để tránh những khó khăn liên quan tới tinh sạch

protein từ vật chủ tự nhiên của chúng [33] Hệ thống biểu hiện E coli đã được sử dụng từ lâu để sản xuất protein tái tổ hợp không chỉ nội bào mà cả ngoại bào [40] Hạn chế chính của việc sử dụng vật chủ biểu hiện là E coli đó là không phải mọi

protein đều được tiết ra một cách hiệu quả

- Tách gene: Tách dòng và biểu hiện gene từ nấm mốc trong E coli chủ yếu

thực hiện bằng cách xây dựng thư viện cDNA cDNA này được tổng hợp từ RNA được tách từ canh trường cảm ứng sinh xylanase của nấm mốc như xylanase được cảm ứng và biểu hiện trong sự có mặt của một số nguồn các bon nhất định, nhưng lại bị ức chế trong sự hiện diện của các nguồn khác [33] Krisana và cộng sự (2005)

đã tách một gene xylanase bằng phương pháp RT-PCR [15] từ Aspergillus cf niger

và cloned nó vào trong vector pGEM-T rồi biến nạp vào trong E coli DH5 Để

khẳng định thể biên nạp mang gene cần chuyển được xác định bằng giải trình tự Gene mã hóa cho xynB có khung đọc mã mở kích thước 678 bp Kimura và cộng sự

(2000) đã tách gene mã hóa xyn A từ Penicilium sp 40 thông qua xây dựng thư viện DNA genome trong E coli DH5 [33] Một phần cấu trúc của gene xynA được tìm thấy là 721 bp Tương tự như vậy, gene XYN2 được tách từ C sativus

thông qua xây dựng thư viện cDNA Giải trình tự của cDNA tiết lộ một khung đọc

mã mở kích thước 693 bp

- Biểu hiện trong E coli

Dòng cDNA của xylanase từ nấm mốc được biểu hiện trong E coli với sự

vắng mặt của intron trong vật chủ Trong nhiều trường hợp, xylanase tái tổ hợp biểu

hiện trong E coli tích tụ trong tế bào chất (cytoplasm) hoặc trong periplasm [33]

Mặc dù hoạt tính ngoại bào cũng đã được báo cáo [33] Mức độ biểu hiện của gene phụ thuộc vào hiệu quả của quá trình phiên mã đó là chức năng của trình tự promoter (Youderian và cộng sự, 1982) Một vài vector biểu hiện và vật chủ là có

sẵn để biểu hiện gene dị hợp (heterologous gene) trong E coli Gene từ Eukaryotic thường không được biểu hiện trong E coli do thiếu một promoter chức năng

Basaran và cộng sự đã biểu hiện β-xylanase từ Pichia stipitis dưới chính promoter

của chúng trong E coli, mặc dù hoạt tính enzyme thu được thấp hơn (4 U/mg) đáng

kể so với haọt tính từ chủng ban đầu (30 U/mg) [33] Chenyan Zhou và cộng sự

(2007) đã tách dòng và giải trình tự gen xyn// mã hóa xylanase của A usamii E001

[47] Gen mã hóa một protein gồm 184 amino acid có khối lượng 19.8 kDa Vùng

mã hóa của gen có một intron nên việc nhân dòng gen được tiến hành thông qua bước tổng hợp cDNA từ RNA Cùng với việc sử dụng pET-28a(+) làm vector biểu

hiện, gene được đưa vào biểu hiện trong E coli BL21-CodonPlus (DE3)-RIL

Xylanase từ chủng tái tổ hợp được xác định hoạt lực đạt cao nhất là 49,6 U/mg Điều kiện phản ứng tối ưu là 50°C, pH 4,6 Hơn 50% hoạt lực enzyme duy trì trong

dải pH từ 4,2 đến 5,3 Đây là công bố đầu tiên về việc tách dòng gen xylanase từ A

usamii [47]

1.5.1.2 Tách dòng trong nấm men

- Tách dòng trong Saccharomyces cerevisiae

Một số gene xylanase từ nấm mốc đã được tách dòng và biểu hiện trong

Saccharomyces cerevisiae [43] Đây là vật chủ rất hấp dẫn cho biểu hiện các

protein dị hợp [33] bao gồm β – xylanase (Romanos và cộng sự, 1992), bởi chúng

có hệ thống sửa đổi sau dịch mã Mặt khác của S Cerevisiae là chúng chỉ tiết ra một

vài protein, do vậy, quá trình tinh sạch để thu các protein được biểu hiện dễ dàng hơn [33] Một gene 1,4-β xylanase (xynC) từ Aspergillus kawachii đã được khuếch

đại nhờ phương pháp RT-PCR và cloned vào trong S cerevisiae (Crous và cộng sự, 1995) Gene xyn2 từ Trichoderma reesei [21] cũng được khuếch đại nhờ phương pháp RT-PCR và được biểu hiện trong S cerevisiae (La Grange và cộng sự, 1996) Hai gene XYN4 và XYN5 từ Aspergillus niger ATCC 90196 đã được biểu hiện trong S cerevisiae Y294 (Lutting và cộng sự, 1997) Trình tự nucleotide của gene

mã hóa cho XYN4 và XYN5 chứa khung khung đọc mã mở có kích thước 636 bp,

mã hóa cho 221 axit amin Hoạt tính xylanase đạt cực đại sau 48 h nuôi cấy đối với các chủng tái tổ hợp mang gene XYN4 là 91 nkat/ml còn với XYN5 là 56 nkat/ml

sau 55 h Gene xyn A từ Aureobasium pullans được biểu hiện trong S cerevisiae

dưới sự kiểm soát của promoter GAN1 trong vetơ pYEF2 và sản phẩm của nó được tiết vào trong môi trường nuôi cấy [33]

Năm 2006, chủng Pichia pastoris X33 được [43] sử dụng làm vật chủ biểu hiện gen xylanase phân lập từ nấm mốc Aspergillus niger CGMCC1067 Hoạt tính

xylanase tái tổ hợp gấp 50 lần so với chủng gốc (62 U/ml) Trong một nghiên cứu

khác, Vasimon Ruanglek và cộng sự cũng biểu hiện thành công gen xylanase của A

niger BCC 14405 trong Pichia pastoris KM 71 [43, 47] Hoạt lực xylanase đạt 8007

U/mg Dải pH phù hợp với enzyme tái tổ hợp rộng hơn so với chủng gốc, pH tối ưu cho phản ứng là 5,0, hoạt lực enzyme duy trì được trên 50% trong dải từ 3,6 đến 6,5

và nhiệt độ tối ưu cho phản ứng cũng cao hơn 5°C so với enzyme của chủng gốc 55°C

cộng sự, 2002) Enzyme tái tổ hợp Xyn2 đã biểu hiện hoạt tính cao nhất ở pH 5,0 – 6,0 và nhiệt độ 50 – 60oC, và duy trì được 75% hoạt tính sau 3 h khi ủ ở 50oC

Levasseur và cộng sự (2005) đã tách dòng thành công cDNA xynB của A niger

dưới sự kiểm soát của promoter mạnh và chủ yếu của gene

gluceroladehydes-3-phosphate dehydrogenase Các mẫu tái tổ hợp được biến nạp vào trong A niger

D15 cho sự biểu hiện đồng thể của gene xynB Hoạt tính xylanase cao nhất là 625

U/ml sau 4 ngày của mẫu biến nạp tốt nhât Ba gene xylanase của Phanerochaete

chrysosporium xynA, xynB và xynC được tách dòng và biểu hiện trong chủng A niger N593 [33], cho biểu hiện protein dị thể (Decelle và cộng sự, 2004) Lượng

hoạt tính xynB cao gấp 4.5 lần so với lượng xynA và xynC tái tổ hợp

Hai gene xylanase, cgxA và cgxB, từ Chaetomium gracile được biểu hiện với promoter của chúng trong A nidulans G191 [33] Phân tích Western blot xác

nhận sự biểu hiện của gene xylanase Tất cả các mẫu biến nạp mang gene cgxA có mức độ hoạt tính xylanase cao đáng kể trong môi trường xylan, trái lại hoạt tính không có hoặc rất thấp được tìm thấy trong môi trường glucose và mẫu này tạo ra xylanase xấp xỉ 20 kDa Các mẫu mang gene cgxB tạo ra được so sánh hoạt tính xylanase sau khi phát triển ở môi trường xylan và glucose cgxB xuất hiện khi gene

được biểu hiện chủ yếu ở A nidulans G191 xynG1 từ chủng A oryzae KBN616 được biểu hiện trong A.nidulans G191 [33] Phân tích gene bằng phương pháp

Southern blot khẳng định sự hài hòa của gene xynG1 Tất cả các mẫu biến nạp đều thể hiện hoạt tính xylanase thậm chí cả trong môi trường glucose Tuy nhiên, mức

độ enzyme trong môi trường xylan cao hơn hẳn so với glucose

Kitamato và cộng sự (1999) đã biểu hiện quá mức gene xynF1 của A.oryzae

dưới sự kiểm soát của promoter mạnh gene TEFI của A Oryzae [33] Mẫu tạo

xynF1 ở mức cao tạo ra 180 mg/l xynF1 trong môi trường chứa glucose Một gen

xynG2 có kích thước 767bp được phân lập từ A oryzae KBN616 và được biểu hiện thành công trong A oryzae dưới sự kiểm soát của promoter P-No8142, promoter mạnh nhất trong A.oryzae được nuôi trong môi trường glucose (Kimura và cộng sự, 2000) Tương tự như vậy, Kimura và cộng sự đã phân lập một gene xynF3 từ A

oryzae KBN616 và biểu hiện nó trong A oryzae dưới sự kiểm soát của promoter

P-No8142 [33] Các mẫu biến nạp đều thể hiện hoạt tính xylanase cao trong môi trường glucose polypeptone trong 3 ngày ở 30oC

Mặc dù hiện nay một vài chủng nấm men và nấm mốc được sử dụng để biểu hiện

các gene xylanase từ nấm mốc, nhưng E coli vẫn tiếp tục được dùng làm vật chủ tách dòng chủ yếu Cải tiến trong vector và chủng E coli sẽ giúp gia tăng nhân dòng

các gene xylanase từ nấm mốc

1.5.2 Một số nghiên cứu liên quan ở Việt Nam

Ở Việt Nam đã có một số công trình nghiên cứu về xylanase từ các chủng vi sinh vật, tuy nhiên những công trình này mới bắt đầu trong vài năm gần đây

Năm 2004, Nguyễn Thị Uyên Thảo và các cộng sự [28] đã công bố nghiên cứu về

việc sử dụng vi nấm Trichoderma để thu nhận các enzyme cellulose, xylanase và

pectinase từ nguồn nguyên liệu là bã khoai mì Tổ hợp enzyme này được nghiên cứu và ứng dụng vào sản xuất thức ăn chăn nuôi

Đỗ Thị Tuyên [12] và cộng sự tiến hành nghiên cứu và đánh giá một số

tính chất hóa lý của chủng Aspergillus niger DSM1957 trên dịch tinh sạch sơ bộ

Hoạt tính của enzym xylanase đạt cao nhất ở nhiệt độ 55oC, pH là 5,0 Hoạt tính xylanase bị giảm khi ủ với một số ion kim loại ( Fe2+, Fe3+, Ca2+, Mg2+, Zn2+, Cu2+,

Ni2+, K+, EDTA ) ở nồng độ 2 mM

Bên cạnh đó cũng có một số đề tài nghiên cứu về xylanase tái tổ hợp Năm

2009, Nguyễn Thị Thu Thùy và cộng sự đã biểu hiện và đánh giá tính chất hóa lý

của xylanase tái tổ hợp từ Aspergillus oryzae VTCC – F187 trong Pichia pastoris

GS115

Nguyễn Hải Chiều và cộng sự biểu hiện thành công một cDNA xylanase

phân lập từ Aspergillus awamoris trong Pichia pastoris Xylanase tái tổ hợp có

hoạt tính cao nhất ở pH 4,0 Dải bền nhiệt của enzyme từ 20 - 60°C

Lê Văn Trường, Thomas Schweder đã biểu hiện gen mã hóa xylanase trong

Bacillus subtilis sử dụng promoter alpha-amylase từ Bacillus amyloliquefaciens

Sau khi biểu hiện, lượng rXynA được tiết ra với mức độ cao, đạt khoảng 0,5 mg/ml trên môi trường BMM Nhiệt độ tối ưu và pH tối ưu cho hoạt tính xylanase

là 50oC, pH 6.0

CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Chủng vi sinh vật, tế bào chủ, vector sử dụng

ƒ Chủng nấm mốc Aspergillus niger B7 có hoạt tính xylanase từ bộ sưu tập giống của phòng Vi Sinh và Kỹ Thuật Di Truyền, viện Công nghệ sinh học-Công nghệ thực phẩm, trường Đại Học Bách Khoa Hà Nội

ƒ Chủng Escherichia coli TOP 10 và Escherichia coli BL 21 được giáo sư Hwang Inhwan (khoa Khoa học đời sống, trường Đại học Khoa học và Công nghệ Pohang, Hàn Quốc) gửi tặng

ƒ Vector tách dòng, biểu hiện được chọn là vector pRSET A (được giáo sư Hwang Inhwan -khoa Khoa học đời sống, trường Đại học Khoa học và Công nghệ Pohang, Hàn Quốc gửi tặng)

Hình 2.1 : Cấu trúc vector tách dòng, biểu hiện pRSET A

Vector biểu hiện pRSET A được thiết kế dựa trên hệ thống biểu hiện promotor T7

Sự biểu hiện của các gene đích tạo dòng trong vector được cảm ứng bằng cách sản

xuất T7 RNA polymerase trong tế bào vật chủ E Coli PT7-promotor mạnh của bacteriophage T7 cho phép biểu hiện gene ở mức độ cao, RBS-vùng liên kết

ribosome, ATG-mã khởi đầu , N-terminal polyhistidine (6xHis) tag- cho phép tinh sạch nhanh protein bằng Niken, EK-enterokinase cắt điểm để loại bỏ đầu dung hợp, MCS-vùng tạo dòng, Stop- gene kết thúc phiên mã terminator, f1 ori của phage dạng sợi- sản xuất DNA sợi đơn, Ampicillin-gene chọn lọc kháng kháng sinh

2.2 Hóa chất và thành phần môi trường nuôi cấy

- Hóa chất:

Tất cả các hóa chất đều có độ tinh sạch cần thiết, đảm bảo các tiêu chuẩn dùng cho nghiên cứu và được sử dụng, bảo quản theo hướng dẫn và khuyến cáo của nhà sản xuất

ƒ Các hóa chất dùng trong nuôi thu sinh khối nấm mốc Aspergillus niger B7 và

C1, nuôi thu sinh khối và nuôi thu enzyme xylanase từ E coli: NaNO3, KCl,

Fe2SO4, MgSO4, KH2PO4, cao nấm men, saccharose, trypton, NaCl,

CH3COONa, axit 3,5-dinitrosalisilic (Trung Quốc), Birchwood xylan Merck (Đức)

ƒ Hóa chất dùng để tách chiết DNA tổng số, điện di DNA, tinh sạch sản phẩm PCR, tinh sạch sản phẩm cắt vector, điện di protein: Tris base, Ethylen diamin tetra acetic acid (EDTA), CTAB, NaCl, β-mercaptoethanol, Sodium dodecyl sulphate (SDS), Natri axetat, ethanol 100%, Cloroform:isoamylalcohol (24:1), agarose, ethydium bromide (EtBr) của hãng Sigma (Mỹ), SiO4, NaI, isopropanol, của Merck (Đức), polyacrylamide, APS, TEMED của hãng Sigma (Mỹ)

ƒ Hóa chất dùng trong khi thực hiện phản ứng PCR gồm: 4 loại dNTP, MgCl2

và Taq DNA polymerase, primer được tổng hợp từ công ty Sigma (Mỹ)

ƒ Các enzym: Proteinase K, RNase, (Merck, Đức); NcoI, XhoI, T4-ligase (Fermentas)

- Thành phần môi trường nuôi cấy :

ƒ Môi trường sinh tổng hợp xylanase (A): NaNO3 3 g/l, MgSO4.7H2O 0,5 g/l, FeSO4 0,01 g/l, KH2PO4 1 g/l, KCl 0,5 g/l, Cao nấm men 5 g/l, xylan 2 g/l, Agar 20 g/l Môi trường được thanh trùng ở 121oC trong thời gian 15 phút

ƒ Môi trường nuôi nấm mốc Czapek (B): NaNO3 3 g/l, MgSO4.7H2O 0,5 g/l, FeSO4 0,01 g/l, KH2PO4 1 g/l, KCl 0,5 g/l, Cao nấm men 5 g/l, saccharose 30 g/l, Agar 20 g/l Môi trường được thanh trùng ở 121oC trong thời gian 15 phút

ƒ Môi trường nuôi E Coli : Cao nấm men 5 g/l, Trypton 10 g/l, NaCl 5 g/l, Agar 15g/l Môi trường được thanh trùng ở 121oC trong thời gian 15 phút

2.3 Thiết bị

Các thiết bị thuộc phòng thí nghiệm Vi sinh và kỹ thuật di truyền, phòng thí nghiệm công nghệ cao thuộc Viện công nghệ Sinh học-Công nghệ thực phẩm, trường đại học Bách Khoa Hà Nội, bao gồm:

- Các loại cân điện tử Nhật Bản

- Nồi khử trùng Hirayama (Nhật Bản)

- Tủ cấy vô trùng Esco (Anh)

- Máy khuấy trộn Vortex KikaWorks (Asia)

- Micropipet các loại Biohit

- Máy li tâm Eppendorf CHLB Đức

- Bộ điện SDS - PAGE Bio-Rad (Italy)

- Bộ điện di agarose Advance Tech (Nhật bản)

- Máy soi chụp ảnh gel Syne Gene (Mỹ)

2.4 Nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp xylanase của chủng

- Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đên hoạt tính xylanase

Chủng nấm mốc Aspergillus niger B7 được nuôi trong môi trường A lỏng với

nồng độ xylan thay đổi từ 2 g/l ÷ 10 g/l, ở nhiệt độ 30oC, pH = 5,0, tốc độ lắc 200 vòng/phút Sau khoảng thời gian 24, 48, 72, 96 và 120 h, dịch nuôi cấy được thu để xác định hoạt độ xylanase

- Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính xylanase : Chủng nấm mốc Aspergillus

niger B7 được nuôi trong môi trường A lỏng ở các nhiệt độ khác nhau 25oC, 30oC,

35oC, 40oC với tốc độ lắc 200 vòng/phút Sau khoảng thời gian 24, 48, 72, 96 và

120 h, dịch nuôi cấy được thu để xác định hoạt độ xylanase

- Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính xylanase

Chủng nấm mốc Aspergillus niger B7 được nuôi trong môi trường A lỏng ở các pH

khác nhau là 4,0; 5,0; 6,0; 7,0; 8,0với tốc độ lắc 200 vòng/phút Sau khoảng thời gian 24, 48, 72, 96 và 120 h, dịch nuôi cấy được thu để xác định hoạt độ xylanase

2.5 Phương pháp tách chiết DNA

- Thu sinh khối sau khi nuôi nấm mốc trên môi trường Czapeck lỏng 48 h

- Lấy 0,2 - 0,3 g sinh khối nấm mốc Bổ sung 1ml đệm lysis (100 mM HCl pH 8,0, 10 mM EDTA, 2% SDS, 1% β-mecaptoethanol, 100 µg protease K) Ủ ở 65oC trong 1 giờ

Tris Thêm NaCl 5M để đạt nồng độ NaCl là 0,7M Thêm CTAB 10% với thể tích bằng 1/10 dịch Ủ ở 65oC trong 30 phút

- Cho hỗn hợp Cloroform:Isoamyl alcohol (24:1) vào dịch với tỷ lệ 1:1

- Hòa tan trong 50 µl TE (10 mM Tris, 1 mM EDTA)

2.5.2 Tách chiết DNA plasmid

ƒ Nguyên tắc

Sử dụng các hóa chất tẩy rửa mạnh để phá vỡ thành tế bào, phá vỡ các liên kết của protein với DNA, loại bỏ được DNA genome, thu DNA plasmid

ƒ Hóa chất

- Dung dịch I: 50 mM glucose, 25 mM tris-HCl (pH 8,0), 10 mM EDTA (pH 8,0)

- Dung dịch II: 1 % SDS, 0,2 N NaOH

- Dung dịch III: 3 M CH3COOK, 5 M acetate

ƒ Tiến hành

- E coli từ môi trường thạch được lấy ngẫu nhiên 10 khuẩn lạc chuyển sang

nuôi trong môi trường LB lỏng, lắc 200 vòng/phút, ở 37oC

- Chuyển môi trường có chứa tế bào vào ống eppendorf, ly tâm 13000 vòng/phút, thời gian 2 phút ở nhiệt độ phòng

- Thu tế bào, bổ sung 200 µl dung dịch 1, vortex

- Bổ sung 400 µl dung dịch 2, lắc nhẹ (tuyệt đối không vortex)

- Bổ sung 300 µl dung dịch 3, lắc nhẹ

- Ly tâm 14000 vòng/ phút, 10 phút ở 4oC

- 850 µl dịch nổi được chuyển sang ống eppendorf mới có bổ sung 1µl RNAse,

ủ ở 37oC trong 30 phút

- Bổ sung 500 µl isopropanol, lắc nhẹ

- Ly tâm thu pellet 14000 vòng/phút, 10 phút, ở 4oC

- Bổ sung 1ml ethanol 70%, ly tâm 13000 vòng/phút, 3 phút ở nhiệt độ phòng

nhằm mục đích thu nhận một lượng lớn bản sao của một trình tự xác định

Phản ứng PCR là một chuỗi gồm nhiều chu kỳ nối tiếp nhau, mỗi chu kỳ gồm 3 bước:

- Bước biến tính DNA: là giai đoạn hình thành đoạn DNA sợi đơn đóng vai trò làm khuôn, nâng nhiệt độ cao hơn nhiệt độ nóng chảy Tm của DNA khuôn (giai đoạn này cần nhiệt độ thường là từ 94oC đến 95oC), thời gian kéo dài từ 30 giây đến 1 phút để biến tính DNA từ dạng sợi kép thành dạng sợi đơn

- Bước tiếp hợp (bắt cặp): Là giai đoạn để mồi bắt cặp với khuôn, cần hạ nhiệt độ xuống dưới Tm của các mồi (thường trong khoảng nhiệt độ từ 40o C –

70oC), phụ thuộc vào độ dài và tỷ lệ G,C của mỗi mồi, thời gian kéo dài từ 30 giây đến 1phút để các mồi bắt cặp với khuôn

- Bước tổng hợp: Là giai đoạn DNA polymerase (Taq polymerase) sẽ tổng

hợp sợi DNA mới trên khuôn, thời gian kéo dài từ 30 giây đến vài phút Giữ ở 720C

để kéo dài phân tử DNA từ đoạn mồi

Như vậy, một phản ứng PCR là một chuỗi nhiều chu kỳ nối tiếp nhau (thường từ 30 - 35 chu kỳ) sẽ tạo được lượng sản phẩm cần thiết và sau n chu kỳ ta thu được 2n đoạn DNA từ một đoạn DNA khuôn ban đầu

Chu trình nhiệt của phản ứng PCR

Nhiệt độ (độ C) Thời gian

- Phản ứng overlap PCR thu cds gene xylanase

- PCR thu exon 1 và exon 2

- PCR thu cds gene xylanase

Nhiệt độ (độ C) Thời gian

2.7 Phương pháp điện di trên gel agarose

ƒ Nguyên tắc

Điện di trên gel agarose là một phương pháp quan trọng để phân tách các mảnh

DNA dựa trên kích thước của chúng Phương pháp này dựa trên tính chất của phân

tử DNA tích điện âm cao trong môi trường dung dịch gần pH trung tính Đặc điểm

này khiến DNA di chuyển qua gel về phía điện cực dương với vận tốc phụ thuộc

vào kích thước của DNA Bằng cách sử dụng thang DNA có khối lượng và kích