Nghiên cứu đa dạng di truyền và hàm lượng huperzin a của loài thạch tùng răng cưa thu từ sapa và đà lạt

Chính vì vậy, theo các nhà khoa học, cây Thạch tùng răng cưa cần được quan tâm nghiên cứu và khai thác ứng dụng trong điều trị các bệnh rối loạn về trí nhớ, nhất là Alzheimer.. Trong khi

LỜI CẢM ƠN

Trước hết, tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới GS.TS Hoàng Đình Hòa -

Bộ môn công nghệ sinh học - Viện Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm - Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội và TS Lê Thị Bích Thủy - Phòng Di truyền Tế bào thực vật - Viện công nghệ sinh học- Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tận tình giúp đỡ, hướng dẫn cho tôi trong quá trình nghiên cứu suốt thời gian qua

Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo, các anh chị, các bạn sinh viên phòng Di truyền Tế bào thực vật - Viện công nghệ sinh học- Viện Hàn lâm Khoa học

và Công nghệ Việt Namđã nhiệt tình giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình thực hiện đề tài

Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè và người thân đã động viên, khuyến khích giúp tôi vượt qua những khó khăn trong suốt thời gian nghiên cứu

và thực hiện đề tài

Hà Nội, ngày 22 tháng 03 năm 2016

Phạm Thị Hạnh

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan: Kết quả của luận văn này là kết quả nghiên cứu của tôi được thực hiện dưới sự hướng dẫn khoa học của GS.TS Hoàng Đình Hòa Trường Đại học Bách khoa Hà Nội và TS Lê Thị Bích Thủy Trưởng phòng Di truyền Tế bào thực vật – Viện công nghệ sinh học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, với sự giúp đỡ của các cán bộ và sinh viên làm việc tại phòng Di truyền Tế bào thực vật - Viện công nghệ sinh học- Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Nội dung luận văn có tham khảo và sử dụng các tài liệu, thông tin được đăng tải trên các tác phẩm, tạp chí và trang web theo danh mục tài liệu kham khảo

Tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm với sự cam đoan trên

Hà Nội, ngày 22 tháng 03 năm 2016

Phạm Thị Hạnh

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC HÌNH

DANH MỤC CÁC BẢNG

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Cây Thạch tùng răng cưa và hoạt chất Huperzin A 3

1.1.1 Cây Thạch tùng răng cưa 3

1.1.1.1 Giới thiệu chung về cây Thạch tùng răng cưa 3

1.1.1.2 Thành phần hoạt chất có trong cây Thạch tùng răng cưa 4

1.1.2 Hoạt chất Huperzin A 5

1.1.2.1 Tính chất hóa học và các thuộc tính hóa lý của Huperzin A 6

1.1.2.2 Dược động học của Huperzin A 7

1.1.2.3 Đặc tính chữa bệnh Alzheimer của Huperzin A 8

1.2 Chỉ thị phân tử RAPD 10

1.3 Tình hình nghiên cứu về Thạch tùng răng cưa và Huperzin A 11

1.3.1 Các nghiên cứu về Thạch tùng răng cưa 11

1.3.2 Các nghiên cứu về Huperzin A 14

CHƯƠNG II: VẬT LIỆU, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16

2.1 Vật liệu, hóa chất và thiết bị máy móc 16

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 16

2.1.2 Hóa chất và thiết bị 18

2.1.2.1 Hóa chất 18

2.1.2.2 Thiết bị 18

2.2 Phương pháp nghiên cứu 18

2.2.1 Phương pháp tách chiết DNA tổng số Thạch tùng răng cưa 18

2.2.2 Kỹ thuật PCR với các mồi RAPD 20

2.2.3 Phân tích số liệu đa dạng di truyền 22

2.2.4 Phương pháp tách chiết Huperzin A 24

2.2.5 Phương pháp sắc ký bản mỏng 25

2.2.6 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) 25

CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 27

3.1 Kết quả tách DNA tổng số 27

3.2 Kết quả đánh giá đa dạng di truyền các mẫu Thạch tùng răng cưa 29

3.2.1 Kết quả đánh giá mức độ đa hình 29

3.2.2 Kết quả phân tích mối quan hệ di truyền 33

3.3 Kết quả định tính và định lượng Huperzin A 35

3.3.1 Kết quả định tính Huperzin A ở các mẫu Thạch tùng răng cưa thu từ 8 địa điểm lấy mẫu 36

3.3.2 Kết quả định lượng Huperzin A ở các mẫu Thạch tùng răng cưa thu từ 8 địa điểm lấy mẫu 37

3.3.3 Kết quả định tính Huperzin A từ các bộ phận và thời điểm lấy mẫu Thạch tùng răng cưa khác nhau 39

3.3.4 Kết quả định lượng Huperzin A từ 4 mẫu lá Thạch tùng răng cưa 41

CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN 45

TÀI LIỆU THAM KHẢO 46

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DNA : Deoxyribonucleic acid RNA : Axit ribonucleotide CTAB : Cetyltrimethyl amoniumbromide dNTP : Deoxynucleosid triphosphat EDTA : Ethylene diamin tetra acetate

Taq Polymerase : Thermus aquaticus Polymerase TBE : Tris base, Boric acid, EDTA

H serrata : Huperzia serata ACh : Acetylcholine BuChE : Butyrylcholinesterase AChE : Acetylcholinesterase

TLC : Thin layer chromatography (Sắc ký lớp mỏng) HPLC : High performance liquid chromatography

(Sắc ký lỏng hiệu năng cao) ACN : Acetonitrile

LC/MS : Sắc ký lỏng khối phổMeOH : Methanol

DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH

Hình 1.1 Cây thạch tùng răng cưa 3

Hình 1.2 Đại diện cho 4 nhóm hợp chất chính của Lycopodium alkaloids thu từ H serrata: Fawcettimine (A), lycodine (B),Lycopodine (C),phlegmarine (D) 4

Hình 1.3 Hai dạng đồng phân quang học của Huperzin A 7

Hình 1.4 Cấu trúc tương tự nhau của Huperzin A và ACh 9

Hình 2.1 Bản đồ 5 vị trí lấy mẫu ở Sa Pa 17

Hình 2.2 Bản đồ 3 vị trí lấy mẫu ở Đà Lạt 17

Hình 3.1 Kết quả điện di tách chiết DNA tổng số từ 8 mẫu Thạch tùng răng cưa 27

Hình 3.2 Kết quả điện di sản phẩm PCR-RAPD với mồi OPC1 30

Hình 3.3 Kết quả điện di sản phẩm PCR-RAPD với mồi OPC8 30

Hình 3.4 Kết quả điện di sản phẩm PCR-RAPD với mồi OPC18 31

Hình 3.5 Kết quả điện di sản phẩm PCR-RAPD với mồi OPC20 31

Hình 3.6 Kết quả điện di sản phẩm PCR-RAPD với mồi OPB6 31

Hình 3.7 Kết quả điện di sản phẩm PCR-RAPD với mồi OPB10 32

Hình 3.6 Quan hệ di truyền giữa 8 mẫu Thạch tùng răng cưa nghiên cứu 35

Hình 3.7 Hình ảnh chạy sắc ký bản mỏng Huperzin A từ 8 mẫu Thạch tùng răng cưa 36

Hình 3.8 Đường chuẩn định lượng Huperzin A 38

Hình 3.9 Hình ảnh chạy sắc ký bản mỏng Huperzin A từ Thạch tùng răng cưa thu tại DL1 40

Hình 3.10 Hình ảnh chạy sắc ký bản mỏng Huperzin A từ Thạch tùng răng cưa thu tại SP1 41

Hình 3.11 Sắc kí đồ HPLC (UV 310 nm) phát hiện Huperzin A 42 Hình 3.12 Phổ ESI- MS positive và pic ion phân tử 243,0 [M+H]+ của Huperzin A 42

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1 Địa điểm lấy mẫu sử dụng trong nghiên cứu 16

Bảng 2.2 Trình tự nucleotide của 8 mồi RAPD sử dụng trong nghiên cứu 22

Bảng 2.3 Thành phần phản ứng PCR-RAPD 22

Bảng 2.4 Bảng gradient nồng độ rửa giải 26

Bảng 3.1 Kết quả đo độ hấp thụ bước sóng 260 nm, 280 nm và nồng độ DNA tổng số của 8 mẫu Thạch tùng răng cưa nghiên cứu 28

Bảng 3.2 Tổng hợp kết quả phân tích 8 mẫu Thạch tùng răng cưa với 8 mồi RAPD cho đa hình 33

Bảng 3.3 Hệ số tương đồng di truyền của 8 mẫu Thạch tùng răng cưa 34

Bảng 3.4 Các thang nồng độ trong đường chuẩn định lượng Huperzin A 37

Bảng 3.5 Kết quả phân tích định lượng 8 mẫu Thạch tùng răng cưa 39

Bảng 3.6 Kết quả phân tích định lượng Huperzin A trong mẫu Thạch tùng răng cưa ở Sa Pa 43

MỞ ĐẦU

Ngày nay, cùng với sự phát triển của kinh tế, con người có xu hướng ăn uống

và sinh hoạt không điều độ dẫn tới khả năng dễ mắc một số bệnh khi về già làm giảm tuổi thọ Có rất nhiều bệnh nguy hiểm gây tử vong ở người già và Alzeimer là chứng bệnh gây tử vong ở người cao tuổi đứng hàng thứ 4 hiện nay Đây là bệnh thoái hóa cả não bộ không hồi phục, gây chứng sa sút trí tuệ ở người cao tuổi Tổn thương tế bào thần kinh ở vỏ não và những cấu trúc xung quanh làm sa sút trí nhớ, giảm phối hợp vận động, giảm cảm giác, nhận cảm sai…, cuối cùng là mất trí nhớ

và chức năng tâm thần, khó khăn trong đi đứng Xuất phát từ những ảnh hưởng tiêu cực của bệnh Alzeimer, có rất nhiều công trình nghiên cứu được tiến hành nhằm tìm

ra nguyên nhân và cách chữa trị chứng bệnh này Các nhà khoa học Mỹ đã mở ra tia

hy vọng mới cho các bệnh nhân Alzheimer với công trình khoa học khẳng định việc

"bắt chết" một enzym liên quan đến bệnh Alzheimer Huperzin A một chất thuộc nhóm Alkaloide có trong cây Thạch tùng răng cưa có khả năng xuyên qua hàng rào mạch máu não và tác động trực tiếp lên não bộ với liều lượng rất thấp tính bằng microgram Chính vì vậy, theo các nhà khoa học, cây Thạch tùng răng cưa cần được quan tâm nghiên cứu và khai thác ứng dụng trong điều trị các bệnh rối loạn về trí nhớ, nhất là Alzheimer Đối với nước Việt Nam chúng ta, hiện nay tỷ lệ người cao tuổi ngày càng gia tăng và các rối loạn về trí nhớ cũng phát triển, dẫn đến nhu cầu

về chữa bệnh cũng tăng lên Trong khi các nhà khoa học trên thế giới phát hiện ra công dụng đặc biệt của loài cây Thạch tùng răng cưa và có nhu cầu rất lớn về cây này để tách chiết các hoạt chất có nguồn gốc thiên nhiên nhằm giảm thiểu tác dụng phụ, thì ở Việt Nam Thạch tùng răng cưa đã phát hiện được ở Sa Pa (Lào Cai) và Đà Lạt (Lâm Đồng) Ở Lào Cai hiện nay loài cây này chỉ còn lại ở một số nơi trong rừng tự nhiên Ở Đà Lạt một số cơ sở nhân giống nhà nước cũng như tư nhân đã tạo được vài vườn giống loài cây này với mục đích thương mại, các vườn này chưa

nhiều và bố trí chưa bài bản Tại một số Viện, Trung tâm nghiên cứu nuôi cấy mô ở Việt Nam hiện nay cũng đã lưu giữ được trong điều kiện nuôi cấy invitro loài Thạch

tùng răng cưa Huperzia serrata, tuy nhiên cũng chỉ mới dừng lại ở mức độ nghiên

cứu lưu giữ và nhân cây trong phòng thí nghiệm Hoàn toàn chưa có một công bố nào nghiên cứu về Thạch tùng răng cưa trong nước

Chính vì vậy, chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu đa dạng di truyền và hàm lượng Huperzin A của loài Thạch tùng răng cưa thu từ Sa Pa và Đà Lạt”

nhằm phục vụ cho việc khai thác và phát triển nguồn gen Thạch tùng răng cưa ở Việt Nam

Mục tiêu của đề tài :

- Đánh giá được mức độ đa dạng di truyền bằng chỉ thị phân tử của loài Thạch tùng răng cưa sinh trưởng tại Sa Pa và Đà Lạt, Việt Nam

- Nghiên cứu định tính và định lượng Huperzin A của Thạch tùng răng cưa Việt Nam

Nội dung nghiên cứu:

- Đánh giá đa dạng di truyền bằng chỉ thị phân tử RAPD với các xuất xứ Thạch tùng răng cưa

- Xác định hàm lượng Huperzin A của Thạch tùng răng cưa ở các thời điểm

và ở các vùng sinh thái khác nhau

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Cây Thạch tùng răng cưa và hoạt chất Huperzin A [6] [21]

1.1.1 Cây Thạch tùng răng cưa

1.1.1.1 Giới thiệu chung về cây Thạch tùng răng cưa

Cây Thạch tùng răng cưa có tên khoa học là Huperzia serrata (H serrata) là một thành viên của gia đình Thông đất (Huperziaceae) và thuộc chi Huperzia

Huperzia serrata lần đầu tiên được biết đến nhờ các nhà y học Trung Quốc với tên

gọi Quian Ceng Ta [17][21] Cây mọc ở đất, thân cao 15-40cm, đường kính khoảng 2mm, hình trụ Lá hình bầu dục, mũi mác, dài 15mm rộng 3mm, tương đối mỏng, gân giữa rõ, có mép răng Túi bào tử ở nách nhánh lá, có hình thận, màu vàng tươi

[36] Huperzia serrata phân bố trên toàn thế giới nhưng tập trung nhiều nhất ở phía

Đông, Nam và Đông Nam khu vực Châu Á, Châu Đại Dương và Trung Mỹ Phân

bố ở độ cao 230-2200m so với mực nước biển dưới tán rừng ẩm Ở nước ta

Huperzia serrata chỉ gặp ở vùng núi cao 1000m như Lào Cai, Lâm Đồng [37]

Huperzia serrata được sử dụng rộng rãi cho các bệnh có liên quan đến hệ tim

mạch, các cơ thần kinh hoặc những người liên quan đến hoạt động cholinesterase

bao gồm sốt, tụ máu, căng thẳng, tiểu máu và tâm thần phân liệt Huperzia serrata

cũng được biết đến như một loại thuốc chống viêm, giải độc cho ngộ độc

organophosphat Những đặc tính chữa bệnh của H serrata chủ yếu là do hoạt tính sinh học của hợp chất Lycopodium alkaloid trong loài cây này [21]

Hình 1.1 Cây thạch tùng răng cưa

1.1.1.2 Thành phần hoạt chất có trong cây Thạch tùng răng cưa

Trong Thạch tùng răng cƣa nhóm chất chính có hoạt tính sinh học làm nên

đặc tính chữa bệnh của cây này là Lycopodium alkaloids Một số Lycopodium

alkaloids với cấu trúc hóa học đa dạng đƣợc phân lập từ cây Thạch tùng răng cƣa

vẫn đang đƣợc các nhà khoa học nghiên cứu để xây dựng nên cấu trúc các hợp chất alkaloids mới Tuy nhiên, có rất ít công bố khoa học về hoạt tính sinh học của các

hợp chất alkaloid này Đa số các Lycopodium alkaloids là liposoluble và chúng

đƣợc phân thành bốn loại cấu trúc chính Bốn loại cấu trúc chính đó đƣợc trình bày

trong hình 1.2 bao gồm các nhóm: Fawcettimine, lycodine,lycopodine, phlegmarine [21][32][33]

Hình 1.2 Đại diện cho 4 nhóm hợp chất chính của Lycopodium alkaloids thu từ H

serrata: Fawcettimine (A), lycodine (B),Lycopodine (C),phlegmarine (D)

Hầu hết các hợp chất alkaloid có khả năng ức chế enzyme Acetylcholinesterase (AchE) thuộc về lớp lycodine (B) gồm có: Huperzin A, 6β-hydroxyHuperzin A, Huperzin B, N-methylHuperzin B và Huperzinine Trong số

đó, đối với vấn đề ức chế AchE thì Huperzin A là hợp chất quan trọng có khả năng

ức chế mạnh nhất Một số nghiên cứu khác đã chỉ ra rằng một vài Lycopodium

alkaloids thuộc nhóm fawcettimine cũng có khả năng ức chế AchE như Huperzin P

và Huperzin R nhưng khả năng ức chế của chúng thấp hơn Huperzin A Ngược lại, 11α-hydroperoxyphlegmariurine B, 7-hydroperoxyphlegmariurine B và

phlegmariurine B cũng thuộc nhóm fawcettimine lại không có khả năng ức chế hoạt

động của AchE

Ngoài các hợp chất Lycopodium alkaloids đã được khảo sát rộng rãi, còn có

các hợp chất có hoạt tính sinh học tự nhiên khác thường tìm được trong cây Thạch tùng răng cưa như nhóm triterpenes: Serrat-14-en-3b, 21a, 29-triol; Flavon: 5,50-dihydroxy-20,40-dimethoxyflavone-7-ObD-(600-O-Z-P-coumaroyl)-

glucopyranoside nhóm chất này cũng được xác định là một axit phenolic [34]

Đến nay, rất nhiều nhà khoa học đã chứng minh Huperzin A là chất kháng AchE mạnh Hơn nữa, Huperzin A cũng là một chất đối kháng thụ thể N-methyl-D-aspartate của não Do đó, Huperzin A cũng được dự đoán rằng nó có thể được dùng

để chữa cho các đối tượng bị bệnh động kinh Huperzin A có khả năng cải thiện hiệu quả chứng suy giảm trí nhớ ở cả động vật và con người, và nó cũng có tiềm năng trong điều trị chứng mất trí nhớ acetylcholine (ACh) bao gồm cả bệnh Alzheimer Thuốc ''Shuangyiping '', một dạng viên của Huperzin A sản xuất từ chiết

xuất của Thạch tùng răng cưa, được phát triển vào năm 1996 và nó đã được chấp nhận như là một loại thuốc mới để điều trị triệu chứng của Alzheimer ở Trung Quốc Năm 1997, Huperzin A được cơ quan quản lý thực phẩm và Dược phẩm công nhận là thực phẩm bổ sung dinh dưỡng và nó được bán trên thị trường Hoa Kỳ dưới nhiều dạng chế phẩm khác nhau như: dạng bột, dạng bánh, dạng viên cho những người mắc chứng suy giảm trí nhớ Kết quả là, Huperzin A nhanh chóng trở thành một mặt hàng đắt khách trong thị trường thuốc Huperzin A được sử dụng rộng rãi

mà không cần có sự kê đơn của bác sĩ và Huperzin A cho thấy là chất không có tác dụng phụ khi sử dụng hoặc nếu có thì cường độ rất nhẹ

Mặc dù Huperzin A có nguồn gốc từ Thạch tùng răng cưa nhưng hợp chất này còn được tìm thấy ở nhiều loài khác có mối quan hệ phân loài gần gũi với loài

Thạch tùng răng cưa thuộc gia đình Huperziaceae Bên cạnh đó Huperzin A còn

được tìm thấy trong nhiều gia đình thực vật khác nhau thuộc họ Lycopodiaceae và Selaginella

Trong cây Thạch tùng răng cưa có chứa Huperzin A ít hơn 0,02% trọng lượng tươi [6] [7] và 0,0047-0,025% trọng lượng khô, phụ thuộc vào mùa, vùng sinh sống, quá trình thu và công nghệ tách chiết [5] [12] Do đó muốn tách chiết được nhiều Huperzin A cần phải có một số lượng lớn cây Thạch tùng răng cưa

Trong chi Huperzia thì H.serrata, H herteriana và H.ovatifolia có chứa Huperzin A cao hơn các loài khác Mặc dù có một số loài khác trong gia đình Huperziaceae có chứa lượng Huperzin A cao nhưng ít được đề cử hơn H serratavì những loài đó khó tìm và ngày càng khan hiếm hơn so với H serrata [28]

Do nhu cầu sử dụng cây này để chữa bệnh ngày càng tăng cao và đặc tính

sinh trưởng rất chậm nên cây H serrata tự nhiên đang bị khan hiếm Do vậy, nhiều

nhóm nghiên cứu đã nỗ lực trong việc phát triển các phương pháp hóa học hoặc nuôi cấy in vitro loài cây này để tổng hợp Huperzin A với số lượng lớn

1.1.2.1 Tính chất hóa học và các thuộc tính hóa lý của Huperzin A

Huperzin A có 2 dạng đồng phân quang học là (+)-Huperzin A và Huperzin A [9] [14]

(-)-Hình 1.3 Hai dạng đồng phân quang học của Huperzin A

Huperzin A có cấu trúc phân tử khá độc đáo, bộ khung của nó nhỏ gọn chắc chắn có chứa một nhóm ethylidene và pyridone thơm kết hợp với một vòng mang nhóm amino Công thức thực nghiệm của Huperzin A là C15H18N2O và trọng lượng phân tử là 242,32g/mol Trong tự nhiên Huperzin A tồn tại ở dạng (-)-Huperzin A (L-Huperzin A) và dạng này hoạt động mạnh hơn dạng (+)-Huperzin A (D-Huperzin A) Huperzin A bền, tinh thể có màu trắng, dễ dàng hòa tan trong dung dịch axit, MeOH và chloroform Huperzin A không bị thay đổi cấu trúc hóa học khi ủ kéo dài

ở nhiệt độ 24ºC với AchE hoặc butyrylcholinesterase (BuChE) hoặc ủ 96h với 0,1N hydrochloric acid

1.1.2.2 Dược động học của Huperzin A

Dược động học của Huperzin A không chỉ được nghiên cứu trên các loài động vật khác nhau mà còn được nghiên cứu trên những người tình nguyện khỏe mạnh

Thí nghiệm ở trên chuột cho thấy, sau khi tiêm tĩnh mạch Huperzin A vào chuột dùng các kỹ thuật kiểm tra người ta thấy rằng Huperzin A có mặt ở tất cả các vùng ở não bộ, nó đặc biệt tập trung ở vỏ não trước, vân não, vùng hippocampus, và vùng nhân não Các thí nghiệm cũng chỉ ra rằng mức độ gắn kết của Huperzin Avới

huyết tương chỉ 17% và phần lớn Huperzin A được bài tiết ngoài qua đường nước tiểu trong 24h còn 2,4% thu được trong phân [30]

Sử dụng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ Wang và cộng sự (2004) đã xây dựng đường cong nồng độ Huperzin A theo thời gian ở trong huyết tương chó sau khi tiêm bắp với cùng 1 công thức 10 Ig/kg/15 ngày Nồng độ cao nhất (Cmax) đạt được 48h sau khi tiêm là 0,36 ng/ml Nồng độ Huperzin A trong huyết tương giảm còn một nửa sau 54,8h [29]

Cho đến nay, các công bố về dược động học của Huperzin A trên người còn nhiều hạn chế do việc khó khăn định lượng các hợp chất trong hệ tuần hoàn của sau khi dùng các liều điều trị Qian và cộng sự (1995) đã nghiên cứu dược động học của Huperzin A trên 6 tình nguyện viên người Trung Quốc sau khi cho họ uống 1 liều duy nhất có chứa 0,99 mg Huperzin A Các giá trị Cmax và thời gian để đạt Cmax Huperzin A trong huyết tương lần lượt là 8,4Ig/l ở 79,6 phút sau khi uống thuốc Nồng độ Huperzin A thải ra ngoài một nửa sau 288,5 phút Tóm lại Huperzin A được hấp thu nhanh qua đường tiêu hóa và phân bố nhanh vào cơ thể và bị thải ra ngoài một cách từ từ [25]

1.1.2.3 Đặc tính chữa bệnh Alzheimer của Huperzin A

Theo các nghiên cứu về bộ nhớ và nhận thức các nhà khoa học đã chỉ ra rằng

có sự tương quan giữa thoái hóa thần kinh cholinergic trong thần kinh trung ương và

sự thiếu hụt nhận thức ở các bệnh nhân Alzheimer Trong cơ thể người bình thường, enzyme acetylcholineterase (AChE) được tiết ra vừa đủ cho các hoạt động dẫn truyền xung thần kinh bằng cách phá vỡ acetylcholine thành acetyl và choline Tuy nhiên, đối với người mắc bệnh Alzheimer enzyme AChE được tiết ra quá nhiều làm suy giảm acetylcholine trong não Như đã trình bày ở trên, Huperzin A có khả năng

ức chế AChE nên sự có mặt của Huperzin A làm giảm enzyme AChE có trong não Nhờ đó, hàm lượng ACh tăng lên làm cải thiện trí nhớ cho bệnh nhân Alzheimer Bệnh lý bệnh này được đặc trưng bởi sự tích tụ quá nhiều β-amyloid peptid do tuổi

già và đám rối các sợi thần kinh nội bào Do thiếu các chiến lược điều trị các triệu chứng và phòng ngừa hiệu quả mà ngày càng có nhiều người mắc bệnh Alzheimer Việc tăng cường dẫn truyền thần kinh cholinergic đã trở thành chiến lược chính sử dụng để làm giảm bớt các triệu chứng về nhận thức Nhiều loại thuốc được nghiên cứu và sử dụng tuy nhiên các chất ức chế AchE để tăng cường hệ thống cholinergic ngoại vi thường có tác dụng phụ quá mức liên quan đến dạ dày và nhiễm độc gan Ngược lại, Huperzin A là chất ức chế chọn lọc, có khả năng cải thiện các triệu chứng của bệnh nhân mắc Alzheimer và ít có tác dụng phụ Huperzin A có thể được

sử dụng như là tác nhân phòng ngừa để làm chậm hoặc ngăn chặn quá trình sinh bệnh ở giai đoạn đầu mắc Alzheimer

Hình 1.4 Cấu trúc tương tự nhau của Huperzin A và ACh

Huperzin A có khả năng ức chế AChE do có cấu tạo tương tự ACh Thực vậy, các nhà khoa học đã nghiên cứu và chỉ ra rằng Huperzin A sở hữu các đặc điểm cấu trúc cơ bản của ACh Nhìn vào hình 1.4 có thể thấy có sự tương đồng giữa nito, oxy

và nhóm cacbonyl của ACh và nhóm amino-nito, nito và cacbonyl tương ứng của Huperzin A [4]

Các nhà khoa học đã chỉ ra rằng Huperzin A có thể làm đảo ngược hoặc giảm bớt chứng thiếu hụt nhận thức trên một số động vật thí nghiệm Ngoài ra, thử

nghiệm lâm sàng cũng chứng minh rằng Huperzin A làm giảm đáng kể chứng giảm trí nhớ ở người già, người bị đãng trí, sa sút trí tuệ Hơn nữa, một số nghiên cứu chỉ

ra rằng loại thuốc này có thể có hiệu quả chống lại các mức giảm ACh trong não và

sự chết của các tế bào thần kinh glutamate, đây là hai trong số các rối loạn thần kinh thường gặp trong bệnh Alzheimer Như vậy, Huperzin A là thuốc có tác dụng điều trị kép với bệnh Alzheimer

Huperzin A có tác dụng điều trị hiệu quả, thuận nghịch, chính xác, tập trung

và chọn lọc

1.2 Chỉ thị phân tử RAPD

Để đánh giá mức độ đa dạng di truyền của các mẫu Thạch tùng răng cưa thu được ngoài sử dụng đặc điểm hình thái thì việc áp dụng chỉ thị phân tử DNA được coi là phương pháp hữu hiệu nhất Kỹ thuật chỉ thị phân tử RAPD là 1 trong số các chỉ thị DNA thường được sử dụng trong nghiên cứu đa dạng di truyền.Chỉ thị DNA được hình thành từ các loại đột biến DNA khác nhau như thay thế (đột biến điểm), sắp xếp lại (thêm vào hoặc bớt đi nucleotide) hoặc các sai sót trong sao chép các đoạn DNA lặp lại liền kề.Các chỉ thị DNA thường nằm ở các vùng khôngphiên mã.Khác với các chỉ thị hình thái và sinh hóa, chỉ thị DNA không giới hạn về số lượng, không ảnh hưởng bởi yếu tố môi trường và giai đoạn phát triển của cây Chỉ thị DNA được sử dụng nhiều trong nghiên cứu quan hệ di truyền, phát sinh chủng loại và phân loại phân tử; trong lập bản đồ liên kết di truyền, nhận biết gen; vàtrong chọn giống bao gồm đánh giá đa dạng di truyền, nhận biết giống, chọn lọc các tính trạng kháng bệnh, chống chịu các điều kiện bất lợi của môi trường, năng suất và phẩm chất giống [2]

Mỗi loại chỉ thị DNA được phát triển bằng một kỹ thuật tương ứng Kỹ thuật chỉ thị DNA lý tưởng cần phải có các tiêu chí sau: cho đa hình cao và phân bố đều trong genome; cho sự phân biệt rõ sự khác nhau về di truyền, tạo nhiều chỉ thị độc lập và chính xác; đơn giản, nhanh và ít tốn kém; cần ít mẫu và DNA; liên kết với

kiểu hình nhất định; có thể lặp lại trong các nghiêncứu, mức độ sai sót thấp nhất, ghi

số liệu dễ và chính xác, có nhiều allen (hàm lượng thông tin cao), không cần biết trước thông tin về genome và cơ thể [2]

Cơ sở của kỹ thuật RAPD là sự nhân bản DNA genome bằng phản ứng PCR với các mồingẫu nhiên để tạo ra sự đa hình DNA do sự tái sắp xếp hoặc mất nucleotide ở vị trí bắt mồi Mồi sử dụng cho kỹ thuật RAPD là các mồi ngẫu nhiên, thường là 10 nucleotide và có nhiệt độ kéo dài mồi thấp (34-37ºC) Sản phẩm PCR-RAPD thường được phân tách trên gel agarose 1,5-2,0% để nhận biết các đoạn được nhân Kỹ thuật RAPD không cần thông tin về genome của đối tượng nghiên cứu và

có thể ứng dụng cho các loài khác nhau với các mồi chung RAPD được coi là một phương pháp tạo ra sự đa hình nhanh và hữu hiệu

Trong bộ genome có một số đoạn có xu hướng được bảo tồn bên cạnh đó có một số đoạn có xu hướng dễ thay đổi giữa các cá thể trong loài, giữa các loài khác nhau Bản chất của phân tích PCR-RAPD là tìm thấy những chuỗi DNA có sự biến đổi vừa đủ cho phép chúng ta phát hiện ra sự khác biệt giữa các sinh vật mà chúng

ta nghiên cứu Việc tìm đúng mồi sẽ cho phép chúng ta phát hiện ra sự khác biệt giữa các chuỗi DNA

Bên cạnh tính ưu việt, kỹ thuật RADP còn có hạn chế là sản phẩm PCR không ổn định do mồi ngắn, nhiệt độ bắt mồi thấp; ngoài ra, kỹ thuật này tạo ra các chỉ thị trội do đó không phân biệt được các cá thể dị hợp tử với các cá thể đồng hợp

tử RADP sử dụng nhiều trong nghiên cứu đa dạng di truyền giữa các loài thực vật, trong nghiên cứu đặc điểm của giống và đánh giá biến đổi di truyền, trong xác định loài, và xác định con lai

1.3 Tình hình nghiên cứu về Thạch tùng răng cưa và Huperzin A

1.3.1 Các nghiên cứu về Thạch tùng răng cưa

Từ xa xưa y học cổ truyền Trung Quốc đã sử dụng cây Thạch tùng răng cưa trong các bài thuốc chữa nhiều bệnh liên quan đến chứng suy giảm trí nhớ, tâm thần

phân liệt, chống viêm Nhưng chỉ đến năm 1986, sau khi Liu và cộng sự phân lập thàch công Huperzin A chất chính làm nên dược tính của của cây Thạch tùng răng cưa thì nhiều nhà khoa học trên thế giới bắt đầu đặc biệt quan tâm nghiên cứu về loài cây này [20]

Công bố của Liang năm 2010 đã thiết lập được hệ thống nuôi cấy mô H

serrata và nghiên cứu được ảnh hưởng của các chất kích thích sinh trưởng nhằm tạo

H serrata sinh trưởng đa chồi và tích lũy Huperzin A cao Môi trường nuôi cấy H serata invitro thường dùng là môi trường nền MS (Murashige và Skoog), bổ sung

các nguyên tố đa, vi lượng, thành phần hữu cơ và 2% đường Có 4 loại hình thái chồi là: chồi đơn (green global body), chồi phân đôi (shoot with dichotomy), chồi đa nhánh (shoot with multi-branch) và chồi không phân đôi (shoot without dichotomy)

Đa chồi (multiple shoots) sẽ tích lũy Huperzin A cao Đa chồi phát triển và tích lũy Huperzin A khi bổ sung Indole-3-acetic acid và Indole-3-butyric acid và bị ức chế khi tăng 6-Benzylaminopurine (> 2µM) và Kinetin (> 5 µM) Bổ sung Indole-3-butyric acid hàm lượng 10 µM tăng cường sự phát triển của đa chồi với sự tăng trưởng 9,4mm/ tháng, mỗi tháng 4 lá mới và tăng sinh khối 5,1 lần sau 60 ngày nuôi cấy [18]

Tại Ba Lan cũng đã nuôi cấy invitro thể bào tử và phôi của H serrata cùng với phân tích lý hóa để xác định Huperzin A H serrata sinh trưởng mạnh nhất ở

môi trường ½ MS Các tế bào của mô sẹo, mà phát triển từ mô phân sinh đỉnh sau 3 tháng nuôi cấy chuyển thành phôi soma Phân tích HPLC-UV chứng minh Huperzin

A cao nhất (3,33mg g-1d.w) trong các chồi của cây phát triển từ phôi soma Sản lượng Huperzin A từ cây thu được từ môi trường sống tự nhiên khác nhau từ 0,54

mg g-1d.w (chồi thu hoạch vào mùa xuân) đến 1.27 mg g-1d.w (chồi thu hoạch vào mùa thu [28]

Rishuang và cộng sự (2012) cũng đã nghiên cứu ảnh hưởng của các loại giá

thể khác nhau nuôi cấy H serata H serata tự nhiên được nuôi cấy trong rong rêu,

đất cát sói mòn, đất vườn thí nghiệm Tỷ lệ sống sót cao nhất (90%) trong giá thể rong rêu, tỷ lệ cao thứ 2 (53,3%) trong đất cát sói mòn và thấp nhất trong môi

trường đất vườn thí nghiệm Các chỉ số sinh lý của H serata cũng được xác định khi nuôi cấy trên các loại giá thể trên Tỷ lệ khô/ướt của H serata tỉ lệ nghịch với tỉ lệ

sống của chúng trên các môi trường Trong đó thành phần diệp lục và hoạt động của

rễ lại tỉ lệ thuận với nó Điều này cho thấy rong rêu là giá thể tối ưu nhất trong nuôi

cấy H serata [26]

M Maridass và cộng sự (2011) đã nghiên cứu về sự phát triển của túi bào tử,

bào tử nảy mầm, giai đoạn đầu của thể giao tử và tái sinh của Huperzia hilliana

(Spring) R.D.Dixit trong điều kiện tự nhiên của vùng Kodaiyar, miền Nam Ấn Độ

Kết quả quan sát túi bào tử trưởng thành dưới kính hiển vi của H hilliana cho thấy

bào tử nảy mầm trong vòng một tháng Sự nảy mầm của bào tử và các giai đoạn phát triển của của thể giao tử được quan sát ở điều kiện tự nhiên Giai đoạn đầu của

thể giao tử tăng trưởng mạnh mẽ Chu kì sống của H hilliana trong điều kiện tự

nhiên ngắn, trong vòng 6 tháng (trong nghiên cứu này từ tháng 2/2011- tháng 7/2011) và bị ảnh hưởng bởi yếu tố môi trường[23]

Sự đa dạng di truyền và cấu trúc di truyền của 7 quần thể và 112 cá thể H serrata từ dãy núi Wuyi đã được phân tích bằng kỹ thuật AFLP Kết quả phân tíchcho thấy các quần thể Taining và Jianning nằm ở trung gian của dãy núi Wuyi

đa dạng cao nhất, trong khi đó quần thể Guangze phân bố ở phần phía bác dãy núi

có sự đa dạng thấp nhất Tổng đa dạng di truyền (Ht) là 0,3273 và sự đa dạng gen của quần thể (Hs) là 0,2722 [31]

De-li Wang và cộng sự (2011) cũng đã nghiên cứu quần thể tự nhiên của H

serrata ở khu bảo tồn thiên nhiên của tỉnh Hải Nam, miền Nam Trung Quốc Họ đã

kiểm tra số lượng cây trưởng thành, bào tử cũng như số lượng mầm của cây ở các

độ tuổi khác nhau Kết quả cho thấy sự khác biệt đáng kể giữa số lượng của mầm và bào tử Hầu hết các cây giống có nguồn gốc từ mầm Từ năm thứ 4 khi mầm phát

triển, mầm có khả năng sinh sản mạnh Bố trí thí nghiệm nuôi cấy mầm trên các môi trường khác nhau: ví dụ như đất, cát và mùn, kết quả không có sự khác biệt đáng kể

về tỉ lệ mầm mọc trên cả 3 môi trường, nhưng tỉ lệ sống trong cát là thấp hơn so với

2 môi trường còn lại Nghiên cứu hình thái học của mầm và mô hình tăng trưởng

mầm của H serrata cho thấy mầm đóng góp vai trò quan trọng trong sinh sản, bảo

vệ tài nguyên và nuôi trồng H serrata [8]

1.3.2 Các nghiên cứu về Huperzin A

Huang và cộng sự năm 2010 đã sử dụng phương pháp sắc ký lỏng để định lượng Huperzin A Sự thay đổi lượng Huperzin A ở cả giữa và trong quần thể Sự thay đổi hoạt động của alkaloid này xảy ra trong quần thể giống nhau sau mỗi năm được phân tích bằng phần mềm SPSS 13.0 (Coefficient of variation, One-way ANOVA analysis, Paired-samples T tests) Kết quả cho thấy lượng Huperzin A khác nhau đáng kể bởi các vị trí địa lý, đặc biệt là thay đổi theo kinh độ Kết quả trình bày trong nghiên cứu này có thể cung cấp bằng chứng cho thấy lượng Huperzin A

biến đổi trong H serrata là kết quả của sự tương tác giữa gen và môi trường, bằng

cách so sánh, chủ yếu được kiểm soát bởi yếu tố di truyền [15]

Phương pháp phổ biến để định lượng Huperzin A là UPLC-MS Trong 11 loài

Huperzia, hàm lượng cao nhất của Huperzin A được tìm thấy ở Huperzia pinifolia

Sự tích tụ các Lycopodium alkaloids khác nhau được theo dõi bằng sử dụng phân

tích Q-IMS-TOFMS Nuôi cấy mô các loài Huperzia khác nhau đã được thực hiện

để sản xuất Huperzin A, đặc biệt trong các mô sẹo của Huperzia pinifolia Các alkaloid chủ yếu sản xuất bởi cây phát triển tự nhiên, mô sẹo của Huperzin pinifolia

thay đổi đáng kể từ Huperzin A đến Nankakurine B [16]

Zhang Jingcai và cộng sự năm 2013 đã tách Huperzin A từ Huperzia serrata

bằng methanol/nước/axit formic (10/90/0,2; v/v/v), mẫu thu được được lọc rồi sử

dụng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) để xác định Huperzin A tách từ Huperzia

serrata Việc tách được thực hiện trên cột Xcharge C18(150mm x 4,6mm, 5µm),

dung dịch rửa giải là nước (có chứa 0,1% (v/v) trifluoroacetic acid) và acetonnitrile (chứa 0.09% (v/v) trifluoroacetic acid) là pha động Kết quả tách nhanh chóng đạt được sau 10 phút, tốc độ dòng chảy là 2ml/phút, UV 310 nm Theo các điều kiện tối

ưu, đường tuyến tính tốt thu được trong khoảng 2,12 – 106 mg/l với hệ số tương quan R2 khoảng 0,9999 Giá trị thu hồi trung bình khoảng 102,34% với độ lệch chuẩn tương đối (RSD) 0,46% Kết quả chứng minh rằng phương pháp định tính định lượng Huperzin A bằng HPLC là phương pháp đơn giản nhanh chóng và chính xác với khả năng thu hồi tốt và có thể sử dụng để đánh giá chất lượng của Huperzia Serrata [35]

Trong các loài khác nhau của Huperziaceae, hàm lượng Huperzin A cao nhất được tìm thấy ở Phlegmariurus caritus cao hơn loài Huperzia serata Cây trồng

trong điều kiện độ ẩm cao (ở các khu rừng ẩm ướt) cũng cho hàm lượng Huperzin A cao hơn đáng kể so với cây trồng trong môi trường có độ ẩm thấp Lượng Huperzin

A cũng thay đổi đáng kể theo mùa, cao nhất ở giữa mùa thu và thấp nhất vào đầu mùa xuân [22]

Thử nghiệm lâm sàng trước đây đã chỉ ra phương pháp cải thiện chức năng bộ nhớ sử dụng kiểm tra MMSE, MQ, ADAS-COG và ADL Kiểm tra ADAS-COG và MMSE, chỉ nâng cao nhận thức với liều 0,4mg Huperzin A, nhưng ở liều 0,2mg thì không quan sát được sự cải thiện Do vậy nguồn thông tin đầy hứa hẹn là Huperzin

A được dung nạp tốt ở liều lượng 0.4mg trong vòng 24 tuần Vì vậy, Huperzin A là

sự lựa chọn tiềm năng để điều trị bệnh Alzeimer [13]

Năm 1999, Wen Yen Gao và cộng sự đã tách chiết thành công Huperzin H từ

H serrata bằng cách sử dụng đệm tách chiết là HCl 1% và CHCl3, loại bỏ đệm chiết dưới điều kiện chân không Cho alkaloid thô qua cột silica gel [(20x80cm)x5] và rửa giải bằng CHCl3- acetone (tỷ lệ 10:1 đến 1:1) sau cùng là methanol Loại methanol dưới điều kiện chân không thu được một hỗn hợp, đưa hỗn hợp này qua chạy sắc ký trung tính Al2O3 và cột silica gel thu được Huperzin H [31]

CHƯƠNG II: VẬT LIỆU, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu, hóa chất và thiết bị máy móc

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Tám mẫu Thạch tùng răng cưa thu tại các địa điểm khác nhau ở Sapa và Đà Lạt được Vườn Quốc gia Hoàng Liên và Viện Sinh học Tây nguyên cung cấp Đây

là loài cây đặc hữu chỉ phát triển tại các vùng núi cao trên 1000 mét so với mặt biển

và bị khai thác cạn kiệt bán sang Trung Quốc do đó chỉ còn phát hiện được ở 5 vùng tại Sa Pa và 3 vùng tại Đà Lạt (thể hiện ở bảng 2.1)

Bảng 2.1 Địa điểm lấy mẫu sử dụng trong nghiên cứu

Bản đồ các vị trí lấy mẫu ở Sa Pa và Đà Lạt thể hiện ở hình 2.1 và 2.2

Hình 2.1 Bản đồ 5 vị trí lấy mẫu ở Sa Pa

Hình 2.2 Bản đồ 3 vị trí lấy mẫu ở Đà Lạt

2.1.2 Hóa chất và thiết bị

2.1.2.1 Hóa chất

Hóa chất tách chiết DNA tổng số: Nito lỏng, đệm CTAB(H2O, Tris-HCl 1M pH8, EDTA 0,5M pH8, NaCl 5M, Mecaptoethanol 14M,CTAB), đệm TE, RNase (10µg/ml), Isopropanol lạnh, phenol, chloroform, isoamylalcohol (25:24:1), cồn

tuyệt đối, cồn 70%

Hóa chất PCR: H2O khử ion, mồi, PCR master mix, DNA mẫu

Hóa chất điện di agarose: agarose, đệm TBE (Tris base, boric axit, EDTA, nước

cất), ethidium bromide, đệm tra mẫu (loading buffer) (xylene cyanol FF, sucrose), maker

Hóa chất chạy sắc ký bản mỏng: Chloroform, isopropanol, acetone,

ammonia, ethyl acetate, 1- butanol, acetic acid, H2O, KMnO4

Hóa chất chạy sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC):Acetonitrile, amino axetat,

axit axetic và nước cất loại dùng cho phân tích và chạy HPLC

2.1.2.2 Thiết bị

Máy siêu âm, Máy LC-MS (Agilent 1260 Series Single Quadrupole LC/MS Systems; Cột sắc ký (Zorbax SB – C18 (150x 4.6mm, 5µm); cột bảo vệ C18 của hãng Agilent, xylanh nhựa 5ml, màng lọc 0,45µm; máy điện di gel agarose Msmidi (Cleaver Scientific, Mỹ), máy PCR PTC-100 (MJ Research Inc, Mỹ), máy ly tâm thường và lạnh, máy chụp gel agarose CLS Mcrodoc (Cleaver Scientific, Mỹ), cân phân tích, tủ lạnh thường và tủ lạnh sâu, máy đo quan phổ UV-1601 (UV-Visble Spectrophotometer, Shimadzu), máy voltex, bể ổn nhiệt, nồi khử trùng, lò vi sóng, các loại pipetman và ống eppendorf các loại

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp tách chiết DNA tổng số Thạch tùng răng cưa

DNA tổng số được tách từ các mẫu lá theo phương pháp của Saghai Maroof

và cộng sự (1984) [27] có cải tiến cho phù hợp với việc tách chiết DNA tổng số của

lá Thạch tùng răng cưa Tách DNA tổng số được tiến hành theo các bước sau :

Nghiền mẫu lá Thạch tùng răng cưa trong nitơ lỏng bằng cối chày sứ Bột đã nghiền cho vào ống eppendorf 1,5ml, thêm 0,7ml đệm CTAB đã làm ấm ở 65oC trong 10 phút Để các ống trong bể ổn nhiệt ở điều kiện 65o

C trong 90 phút, lắc nhẹ nhàng nhưng dứt khoát 15 phút một lần để việc tách có hiệu quả Chuyển các ống ở

bể ổn nhiệt ra để ở nhiệt độ phòng 5 phút Thêm 0,7ml dung dịch Chloroform/Isoamyl alcohol (24:1), lắc ống nhẹ nhàng 10 phút Ly tâm 10.000 vòng/phút trong 10 phút ở nhiệt độ phòng Dùng pipetman hút lớp trên cùng sang ống eppendorf 1,5ml mới Thêm Isopropanol theo tỉ lệ 1:1 Sau đó xoay ống nhẹ nhàng vài phút Để mẫu ở tủ -200

C trong 1 giờ Ly tâm tốc độ 10.000 vòng/phút trong 10 phút Bỏ phần dịch phía trên thu lấy tủa Rửa tủa bằng cồn 70% lạnh Sau

đó, thổi khô và hoà tan tủa bằng 0,5 ml TE pH=8,0 Bổ sung RNase đã được đun cách thuỷ trong 20 phút, sau đó ủ ở 37oC trong 180 phút Bổ sung hỗn hợp Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol (25:24:1) theo tỉ lệ 1:1, lắc nhẹ trong 10 phút

Ly tâm với tốc độ 10.000 vòng/phút Hút phần dịch trên sang ống eppendorf 1,5ml mới, thêm 0,5ml dung dịch chloroform/isoamyl alcohol (24:1), lắc ống nhẹ nhàng

10 phút Ly tâm với tốc độ 10.000 vòng/phút trong 10 phút Hút dịch nổi sang ống mới Thêm cồn tuyệt đối lạnh theo tỉ lệ cồn: mẫu (2:1) vào dịch nổi, bổ sung 15μl NaCl 5M sau đó lắc nhẹ Ly tâm hỗn hợp 10.000 vòng/phút trong 10 phút Bỏ phần dịch nổi phía trên, thu tủa và rửa tủa bằng cồn 70% lạnh Thổi khô tủa trong 20 phút

ở Laminar Sau đó hoà tan tủa bằng TE Giữ mẫu trong tủ 4o

và mạch đơn, người ta sẽ đo được giá trị mật độ quang ở bước sóng 260 nm (OD260nm - Optical Density 260 nm) của các mẫu Ở bước sóng 280 nm, các protein

có mức hấp thụ cao nhất, đồng thời cũng hấp thụ ở bước sóng 260 nm như các axit nucleic và gây nên sự sai lệch giá trị thật khi tính nồng độ acid nucleic

Nồng độ DNA được tính theo công thức sau:

CDNA (µg/µl) = OD260 x 50 x hệ số pha loãng

Độ sạch DNA = OD260/OD280 (OD260, OD280 là chỉ số đo được ở bước sóng

260 nm và 280 nm) Một dung dịch acid nucleic được coi là sạch (không lẫn protein) khi tỉ số OD260 nm/OD280 nm nằm trong khoảng 1,8 - 2,0

Các bước tiến hành

Lấy 1 ml dung môi hoà tan DNA (TE pH 8,0 hoặc nước khử ion vô trùng) cho vào cuvette đo làm đối chứng Cho 5 μl dung dịch DNA cần đo nồng độ vào

995 μl dung môi hoà tan DNA (pha loãng 200 lần) Sau đó cho vào cuvette và đo

OD ở bước sóng 260 nm và 280 nm.Từ kết quả đo được, tính nồng độ DNA theo công thức trên Dựa vào nồng độ để pha loãng DNA ra nồng độ 25 ng/µl bằng nước

để chuẩn bị chạy PCR với các mồi SSR theo công thức:

N1 × V1 = N2 × V2Trong đó N1: Nồng độ DNA ban đầu; V1: Thể tích cần lấy để pha; N2: Nồng

độ DNA cần pha; V2: Thể tích cần pha

Kiểm tra DNA tách chiết đã được pha loãng bằng cách điện di trên gel agarose 1 % Gel agarose được nhuộm trong ethidium bromide và chụp ảnh dưới ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 254 - 260 nm trên máy chụp ảnh gel CLS - Microdoc (Cleaver Scientific Ltd, Mỹ)

2.2.2 Kỹ thuật PCR với các mồi RAPD [1][2][3]

Phân tích đa dạng di truyền bằng chỉ thị phân tử có rất nhiều phương pháp như: SSR (kỹ thuật chỉ thị dựa trên chuỗi lặp lại đơn giản), RFLP (kỹ thuật đa hình đoạn cắt giới hạn), AFLP (đa hình độ dài nhân bản chọn lọc), RAPD (kỹ thuật đa

hình DNA nhân ngẫu nhiên) mỗi phương pháp có ưu nhược điểm riêng Tuy nhiên phương pháp RAPD có thể khắc phục được những nhược điểm của các phương pháp khác như: AFLP, RFLP, SSR là phương pháp có giá thành cao, đòi hỏi trang thiết bị hiện đại Phương pháp RFLP không đòi hỏi phải đọc trình tự genome song chỉ thị này có mặt hạn chế là phải tuyển chọn một lượng lớn mẫu dò Phương pháp SSR rất tốn kém trong việc xây dựng cặp mồi đặc hiệu cho mỗi locus đa hình Phương pháp AFLP phải qua nhiều bước mới có kết quả Trong khi đó phương pháp RAPD có ưu điểm phù hợp với mục đích nghiên cứu và điều kiện phòng thí nghiệm như: Chỉ thị RAPD cho phép phát hiện nhanh đa hình vì chỉ cần một lượng nhỏ mẫu DNA, với mồi đơn ngẫu nhiên không đòi hỏi hiểu biết về trình tự DNA trong cơ thể nghiên cứu mà có thể phát hiện nhiều locus cùng một lúc Thao tác đơn giản, thời gian thực hiện để có kết quả ngắn, giá thành thấp hơn, dễ dàng phân tích một số lượng mẫu lớn, mỗi mồi cung cấp số liệu từ nhiều vị trí trong hệ gen, vì vậy những

đa hình hiếm giữa các mẫu có quan hệ gần gũi có thể được phát hiện nhanh hơn với phân tích locus đơn [3] Chính vì những lý do trên mà trong phạm vi đề tài chúng tôi

sử dụng kỹ thuật RAPD để đánh giá đa dạng di truyền Thạch từng răng cưa thu từ các địa điểm ở Sa Pa và Đà Lạt

Phản ứng RAPD được chúng tôi tiến hành với các mồi ngẫu nhiên theo phương pháp của Foolad và cs (1995) [10]

Sử dụng 8 mồi ngẫu nhiên được tổng hợp tại hãng Invitrogen, mỗi mồi dài 10nucleotide, thông tin về trình tự các mồi sử dụng được trình bày trong bảng 2.2 Phản ứng RAPD được thực hiện trong 15 μl dung dịch với thành phần trong bảng 2.3 Tiến hành nhân bản DNA trong máy PCR với chu trình nhiệt của phản ứng RAPD là 1 chu kì 94ºC trong 3 phút; 45 chu kì với nhiệt độ (92 ºC trong 30 giây, 36

ºC trong 45 giây, 72 ºC trong 1 phút); 1 chu kì 72 ºCtrong 10 phút; lưu giữ ở 4 ºC

Bảng 2.2 Trình tự nucleotide của 8 mồi RAPD sử dụng trong nghiên cứu

2.2.3 Phân tích số liệu đa dạng di truyền

Để nghiên cứu mức độ đa dạng di truyền người ta thường dựa vào ba hệ số cơ bản: Hệ số Nei và Li, hệ số Jaccard, hệ số SM Để phân tích các nhóm và so sánh

các ma trận tương đồng với nhau, người ta dùng một số phương pháp: ma trận khác nhau UPGMA, ma trận giống nhau WPGMA, liên kết đơn và liên kết hoàn toàn Việc chọn sử dụng phương pháp nào là tuỳ thuộc vào từng đối tượng và mục đích nghiên cứu Nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng sử dụng hệ số tương đồng di truyền Jaccard và phương pháp tính UPGMA cho nghiên cứu đa dạng di truyền là phù hợp hơn cả

Hệ số tương đồng di truyền Jaccard cho ta biết mối tương quan về mặt di truyền giữa các mẫu phân tích Trị số Jaccard càng tiến về 0 thì mức độ tương đồng

di truyền giữa các mẫu càng thấp và ngược lại, càng tiến về 1 thì mức độ tương đồng di truyền càng cao Số liệu thu được từ các chỉ thị qua phản ứng PCR kết hợp với điện di được đưa vào xử lý bằng phần mềm NTSYSpc version 2.02 để tính hệ số tương đồng di truyền và xây dựng biểu đồ quan hệ di truyền giữa các mẫu Thạch tùng răng cưa

Các băng DNA được ghi nhận dựa trên sự có mặt hay vắng mặt của chúng ở các mẫu nghiên cứu theo DNA chuẩn (DNA marker) Nếu một băng DNA (có kích thước cụ thể) xuất hiện ở mẫu i nhưng không xuất hiện ở mẫu j hoặc đồng thời xuất hiện ở cả i và j nhưng không xuất hiện ở các mẫu khác thì băng ADN này gọi là băng đa hình Ngược lại, nếu băng ADN này xuất hiện ở tất cả các mẫu nghiên cứu thì gọi là băng đơn hình

Các băng được mã hóa bằng số tự nhiên 0 và 1 Nếu mẫu nào có băng thì ký hiệu là 1, còn không có thì ký hiệu là 0 Các số liệu này được đưa vào xử lý theo chương trình NTSYSpc để tính ma trận tương đồng giữa các đôi mẫu

Việc tính toán ma trận tương đồng dựa trên công thức:

Jij = a/(n – d) a: Số băng DNA có ở hai dòng i và j d: Số băng DNA không có băng cả hai dòng i và j n: Tổng số băng thu được