Nghiên cứu mức độ nhiễm tạp AFLATOXIN theo chuỗi sản xuất và cung ứng ngô trên địa bàn tỉnh phú thọ

Đảm bảo vệ sinh an toàn thực phẩm cho các loại nông sản là việc kiểm tra cảnh o dư lượng và tìm ra biện ph p ngăn chặn các chất độc hại ô nhiễm trên các loại nông sản đ đồng thời đảm bảo

Đào Thị Hiên

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến GS.TS Hà Duyên Tư và TS Cung Thị Tố Quỳnh đã thu nhận, trực tiếp hướng dẫn, quan tâm tận tình chỉ bảo tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành khóa luận này

Tôi xin cảm ơn các thầy cô giáo, các cán bộ nhân viên của Viện sau đại học, Viện công nghệ sinh học và thực phẩm, Đại học Bách Khoa Hà nội đã giảng dạy và chỉ bảo cho tôi những kiến thức và kỹ năng quý báu trong quá trình học tập hoàn thành chương trình thạc sỹ tại nhà trường

Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô phụ trách, anh chị kỹ thuật viên thuộc Trung tâm đào tạo và phát triển Công nghệ Sinh học - trường Đại học Bách khoa Hà Nội, Phòng thí nghiệm trường Cao đẳng Công nghiệp Thực phẩm Việt Trì đã nhiệt tình giúp đỡ về cơ sở vật chất và chỉ dạy tôi trong quá trình tôi thực hiện phần thí nghiệm của luận văn này

Tôi gửi lời cám ơn chân thành tới anh Lê Thiên Minh cùng các anh chị cán bộ tại viện sau thu hoạch, Viện Công nghiệp Thực phẩm đã giúp đỡ tôi nhiệt tình trong quá trình tôi tiến hành một số thí nghiệm đánh giá tại viện

Lời cuối cùng, tôi gửi lời cảm ơn sâu sắc tới cha mẹ, những người thân trong gia đình tôi và bạn bè đã ủng hộ, tạo điều kiện và chia sẻ khó khăn cùng tôi trong suốt thời gian qua

Xin chân thành cảm ơn!

Tác giả luận văn:

Đào Thị Hiên

Đào Thị Hiên

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

STT Ký hiệu Tên đầy đủ

1 AF Aflatoxin

2 PGA Potato Glucose Agar

3 STH Sau thu hoạch

4 AFPA Aspergillus flavus and parasiticus Agar

5 TLC Thin Layer Chromatography

6 HPLC High Perfomence Liquid Chromatography

7 ELISA Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay

8 DNA Deoxyribonucleotide Acid

9 PCR Polymerase Chain Reaction

10 FDA Food and Drug Aministration

Đào Thị Hiên

DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Các tính chất hóa lý của Aflatoxin 8

Bảng 1.2 Tỷ lệ dân số bị ung thư gan và hàm lượng aflatoxin trung bình có trên thực phẩm 12

Bảng 1.3 Quy định về hàm lượng aflatoxin trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi của FDA (theo Smith và Tara, 2005) 14

Bảng 1.4 Giới hạn aflatoxin ở một số nước theo tiêu chuẩn của FDA 14

Bảng 1.5 Quy định về hàm lượng aflatoxin trong các sản phẩm thực phẩm của Bộ Y tế Việt Nam 15

Bảng 1.6 Quy định về độc tố aflatoxin B1 và aflatoxin tổng số của Việt Nam ( số 104/2001/QĐ/BNN) 16

Bảng 1.7 Các chủng tạo aflatoxin của A flavus và A parasiticus phân lập được 18

Bảng 1.8 Một số loài nấm mốc có khả năng sinh aflatoxin 18

Bảng 1.9 Đặc điểm hình thái của A flavus và A parasiticus 20

Bảng 3.1 Mật độ A.flavus và A.parasiticus trên đất trồng ngô 43

Bảng 3.2 Tỷ lệ nhiễm nấm mốc trên ngô giống được gieo trồng trên địa bàn tỉnh Phú Thọ 45

Bảng 3.3 Tỷ lệ nhiễm nấm mốc trên ngô STH ở Phú Thọ 47

Bảng 3.4 Kết quả kiểm tra aflatoxin trong ngô STH trên địa bàn tỉnh Phú Thọ 49

Bảng 3.5 Mức độ nhiễm aflatoxin trên ngô STH 50

Bảng 3.6 Tỷ lệ nhiễm nấm mốc nghi sinh độc tố afltoxin trên ngô bảo quản 51

Đào Thị Hiên

MỤC LỤC Ở ĐẦU 1

Phần I : TỔNG QU N 3

1.1 Aflatoxin 3

1.1.1 Cấu tạo 3

1.1.2 T nh chất h a l 3

1.1.3 Độc t nh của Aflatoxin 6

1.1.4 Sự chuyển h a aflatoxin trong cơ thể 13

1.2 Nấm mốc c hả năng sinh aflatoxin 14

1.2.1 C c loại nấm mốc c hả năng sinh aflatoxin 14

1.2.2 Đặc điểm h nh th i 16

1.2.3 C c yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng 20

1.2.4 Điều iện sinh độc tố 21

1.3 T nh h nh nghiên cứu về aflatoxin trong và ngoài nước 21

1.3.1 T nh h nh nghiên cứu trong nước 21

1.3.2 T nh h nh nghiên cứu ngoài nước 24

1.4 C c phương ph p ph n t ch Aflatoxin 25

1.4.1 Phương ph p s c ản m ng T C 25

Đào Thị Hiên

1.4.2 Phương ph p s c l ng hiệu năng cao HP C 26

Phần II : VẬT ỆU VÀ P ƢƠNG P P NG N CỨU 32

2.1 Vật liệu 32

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 32

2.1.2 Thiết ị và h a chất 32

2.1.3 C c môi trường 33

2.2 Phương ph p nghiên cứu 35

2.2.1 Phương ph p thu thập mẫu 35

2.2.2 Phương ph p x c định hàm ẩm trong ngô 36

2.2.3 Phương ph p x c định mức độ nhiễm mốc 36

2.2.4 Phương ph p x c định aflatoxin 37

2.2.5 Phương ph p ph n loại nấm mốc 39

2.2.6 Phương ph p xử lý số liệu 39

Phần III : ẾT QUẢ VÀ T ẢO UẬN 40

3.1 Nghiên cứu mật độ các loài Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticus sinh aflatoxin trong đất trồng ngô 40

3.2 Nghiên cứu mức độ nhiễm tạp nấm mốc và aflatoxin trên ngô giống 42

3.3 Nghiên cứu mức độ nhiễm nấm mốc và aflatoxin ở ngô sau thu hoạch trên địa bàn tỉnh Phú Thọ 44

Đào Thị Hiên

3.4 Nghiên cứu mức độ nhiễm nấm mốc và aflatoxin trên ngô bảo quản sau thu hoạch 48

Phần IV : ẾT UẬN VÀ ẾN NG Ị 50

TÀ ỆU T ẢO 51

P Ụ ỤC 54

Đào Thị Hiên 1

Ở ĐẦU

An toàn vệ sinh thực phẩm là vấn đề hiện nay đang được cả thế giới quan tâm ương thực, đặc biệt là các loại nông sản như th c gạo, ngô, khoai, s n, cây có dầu…

là nguồn nguyên liệu nuôi sống loài người, là nguyên liệu ch nh để sản xuất thực phẩm

và thức ăn gia súc Đảm bảo vệ sinh an toàn thực phẩm cho các loại nông sản là việc kiểm tra cảnh o dư lượng và tìm ra biện ph p ngăn chặn các chất độc hại ô nhiễm trên các loại nông sản đ đồng thời đảm bảo an toàn trong quá trình chế biến Chính vì vậy việc nghiên cứu chuyên s u để góp phần nâng cao chất lượng dinh dưỡng đồng thời đảm bảo vệ sinh an toàn thực phẩm cho các loại c y lương thực ngày càng được chú trọng

Việt Nam là nước nhiệt đới có khí hậu nóng ẩm, gi mùa, là điều kiện thuận lợi cho vi sinh vật đặc biệt là nấm mốc phát triển Hoạt động hết sức mạnh mẽ của các loài sinh vật có hại đã g y nên tổn thất lớn cho nông sản trước và sau thu hoạch, trong đ tổn thất do nấm mốc gây nên chiếm một phần đ ng ể Ngoài việc gây tổn thất về chất lượng cảm quan, chất lượng dinh dưỡng, tổn thất khối lượng, nấm mốc còn sinh ra các độc tố có tính chất nguy hiểm đến sức kh e con người, động vật và ảnh hưởng tới nền kinh tế Nấm mốc phát triển trên lương thực thực phẩm sử dụng các chất dinh dưỡng của hạt protein, glucid, lipit và c c vitamin đồng thời tiết ra độc tố Độc tố Aflatoxin do

nấm mốc Aspergillus flavus, Aspergillus parasiticus tạo ra là độc tố nguy hiểm nhất và

thường nhiễm trên nông sản g y độc cho người và gia súc, biểu hiện cấp tính, mãn tính gây tổn thương gan (u xơ, ung thư gan ), g y qu i thai, g y đột biến thậm chí có thể dẫn đến tử vong với liều lượng cao

Trên thế giới hiện nay việc nghiên cứu mức độ nhiễm nấm mốc và độc tố nấm trên lương thực, thực phẩm là vấn đề quan trọng nhằm bảo vệ sức khoẻ con người và

c c động vật kinh tế Do vậy, đã c rất nhiều công trình nghiên cứu về mức độ nhiễm

Đào Thị Hiên 2

nấm mốc và c c độc tố vi nấm, các biện pháp phòng trừ độc tố mốc trên lương thực, thực phẩm Giới hạn về mức nhiễm aflatoxin đã là một trong những tiêu chuẩn về an toàn vệ sinh thực phẩm

Ở nước ta hiện nay đã c một số tác giả nghiên cứu về vấn đề nhiễm nấm mốc trên một số loại lương thực bảo quản như Nguyễn Phùng Tiến và cộng sự (1970) đã nghiên cứu mức nhiễm nấm mốc trên thóc ở kho bảo quản lương thực miền B c Việt Nam và một số lương thực như: Đậu, đỗ, lạc…,Đặng Hồng Miên cũng đã nghiên cứu

sự nhiễm nấm mốc và Aflatoxin trên lạc, Nguyễn Thuỳ Châu và cộng sự (1996) đã nghiên cứu tình hình nhiễm độc tố nấm mốc như Aflatoxin, fumonixin, Ochotoxin A, deoxynivalenol và nivalenol…và c c iện pháp phòng trừ Kết quả nghiên cứu cho thấy lương thực của nước ta đã nhiễm nhiều loại mycotoxin trong đ Aflatoxin ị nhiễm ở hàm lượng khá cao Tuy nhiên việc nghiên cứu về mycotoxin mới chỉ ra được tình trạng nhiễm độc tố vi nấm ở một số vùng, miền mà chưa chỉ rõ nguồn gốc, nguyên

nh n và con đường nhiễm tạp c c độc tố vi nấm vào lương thực, thực phẩm Đứng trước thực trạng đ việc nghiên cứu sự nhiễm tạp nấm mốc theo chuỗi góp phần tìm ra nguyên nh n, con đường nhiễm tạp để đưa ra iện pháp phòng trừ đảm bảo an toàn vệ sinh cho lương thực là một vấn đề mang tính cấp thiết

Xuất phát từ thực tế chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài “Nghiên cứu mức độ

nhiễm tạp aflatoxin theo chuỗi sản xuất và cung ứng ngô trên địa bàn tỉnh Phú Thọ”

với các mục tiêu sau:

+ X c định được tình trạng nhiễm nấm mốc và sự nhiễm tạp aflatoxin trên ngô

giống và đất trồng ngô ở Phú Thọ

+ Đ nh gi sự nhiễm tạp aflatoxin trên ngô sau thu hoạch và trong thời gian bảo quản ở địa phương

Đào Thị Hiên 3

Phần TỔNG QU N 1.1 Aflatoxin

Aflatoxin là nh m độc tố nấm mốc được tạo bởi hai loài nấm mốc Aspergillus

flavus, Aspergillus parasiticus và một số nấm h c Người ta phát hiện và xác nhận 16

loại Aflatoxin h c nhau như AFG1, AFG2 AFB1, AFB2, AFM1, AFM2… trong đ AFB1 c độc tính mạnh nhất, các loại h c đều là sản phẩm chuyển hóa từ AFB1

1.1.1 u t o

Aflatoxin c nhiều loại và c c c iểu cấu trúc h c nhau, trong đ đặc iệt chú đến c c aflatoxin B1, B2, G1, G2 Đ là 4 loại aflatoxin xuất hiện phổ iến trong tự nhiên và trong môi trường nuôi cấy Aflatoxin G1 và G2 tương ứng là dẫn xuất dihydroxyl của aflatoxin B1 và B2 Trong sữa aflatoxin B1 và B2 chuyển h a thành aflatoxin M1 và M2 Aflatoxin B1 là độc tố nguy hiểm nhất trong c c loại aflatoxin, chỉ với một lượng nh (0,03 ppm) aflatoxin trong hô lạc c thể g y ra u gan, tiếp theo là

G1, trong hi đ B2 và G2 tồn tại ở nồng độ thấp hơn[14] Về mặt cấu tạo c thể coi aflatoxin B1 là hợp chất m , Aflatoxin M1 và M2 là c c chất trao đổi hydroxylat h a của B1 và B2, theo thứ tự chúng c công thức cấu tạo như h nh 1.1

1.1.2 T h h t h

Aflatoxin là tinh thể màu tr ng, có khả năng ph t quang mạnh khi ở dưới ánh sáng cực t m (λ = 360 nm) Dựa vào tính chất này cho phép phát hiện các hợp chất aflatoxin ở nồng độ rất thấp (0,5 ng hay thấp hơn trên một vết của s c ký bản m ng), là

cơ sở để ph n t ch định t nh và định lượng aflatoxin bằng phương ph p hóa lý

Aflatoxin hòa tan tốt trong các dung môi phân cực nh như chloroform và methanol, đặc biệt là dimetyl sulfoxit là dung môi được sử dụng như phương tiện trong việc đưa aflatoxin vào cơ thể động vật Độ h a tan trong nước dao động từ 10 ÷ 20

Đào Thị Hiên 4

mg/l [1]

nh 1 1 C n thứ ấu t o ủ to n

Đào Thị Hiên 5

Bảng 1.1 Các tính chất hóa lý của Aflatoxin Aflatoxin

Công thức phân tử

Trọn ƣợng phân tử

LD50 (µg/50g trọng ƣợng ơ thể vịt) Huỳnh quang

AFB1 C17H12O6 312 18,2 Xanh da trời AFB2 C17H14O6 314 84,4 Xanh da trời AFG1 C17H12O7 328 39,2 Xanh lá cây AFG2 C17H14O7 330 172,5 Xanh lá cây AFM1 C17H12O7 328 16,6 Xanh tím AFM2 C17H14O7 330 62,0 Xanh tím

Các aflatoxin rất bền ở nhiệt độ cao, không bị phân hủy hi đun n ng thông thường mà chỉ có thể bị phân hủy khi hấp ở 1200

C trong 30 phút Do đ n vẫn có thể tồn tại trong thực phẩm khi nấm mốc đã ị tiêu diệt bởi xử lý nhiệt Tuy nhiên hi để trong môi trường không khí đặc biệt là có tia tử ngoại aflatoxin lại tương đối không bền

Aflatoxin bền vững trong các dung môi chloroform và benzene khi giữ ở điều kiện tối và nhiệt độ thấp C c aflatoxin cũng c thể bị phá hủy hoàn toàn bằng việc xử

lý mạnh bởi ammoniac hoặc hypoclorit

Sự có mặt của vòng lacton trong phân tử aflatoxin làm chúng nhạy cảm với việc thủy ph n trong môi trường kiềm, đặc tính này rất quan trọng trong chế biến thực phẩm

vì xử lý kiềm làm giảm sự nhiễm aflatoxin trong các sản phẩm thực phẩm Tuy nhiên nếu sau quá trình sử lý kiềm mà có sự axit hóa sẽ làm phản ứng ngược trở lại để tạo

AFB1 và các sản phẩm chuyển hóa của n được bài tiết qua 3 con đường chính

là qua mật, nước tiểu và sữa (sản phẩm của AF B1qua sữa là AF M1) Người ta đã x c định có sự tương quan tuyến tính giữa AF B1 ăn vào và lượng AF M1 trong sữa ượng

AF M1 trong sữa ước tính khoảng 1% lượng AF B1 ăn vào

1.1.3 Đ t h to i

Trong tất cả các loại độc tố nấm mốc th aflatoxin là độc tố nguy hiểm nhất, nồng

độ giới hạn được WHO quy định được có trong thực phẩm là 5ppb Các kết quả thí nghiệm cho thấy aflatoxin liên kết với DNA trong nhân tế bào (một phân tử gam aflatoxin có mối liên kết với 600 phân tử gam DNA) gây ức chế enzyme polymerase của RNA Mặt khác, tác dụng hạn chế trong tổng hợp RNA và tác dụng ức chế polymerase t-RNA là các nguyên nhân làm giảm sút tổng hợp protein trong tế bào Người ta cũng chứng minh rằng v ng α, β-lacton không bão hòa có trong phân tử aflatoxin làm cho hoạt chất này có hoạt t nh g y ung thư và cũng ch nh v ng lacton này gây ức chế tổng hợp DNA nhân tế ào, do đ làm rối loạn sự tăng trưởng nh thường của tế bào [6]

Aflatoxin là các chất có khả năng g y ung thư, g y đột biến gen, là tác nhân làm giảm khả năng miễn dịch Con người có thể bị nhiễm aflatoxin do ăn phải các loại ngũ cốc bị ô nhiễm hoặc ăn thịt c c động vật được nuôi bằng ngũ cốc bị nhiễm aflatoxin Các nghiên cứu ở những vùng có tỷ lệ ung thư cao trên thế giới đều cho thấy nhiễm độc aflatoxin là nguy cơ ch nh g y ung thư gan [14]

Đào Thị Hiên 7

Do cấu trúc hóa học có vòng dihydro-fural nên aflatoxin B1 liên kết với một số enzym làm cản trở trao đổi chất dẫn đến tử vong Ngoài ra, aflatoxin B1 c n tương t c đồng hóa trị với vật chất di truyền (DNA, RNA) làm rối loạn cấu trúc di truyền dẫn đến tổn thương gan và ung thư gan

Cho đến nay, các luận chứng khoa học công nhận khả năng t c động lên tế bào gan của aflatoxin qua 5 giai đoạn sau[14]:

+ ức chế enzym polymerase mà chúng có vai trò tổng hợp DNA và RNA

+ Làm chậm hoặc ngừng hẳn sự tổng hợp DNA

+ Ngăn cản cở thể sinh tổng hợp RNA truyền tin

+ Biến đổi hình dạng nhân tế bào

+ Hạn chế quá trình sinh tổng hợp protein

Hậu quả là g y ung thư iểu mô ở tế bào gan

Aflatoxin làm thiệt hại kinh tế cho ngành trồng trọt ngũ cốc và ngành chăn nuôi rất lớn do nó làm giảm tỷ lệ sống, giảm sự sinh trưởng, sức sản xuất của động vật như trứng, sữa; đặc biệt aflatoxin còn tích tụ trọng gan, trứng, sữa gây nguy hiểm cho sức

kh e của người tiêu dùng Độc tính của aflatoxin trên động vật thí nghiệm gây một loạt các triệu chứng cấp tính và mãn tính Nhiễm độc cấp thường biểu hiện bằng cái chết của động vật thí nghiệm với triệu chứng là hoại tử nhu mô gan, chảy máu gan và viêm cầu thận cấp Nhiễm độc mãn t nh thường biểu hiện bằng ăn ém ngon, chậm lớn, gan

tụ máu, chảy máu và hoại tử nhu mô Loại mãn t nh t c động tới yếu tố di truyền tương ứng với 3 kiểu là g y ung thư, g y qu i thai và g y đột biến

+ Khả năng g y ung thư của aflatoxin: được Wogan nghiên cứu và được IARC

đ nh gi Ở mức độ tế bào, việc cho uống aflatoxin với liều lượng h c nhau đã nhanh chóng ức chế rõ ràng enzym DNA và RNA polymerase ở gan, c c đ p ứng tương tự đã được quan sát ở việc nuôi cấy tế ào và động vật Quá trình sinh tổng hợp chịu ảnh hưởng mạnh bằng sự biến đổi ở quá trình sinh tổn hợp ARN thông tin Các u gan và thận: khi cho các aflatoxin uống qua

Trên người, một loạt các nghiên cứu cho thấy tỷ lệ m c ung thư gan nguyên ph t tăng ở các vùng có tỷ lệ phơi nhiễm cao với aflatoxin , nhưng cơ chế t c động của aflatoxin g y ung thư gan ở người như thế nào vẫn còn nhiều tranh cãi, tuy nhiên đã tìm thây sự g n kết của aflatoxin B1 với DNA của tế bào gan của các bệnh nhân ung thư gan nguyên ph t, phức hợp này cong t m được trong máu ngoại vi, máu nhau thai

và máu dây rốn của các sản phụ c phơi nhiễm với aflatoxin B1 Bên cạnh đ c n c sự liên quan giữa phơi nhiễm aflatoxin B1 với sự đột biến gen ở các bệnh nhân này, mà nhiều nhất là sự đột biến gen p53 – một gen kiểm soát sự chết tế ào theo chương tr nh,

hi đột biến gen này sẽ làm đời sống tế ào tăng lên éo theo nguy cơ tế bào sẽ chuyển thành ác tính

Như vậy aflatoxin có khả năng g y độc cấp tính và mãn tính ở các loài động vật

và con người Độc tính nguy hiểm nhất là khả năng g y xơ gan và ung thư gan nguyên phát Một loạt các nghiên cứu cũng cho thấy sự phơi nhiễm aflatoxin tăng lên liên quan đến sự gia tăng m c bệnh ung thư gan nguyên ph t trên người Do vậy vấn đề bảo quản lương thực thực phẩm, an toàn lương thực thực phẩm, không sử dụng các thực phẩm đã

bị h ng, bị nhiễm nấm mốc là một vấn đề hết sức quan trọng và c nghĩa trong việc hạn chế tần suất xuất hiện bệnh ung thư nguyên ph t

Các số liệu nghiên cứu ở c c vùng ung thư h c nhau ở c c nước khác nhau trên thế giới cho thấy nồng độ aflatoxin thực tế

Đào Thị Hiên 9

ở thức ăn đã liên quan tới tai biến ung thư gan ở c c vùng đ Tỷ lệ này dao động từ 3,5 ÷ 22,1 µg/kg trọng lượng cơ thể trong 1 ngày và gây tai biến ung thư dao động từ 1,2 † 13 người trên 100.000 d n trong 1 năm Bệnh aflatoxin cấp t nh t được thông báo, có lẽ v hông được thường xuyên theo dõi Có thể kể đến trường hợp ba trẻ em ở Đài oan và một trẻ em ở Uganda bị hoại tử gan cấp tính liên quan tới việc ăn phải gạo

và s n nhiễm aflatoxin ở liệu 200 µg/kg và 1700 µg/kg là bằng chứng có tính thuyết phục nhất về sự liên quan giữa aflatoxin với bệnh gan cấp tính Ở vùng Tây b c Ấn độ năm 1994, trong một vụ dịch, hàng trăm d n làng ăn ngô ị nhiễm aflatoxin ở mức 15 µg/kg có dấu hiệu bị ngộ độc và trên 100 người chết [14]

Bảng 1.2 Tỷ lệ dân số bị un thư n và hàm ượng aflatoxin trung bình có

trên thực phẩm Tên nước hoặc vùng àm ượng

aflatoxin trong thực phẩm (ppm)

Tỷ lệ n ười mắc ung thư n trên 10 5

n ườ /năm

Vùng cao Kenya

Songkha (Thái Lan)

Thảo nguyên vùng cao (Thụy Sỹ)

Vùng cao trung bình Kenya

Thảo nguyên cao trung bình Thụy Sỹ

Vùng thấp Kenya

Thảo nguyên vùng thấp Thụy Sỹ

Môzăm ic

0,1 0,2 0,2 0,2 0,3 0,3 1,5 7,8

1,2 2,0 2,2 2,5 3,8 4,0 9,2 10,0

n t c động vào thận gây viêm thận, nếu kéo dài có thể g y ung thư, t c động vào hệ tuần hoàn gây xuất huyết mãn t nh, ngưng ết hồng cầu, giảm lượng kháng thể… Theo một số nghiên cứu của gi o sư Sheryl Tsai đến từ trường Đại học UCI (University of California Irvine) cho thấy: tại những nơi như Trung Quốc, Việt Nam và Nam Phi, sự kết hợp của aflatoxin và bệnh viêm gan B đã làm tăng nguy cơ ung thư gan lên gấp 60 lần, độc tố này cũng là một trong những nguyên nh n g y ung thư, chiếm 10% tỷ lệ tử vong tại các quốc gia này

Với mức độ ảnh hưởng nghiêm trọng của độc tố aflatoxin đến sức kh e con người, rất nhiều quốc gia trên thế giới đã phải đưa ra c c quy định về nồng độ giới hạn aflatoxin được phép có mặt trong thực phẩm Cục quản lý thực phẩm và dược phẩm Hoa Kỳ FDA đã đưa ra mức khuyến cáo về hàm lượng aflatoxin trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi nhằm bảo vệ sức kh e người tiêu dùng và sức kh e động vật Khuyến c o này được trình bày trong bảng 1.3 và bảng 1.4 như sau:

Đào Thị Hiên 11

Bảng 1.3 Quy định về hàm ượng aflatoxin trong thực phẩm và thứ ăn hăn nu

của FDA (theo Smith và Tara, 2005) Tiêu chí àm ượng (ppb)

Đối với ngô và các loại hạt dùng cho vật nuôi chưa trưởng thành

(kể cả gia cầm chưa trưởng thành) và các vật nuôi cho sữa hoặc

dùng cho các mục đ ch h c hông được công bố và đối với

thức ăn chăn nuôi ngoài trừ ngô và bột từ hạt bông

20

Đối với ngô và các loại hạt dùng cho giống nuôi (bò, lợn) hoặc

gia cầm đã trưởng thành

100

Đối với ngô và các loại hạt dùng cho lợn từ 100 pound trở lên 200

Đối với ngô và các loại hạt dùng cho bò giai đoạn cuối (vỗ béo)

và đối với bột hat bông dùng cho lợn, bò và gia cầm

300

Bảng 1.4 Giới h n aflatoxin ở một số nước theo tiêu chuẩn của FDA

Nước Lo i thứ ăn

Giới h n Aflatoxin tố đ cho phép (ppb)

Mỹ

Bột ngô sử dụng làm thức ăn cho gia súc, gia cầm ở tất cả c c giai đoạn khác nhau 20 Thức ăn cho gia súc, gia cầm hoặc trong nguyên

Châu Âu Thực phẩm sử dụng cho người 5

(Nguồn: Bộ Nông nghiệp Hoa Kỳ)

Ở Việt Nam, “Quy đinh giới hạn tối đa ô nhiễm sinh học và hóa học trong thực phẩm” an hành èm theo quyết định số 46/2007/QĐ – BYT ngày 19 th ng 12 năm

2007 của Bộ Y tế đã quy định về hàm lượng aflatoxin đươc phép c mặt trong các sản phẩm thực phẩm được trình bày trong bảng 1.5 như sau:

Bảng 1.5 Quy định về hàm ƣợng aflatoxin trong các sản phẩm thực phẩm

của Bộ Y tế Việt Nam Tiêu chí Giới h n tố đ , µg/kg

Đối với aflatoxin B1 trong thực phẩm nói chung 5

Đối với aflatoxin B1, B2, G1, G2 trong thực phẩm nói chung 15

Đào Thị Hiên 13

Đối với aflatoxin M1 trong sữa và các sản phẩm từ sữa 0,5

Bộ Nông nghiệp và phát triển nông thôn cũng đưa ra quy định về hàm lượng tối

đa aflatoxin B1 và hàm lượng tổng số các aflatoxin (B1 +B2 + G1 + G2) được tính bằng

µg trong 1 kg thức ăn hỗn hợp hoàn chỉnh cho gia súc, gia cầm[13]

Bản 1 6 Quy định về độc tố aflatoxin B1 và aflatoxin tổng số của Việt Nam ( số

Sau những nghiên cứu rộng rãi trên chuột, cá hồi, aflatoxin đặc biệt là aflatoxin

B1 được khẳng định như một tác nhân chuyển h a g y ung thư Sự chuyển hóa của aflatoxin đ ng vai tr quyết định tới mức độ gây độc tính của aflatoxin Sau hi ăn vào bụng, aflatoxin được chuyển hóa bởi nh m enzym Cytochrome P450 trong gan, nơi chúng được chuyển hóa thành những sản phẩm như aflatoxicol, aflatoxin Q1, aflatoxin

Đào Thị Hiên 14

P1 và aflatoxin M1 Cùng với những sản phẩm như trên aflatoxin 8,9 epoxide cũng được h nh thành Hàm lượng sản phẩm chuyển hóa này tùy thuộc vào độ nhạy cảm của DNA và vật chủ bằng cách xen vào DNA, hình thành liên kết với guanine của DNA

Sự xen giữa này của epoxide gây ra sự chuyển vị trí giữa G và T ở codon 249 của gen p53 trong gan dẫn đến ung thư Điều này quan sát thây ở hầu hết các mẫu thí nghiệm

và điều đ cũng chỉ ra nguyên nhân chính dẫn đến ung thư của aflatoxin Khả năng ung thư tùy thuộc vào khả năng hử độc của gan, yếu tố di truyền, độ tuổi và một số yếu tố dinh dưỡng[14]

Hình 1.2 Cá đườn hướng chuyển hóa chính của aflatoxin B 1 tron ơ thể

(Nguồn: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1872085407020073)

1.2 Nấm mố hả năn s nh to n

1.2.1 o i h ă g si h to i

Nấm mốc sinh độc tố aflatoxin chủ yếu thuộc chi Aspergillus Chi Aspergillus

phân bố rộng rãi trên kh p tr i đất có thể có lợi hoặc có hại tùy theo cơ chất chúng sử

Đào Thị Hiên 15

dụng Trong đ người ta nhận thấy A flavus và A parasiticus có mối quan hệ chặt chẽ

về mặt cấu trúc gen và là hai loài có khả năng sinh độc tố aflatoxin mạnh nhất Việc

x c định các loại sinh aflatoxin hiện tại dựa vào đặc điểm hình thái, vào loại mycotoxin sản sinh ra hoặc dựa vào trình tự DNA (Ito và cộng sự, 2000)

Các chủng sinh aflatoxin của A flavus và A parasiticus là rất phổ biến và

thường được phân lập ở các nguyên liệu khác nhau Bảng 1.5 cho thấy các chủng phân

lập của A.flavus có khả năng tạo aflatoxin chiếm tỷ lệ cao

Bảng 1.7 Các chủng t o aflatoxin của A flavus và A parasiticus

phân lập đƣợc

Nguồn Các chủng

phân lập

Các chủng t o aflatoxin, %

Nồn độ AF cự đ i trong sản phẩm, µg/kg

(Nguồn: Schroder và Boller, 1976)

Ngoài hai loài A flavus và A parasiticus còn có một số loài khác có khả năng

sinh một số aflatoxin nhưng yếu hơn được trình bày trong bảng 1.8

Bảng 1.8 Một số loài nấm mốc có khả năn sinh aflatoxin

Loài Nhóm Aflatoxin

A flavus (Samson 2001, Varga et al, 2003) B

Đào Thị Hiên 16

A nomisnus (Samson 2001, Varga et al, 2003) B,G

A parasiticus (Samson 2001, Varga et al, 2003) B,G

1.2.2 Đ iể h h th i

A flavus và A parasiticus đều thuộc họ nấm cúc có khả năng sinh độc tố

aflatoxin trong môi trường tự nhiêm và môi trường nuôi cấy

1.2.2.1 A flavus

A flavus phân bố ở kh p nơi trên tr i đất: dưới đất, trên các nông sản thực phẩm

đặc biệt là trên lạc và các sản phẩm từ lạc là nơi ph t triển ưa th ch của chúng Ngoài ra chúng còn thấy nhiều trên sợi bông, nhất là trên hạt bông và khô hạt bông, thức ăn gia súc, dăm ông, dồi thịt và nhiều thức ăn h c

A flavus xâm nhập vào thực phẩm qua c c điểm tiếp hợp nhờ những chỗ côn

trùng hủy hoại gây ra Tuy nhiên ở cây lạc tươi A flavus khó xâm nhập hơn v vậy mà chúng xâm nhậ khi củ lạc đã già, nhất là sau khi thu hoạch A flavus xâm nhập vào hạt

lạc chứa 15 † 20% nước, tức là vào thời điểm đầu của việc làm khô

Hình 1.3 Đặ đ ểm hình thái của Aspergillus flavus

A flavus có màu vàng lục hay xanh lục của đ m ào tử khi chín trên mầm của

hạt, trên môi trường nuôi cấy nhân tạo (Czapeck hay thạch Sabouraud) hình thái khuẩn lạc sau 24 giờ nuôi cấy có màu vàng nhạt ở trung tâm rìa mép bờ có màu tr ng mịn, sau 48 giờ hình thành bào tử trung tâm rìa

Đào Thị Hiên 17

mép bờ có màu tr ng mịn xuất hiện các khối bào tử chín màu vàng nhạt chuyển sang màu vàng, sau 72 ÷ 96 giờ khuẩn lạc phát triển cực đại, tới 6 ÷ 7 ngày sau nuôi cấy ở nhiệt độ phòng, lúc này đường kính bằng 4 † 5 cm, h nh thành v ng tr n đồng t m đều đặn từ các bào tử, thường có 5 ÷ 6 vòng tròn màu xanh lục trên bề mặt khuẩn lạc

A flavus có khả năng sinh c c loại độc tố AFB1, AFB2 và axit cyclopyazoic (CPA)

1.2.2.2 A parasiticus

Hình 1.4 Đặ đ ểm hình thái của Aspergillus parasiticus

A parasiticus c đặc điểm h nh th i tương tự như A flavus nhưng ào tử của A parasiticus thường c màu xanh đậm, có khả năng sinh AFB1, AFB2, AFG1, AFG2nhưng hông c hả năng sinh axit cyclopyazoic

Mặc dù có sự tương đồng khá lớn về đặc điểm hình thái nhưng người ta vẫn tìm được một số khác biệt nh giữa , sự khác biệt giữa hai loại này có thể tóm t t ở bảng 1.7 [6]

Bảng 1.9 Đặ đ ểm hình thái của A flavus và A parasiticus

Đặ đ ểm A flavus A parasiticus

Có hoặc không

6 ÷ 8

Dạng len, xốp nh Lục vàng, xanh lục Kem, nâu nhạt Không

Theo kết quả nghiên cứu không phải tất cả các loại A flavus đều có khả năng

sinh aflatoxin nhưng phần lớn các chủng A parasiticus phân lập được đều sinh tổng hợp aflatoxin Ở Pháp 25% số chủng A flavus phân lập được từ lương thực, thực phẩm

và thức ăn gia súc tạo thành aflatoxin Các chủng của loài A flavus tạo thành aflatoxin

trên lạc chiếm 96%, ở hạt bông chiếm 78%, ở lúa mạch chiếm 49% và ở gạo chiếm 35% [10]

Các chủng gốc vùng nhiệt đới có nhiều loài sinh độc tố hơn so với các chủng vùng ôn đới Một số ý kiến cho rằng các chủng sinh độc tố bao giờ cũng c đầu bào tử

đ nh màu xanh lục, ngay cả ở các giống nuôi cấy lâu ngày, có thể bình 2 lớp, cuống bào tử đ nh c v ch, c gai, những chủng sinh độc tố có sự phình to một phần sợi trên sợi nấm tạo thành những m t nh [10] Tuy nhiên chỉ dựa vào đặc điểm hình thái sẽ rất

Đào Thị Hiên 20

h để x c định chính xác những chủng sinh hay không sinh aflatoxin

1.2.3 u t h h g sự si h tr g

Nhiệt độ

A flavus và A parasiticus là loại nấm mốc ưa nhiệt có thể sinh trưởng và phát

triển ở dải nhiệt độ từ 20 ÷ 600C, t0opt 25 ÷ 350C, nhiệt độ dưới 120C A flavus không

phát triển được hoặc phát triển rất yếu [10]

Độ ẩm

A flavus và A parasiticus phát triển tối ưu ở độ ẩm 80 ÷ 85% Chúng phát triển

tốt trên các loại cơ chất có dầu như c c loại nông sản như lạc, ngô, gạo, bông Hàm

lượng nước trong cơ chất thích hợp cho sự phát triển của A flavus và A parasiticus là

từ 15 ÷ 30% Ở hàm lượng nước cao hơn hoặc thấp hơn đều ức chế sự phát triển của chúng[10]

Độ pH

A flavus và A parasiticus có thể phát triển ở khoảng pH khá rộng (pH = 2 ÷ 8)

tùy thuộc vào loài Tuy nhiên pH tối ưu cho sự phát triển của chúng là 4,5 ÷ 6,5 [10]

Nguồn ơ hất

A flavus và A parasiticus có các enzym thủy phân tinh bột, nhưng nguồn

hydrocacbon thích hợp nhất cho sự sinh trưởng và phát triển của các loại nấm này là glucose và saccharose Môi trường Czapeck – Dox có nguồn thức ăn cac on dưới dạng

saccharose, thường được sử dụng làm môi trường nuôi cấy và phân loại của A flavus

và A parasiticus

A flavus và A parasiticus đều có khả năng đồng hóa các loại muối amon và

nitrat Cũng c nhiều loại vi nấm không phát triển được trên môi trường chứa muối amôn, do hi cơ thể đồng hóa NH4

+

trong môi trường sẽ t ch lũy c c ion SO42-, HPO4

2-và Cl-… làm hạ thấp pH của môi trường Khi cơ thể đồng hóa NO3

môi trường sẽ tích lũy c c cation K+

, Na+… do đ làm tăng pH môi trường Với A flavus và A

parasiticus cả hai loài này đều đồng hóa

cũng rất cần thiết cho sự phát triển của A flavus và A parasiticus

Ngoài ra c c vitamin nh m B cũng c t c dụng kích thích sự tạo thành các aflatoxin Tuy nhiên riboflavin và piridoxin thì không có tác dụng nhiều Người ta đã

x c định được khi A flavus phát triển trên hạt lúa mỳ th hàm lượng aflatoxin tạo ra ở

giai đoạn phôi mầm nhiều hơn hẳn ở giai đoạn phôi nhũ Việc thêm nước chiết từ mầm lúa mỳ, lipit hay các axit béo sẽ kích thích tốt sự h nh thành aflatoxin Điều này khiến người ta nghĩ rằng các chất này có vai trò quan trọng trong việc sinh tổng hợp aflatoxin

vì sự phân hủy của chúng tạo thành các chất trao đổi tham gia vào vòng chuyển hóa sinh tổng hợp aflatoxin [10]

1.3 T nh h nh n h ên ứu về a to n tron và n oà nướ

1.3.1 T h h h ghi u tro g

Đào Thị Hiên 22

Nguyễn Thùy Châu và cộng sự (1996) đã nghiên cứu thấy mức độ nhiễm aflatoxin trên ngô miền Nam và miền B c Việt Nam là tương đối cao, từ 73,3% đến 95,8% trong đ hàm lượng aflatoxin trung bình cao nhất là 63,8ppb và thấp nhất là 16,25 pp đối với các tỉnh khác nhau [1 ]

Đậu Ngọc Hào và cộng sự (1991) x c định tỷ lệ nhiễm aflatoxin B1 trong 168 mẫu nguyên liệu sản xuất thức ăn chăn nuôi, tỷ lệ nhiễm trên ngô hạt là 33%, ngô bột

là 74,2%, khô lạc là 84,7% [7]

Viên Y tế cộng đồng Thành phố Hồ Chí Minh nghiên cứu cho thấy gần 95% thức ăn gia súc c chứa aflatoxin, các thực phẩm sử dụng cho con người cũng c chứa loại độc tố này Kết quả thể hiện ở 68% mẫu lạc và các sản phẩm từ lạc bị nhiễm

Nguyễn Thùy Châu, Nguyễn Hòa Bình, Nguyễn Minh Tâm phân tích 35 mẫu gạo miền B c và miền Nam năm 1987 – 1998 (gạo bảo quản trong thời gian 3 ÷ 6 tháng) cho thấy không có mẫu nào phát hiện thấy có mặt của aflatoxin B1 Giới hạn phát hiện của phương ph p là 0,5 † 1 ppb [3]

Nguyễn Thùy Châu và cộng sự (1994) phân tích mức độ nhiễm aflatoxin trên 18 mẫu ngô bột của Hà Nội, Hà B c, Sơn a, Hà T y trong đ c 14 mẫu nhiễm aflatoxin chiếm 82,3% tổng số mẫu ph n t ch Hàm lượng aflatoxin dao động từ 16,25 pp đến 44,8 pp , trong đ ngô ột ở Hà Tây có mức độ nhiễm aflatoxin cao nhất [4]

Đỗ Thị Tính (1998) nghiên cứu thấy hàm lượng aflatoxin B1 trong nước tiểu của bệnh nh n ung thư gan là 26,9% với nồng độ dao động từ 0,04 0,12pb, có 1/3 trường hợp tìm thấy trong dịch cổ trướng là 0,75ppb [12]

Bùi Thị Thanh Hà và cộng sự (2000) phân tích 5 mẫu tổ chức gan nh thường thì không phát hiện aflatoxin và 17 mẫu gan của bệnh nh n ung thư gan cho thấy 15 mẫu có aflatoxin B1 (88,2%) với nồng độ dao động từ 0,12 † 3,1 pp cao hơn trong nước tiểu 10 ÷ 25 lần Việc không tìm thấy aflatoxin B1 trong tổ chức gan nh thường

và tìm thấy sự có mặt của aflatoxin B1 trong mẫu gan bệnh phẩm ung thư gan cao hơn hẳn trong nước tiểu c nghĩa trong việc

Đào Thị Hiên 23

khẳng định mối quan hệ giữa aflatoxin và ung thư gan [8]

Lê Thị Ngọc Diệp (2003) nghiên cứu sử dụng actiso để hạn chế tác hại của aflatoxin trong thức ăn chăn nuôi đối với gà thịt nuôi công nghiệp dưới dạng bột với liều 0,25 và 0,5% có tác dụng hạn chế tác hại của độc tố nấm mốc aflatoxin mức 100pp đến 300ppb Bổ sung 0,5% actiso bột có tác dụng đối với mức nhiễm 500ppb aflatoxin B1 Gà ăn thức ăn ị nhiễm aflatoxin B1 ở mức 100ppb hoặc 300ppb, nếu được bổ sung actiso bột với tỷ lệ 0,25% hoặc 0,5% có tốc độ sinh trưởng và hiệu quả

sử dụng thức ăn tốt, nuôi tới 49 ngày tuổi vẫn có các chỉ tiêu sinh lý, sinh hóa bình thường, không có bệnh tích nhiễm độc và không có tồn dư aflatoxin B1 trong cơ và gan[5]

Nguyễn Thùy Châu, Nguyễn Thị Hồng Hà (2002) nghiên cứu khả năng diệt

nấm mốc A.flavus và ức chế aflatoxin của chất diệt nấm sinh học Iturin A trên ngô, đậu

tương, đậu đen, đậu xanh và cà phê Kết quả cho thấy Inturin A hoàn toàn có khả năng ứng dụng để phòng trừ nấm mốc và độc tố nấm mốc trên nông sản trong quá trình bảo quản đồng thời nó mở ra khả năng ứng dụng hoạt chất này vào việc phòng chống nấm mốc và độc tố nấm mốc bằng phương ph p sinh học Trên một số nông sản như Ngô, đậu đen, đậu xanh, đậu tương và cà phê sau thời gian bảo quản 2 tháng tác dụng diệt nấm mốc tăng tỷ lệ thuận với nồng độ Iturin A cho vào xử l Đặc biệt với nồng độ Iturin A 0,05% nông sản không những có màu s c s ng, đ p tác dụng diệt nấm mốc

A.flavus là 100%, hàm lượng aflatoxin không phát hiện được[2]

Trần Văn Chương và cộng sự (2002) khảo sát thực trạng chất lượng ngô 4 huyện miền núi vùng cao phía b c tỉnh Hà Giang cho thấy hàm lượng aflatoxin trong một số mẫu ngô thu thập trước bảo quản gấp 2 ÷ 3 lần so với mức cho phép (10ppb) Sau thời gian bảo quản 6 th ng hàm lượng aflatoxin trong ngô ở Hà Giang tăng lên hông đ ng ể

Đậu Ngọc Hào, Phạm Minh Hằng và Tô Hồng Đức (2000) nghiên cứu ứng dụng

chủng nấm men sống Saccharomyces

Đào Thị Hiên 24

cerevisiae bổ sung thức ăn chăn nuôi nhằm giảm tác hại của aflatoxin

1.3.2 T h h h ghi u goài

Những nghiên cứu của Abbas K và cộng sự (2004) cho thấy sự nhiễm aflatoxin

trên ngô do nấm Aspergillus flavus gây ra là một vấn đề nghiêm trọng ở các vùng trồng

ngô Missisipi – Mỹ

Trong 3 năm (2000 – 2002) các nhà nghiên cứu đã nghiên cứu mức độ nhiễm

A.flavus trong đất và đã x c định rằng mức nhiễm A.flavus trong đất trồng ngô bị ảnh

hưởng bởi các vụ canh t c trước Mật độ A.flavus trong đất trồng ngô năm 2001 cao

nhất là 794 CFU/g, năm 2000 trong đất trồng bông gối vụ là 251 CFU/g, năm 2002

trong đất trồng lúa mì gối vụ là 457 CFU/g Sự nhiễm A.flavus trên ngô hạt năm 2000

dao động từ 0% đến 100% (trung bình là 15% hạt ngô bị nhiễm) Hàm lượng aflatoxin trong ngô dao động trong khoảng 0 ÷ 1590 ppb (trung bình là 57 ppb) Mức nhiễm aflatoxin phân bố ngẫu nhiên trong ngô ở ngoài đồng hông tươn quan với mức nhiễm

A.flavus Nghiên cứu cho thấy 43% đến 59% các chủng A.flavus phân lập trong đất có

khả năng sinh aflatoxin Với sự nhiễm cao nhất ở quần thể đất của ngô gối vụ năm

2001, kết quả cho thấy 84% số chủng A.flavus phân lập từ các hạt ngô có khả năng tạo

aflatoxin[16]

Ở Thượng Hải - Trung Quốc, năm 1994 điều tra 7000 người thì phát hiện 55 trường hợp ung thư gan Định lượng aflatoxin B1 và các sản phẩm chuyển hóa của nó trong nước tiểu bằng phương ph p s c ký l ng hiệu năng cao, ph t hiện 36/55 (72%) trường hợp c aflatoxin Trong đ 30% ệnh nhân có aflatoxin B1 có nồng độ 0,59 16

pp Điều này chứng t rằn hi aflatoxin đào thải qua nước tiểu thì chủ yếu là đào thải sản phẩm chuyển hóa của aflatoxin B1, c n lượng aflatoxin B1 đào thải qua nước tiểu rất ít do đã ị chuyển hóa ở gan Qua đ cũng l giải được tỷ lệ tìm thấy aflatoxin B1 trong nước tiểu (26,9%) là thấp hơn rất nhiều trong tổ chức gan (88,2%) [17]

Tại Thái Lan, nghiên cứu cho thấy 35% mẫu ngô phân tích nhiễm aflatoxin B1(trung bình 400µg/kg) trong khi 40%

Tiến hành phân tích aflatoxin bằng phương ph p s c kí bản m ng do Doronina

và Maksimenko mô tả Dựa trên cơ sở của phương ph p CB (AOAC) c cải tiến gồm những giai đoạn sau: 25g mẫu được say mịn trên máy xay cà phê, chiết xuất aflatoxin bằng hỗn hợp aceton (100ml) và dung dịch NaCL 10% (50ml) Mẫu được nghiền trên máy nghiền đồng thể Polytron Lọc qua giấy lọc Whatman N0 1 Lấy 50ml dịch lọc và tủa bằng Pb(CH3COO)2 10% (50ml) để loại b protein, lọc qua giấy lọc Whatman N0 1 80ml dịch lọc được chuyển vào phễu chiết để chiết xuất bằng hai pha l ng – l ng với 40ml hexan (2lần) Lớp nước axeton được chiết xuất với 40ml cloroform (3lần), loại b lớp nước axeton Lớp cloroform c aflatoxin được giữ lại àm ay hơi toàn ộ lượng cloroform có aflatoxin ở máy cất quay cô chân không Phần cặn được hòa tan vào 100

μl cloroform, giữ ở 40C cho đến lúc tiến hành định t nh và định lượng aflatoxin

Định tính aflatoxin:

Dùng ơm tiêm vi lượng (microsyring) nh trên s c ký lớp m ng 2μl, 6μl và 2 lần 10μl mẫu phân tích Các vết nh của dung dịch được chấm vào phiến m ng cách đường thẳng mép 2cm (từ mép dưới của phiến m ng) và 1,5 ÷ 2cm từ mỗi cạnh bên Việc chấm phải thực hiện ở những phần nh sao cho các vết nh hông c đường kính

qu 5 mm trên đường b t đầu Nh 2, 6, 10μl chuẩn aflatoxin B1 với nồng độ 0,71 ng/µl trên cùng một phiến bản m ng Nh

Đào Thị Hiên 26

5mcl chuẩn aflatoxin B1 vào cùng một vết của mẫu ph n t ch (10μl) như chuẩn trong

Hệ dung môi dùng cho s c ký bản m ng một chiều là: cloroform : aceton 9:1

Giới hạn độ phát hiện của phương pháp là 1 µg aflatoxin/kg sản phẩm (1ppb),

hệ số dao động là 0,3÷5,0

Phát hiện aflatoxin bằng cách phát hiện sự phát quang của phiến lớp m ng ở buồng tối dưới đèn cực t m s ng dài (độ phát xạ cực đại 365nm) Phát hiện bằng m t thường trên s c đồ của mẫu chiết cường độ phát quang của các vết có giá trị Rf bằng với chuẩn Chọn phần tương ứng thích hợp của mẫu phân tích cho việc định lượng của aflatoxin

Thử xác minh aflatoxin:

Thử với axit vô cơ : Phun lên ản m ng dung dịch axit H2SO4 trong nước, tỷ lệ 1: 2 Nếu như màu ph t quang của các vết của mẫu chiết không chuyển sang màu vàng như ở mẫu chuẩn, tức là không có aflatoxin trong mẫu thử Nhưng nếu màu phát quang của các vết của mẫu thử aflatoxin ứng với độ di động s c cũng chuyển thành màu vàng, điều đ c thể xem như là c aflatoxin trong mẫu thử

1.4.2 h ơ g h s g hi u ă g o

* Nguyên l : Aflatoxin được chiết tách từ mẫu thử bằng dung môi hữu cơ chloroform Dịch chiết được lọc qua phễu với chất trợ lọc celit, một phần dịch lọc được làm sạch qua cột silicagen ( hoặc florisil, SPE) Rửa giải cột bằng dung môi chloroform – aceton (4:1) Dung dịch rửa giải được cất quay ch n hông đến cạn khô, hòa cặn bằng dung môi pha động rồi ơm vào hệ thống s c ký l ng hiệu năng cao

* Thi t bị.dụng cụ, hóa ch t

Thiết bị: