Nghiên cứu chế độ xử lý bã mía cho mục tiêu lên men bioethanol

Tiền xử lí nguyên liệu lignocellulose Trước khi thủy phân, nguyên liệu cần được tiền xử lí với mục tiêu giảm hàm lượng lignin và hemicellulose trong vật liệu, làm trương nở ma trận lign

Đề tài: Nghiên cứu chế độ xử lí bã mía cho mục tiêu lên men bioethanol

Tác giả luận văn: Lê Duy Khương Khóa: 2009

Người hướng dẫn: PGS.TS TÔ KIM ANH

Nội dung tóm tắt:

a Lý do chọn đề tài:

Năm 2007, chính phủ đã phê duyệt “Đề án phát triển nhiên liệu sinh học đến năm

2015, tầm nhìn 2025” nhằm tạo ra dạng năng lượng tái tạo được thay cho nhiên liệu hóa thạch, góp phần bảo đảm an ninh năng lượng và bảo vệ môi trường: đến năm 2015 sản lượng ethanol và dầu thực vật đạt 250 nghìn tấn (pha được 5 triệu tấn E5 và B5), đáp ứng 1% nhu cầu xăng dầu cả nước và đến 2025 sẽ đạt 1,8 triệu tấn, đáp ứng 5% nhu cầu xăng dầu

Trong các nguyên liệu lignocellulose, bã mía là một trong những nguồn lignocellulose tập trung nhất Nếu lượng sinh khối này được chuyển hóa thành đường lên men được, bã mía sẽ là một trong các nguồn nguyên liệu quan trọng cho mục tiêu sản xuất cồn nhiên liệu ở nước ta nói riêng và trên thế giới nói chung

b Mục đích nghiên cứu của luận văn, đối tượng, phạm vi nghiên cứu

Để tài sẽ tập trung lựa chọn chế độ xử lý bã mía bao gồm tiền xử lí bã mía, thủy phân bằng hệ enzym cellulase và nghiên cứu thu nhận dịch đường có thể lên men được Hiện nay việc thủy phân hemicellulose cũng như tạo các chủng lên men từ đường 5C đã

có những thành công bước đầu nhưng chưa thực sự sẵn sàng áp dụng, do đó hệ cellulase được sử dụng để thủy phân bã mía thành glucose cho mục tiêu lên men

c.Tóm tắt cô đọng các nội dung chính và đóng góp mới của tác giả

o Khảo sát để lựa chọn phương án tiền xử lí bã mía

o Khảo sát khả năng áp dụng laccase trong kết hợp với tiền xử lí hóa-lý

o Đã lựa chọn chế độ sử dụng laccase cho xử lí dịch sau tiền xử lí, làm tăng hiệu suất thu hồi ethanol

o Lựa chọn tỷ lệ các enzym cellulase thủy phân bã mía

d Phương pháp nghiên cứu:

Lựa chọn nguyên liệu lignocellulose cho nghiên cứu

Khảo sát các chế độ tiền xử lí nguyên liệu bằng tác nhân hóa nhiệt bao gồm nhiệt, kiềm-nhiệt và kết hợp nhiệt kiềm với laccase Hiệu quả tiền xử lí được đánh giá thông qua hiệu quả thủy phân bã mía và mức giảm hàm lượng lignin trong bã mía trước

axít-và sau tiền xử lí

Nghiên cứu loại phenol trong dịch sau tiền xử lí bằng laccase, nhằm giảm sự ức chế tế bào nấm men Hiệu quả loại phenol được đánh giá thông qua hiệu suất thu hồi ethanol và lượng phenol trước và sau xử lí

Nghiên cứu tối ưu tỷ lệ bổ sung enzym trong hệ cellulase và thời gian thủy phân

bã mía, các thí nghiệm được được đưa ra theo phần mềm Design Expert 7 (DX-7) Phương án tối ưu được kiểm tra bằng thực nghiệm

e Kết luận

1 Đã khảo sát điều kiện tiền xử lí lựa chọn được chế độ tiền xử lí bã mía như sau:

+ Bã mía sấy ở 45oC, bổ sung kiềm với 0,1g NaOH/g bã mía, quá trình thực hiện ở nhiệt độ 121oC trong thời gian 60 phút, cho hiệu quả thủy phân bã mía cao hơn so với axít, vôi

+ Phối hợp laccase (40÷70) U/g bã mía trong tiền xử lí làm tăng hiệu quả thủy phân bã mía lên 284,15±4,6 mg đường khử/g bã mía (tăng 8,2% so với không phối hợp laccse), làm giảm hàm lượng lignin tới 72% (tăng 3,1% so với không phối hợp laccase)

2 Bã mía đã xử lí với chế độ lựa chọn có thể được thủy phân hiệu quả với 31,5/53,61/20,47 (CMCase/FPU/CBU)/g bã mía, thời gian thủy phân 40,5 giờ, đạt 435 mg

đường khử/g bã mía

3.Laccase có thể sử dụng loại phenol khử độc trong dịch thủy phân, làm tăng hiệu suất thu hồi ethanol tới 76,27±4,67% (tăng 68% so với không khử độc)

MỤC LỤC

MỤC LỤC 1

LỜI CẢM ƠN 4

LỜI CAM ĐOAN 5

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT 6

DANH MỤC CÁC BẢNG 7

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ 8

MỞ ĐẦU 9

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 11

1.1 Nhiên liệu sinh học 11

1.2 Bã mía, nguyên liệu tập trung cho s ản xuất bioethanol 13

1.2.1 Cellulose 14

1.2.2 Hemicellulose 15

1.2.3 Lignin 18

1.3 Tiền xử lí nguyên liệu lignocellulose 19

1.3.1 Tiền xử lí nguyên liệu lignocellulose bằng phương pháp vậy lý 20

1.3.2 Tiền xử lí lignicellulose bằng phương pháp hóa học 20

1.3.3 Tiền xử lí lignocellulose bằng phương pháp hóa lý 24

1.4 Tiền xử lí lignocellulose bằng phương pháp sinh học 25

1.4.1 Peroxidase 25

1.4.2 Lacase và cơ chế phân hủy lignin 27

1.5 Thủy phân cellulose 31

1.5.1 Thủy phân lignocellulose bằng phương pháp hóa học 31

1.5.2 Thủy phân lignocellulose sử dụng enzym 31

1.6 Lên men ethanol dịch thủy phân 34

CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 37

2.1 Vật liệu 37

2.1.1 Bã mía 37

2.1.2 Enzym và hóa chất 37

2.1.3 Chủng vi sinh vật 37

2.1.4 Dụng cụ và thiết bị 38

2.2 Các phương pháp phân tích 38

2.2.1 Xác định độ ẩm bã mía bằng phương pháp sấy đến trọng lượng không đổi 38

2.2.2 Xác định hàm lượng cellulose ằng phương pháp Kurshner 38

2.2.3 Xác định hàm lượng lignin theo phương pháp iến tính của Komarov 39

2.2.4 Xác định hàm lượng đường khử trong dung dịch 41

2.2.5 Xác định hoạt độ enzym 42

2.2.6 Xác định hàm lượng phenol tổng số trong dung dịch bằng phương pháp Folin Ciocalteau 46

2.3 Phương pháp nghiên c ứu 47

2.3.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ sấy bã mía 47

2.3.2 Nghiên cứu lựa chọn tác nhân tiền xử lí hóa-nhiệt bã mía 48

2.3.3 Khảo sát vai trò của laccase trong tiền xử lí 49

2.3.4 Ảnh hưởng của thời gian xử lí hóa-nhiệt 49

2.3.5 Tối ưu tỷ lệ các enzym hệ cellulase 49

2.3.6 Khảo sát vai trò khử độc dịch thủy phân lignocellulose của laccase .49

CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 52

3.1 Lựa chọn nguyên liệu lignocellulose sử dụng trong nghiên cứu 52

3.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ sấy ã mía đến hiệu quả trình thủy phân 52

3.3 Tiền xử lí bã mía với H2SO4 53

3.4 Tiền xử lí trong môi trường kiềm Ca(OH)2 và NaOH 54

3.5 Tiền xử lí hóa nhiệt kết hợp với laccase .58

3.6 Ảnh hưởng của thời gian xử lí NaOH- nhiệt đến hiệu quả thủy phân bã mía 60

3.7 Ảnh hưởng của tỷ lệ enzym trong hệ cellulase đến hiệu quả thủy phân bã mía 60

3.8 Nghiên cứu kỹ thuật khử phenol c ủa dịch tiền xử lí bằng laccase .66

3.8.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ tới khả năng khử phenol của laccase 67

3.8.2 Ảnh hưởng của thời gian tới khả năng khử phenol của laccase 69

3.8.3 Ảnh hưởng của nồng độ laccase tới khả năng loại phenol trong dịch 69

KẾT LUẬN 72

KIẾN NGHỊ 73

TÀI LIỆU THAM KHẢO 74

PHỤ LỤC 80

Tôi xin cảm ơn các thầy cô trong Viện Công nghệ Sinh học và Thực phẩm, Trường Đại học Bách khoa Hà Nội vì những kinh nghiệm và kiến thức mà các thầy cho em trong quá trình học và làm nghiên cứu

Xin chân thành cảm ơn Ths Phùng Thị Thủy, KS Lê Tuân, KS Nguyễn Thị Huyền, đã tạo điều kiện thuận lợi tôi hoàn thành luận văn

Cuối cùng, tôi xin cảm ơn Viện đào tạo sau đại học Trường đại học Bách Khoa - Hà Nội vì đã tạo điều kiện cho tôi hoàn thành các thủ trong trong quá trình học và bảo vệ luận văn

Hà Nội, ngày 20 tháng 05 năm 2011

Tác giả

Lê Duy Khương

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan tất cả các số liệu nghiên cứu của đề tài là hoàn toàn trung thực Các thí nghiệm được tiến hành một cách nghiêm túc trong quá trình nghiên cứu, không có sự sao chép từ ất kỳ tài liệu khoa học nào

Tác giả

Lê Duy Khương

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

- ABTS: 2,2' -azinobis-3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonate

- CBU: Celobiase unit

- CFU: Colony forming unit

- OPEC: Organization of the Petroleum Exporting Countries

- SHF: Separate hydrolysis and fermentation

(thủy phân và lên men riêng rẽ )

- SSF: Simultaneous saccharification and fermentation

(thủy phân và lên men đồng thời)

- VA: Veratryl alcohol

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1: Thành phần của một số loại nguyên liệu lignocellulose 13

Bảng 3.1 : Các yếu tố đầu vào và kho ảng biến đổi 61

Bảng 3.2 : Các chế độ thực nghiệm và kết quả hiệu quả thủy phân bã mía thiết kế theo DX-7 61

Bảng 3.3 : Kết quả phân tích phương sai c ủa mô hình 62

Bảng 3.4: Các chế độ và kết quả hiệu quả thủy phân bã mía theo DX-7 65

Bảng 3.5 : So sánh hiệu quả của các chế độ thủy phân bã mía 70

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ

Hình 1.1: Mô phỏng cấu trúc của nguyên liệu bã mía 14

Hình 1.2: Cấu trúc c ủa lignocellulose 15

Hình 1.3 Mạch acetyl-4-O-methylglucuronoxylan 16

Hình 1.4: Mạch glucomannan 17

Hình 1.5: Mạch galactoglucomannan 17

Hình 1.6: Mạch arabinoglucuronoxylan 18

Hình 1.7: Cấu trúc c ủa mạng lignin 18

Hình 1.8: Mô phỏng cấu trúc lignocellulose trước và sau tiền xử lí 19

Hình 1.9: Quá trình phân c ắt mối liên kết C-C 26

Hình 1.10: Cơ chế xúc tác của peroxidase 27

Hình 1.11: Cơ chế laccase tác động đến lignin 28

Hình 1.12: Cơ chế phân hủy lignin và các dạng biến đổi của laccase 30

Hình 1.13: Cơ chế quá trình thủy phân cellulose bởi hệ enzym cellulase 33

Hình 1.14: Sự ức chế tế bào nấm men bởi các chất ức chế sinh ra 35

Hình 3.1 : Thành phần bã mía nghiên c ứu 52

Hình 3.2: Ảnh hưởng của nhiệt độ sấy tới hiệu quả thủy phân ã mía 53

Hình 3.3: Kết quả tiền xử lí bằng axít H2SO4 54

Hình 3.4 : Kết quả tiền xử lí ã mía trong môi trường kiềm 55

Hình 3.5 : So sánh kết quả tiền xử lí bã mía 57

Hình 3.6: Đánh giá vai trò của laccase trong tiền xử lí bã mía 59

Hình 3.7: Hiệu quả thủy phân bã mía theo thời gian hóa nhiệt 60

Hình 3.8: Kết quả bề mặt đáp ứng của hiệu suất thủy phân bã mía 63

Hình 3.9: Kết quả khảo sát vai trò laccase trong khử độc dịch tiền xử lí bằng laccase 69

MỞ ĐẦU

Với sự gia tăng nhanh chóng giá xăng ầu trên thế giới do cạn kiệt dầu mỏ, các quốc gia đang tìm kiếm một nguồn nhiên liệu tái tạo có thể thay thế nhiên liệu hóa thạch trong tương lai gần Trong số các giải pháp có thể, cồn nhiên liệu được sản xuất từ các nguồn sinh khối khác nhau hiện đang là một trong những giải pháp đang được quan tâm Hiện nay ethanol sản xuất từ các nguồn nguyên liệu liên quan đến tinh bột (ngô, sắn) hoặc đường (củ cải, mía) là giải pháp duy nhất hiện nay thay thế xăng ầu và giữ vai trò quan trọng: năng lượng tái tạo, giúp cắt giảm phát thải

CO2, đảm bảo an ninh năng lượng, nâng cao thu nhập cho người làm nông nghiệp Tuy nhiên, đối mặt với an ninh lương thực và hạn chế đất trồng làm việc sản xuất ethanol từ loại nguyên liệu thực phẩm gặp khó khăn và chỉ là giải pháp trước mắt

Sinh khối lignocellulose là nguyên liệu tiềm năng cho ioethanol o hàm lượng cellulose và hemicellulose cao, sản lượng lớn và có khả năng tái tạo nhanh hơn các nguyên liệu hóa thạch đang cạn kiệt Bã mía là một trong những nguồn lignocellulose tập trung nhất Nếu lượng sinh khối này được chuyển hóa thành đường lên men được, thì bã mía sẽ là một trong các nguồn nguyên liệu quan trọng cho mục tiêu sản xuất cồn nhiên liệu ở nước ta nói riêng và trên thế giới nói chung

Ước tính 1kg cellulose có thể thu được xấp xỉ 0,56 kg ethanol [15] Tuy nhiên, công nghệ sản xuất bioethanol từ bã mía nói riêng và lignocellulose nói chung chưa được thương mại hóa Nguyên nhân do quá trình chuyển hóa cellulose thành đường lên men được hiện chiếm chi phí giá thành sản phẩm cao, công nghệ tiền xử lí chưa tối ưu cho mọi loại nguyên liệu, giá thành enzym cao làm cho chi phí của quá trình thủy phân chiếm tỷ trọng lớn

Với lợi thế là nước có khí hậu nhiệt đới, Việt Nam sở hữu một nguồn nguyên liệu mong ước so với các nước có khí hậu ôn và hàn đới Trong những năm gần đây việc nghiên cứu phát triển cồn nhiên liệu ở Việt Nam bắt đầu được quan tâm, mở ra một thời kỳ mới được dự báo là rất hấp d n và không ít những thách thức

Để góp phần vào quá trình nghiên cứu nâng cao hiệu quả xử lí lignocellulose

chung, đề tài của tôi chọn là “Nghiên cứu chế độ xử lí bã mía cho mục tiêu lên men bioethanol“

Nội dung của vấn đề nghiên cứu bao gồm:

o Khảo sát để lựa chọn phương án tiền xử lí bã mía

o Khảo sát khả năng áp ụng laccase trong kết hợp với tiền xử lí hóa-lý

o Khảo sát khả năng khử độc dịch tiền xử lí bằng enzym laccase

o Lựa chọn tỷ lệ các enzym cellulase thủy phân bã mía

o Đưa ra chế độ xử lí bã mía thu nhận dịch thủy phân có thể lên men được

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN

1.1 Nhiên liệu sinh học

Nhiên liệu sinh học ao gồm các loại nhiên liệu ở trạng thái lỏng, rắn hay khí được sản xuất từ các nguồn sinh khối không đồng ạng

Hiện nay, một trong các nhiệm vụ trọng điểm của quốc gia là phát triển các nhiên liệu thay thế các nhiên liệu hóa thạch, dự kiến sẽ giảm 80% vào năm 2030, cạn kiệt hoàn toàn vào năm 2050 Với giá dầu đạt kỷ lục, nhiên liệu sinh học làm từ cây trồng được quan tâm trên toàn thế giới Sản xuất nhiên liệu sinh học toàn cầu đã tăng gấp ba lần từ 4,8 tỷ galon năm 2000 lên khoảng 16,0 tỷ trong năm 2007 Khoảng 90 % nhiên liệu sinh học được sản xuất tập trung ở Hoa Kỳ, Brazil & Liên minh Châu Âu [16] Ngày nay, ethanol được coi như một nguồn năng lượng có khả năng thay thế xăng ở mức 5 ÷ 10% mà không phải thay đổi cấu trúc và vật liệu chế tạo động cơ Brazil thúc đẩy sự sử dụng ethanol tại hầu hết các trạm xăng ầu và sản xuất xe ô tô nhiên liệu linh hoạt (có khả năng sử dụng xăng nguyên chất, E25)

Mỹ đề nghị luật pháp cung cấp ưu đãi để mở rộng E85 phân phối và sản xuất nhiều

xe E85 [16]

Hiện tại, tổng sản lượng ethanol trên toàn thế giới ước tính khoảng 60 triệu tấn, trong đó 47% được sản xuất từ mía đường và 53% từ tinh ột (ngô, sắn .) Tăng trưởng hàng năm về sản lượng ioethanol của các quốc gia ước tính 1,4% (Trung Quốc) tới 9,9% (Cana a) Dự kiến tới 2012 lượng ioethanol tăng tới 81,9 triệu tấn, trong đó a quốc gia đứng hàng đầu thế giới về sản xuất và tiêu thụ ioethanol là Mỹ, Brasil & Trung Quốc Trong các nước khối Đông Nam Á, Thái Lan là quốc gia có sản lượng ethanol phát triển nhanh, chủ yếu từ các nguyên liệu tinh ột-đường [43] Tại Việt Nam, năm 2007 chính phủ đã phê uyệt “Đề án phát triển nhiên liệu sinh học đến năm 2015, tầm nhìn 2025” nhằm tạo ra ạng năng lượng tái tạo được thay cho nhiên liệu hóa thạch, góp phần ảo đảm an ninh năng lượng và ảo vệ môi trường: đến năm 2015 sản lượng ethanol và ầu thực vật đạt

250 ngàn tấn (pha được 5 triệu tấn E5 và B5), đáp ứng 1% nhu cầu xăng ầu cả nước, và đến 2025 sẽ đạt 1,8 triệu tấn, đáp ứng 5% nhu cầu xăng ầu Có a con

đường chính trên thế giới để điều chế nhiên liệu sinh học ( io-ethanol) là cây nguyên liệu chứa đường (mía, củ cải đường, nước thốt nốt ), cây nguyên liệu chứa tinh ột ( ắp, gạo, lúa mì, khoai mì ), cây nguyên liệu chứa cellulose (cây sinh trưởng nhanh cho xơ nhiều, phế phẩm nông nghiệp)

Bioethanol thế hệ thứ nhất là ethanol được sản xuất phổ iến từ các nguồn tinh ột hoặc đường như: sắn, rỉ đường (ở Châu Á), ngô (ở Hoa Kỳ), củ cải đường

và lúa mì (ở Châu Âu) Tuy nhiên, việc phát triển ethanol từ nguyên liệu thế hệ thứ nhất đang đối mặt với nhiều thách thức, trước tiên là sự ất ổn về an ninh lượng thực và sự hạn chế đất trồng, đồng thời chi phí lương thực ngày càng cao o nhu cầu ngày càng tăng Tổ chức Nông Lương Liên Hiệp Quốc ước tính trong năm 2008

có 963.000.000 người suy inh ưỡng trên thế giới, người không tiêu thụ đủ năng lượng cơ ản hàng ngày để duy trì hoạt động, cuộc sống lành mạnh, so với 923.000.000 năm 2007 [16] Do vậy FAO đã khuyến cáo các nước không nên sản xuất ioethanol từ nguyên liệu liên quan đến tinh ột Tại Việt Nam, nhu cầu sử ụng ethanol ngày càng tăng, n đến sự thiếu hụt nghiêm trọng nguyên liệu sắn cho các nhà máy sản xuất ethanol: tổng sản lượng sắn năm 2009 là 9,45 triệu tấn Bắt đầu từ năm 2010 iện tích trồng sắn ị giới hạn ở 500.000ha với năng suất là 16,9 tấn/ha Sắn được sử ụng cho nhiều mục đích, có cả xuất khẩu đã n tới sự cạnh tranh về nguyên liệu Hệ quả tất yếu là giá sắn lên cao từ 12.000đ/kg (2009) lên 16.000đ/kg (2010) Đứng trước tình trạng này ngành ethanol từ sắn rất có thể ị ảnh hưởng mạnh nếu không có cơ chế cho vùng nguyên liệu

Để phát triển ngành công nghệ sản xuất nhiên liệu sinh học một cách ền vững, cả thế giới đang chuyển hướng sang lựa chọn ạng nguyên liệu thứ hai Bioethanol thế hệ thứ hai được sản xuất từ nguyên liệu như gỗ, ã nía, rơm rạ…,nó mang đến các viễn cảnh vô cùng tươi đẹp : (i) không gây ảnh hưởng đến nguồn thực phẩm, (ii) giá nguyên liệu rẻ hơn, (iii) nguyên liệu tái tạo nhanh đồng nghĩa với việc sản xuất ioethanol nhanh hơn các nhiên liệu hóa thạch Phát triển ioethanol thế hệ thứ hai giúp nâng cao giá trị các phụ phẩm nông nghiệp, từ đó góp phần nâng cao thu nhập cho người làm nông nghiệp [8]

Hàng năm, quá trình quang hợp ở thực vật đã tổng hợp được khoảng 232 tỷ tấn cac on hữu cơ, trong đó có 172 tỷ tấn tạo ra từ trên cạn, 60 tỷ tấn tạo thành ưới iển Trong số đó lignocellulose ở ạng các thành tễ ào thực vật chiếm 30% [19] Tuy nhiên, cho đến nay chưa có một công nghệ sản xuất ethanol từ lignocellulose được công ố là hiệu quả về mặt kinh tế Nguyên nhân ở đây là quá trình chuyển hóa cellulose thành đường lên men được chiếm tới 50% chi phí giá thành ao gồm: chi phí cho tiền xử lí chưa tối ưu với từng nguyên liệu, giá thành enzym cao so với hiệu quả thủy phân bã mía mang lại Nhưng với các nỗ lực nghiên cứu cho phát triển ioethanol thế hệ thứ hai từ các phụ phẩm nông nghiệp, lâm nghiệp trong những năm gần đây đang ngày càng tiến gần hơn đến việc hiện thực hóa ngành công nghiệp sản xuất ioethanol thế hệ thứ hai

1.2 Bã mía, nguyên liệu tập trung cho sản xuất bioethanol

Bã mía là một lignocellulose từ phụ phẩm của công nghiệp mía đường Ở Việt Nam, bã mía chủ yếu được sử dụng như một nguồn chất đốt tại một số vùng nông thôn và tại chính các nhà máy

Bảng 1: Thành phần của một số loại nguyên liệu lignocellulose [46]

Là nguyên liệu chứa lignocellulose, bã mía có thành phần chủ yếu là 3 loại polyme: cellulose, hemicellulose và lignin được liên kết chặt chẽ với nhau bởi các liên kết phi đồng hóa trị và đồng hóa trị Tại Việt Nam, bã mía có thành phần gồm 46,53% cellulose, 29,11% hemicellulose, 21,36% lignin [4], với hàm lượng cellulose cao bã mía có thể chọn là một nguồn nguyên liệu cho sản xuất bioethanol

Hình 1.1: Mô phỏng cấu trúc của nguyên liệu bã mía 1.2.1 Cellulose

Cellulose là thành phần polyme phổ biến nhất trong tự nhiên, chiếm 50% lượng sinh khối thực vật Cấu trúc của cellulose là polysaccharit đồng thể mạch thẳng cấu tạo bởi các tiểu đơn vị glucose liên kết với nhau bởi các liên kết loại O–-(1,4)-glycozit Các mạch này được định hướng và có một đầu khử với nhóm chức hydroxyl ở vị trí C1 tự o Đầu còn lại là đầu không khử, nhóm chức hydroxyl ở vị trí C1 bị bao vây trong một liên kết O–glycozit Các mạch cellulose được nhóm lại với nhau ưới dạng vi sợi bền bởi các liên kết hydro nội và ngoại phân tử [39]

Hình 1.2: Cấu trúc của lignocellulose

Cellulose gồm từ 1.400÷10.000 gốc β-D-glucose liên kết với nhau bằng liên kết β-1,4–glucozit tạo thành dạng chuỗi Cấu trúc micell của cellulose bao gồm đồng thời vùng kết tinh và vùng không định hình Vùng kết tinh có cấu trúc trật tự

rất cao, cấu trúc sợi đậm đặc và chặt chẽ như tinh thể, chiếm khoảng ¾ cấu trúc

cellulose [41].Tỷ lệ vùng kết tinh với vùng vô định hình tùy thuộc vào nguồn gốc xuất xứ của nguyên liệu Sự kết tinh của cellulose một phần là nhờ các liên kết hydro giữa các mạch cellulose Tất cả các nhóm hy roxyl trong pha vô định hình là đều hấp thụ với nước và trương nở giúp cho cellulase tấn công dễ dàng Trong khi chỉ vài số ít các nhóm hydroxyl –OH trong vùng kết tinh có tương tác với nước, ở điều kiện thường cellulase chỉ có thể tác động lên bề mặt sợi cellulose Tuy nhiên, việc thủy phân cellulose chỉ có thể diễn ra khi cellulose đã tách ra khỏi các thành phần cùng cấu tạo nên thành tế bào thực vật Các đường glucose được thủy phân ra

từ cellulose được lên men ethanol nhờ nấm men

1.2.2 Hemicellulose

Hemicellulose là một polysaccharit chiếm tỷ lệ lớn trên thế giới sau cellulose, là các polysaccharit dị thể, phân nhánh, liên kết với cellulose tạo nên

thành tế bào thực vật Hemicellulose chứa cả đường 6 cacbon gồm glucose, mannose và galactose và đường 5 gồm xylose và arabinose Tùy thuộc vào tỷ lệ của các thành phần đơn phân, hemicellulose còn được gọi là mannan (chứa mannose), xylan (chứa xylose) hay galactan (chứa galactose) Liên kết giữa hemicellulose với các polysacchrit khác và lignin được thực hiện bởi các liên kết mạch ngắn Do vậy, hemicellulose luôn luôn tồn tại ưới dạng vô định hình và rất dễ dàng bị thủy phân [25]

• Mạch chính của hemicellulose được cấu tạo từ liên kết β -(1,4)

• Xylose là thành phần quan trọng nhất

• Nhóm thế phổ biến nhất là nhóm acetyl O – liên kết với vị trí 2 hoặc 3

• Mạch nhánh cấu tạo từ các nhóm đơn giản, thông thường là disaccharit hoặc trisaccharit Sự liên kết của hemicellulose với các polysaccharit khác và với

lignin là nhờ các mạch nhánh này Cũng vì hemicellulose có mạch nhánh nên tồn tại ở dạng vô định hình và vì thế dễ bị thủy phân

Các phân tử đường được liên kết với nhau bởi liên kết β-1,4, β-1,3 và glucozit, thường bị acetyl hóa, tạo thành keo dính các phân tử cellulose và lignin

β-1,6-Gỗ cứng, gỗ mềm và nguyên liệu phi gỗ có các đặc điểm hemicellulose khác nhau:

- Acetyl-4-O-methylglucuronoxylan, là một loại polyme có mạch chính

gồm β-D-xylopyranose liên kết với nhau bằng liên kết β-D (1,4) Trong đó 70% các nhóm -OH ở vị trí C2 và C3 bị acetyl hóa, 10% các nhóm ở vị trí C2 liên kết với acid 4- O-methyl-D-glucuronic Gỗ cứng còn chứa glucomannan, polyme này chứa một tỉ lệ bằng nhau β-D-glucopyranose và β-D-mannopyranose [12]

Hình 1.3 Mạch acetyl-4-O-methylglucuronoxylan

Hình 1.4: Mạch glucomannan

- Loại thứ hai có mạch chính là β-D-galactopyranose, phân nhánh Loại

hemicellulose này tạo liên kết –O tại nhóm -OH ở vị trí C6 với α-L-ara inose, β-D- galactose hoặc aci β-D-glucoronic [12]

- Galactoglucomannan, đây là polyme cấu thành từ các phân tử

D-mannopyranose liên kết với D-glucopyranose bằng liên kết β-(1,4) với tỉ lệ hai monome tương ứng là 3:1 Tuy nhiên, tỉ lệ này thay đổi tùy theo loại gỗ [12]

Hình 1.5: Mạch galactoglucomannan

- Arabino-4-O-methylglucuronoxylan, cấu tạo từ các D-xylopyranose, các

monome này bị thế ở vị trí 2 bằng acid 4-O-methyl-glucuronic, ở vị trí 3 bằng α- L-arabinofuranose [12]

Đối với bã mía, 20 ÷ 40% hemicellulose là xylose Polysaccharide này cấu tạo từ các D-xylopyranose, OH ở C2 bị thế bởi acid 4-O-methylglucuronic -OH ở

vị trí C3 sẽ tạo mạch nhánh với α-L-arabinofuranose [12]

Hình 1.7: Cấu trúc của mạng lignin [45]

Lignin được cấu thành bởi 3 đơn vị là các rượu phenol: Alcohol coniferylic, Alcohol p-coumarylic, Alcohol sinapylic Các co-polyme của lignin cũng chứa các đơn vị cơ ản parahydroxylphenyl, guaiacyle và syringyle [10]

Do đó, phân hủy lignin sẽ tạo điều kiện cho thủy phân ã mía hiệu quả, các nghiên cứu đã sự tỷ lệ thuận giữa mức độ lignin bị phân hủy và mức độ thủy phân

ã mía [24]

1.3 Tiền xử lí nguyên liệu lignocellulose

Trước khi thủy phân, nguyên liệu cần được tiền xử lí với mục tiêu giảm hàm lượng lignin và hemicellulose trong vật liệu, làm trương nở ma trận lignocellulose

và tăng kích thước lỗ trong sợi lignocellulose, làm giảm mức độ kết tinh của cellulose qua đó gia tăng iện tích bề mặt giữa enzym và cơ chất Có rất nhiều các phương pháp tiền xử lí như phương pháp vật lý, hóa học, sinh học hoặc phối kết hợp Nhưng không có một phương pháp tối ưu cho mọi loại nguyên liệu Thông thường quá trình làm mất mát chất khô hay sự phân hủy các loại đường sinh ra và tạo thành các chất ức chế vi sinh vật Yêu cầu quá trình tiền xử lí cần phải hiệu quả, các thiết bị dùng cho quá trình tiền xử lí cần phải đơn giản và ít tốn kém, chi phí xử

lí cần phải được giảm thiểu tối đa, nhất là chi phí cho năng lượng và hóa chất

Hình 1.8: Mô phỏng cấu trúc lignocellulose trước và sau tiền xử lí

1.3.1 Tiền xử lí nguyên liệu lignocellulose bằng phương pháp vậy lý 1.3.1.1 Phương pháp cơ học

Nguyên tắc của phương pháp này là gia tăng ề mặt tiếp xúc giữa cơ chất với các enzym, tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình thủy phân bằng enzym Phương pháp này làm giảm mức độ trùng hợp của cellulose, lignin và mức độ kết tinh của cellulose Phương pháp vật lý bao gồm: nghiền hoặc nghiền đến kích thước nano,

xử lí bức xạ năng lượng cao, xử lí thủy nhiệt và nổ hơi Ưu điểm của các phương pháp thuộc nhóm này là không sử dụng hóa chất trong quá trình xử lí, nhưng tiêu hao năng lượng lớn Tuy nhiên v n còn là quá khó để có thể sử dụng phương pháp này ở quy mô lớn [39]

1.3.1.2 Phương pháp thủy-nhiệt

Quá trình thường đun nguyên liệu trong nước ưới áp suất cao ở nhiệt độ

200oC÷230oC có thể làm hòa tan từ 80÷90% hemicellulose và mở mạch cellulose, quá trình thủy phân cellulose nhờ các enzym sau đó có thể đạt 90% Thời gian đun thường từ 15÷60 phút Các nghiên cứu được tiến hành trong điều kiện phòng thí nghiệm đã chỉ ra rằng phương pháp này có khả năng hòa tan hoàn toàn hemicellulose và một lượng đáng kể lignin Nó cũng cho phép gia tăng kích thước các lỗ của ma trận lignocellulose và làm giảm mức độ kết tinh của cellulose qua đó tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình thủy phân bằng enzym sau này Phương pháp này mặc dù có khá nhiều ưu điểm: Mức độ hòa tan pentose và cơ chất sau tiền xử lí hấp thụ enzym tốt, không cần sử dụng hóa chất, ít tạo thành chất ức chế, ít gây thất thoát chất khô và có thể xử lí được với nồng độ cơ chất cao (trên 20 bar) [34]

Nhưng khó được áp dụng trên quy mô lớn chủ yếu vì khó khăn khi phải thực hiện ở nhiệt độ và áp suất cao

1.3.2 Tiền xử lí lignicellulose bằng phương pháp hóa học

1.3.2.1 Tiền xử lí trong môi trường axít loãng

Xử lí với axít loãng là một trong những phương pháp đơn giản và dễ áp dụng nhất trong tất cả các phòng thí nghiệm mà không cần bất kỳ một thiết bị chuyên dụng nào Ion H+ ở nhiệt độ cao có khả năng phân cắt các liên kết glucozit và phân hủy hemicellulose cũng như giảm mức độ kết tinh của cellulose [33]

Trong quá trình tiền xử lí với axít, hemicellulose dễ dàng bị phân hủy hơn so với cellulose hay lignin Vì thế, các hợp phần cellulose và lignin trong pha rắn hầu như không ị thay đổi và có thể tiếp tục được xử lí về sau [33] Tùy theo các điều kiện tiền xử lí, pha lỏng của dịch thủy phân sẽ bao gồm các đường đơn là xylose, glucose hay arabinose, các sản phẩm của sự phân hủy hemicellulose (các oligosaccharit từ polysaccharit, axít acetic từ sự thủy phân nhóm acetyl liên kết với đường) và/hoặc các sản phẩm của sự phân hủy monosacchrit (furfural-sản phẩn của

sự khử nước đường pentose, 5-hydroxymethylfurfural (HMF) - sản phẩm của sự khử nước đường hexose) [34] Các sản phẩm này đều là những chất ức chế đến sự phát triển của vi sinh vật, do vậy ức chế quá trình lên men sau này

Tiền xử lí với axít sulfuric

Pattra và cộng sự [37], đã nghiên cứu quá trình tiền xử lí bã mía sử dụng axít sulfuric ở các nồng độ khác nhau 0,25÷7% (w/v), thời gian xử lí thay đổi từ 15÷240 phút ở 121oC, áp suất 1,5 kg/cm2 Các điều kiện tối ưu thu được là 0,5% (w/v)

H2SO4 trong 60 phút, hiệu quả thủy phân ằng hệ cellulase được sử dụng để đánh giá hiệu quả tiền xử lí nguyên liệu với kết quả thu được 24,5g/l đường tổng số Trong đó, đạt được là 11g/l glucose; xylose 11,29g/l; arabinose 2,22g/l; axít acetic 2,48g/l và furfural 0,12g/l Việc tăng nồng độ H2SO4 từ 0,5% lên 1% không làm thay đổi hàm lượng đường glucose sinh ra trong dịch thủy phân bã mía Khi nồng

độ H2SO4 tăng từ 1% lên 1,5%, hàm lượng glucose thậm chí còn giảm Xylose được coi như là đường chính thu được khi tiền xử lí lignocellulose bằng axít [38]

Tiền xử lí với axít clohydric

Axít clohydric (HCl) được sử dụng để xử lí các lignocellulose khác nhau như

là rơm của cây lúa miến, bã mía Tuy nhiên, sự tác động tới môi trường và tính chất ăn mòn là những hạn chế của phương pháp này Sử dụng HCl tiền xử lí bã mía cho phép thu được dịch thủy phân sau này với hiệu suất cao hơn so với các loại nguyên liệu lignocellulose khác, đường khử thu được 37,21% theo khối lượng bã mía [23]

Tiền xử lí với axít phosphoric

Lợi thế của việc sử dụng axít phosphoric (H3PO4) là sau quá trình trung hòa dịch tiền xử lí bằng NaOH, muối tạo thành natri phosphat trong dung dịch có thể được sử dụng như một nguồn chất inh ưỡng cho các vi sinh vật [35] Vì vậy, quá trình lọc tách bã là không cần thiết Việc giảm bớt được một giai đoạn lọc làm cho phương pháp này có khả năng sinh lợi cao hơn và có tác động tích cực đến môi trường (không sinh ra các chất thải là muối) Gámez và cộng sự [34], đã nghiên cứu tiền xử lí bã mía với H3PO4 1% trong 1giờ ở 145oC Bã mía tiền xử lí được trung hòa bằng NaOH, bổ sung enzym Biocellulase của Kerry Bioscience 50FPU/g bã mía khô, thu được 424 mg đường khử/g bã mía khô và Novozym 188 của Sigma

Aldrich 0,5FPU/g bã mía khô, thu được 198 mg đường khử/g bã mía khô

Tiền xử lí với axít nitric

Rodriguez-Chong và cộng sự [5] đã so sánh kết quả tiền xử lí bã mía bằng axít nitric (HNO3) với xử lí bằng H2SO4 và H3PO4 cho thấy tiền xử lí với HNO3 cho hiệu quả thủy phân ã mía tương tự

1.3.2.2 Tiền xử lí lignocellulose trong môi trường kiềm

Tiền xử lí trong môi trường kiềm là quá trình sử dụng dung dịch kiềm ở nhiệt

độ và áp suất thấp hơn so với các phương pháp thủy-nhiệt, cho phép hòa tan gần như hoàn toàn lignin và một phần hemicellulose cũng như làm trương nở các sợi cellulose và làm cho chúng dễ bị thủy phân hơn ởi enzym [6] Mức độ trùng hợp

và chỉ số kết tinh của cellulose được hạ thấp Trong điều kiện tiền xử lí với 0,8÷1,2

g Ca(OH)2 cho 10g bã mía khô, nhiệt độ 90÷120oC và thời gian xử lí khoảng 60 phút, kết quả thuỷ phân sử dụng enzym thu được 659mg đường khử tổng số/g bã mía khô [44] Theo Ymashita và cộng sự [48], với điều kiện tiền xử lí 0,1g NaOH/g tre cho hiệu quả thủy phân nhờ enzym 568 mg đường khử tổng số/g tre

1.3.2.3 Tiền xử lí lignocellulose bằng phương pháp chiết dung môi

Phương pháp chiết dung môi dựa vào việc hòa tan và chiết lignin cũng như hemicellulose trong một dung môi hữu cơ (methanol hay ethanol) HCl hay H2SO4thường được thêm vào khi nhiệt độ phản ứng đạt ≥185o

C, dung môi hữu cơ sau đó được tách ra bằng cách cho ay hơi và được tái sử dụng Phương pháp tiền xử lí này cho phép thu hồi gần như hoàn toàn lượng lignin và có thể được sử dụng độc lập

Glycerol, phụ phẩm của quá trình sản xuất biodiesel có thể được sử dụng như là dung môi cho phương pháp chiết dung môi Người ta đã chứng minh rằng glycerol

có thể tách được hơn 60% hemicellulose và hơn 60% lignin, cao hơn so với phương pháp nổ hơi (60% hemicellulose và 10% lignin bị phân hủy) [41] Axít formic, một dung môi hữu cơ cũng được thử nghiệm để tiền xử lí lignocelulose ở áp suất khí quyển Sự khử lignin trong lignocellulose diễn ra trong dung dịch 90% axít formic gần như hoàn toàn sau khoảng 80 phút Chu trình này kết hợp việc sử dụng một lượng nhỏ dung môi hữu cơ và tạo điều kiện cho việc thu hồi lignin bằng cách giảm

áp suất sau khi đưa về dạng bột [31] Tuy vậy, phương pháp này có giá thành cao

1.3.2.4 Tiền xử lí lignocellulose bằng phương pháp oxi hóa

Trong quá trình này, lignin được ozone hóa hoặc oxy hóa lignin đến một mức độ thấp hơn, kết quả khảo sát cho thấy hàm lượng lignin giảm 40-50% Ozone

đã được thử nghiệm oxy hóa các cơ chất như rơm, lúa mì, bã mía hoặc thông, kết quả làm tăng khả năng tiếp cận của các enzym trong quá trình thủy phân lignocellulose thành các đường đơn đạt hiệu suất thủy phân cellulose 74,9% bằng cách xử lí sơ ộ tại 195°C, 15 phút và pH kiềm Việc khử lignin bằng phương pháp oxy hóa rất hiệu quả với sự hạn chế của các hợp chất ức chế nấm men

Martin và cộng sự [27] đã đánh giá các điều kiện oxy hóa khác nhau thông qua đánh giá khả năng khả năng thủy phân cellulose trong bã mía bằng hệ cellulase Các biến nghiên cứu đã được xác lập là pH, nhiệt độ và thời gian phản ứng, trong điều kiện áp suất 12bar, pH được điều chỉnh bằng cách thêm H2SO4 hoặc Na2CO3 Kết quả nghiên cứu thu được 161mg đường khử/g bã mía, xử lí nguyên liệu ở 185°C trong 5 phút, pH axít Các phân tích thành phần chất rắn còn lại sau tiền xử lí cho thấy có sự hòa tan của hemicellulose, nhưng nồng độ khử trong phần chất lỏng

là rất thấp, các sản phẩm sau tiền xử lí phát hiện trong dịch chủ yếu là các oligosaccharit của hemicellulose [27] Phản ứng oxy hóa lignin trong bã mía nhờ N-methyl-N-oxit ở 130°C trong 1 giờ với nước khử ion cho thấy 95% cellulose được chuyển thành glucose sau thủy phân [13] Hạn chế của phương pháp này là chi phí hóa chất lớn, làm quá trình có chi phí cao

1.3.3 Tiền xử lí lignocellulose bằng phương pháp hóa lý

1.3.3.1 Phương pháp nổ hơi

Nổ hơi có thể thực hiện trong môi trường nước hoặc axít loãng Khi nổ hơi trong môi trường nước, nhiệt độ cần cấp lên tới 230°C÷250°C ở áp suất cao có thể phải tới 40bar, sau đó giữ nhiệt trong khoảng thời gian từ vài giây cho đến vài phút trước khi đưa về áp suất khí quyển Với điều kiện này hiệu suất thủy phân lên tới 90% nhưng quá trình tạo ra các chất ức chế nấm men sau này do phân hủy đường Các thông số cần kiểm soát của quá trình bao gồm nhiệt độ, thời gian xử lí nhiệt, nồng độ chất khô và điều kiện an đầu của vật liệu Phương pháp này cho phép thủy phân một phần hemicellulose cũng như chuyển hóa lignin và phá vỡ cấu trúc của

ma trận lignocellulose Ngoài ra, nổ hơi còn giảm chỉ số kết tinh của cellulose Sự

nổ hơi được tiến hành bằng cách kết hợp hoặc nhiệt độ cao và thời gian phản ứng ngắn (270oC, 1 phút) hoặc ở nhiệt độ thấp hơn và thời gian phản ứng kéo ài hơn (190oC, 10 phút) Tuy nhiên, với phương pháp này, sự hòa tan hemicellulose không đạt cực đại và d n đến việc thu được oligosaccharit có mức độ trùng hợp thấp

Khi kết hợp nổ hơi với H2SO4 hay SO2, quá trình nổ hơi có thể được tiến hành ở nhiệt độ thấp hơn 150÷200oC so với 250oC khi không dùng chất xúc tác Với

sự cải tiến này, nổ hơi có thể hòa tan và thủy phân hoàn toàn hemicellulose, cải thiện hiệu suất thủy phân cellulose sau này và giảm thiểu sự tạo thành các chất ức chế Carasco và cộng sự [9] đã tiến hành nổ hơi ã mía ở nhiệt độ 190oC trong 5 phút với chất xúc tác 2% H2SO4 Bã mía sau nổ hơi được bổ sung hệ enzym thủy phân cellulase là 65 FPU Celluclast 1.5L/g và 17 CBU β-glucosidase/g, thủy phân trong 72h, 2% chất khô, pH 4,8 cho phép thu hồi 87% cellucose và 57% pentose [9] Sự thất thoát chất khô thường do nguyên nhân bay hơi trong quá trình giảm áp (≤10%, chủ yếu là furrfural và axít acetic) Nổ hơi ưới sự có mặt của khí SO2 cho phép các chất xúc tác xâm nhập tốt hơn vào ma trận lignocellulose Tuy vậy, phương pháp này có thể d n đến thất thoát chất xúc tác, tạo ra các chất độc hại cũng như khả năng ứng dụng thấp trong công nghiệp do SO2 dễ ay hơi

Khi nghiên cứu nổ hơi [4], tiến hành ở nhệt độ cao (200oC÷220oC) với tỉ lệ chất khô/nước là 75g/l, thu được glucose cao nhất 42,63g/l, tương đương hiệu quả

thủy phân cellulose đạt 81% khi nổ hơi ở 210oC [4] Phương pháp tiền xử lí bằng nổ hơi đem lại hiệu quả thủy phân cao, đặc biệt là trong môi trường axít, ngoài ra nó còn có các lợi ích khác như: không đòi hỏi nhiều năng lượng, ít sinh các chất thải,

dễ àng để áp dụng vào quy trình gián đoạn, tiêu thụ ít chất xúc tác hóa học và có thể phù hợp để xử lí cả nguyên liệu có kích thước lớn Tuy nhiên, yêu cầu thiết bị lại quá phức tạp, mang tính chuyên dụng cao

1.4 Tiền xử lí lignocellulose bằng phương pháp sinh học

Bản chất của quá trình phân hủy sinh học vật liệu lignocellulose là do các enzym ngoại ào cơ ản của các nấm mốc bao gồm Lignin peroxidase (LiP), Manganese peroxidase (MnP) và Laccase (Lac) tấn công và oxy hóa mạnh mạng lưới lignin Ưu điểm của phương pháp tiền xử lí sinh học là tiêu thụ năng lượng thấp, gần như không có hóa chất, không gặp các vấn đề ăn mòn Lignocellulose có khả năng ị phân hủy chậm bởi các vi sinh vật trong tự nhiên Hiện nay nấm mục

trắng đang được nghiên cứu nhiều đặc biệt là Phanerochaet chryzosporium, Trametes versicolor, Pleurotus ostreatus, Phanerochaete sordida, Trametes hirsutus và Fusarium culmorum, do có khả năng tổng hợp phổ các enzym phân hủy

lignin [20]. Nhược điểm lớn của tiền xử lí sinh học hiện nay là thời gian của quá trình phân hủy sinh học dài, khó áp dụng trong sử dụng công nghiệp Vì vậy, ngoài việc sử dụng trực tiếp các chủng vi sinh vật nói trên, một hướng tiếp cận khác là sử dụng các enzym này cho mục tiêu phân hủy lignin

1.4.1 Peroxidase

Lignin peroxidase (EC 1.11.1.14), lần đầu tiên được tìm thấy trong môi

trường nuôi cấy P chryzosporium Hiện nay có thể tìm thấy enzym này trong một

số loài nấm làm mục gỗ khác như Phlebia radiate, Phlebia tremellose, Trametes versicolor và xạ khuẩn Streptomyces viritosporus, Thermomonospora fusca…

Enzym xúc tác các quá trình oxi hóa phức hợp lignin, cắt mối liên kết C-C của nhánh bên lignin, thực hiện oxi hóa VA và các cấu trúc tương tự tạo thành andehyt và ceton, phân cắt mối liên kết intradiol của cấu trúc phenylglycol và hydro hóa nhóm benzylic metylen [18]

Hình 1.9: Quá trình phân cắt mối liên kết C-C

Manganese peroxidase (EC 1.11.1.13), được tìm thấy trong môi trường nuôi

cấy P chryzosporium và trong các nấm mốc T versicolor, P radiata, Ceriporiopsis cubvermis, Agarious bisporus, Nematoloma frowadic [20] Enzym này hoạt động

như một phenoloxy ase trên cơ chất phenol bằng cách sử dụng Mn3+

/Mn2+ làm cặp oxy hoá khử trung gian Nhiệm vụ chính của enzym này là tham gia vào phản ứng oxy hoá hợp chất phenol cũng như cấu trúc phenol của lignin (có -OH phenol tự do) MnP tấn công trực tiếp vào cấu trúc vòng thơm lignin, chuyển hóa thành những gốc oxy hóa có trọng lượng phân tử thấp theo con đường oxy hóa khử Mn

A

MnP có thể polyme hóa và/hoặc phân hủy clo-lignin phân tử lượng lớn MnP

xuất hiện sớm hơn LiP khi nuôi cấy P chrysosporium và có nhiều nghiên cứu cho

rằng đây là enzym chính trong hệ enzym phân hủy lignin MnP có thể oxy hóa các phần cấu trúc phenol, như vậy nếu điều kiện thuận lợi MnP phối hợp với LiP hình thành hệ enzym hoạt tính cao, có thể phân hủy vật liệu gỗ và phi gỗ giàu lignin [30]

1.4.2 Lacase và cơ chế phân hủy lignin

Laccase (EC 1.10.3.2), chứa 4 ion đồng trong trung tâm xúc tác, phân bố ở 3

vị trí liên kết khác nhau và thường được gọi là polyphenol oxy ase đa đồng Laccase có khả năng xúc tác phản ứng chuyển hóa hợp chất phenol thành các gốc quinin và sau đó oxy hóa chúng thành quinon Phản ứng oxy hóa gắn liền với sự

khử phân tử oxy tạo thành nước Khả năng oxy hóa hợp chất phenol của laccase đánh ấu ước phát triển của ngành công nghệ enzym [29]

Ion đồng ạng 1(T1) có vai trò một ion vận chuyển điện tử từ cơ chất tới tâm hoạt động của 2 ion ạng 2(T2) và 1 ion ạng 3(T3) nhờ ộ 3 axít (His-Cys-His), là nơi chúng liên kết với oxy và ị khử trở thành hai phân tử nước (hình 1.11A) Các ion đồng này giúp cho quá trình khử 4 electron của phân tử oxy không tạo thành chất trung gian là oxy nguyên tử hoạt động mạnh

A

B

Hình 1.11: Cơ chế laccase tác động đến lignin

A Phân hủy các hợp chất hydroxyl tới các gốc phenol;

B Cơ chế oxy hóa các tiểu phần phenol của lignin bởi laccase [32]

Laccase là enzym oxy hóa, có tính đặc hiệu cao với các hợp chất hydroxyl thơm hoặc các amino thơm tới các gốc phenol và gốc amino tự do Laccase cũng oxy hóa cấu trúc phenol-lignin thành các gốc phenol tự do bằng cách tách một điện

tử, hình thành gốc tự do, d n đến thay đổi các chất quinon Sự thay đổi này d n tới việc phân tách bộ khung C-C hoặc C-O bên trong các tiểu đơn vị lignin phenyl-propan Kết quả là hai chuỗi ên và các vòng thơm ị phân hủy Đây là những ước phản ứng quan trọng cho quá trình chuyển hóa, phân hủy các hợp chất lignin Trong quá trình xúc tác này, laccase kết hợp với một số enzym như glucose oxydase, LiP…, thực hiện phân cắt các mối liên kết C-C, C-O trong cấu trúc lignin và d n xuất của nó thành các vòng thơm có cấu trúc đơn giản hơn

Laccase chỉ tác dụng vào tiểu phần phenol của lignin d n đến sự oxy hóa của

Cα, cắt liên kết Cα-Cβ và liên kết aryl-alkyl Laccase có khả năng khử một phân tử oxy tạo thành hai phân tử nước trong khi thực hiện sự oxy hóa các hợp chất thơm như polyphenol, phức hợp methoxyl và các amin thơm [32] Quá trình oxy hóa một điện tử này d n đến việc hình thành gốc tự do ở vị trí oxy trung tâm, sau đó tiếp tục được chuyển hóa thành quinon ưới sự xúc tác của laccase Quinon và các gốc tự do

có thể tiếp tục quá trình polyme hóa (hình 1.11B)

Cho đến năm 1990, laccase mới chỉ được biết đến với vai trò phân giải các hợp chất phenol của lignin Nhưng hiện nay các nhà khoa học đã nhận thấy dải cơ chất của laccase có thể mở rộng đối với các tiểu phần khác không có bản chất phenol của lignin (non-phenol) khi có mặt chất trung gian (mediator) thích hợp (hình 1.12A, 1.12B)

Cơ chế xúc tác của hệ thống laccase - mediator bắt đầu bằng việc laccase oxy các mediator, biến mediator về dạng oxy hóa; sau đó các me iator đã được oxy hóa tiếp tục thực hiện phản ứng oxy hóa khử với cơ chất (hình 1.12C) Hiện nay, có hơn

200 me iator đã được tìm thấy trong đó ABTS, HBT (1-hydroxybenzotriazole), guaiacol, syringal azine là các me iator được sử dụng rộng rãi nhất

Việc sử dụng laccase đơn giản hơn LiP và MnP o không phụ thuộc vào

H2O2, hiện nay các nghiên cứu v n đang đƣợc tiếp tục tiến hành để làm sáng tỏ vai trò của laccase trong quá trình phân hủy lignin

A

B

C

Hình 1.12: Cơ chế phân hủy lignin và các dạng biến đổi của laccase

A (ABTS) hỗ trợ laccase oxy hóa tiểu phần phi phenol của lignin;

B Cơ chế oxy hóa các hợp chất phi phenol thông qua mediator;

C Các dang laccse trong quá trình oxi hóa các cơ chất [32]

1.5 Thủy phân cellulose

Để thực hiện lên men ethanol từ cellulose trong lignocellulose, cellulose cần được thủy phân thành glucose để lên men nhờ nấm men Do cấu trúc phức tạp, sự kết tinh và liên kết chặt chẽ với lignin cũng như hemicellulose, ngay cả sau khi đã tiền xử lí, sự thủy phân cellulose thành glucose cũng là một giai đoạn mấu chốt Có thể thủy phân cellulose bằng con đường hóa học hay bởi enzym [23]

1.5.1 Thủy phân lignocellulose bằng phương pháp hóa học

Thông thường, việc thủy phân bằng axít đậm đặc không đòi hỏi quá trình tiền xử lí Quá trình này được tiến hành với H2SO4 đậm đặc ở nhiệt độ cao, cả hemicellulose và cellulose đều được thủy phân thành các đường đơn Phần lignin không tan sẽ được tách ra khỏi dịch thủy phân nhờ quá trình lọc và được sử dụng làm chất đốt trong công nghiệp điện

Công nghệ này đã được đưa ra vào năm 1950 , tuy nhiên, quá trình thủy phân bằng H2SO4 đặc d n đến sự tạo thành các sản phẩm phân hủy như là furfural sản phẩm của sự đề hy rat hóa đường pentose và 5-hydroxymethylfurfural (HMF), sản phẩm của sự đề hy rat hóa đường hexose [34] Các chất này gây ra ức chế đối với quá trình sinh trưởng của nấm men sau này, hiệu suất thu hồi đường không cao do đường bị phân hủy trong quá trình thủy phân

Hiện nay, các phương pháp thủy phân hóa học ít có khả năng cạnh tranh chủ yếu là do vấn đề môi trường và chi phí thiết bị cao

1.5.2 Thủy phân lignocellulose sử dụng enzym

Hiện nay, người ta đã thay thế thủy phân hóa học bằng các phương pháp sử dụng enzym [23] Phương pháp thủy phân bằng enzym có tính đặc hiệu cao hơn phương pháp hóa học, đem lại hiệu quả thủy phân cao hơn trong điều kiện tiến hành êm dịu hơn Để tăng hiệu suất thủy phân, sinh khối lignocellulose đã được tiền

xử lí trước đó nhằm mở cấu trúc liên kết chéo giữa cellulose, hemicellulose và lignin, tạo điều kiện thuận lợi cho hệ cellulase tiếp cận cơ chất một cách dễ dàng hơn

Khi so sánh với phương pháp thủy phân hóa học, việc sử dụng enzym ít tạo

ra các ảnh hưởng xấu đến dịch lên men và không ăn mòn thiết bị và an toàn về môi trường

Một nguyên liệu có cấu trúc phức tạp như lignocellulose không thể được thủy phân hoàn toàn bởi chỉ duy nhất một loại enzym Quá trình thủy phân cellulose trong nguyên liệu lignocellulose để tạo thành glucose là kết quả của sự tác động hiệp đồng từ ít nhất ba loại enzym chính khác nhau:

- Endo-1,4-β-glucanase (EG) hay 1,4-β-D-glucan glucanohydrolase (EC

3.2.1.4): tấn công một cách ng u nhiên các liên kết 1,4-β-glucan tạo thành các mạch polysaccharite có chiều dài khác nhau

- Exo-1,4-β-D-glucanase bao gồm 1,4-β-D-glucan glucohydrolase (EC

3.2.1.74) giải phóng D-Glucose từ 1,4-β-glucan và thủy phân chậm các D

cellobiose, và 1,4-β-D-glucan cellobiohydrolase (EC 3.2.1.91) (CBH) giải phóng

cellobiose từ 1,4- β-glucan

- β-D-glucosidase hay β-D-glucoside glucohydrolase (EC 3.2.1.21): enzym

này thủy phân các cellobiose hay cellotriose tạo thành D-glucose

Ngoài ra, còn có một số các enzym khác tham gia hỗ trợ quá trình thủy phân cellulose trong bã mía, các enzym này tham gia cắt các liên kết giữa các tiểu phần của nguyên liệu như laccase, LiP, MnP, ferulol esterase… và xylanase cũng có thể xếp vào nhóm này nếu mục đích sử dụng làm tăng hiệu quả thủy phân cellulose Các enzym này được gọi tên chung là enzym hỗ trợ Tuy nhiên, tập hợp đầy đủ các enzym này chưa được xác lập

Hình 1.13: Cơ chế quá trình thủy phân cellulose bởi hệ enzym cellulase

Mặc dù một vài loại vi khuẩn như Clostritium thermocellum có khả năng sản

sinh enzym cellulase với tính đặc hiệu cao, tuy nhiên khả năng sản suất và mức độ tăng trưởng lại quá yếu để có thể ứng dụng vào quy mô công nghiệp Trong số các

nấm sinh cellulase ngoại bào, Trichoderma reesei là loài được nghiên cứu nhiều nhất cho mục đích sản xuất cellulase Thật vậy, T reesei có khả năng sản sinh

cellulase với nồng độ và hoạt lực cao và loài này cũng là đối tượng của rất nhiều ứng dụng trong công nghiệp

Bã mía là nguyên liệu thế hệ thứ hai đang được nghiên cứu rộng rãi, các enzym được sử dụng để thủy phân bao gồm chế phẩm cellulase, β-glucosidase Trong đó, các enzym được thử nghiệm và nghiên cứu nhiều nhất là Celluclast 1.5L

và N188 (Novozym) Nghiên cứu xử lí bằng nổ hơi ở nhiệt độ 210oC và hiệu quả thủy phân cellulose trong bã mía bằng enzym đạt 81% [4] Năm 2007, Carlos và cộng sự [11], sử dụng nổ hơi ã mía trong 2 phút ở 190oC trong môi trường kiềm, thủy phân với hệ enzym gồm 25 FPU Celluclast 1.5L và 0,46 CBU N188/g bã mía,

hiệu suất thủy phân cellulose đạt 75% [11] Một nghiên cứu khác, nổ hơi trong môi trường SO2, với tỷ lệ enzym 65 FPU/386 CBU (Celluclast/N188)/g bã mía hay 50 FPU/0,5 CBU/g bã mía cho hiệu quả thủy phân cellulose lên tới 87% và 89% Nghiên cứu sử dụng chế độ axít/kiềm ở nhiệt độ thấp 121oC, với tỷ lệ enzym thấp hơn (10 FPU/5 CBU)/g bã mía, chỉ cho hiệu quả thủy phân là 48,9% và 50% cellulose [14]

1.6 Lên men ethanol dịch thủy phân

Lên men là giai đoạn thứ 3 trong quá trình sản xuất ethanol sau tiền xử lí và thủy phân Các đường thu nhận được sau quá trình tiền xử lí và thủy phân nguyên liệu lignocellulose bao gồm pentose (chủ yếu là xylose và arabinose), disaccharit (cellobiose) và quan trọng nhất là glucose – đường có thể được lên men trực tiếp

bởi nấm men Saccharomyces cerevisiae để tạo thành ethanol

Trong số các chủng có khả năng lên men đường glucose, S cerevisiae là

chủng được sử dụng rộng rãi nhất nhờ vào khả năng lên men ethanol cao Hiện nay, chưa có một loại vi sinh vật nào có thể đạt được hiệu suất lên men ngang bằng với

S cerevisiae (xấp xỉ 0,47g ethanol/g glucose ở điều kiện thường) [3] Larissa

Canilha và cộng sự [26] đã nghiên cứu sản xuất ethanol từ nguồn sinh khối bã mía

sử dụng Pichia stipilis Quá trình lên men dịch thủy phân đã qua khử độc mang lại

hiệu suất rất khả quan: 7,5g ethanol/l sau 48 giờ Rất nhiều nghiên cứu gần đây hướng đến mục đích lựa chọn cũng như tạo chủng lên men đường pentose thành ethanol Trong các nghiên cứu đó, các loại vi sinh vật được chú ý nhiều nhất là nấm

men dại có khả năng lên men đường pentose, các chúng tái tổ hợp giữa S cerevisiae

và các loại vi khuẩn chịu nhiệt có thể sử dụng pentose Nhưng các nghiên cứu này cần thêm thời gian để có thể khẳng định tính hiệu quả lên men ethanol

Các chủng nấm men S cerevisia lên men dễ dàng lên men các dịch đường từ

các nguyên liệu thế hệ thứ nhất như ngô, sắn…Nhưng với dịch đường thủy phân lignocellulose, chứa nhiều hợp chất phenol được sinh ra sau tiền sử lí ở nhiệt độ cao

và hóa chất đã ức chế sự sinh trưởng của nấm men, làm giảm hiệu suất thu hồi ethanol Các chất ức chế sẽ xâm nhập tế bào nấm men và gây ức chế sự tồn tại của

chúng, đồng thời ức chế khả năng lên men Sự sinh ra các chất ức chế và tấn công tế bào nấm men có thể mô tả sơ lƣợc trong hình 1.14

A

B

Hình 1.14: Sự ức chế tế bào nấm men bởi các chất ức chế sinh ra

A Nguồn gốc các chất ức chế sinh ra trong quá trình tiền xử lí hóa nhiệt;

B Sự ức chế nấm men bởi các chất ức chế

Với mỗi loại chất ức chế sẽ có cơ chế tác động tới nấm men khác nhau Để khắc phục ảnh hưởng của chất ức chế, có nhiều giải pháp được đưa ra để giảm thiểu tác động ức chế của các chất này bao gồm trao đổi nhựa ion, sử dụng enzym oxi hóa khử, sử dụng môi trường có pH thay đổi, kỹ thuật gen nhằm tạo ra các chủng nấm men có khả năng chống chịu tốt với các chất ức chế …Trong các giải pháp đã đưa

ra, sử dụng laccase được xem là lựa chọn tối ưu loại ỏ độc tính của các chất này

Về cơ chế, việc loại ỏ độc tính còn chưa rõ ràng, cơ chế có thể là oxi hóa khử, cũng có thể là polyme hóa và cũng có thể là cả hai, nhưng nó sẽ chứng minh là có hiệu quả nếu cải thiện được khả năng lên men của 1 chủng nấm men lựa chọn, trong các điều kiện lên men tương tự [22]

CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu

- Laccase của hãng Mooyuan, Trung Quốc, hoạt độ 1861 IU/g

- Cellulclast 1.5L, Novozyme, Đan Mạch hoạt độ 700 EGU/ml

- β-Glucosidase N188, Novozyme, Đan Mạch, hoạt độ 250 CBU/ml

 Hóa chất sử dụng bao gồm :

o Glucose, Sigma, Đan Mạch

o Natri Fluorosilicate (Na2SiF6)

o CMC (Carboxyl-methyl cellulase), sigma, Đan Mạch

o P-nitrophenyl--D-glucopyranozite (p-NPG), Sigma, Đan Mạch

o Folin ciocalteau (FC), Sigma, Đan Mạch

o Aci gallic, Sigma, Đan Mạch

o Dung dịch thuốc thử DNS, Rodzevich, đệm natri citrate pH 4,8 và môi trường lên men (phụ lục)

2.1.3 Chủng vi sinh vật

Chủng S cerevisiae 4182 do Viện Công nghệ Sinh học & Công nghệ Thực

phẩm, trường Đại học Bách khoa Hà nội cung cấp, sử dụng để lên men ethanol dịch

bã mía sau thủy phân

Cân chính xác 5g bã mía vào cốc nung đã iết trước khối lượng (m1), sấy ở

105oC trong 2÷3h sau đó chuyển vào bình hút ẩm trong 30 phút Cân khối lượng của cốc nung có chứa m u (m2) Lặp lại cho đến khi m2 không đổi

Độ ẩm W (%) của ã mía được tính theo công thức :

100 ) (

) (

0 1

m m

Trong đó:

m0: khối lượng cốc nung (g);

m1: khối lượng cốc và ã mía an đầu (g);

m2: khối lượng cốc và bã mía sau sấy (g)

2.2.2 Xác định hàm lượng cellulose bằng phương pháp Kurshner [1]