Đặc điểm dịch tễ học phân tử của các chủng v parahaemolyticus phân lập được ở bệnh nhân ngộ độc thực phẩm tại hà nội

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI --- Nguyễn Hoài Thu Đặc điểm dịch tễ học phân tử của các chủng Vibrio parahaemolyticus phân lập được ở bệnh nhân ngộ độc thực p

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

-

Nguyễn Hoài Thu

Đặc điểm dịch tễ học phân tử của các chủng

Vibrio parahaemolyticus phân lập được ở bệnh nhân

ngộ độc thực phẩm tại Hà Nội

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Người hướng dẫn khoa học: PGS TS Nguyễn Bình Minh

Hà Nội - Năm 2010

Lời cảm ơn

Trước hết, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc tới PGS TS Nguyễn

Bình Minh, người đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ và hỗ trợ tôi trong suốt quá trình

công tác cũng như trong thời gian học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn này

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới các thầy cô và cán bộ công tác tại Viện Công nghệ Sinh học thực phẩm, Viện đào tạo sau đại học - Trường Đại học Bách khoa Hà Nội đã dạy dỗ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập tại trường

Tôi xin chân thành cảm ơn các cán bộ, anh chị em trong phòng thí nghiệm Vi khuẩn đường ruột, Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương, đã giúp đỡ và động viên tôi trong quá trình công tác và nghiên cứu khoa học vừa qua

Và tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bố, mẹ, em gái, chồng và con trai Hoàng Dương đã luôn ở bên tôi, nhiệt tình động viên, giúp đỡ tôi trong quá trình học tập, nghiên cứu khoa học cũng như trong cuộc sống

Xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, tháng 10 năm 2010 Nguyễn Hoài Thu

Lời cam đoan

Tôi xin cam đoan đã trực tiếp thực hiện các nghiên cứu trong luận văn này Mọi kết quả thu được nguyên bản, không chỉnh sửa hoặc sao chép từ các nghiên cứu khác; các

số liệu, kết quả của luận văn này chưa từng được công bố

Mọi dữ liệu, hình ảnh và trích dẫn tham khảo trong luận văn đều được thu thập

và sử dụng từ nguồn dữ liệu mở hoặc với sự đồng ý của tác giả Phần mềm phân tích kết quả Bio Numeric sử dụng là phần mềm có bản quyền

Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm với những lời cam đoan trên!

Nguyễn Hoài Thu

Mục lục

Trang phụ bìa 2

Lời cảm ơn 3

Lời cam đoan 4

Mục lục 5

Danh mục chữ viết tắt 8

Danh mục bảng 9

Danh mục hình minh họa 11

ĐẶT VẤN ĐỀ 12

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 15

1.1 Ngộ độc thực phẩm nguyên nhân do V parahaemolyticus 15

1.1.1 Tình hình ngộ độc thực phẩm do V parahaemolyticus trên thế giới 15

1.1.2 Tình hình ngộ độc thực phẩm do V parahaemolyticus tại Việt nam 16

1.1.3 Đặc điểm lâm sàng 16

1.1.4 Phòng và chống bệnh 17

1.2 Vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus 18

1.2.1 Định danh 18

1.2.2 Phân loại 18

1.2.3 Hình thái và tính chất hóa sinh 18

1.2.4 Đặc điểm sinh thái 21

1.2.5 Tính chất kháng nguyên 23

1.2.6 Bộ gen của V parahaemolyticus 24

1.2.7 Độc tố và cơ chế gây bệnh 24

1.2.8 Chủng V parahaemolyticus gây dịch type huyết thanh O3:K6 28

1.2.8.1 Nguồn gốc phát sinh chủng O3:K6 mới 28

1.2.8.2 Các biến thể của type huyết thanh O3:K6 29

1.3 Các phương pháp chẩn đoán 30

1.3.1 Phương pháp nuôi cấy phân lập 30

1.3.2 Phương pháp sinh học phân tử 33

1.3.2.1 Kỹ thuật lai ADN 33

1.3.2.2 Kỹ thuật PCR 34

1.3.2.3 Kỹ thuật Real-time PCR 34

1.4 Ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử trong nghiên cứu và chẩn đoán V parahaemolyticus 35

1.4.1 Trên thế giới 35

1.4.1.1 Phương pháp PCR 35

1.4.1.2 Phương pháp xác định genotype 37

1.4.1.3 Kỹ thuật Ribotyping 39

1.4.1.4 Phương pháp sử dụng enzyme giới hạn 40

1.4.2 Tại Việt Nam 40

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 42

2.1 Đối tượng nghiên cứu 42

2.2 Vật liệu nghiên cứu 42

2.3 Thiết bị, hóa chất và sinh phẩm 42

2.3.1 Trang thiết bị 42

2.3.2 Hóa chất, sinh phẩm 43

2.4 Phương pháp nghiên cứu 44

2.4.1 Thu thập mẫu nghiên cứu 44

2.4.2 Nuôi cấy và phân lập vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus 44

2.4.3 Phương pháp PCR xác định các gen ToxR, tdh, trh và GS 45

2.4.3.1 Tách chiết ADN của vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus phân lập được 45

2.4.3.2 Phản ứng chuỗi men (PCR) phát hiện gen ToxR 45

2.4.3.3 PCR phát hiện gen tdh 47

2.4.3.4 PCR phát hiện gen trh 48

2.4.3.5 PCR phát hiện gen GS 50

2.5 So sánh genotype các chủng vi khuẩn Vibiro parahaemolyticus phân lập

được 51

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 55

3.1 Tỷ lệ V parahaemolyticus phân lập từ bệnh nhân ngộ độc thực phẩm ở Hà Nội 55

3.2 Xác định type huyết thanh của các chủng V parahaemolyticus phân lập được 58

3.3 Tỷ lệ phát hiện gen đặc hiệu loài ToxR và các gen độc tố tdh, trh, gen chỉ điểm chủng gây dịch GS 60

3.4 So sánh kiểu gen của các chủng phân lập được 63

KẾT LUẬN 68

KIẾN NGHỊ 69

TÀI LIỆU THAM KHẢO 70

Danh mục chữ viết tắt

ADN axit deoxyribonucleic

ARN axit ribonucleic

bp base pair (cặp ba zơ)

CDC Centers for Disease Control and Prevention

(Trung tâm kiểm soát và phòng bệnh dịch) CLB Cell Lysis Buffer (dung dịch đệm ly giải tế bào)

CSB Cell Solution Buffer (dung dịch đệm hòa tan tế bào)

GS group specific (đặc hiệu nhóm)

KP Kanagawa Phenomenon (hiện tượng Kanagawa)

LB Luria Bertani

LDC Lysine Decarboxylase

PCR Polymerase Chain Reaction (phản ứng chuỗi men)

PFGE Pulse Field Gel Electrophoresis (điện di trường xung)

TBE Tris Borate EDTA

TCBS Thiosulfate Citrate Bile Salts Sucrose Agar

tdh thermostable direct hemolysin

(ly giải hồng cầu trực tiếp chịu nhiệt)

trh thermostable related hemolysin

(ly giải hồng cầu có liên quan đến yếu tố chịu nhiệt) TTSS Type III Secretion System (hệ thống tiết type III)

UT Untype (không xác định type)

Danh mục bảng

Bảng 1.1 Tính chất hóa sinh của Vibrio parahaemolyticus 20

Bảng 1.2 Các điều kiện tối ưucho giới hạn phát triển của V parahaemolyticus 22

Bảng 1.3 Các type huyết thanh của V parahaemolyticus 23

Bảng 1.4 So sánh đặc điểm khuẩn lạc trên môi trường thạch TCBS 32

Bảng 1.5 So sánh đặc điểm khuẩn lạc trên môi trường thạch Chrom 33

Bảng 2.1 Trình tự cặp mồi ToxR 45

Bảng 2.2 Thành phần phản ứng khuếch đại gen ToxR 46

Bảng 2.3 Chu trình chạy PCR phát hiện gen ToxR 46

Bảng 2.4 Trình tự cặp mồi tdh 47

Bảng 2.5 Thành phần phản ứng khuếch đại gen tdh 47

Bảng 2.6 Chu trình chạy PCR phát hiện gen tdh 48

Bảng 2.7 Trình tự cặp mồi trh 48

Bảng 2.8 Thành phần phản ứng khuếch đại gen trh 49

Bảng 2.9 Chu trình chạy PCR phát hiện gen trh 49

Bảng 2.10 Trình tự cặp mồi gen GS 50

Bảng 2.11 Thành phần phản ứng khuếch đại gen GS 50

Bảng 2.12 Chu trình chạy PCR phát hiện gen GS 51

Bảng 2.13 Thành phần dung dịch đệmtrước khi cắt ADN bằng enzyme giới hạn 53 Bảng 2.14 Thành phần hỗn hợp phản ứng cắt ADN bằng NotI 54

Bảng 3.1 Tính chất hóa sinh của 84 chủng V parahaemolyticus 57

Bảng 3.2 Kết quả xác định type huyết thanhcủa các chủng V parahaemolyticus 58

Bảng 3.3 Phân nhóm kiểu gen độc tố 62 Bảng 3.4 Mối liên quan giữa type huyết thanhvà các kiểu gen của các chủng vi khuẩn 65

Danh mục hình minh họa

Hình 1.1 Vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus dưới kính hiển vi điện tử 19

Hình 1.2 Khuẩn lạc V parahaemolyticus trên môi trường thạch TCBS 30

Hình 1.3 Khuẩn lạc V parahaemolyticus trên môi trường thạch Chrom 31

Hình 1.4 Tính chất sinh hóa của V parahaemolyticus 32

Hình 1.5 Vị trí cặp mồi khuếch đại trình tự ToxRSvà vị trí các base khác nhau giữa dòng O3:K6 cũ và mới 36

Hình 2.1 Hình ảnh điện di gen ToxR 46

Hình 2.2 Hình ảnh điện di gen tdh 48

Hình 2.3 Hình ảnh điện di gen trh 49

Hình 2.4 Hình ảnh điện di gen GS 51

Hình 2.5 Vị trí cắt của enzyme NotI 53

Hình 3.1 Phân bố theo giới tính của bệnh nhân nhiễm V parahaemolyticus 55

Hình 3.2 Phân bố theo độ tuổi của bệnh nhân nhiễm V parahaemolyticus 56

Hình 3.3 Tỷ lệ các ca nhiễm trùng V parahaemolyticus theo tháng 57

Hình 3.4 Tỷ lệ các type huyết thanh của các chủng V parahaemolyticus 59

Hình 3.5 Tỷ lệ mang gen độc tố của các chủng V parahaemolyticus 61

Hình 3.6 Kết quả kiểu gen PFGE đại diện của 84 chủng V parahaemolyticusphân lập ở Hà Nội 64

Hình 3.7 Tỷ lệ tương đồng giữa các kiểu gen PFGE 66

ĐẶT VẤN ĐỀ

Hiện nay, các bệnh liên quan đến ngộ độc thực phẩm đang là một vấn đề được quan tâm trên toàn thế giới, đặc biệt ở những nước đang phát triển, trong đó

có Việt Nam Trong số đó, ngộ độc thực phẩm do Vibrio chiếm tỷ lệ lớn trong cộng

đồng Số lượng các loài trong họ phẩy khuẩn gây bệnh ở người tăng lên một cách nhanh chóng và một số loài đã được biết đến với vai trò gây bệnh đường tiêu hóa

Các Vibrio gây ngộ độc thực phẩm khác nhau về kiểu hình, tính chất lý hóa, sinh thái và dịch tễ Những loài thường gặp gây bệnh đường tiêu hóa ở người như Vibrio

cholerae, Vibrio parahaemolyticus và Vibrio vulnificus Các phẩy khuẩn khác như Vibrio mimicus, Vibrio fluvialis, Vibrio furnissii và Vibrio holliase thường ít gây

bệnh cho người

Không như V cholerae, thường gây bệnh ở những nước chậm phát triển có điều kiện vệ sinh thấp kém, nhiễm khuẩn do V parahaemolyticus thường xảy ra ở

cộng đồng dân cư có mức sống cao, ngay cả ở những nước đang phát triển Nguyên

nhân nhiễm khuẩn V parahaemolyticus không chỉ do ý thức vệ sinh an toàn thực

phẩm mà còn do tập quán ăn uống Vi khuẩn này cư trú tự nhiên ở nước biển hoặc cửa sông và truyền bệnh cho người do ăn các loại hải sản sống, chưa được nấu chín

hoặc thực phẩm bị nhiễm trùng Nhiễm trùng V parahaemolyticus gây hội chứng

viêm dạ dày ruột bao gồm các triệu chứng: tiêu chảy cấp, đau bụng, nôn, đau đầu,

sốt nhẹ, thỉnh thoảng tiêu chảy có máu Nhiễm trùng V parahaemolyticus thường gây thành dịch lớn ở nhiều nước Cơ chế gây bệnh do V parahaemolyticus hiện vẫn chưa được hiểu đầy đủ Nghiên cứu ở một số nước cho thấy các chủng V

parahaemolyticus phân lập từ bệnh nhân mang gen ly giải hồng cầu trực tiếp chịu

nhiệt tdh (thermostable direct hemolysin) hoặc gen trh (thermostable related hemolysin) ly giải hồng cầu liên quan với tdh hoặc cả hai gen

V parahaemolyticus là nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm ở nhiều nước

trên thế giới, trong đó có Việt Nam Tại Việt Nam, V parahaemolyticus đã được

phân lập từ ghẹ, tôm hùm và ốc [61] Trong một điều tra về bệnh đường ruột ở tỉnh Khánh Hòa từ năm 1997 đến năm 1999 đã phát hiện ra 548 ca nhiễm trùng có

nguyên nhân do V parahaemolyticus Trong đó có hơn 90% bệnh nhân trên 5 tuổi,

53% bệnh nhân có triệu chứng tiêu chảy ra nước và 6% bệnh nhân tiêu chảy có máu Tuy nhiên, cho đến nay, ở Việt Nam chưa có số liệu nghiên cứu về tỷ lệ mắc

cũng như vai trò gây ngộ độc thực phẩm của V parahaemolyticus Tại miền Bắc Việt Nam, với điều kiện khí hậu nóng ẩm tạo điều kiện thuận lợi cho V

parahaemolyticus phát triển trong môi trường thực phẩm, cộng thêm ý thức về vệ

sinh an toàn thực phẩm của người dân chưa được đầy đủ, đặc biệt khi đời sống kinh

tế xã hội được cải thiện kéo theo việc sử dụng rất nhiều các sản phẩm thực phẩm có

nguồn gốc từ hải sản trong bữa ăn, chắc chắn ngộ độc thực phẩm do V

parahaemolyticus gây ra chiếm tỷ lệ không nhỏ, nhất là các thành phố lớn Nhằm

hiểu sâu hơn về các đặc tính của các chủng V parahaemolyticus gây ngộ độc thực

phẩm tại Hà Nội, chúng tôi tiến hành đề tài nghiên cứu “Đặc điểm dịch tễ học

phân tử của các chủng V parahaemolyticus phân lập được ở bệnh nhân ngộ

độc thực phẩm tại Hà Nội”

Đây là một nghiên cứu có ý nghĩa thực tiễn khách quan nhằm:

- Từng bước nâng cao năng lực cho cán bộ nghiên cứu, phù hợp với xu thế phát triển chung của đất nước;

- Hiểu sâu hơn về ngộ độc thực phẩm do V parahaemolyticus;

- Làm giảm chi phí xã hội thông qua việc ngăn ngừa các vụ ngộ độc thực

phẩm do V parahaemolyticus;

- Là nâng cao năng lực kiểm soát vệ sinh an toàn thực phẩm của các cơ quan chức năng

Với những ý nghĩa trên, mục tiêu nghiên cứu của đề tài gồm:

1 Phát hiện và định type V parahaemolyticus từ bệnh nhân tiêu chảy ở Hà

Nội bằng phương pháp nuôi cấy phân lập

2 Xác định các gen độc tố tdh, trh và GS và so sánh các chủng V

parahaemolyticus bằng kỹ thuật PCR và kỹ thuật điện di trường xung

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 Ngộ độc thực phẩm nguyên nhân do V parahaemolyticus

1.1.1 Tình hình ngộ độc thực phẩm do V parahaemolyticus trên thế giới

V parahaemolyticus được Fujino phát hiện lần đầu tiên vào mùa hè năm

1951 tại vùng ven biển Nhật Bản sau các vụ ngộ độc do ăn cá, hàu, hến sống làm

272 người nhập viện và 20 người chết [13] Các vụ dịch do vi khuẩn này gây ra đã được ghi nhận ở Đông Bắc nước Mỹ [30, 39, 42], Tây Bắc Thái Bình Dương [25,

40, 41], Louisiana [3, 26], Florida [18], và ở vùng Vịnh nước Mỹ [18, 28]; tỉnh bang cực tây của Canada [14], Bangladesh [21]; Vellore của Ấn Độ [27]; Thái Lan [57]; Đài Loan [6, 44, 45]; Vladivostok của Nga [52]; Guam [16]; Lima ở Peru [4]; Dakar ở Senegal [53] và lưu vực Cross River ở Nigeria [11, 34] Ở Đài Loan, vi khuẩn này chiếm đến một nửa các vụ dịch ngộ độc thường niên [45] Một điều tra trong suốt một năm tại vùng Vịnh của Mỹ và trong suốt khoảng thời gian 13 năm tại

Florida [18, 28] cũng đã cho thấyV parahaemolyticus là loại phẩy khuẩn hay được phân lập thấy nhất trong họ Vibrio Tại Việt Nam, V parahaemolyticus đã được

phân lập từ ghẹ, tôm hùm và ốc [61] Mặc dù có rất nhiều chủng huyết thanh khác nhau của vi khuẩn này có thể gây bệnh, tuy nhiên O3:K6 là chủng nổi trội nhất trong hầu hết các vụ dịch từ năm 1996 trên toàn thế giới [30] Dịch bệnh do dòng vi khuẩn này gây ra bắt đầu từ tháng hai năm 1996 và những chủng phân lập được từ những người du lịch Châu Á bắt đầu từ năm 1995 đều thuộc về một dòng duy nhất

có gen tdh, không có gen trh và có cùng các băng ADN giống nhau khi làm

AP-PCR [37] Trong 227 chủng phân lập ở bệnh viện Bangladesh từ năm 1977 đến

1998, chỉ có 22 chủng phân lập giữa năm 1996 và 1998 là thuộc về dòng O3:K6

mới này (định danh bằng chủng huyết thanh, gen tdh và trh và AP-PCR) Các chủng

O3:K6 phân lập được từ bệnh phẩm lâm sàng ở Đài Loan, Lào, Nhật Bản, Thái Lan, Hàn Quốc và Mỹ từ năm 1997 đến 1998 cũng thuộc về chủng O3:K6 mới này

1.1.2 Tình hình ngộ độc thực phẩm do V parahaemolyticus tại Việt nam

Tại Việt Nam, các nhà khoa học đã tiến hành nghiên cứu về bệnh đường ruột

ở tỉnh Khánh Hòa và ghi nhận một lượng lớn các ca tiêu chảy có liên quan đến

nhiễm trùng có nguyên nhân do V parahaemolyticus Từ tháng 1 năm 1997 đến tháng 11 năm 1999 nghiên cứu này cho thấy tỉ lệ mắc V parahaemolylticus trên

1000 người là 0,15 ca bệnh đối với trẻ nhỏ hơn 6 tuổi, 0,18 ca từ 6-65 tuổi và 0,09

ca lớn hơn 65 tuổi Mặc dù hải sản vẫn là yếu tố nguy cơ chính gây nhiễm trùng V

parahaemolyticus nhưng điều đáng thú vị là khi so sánh điều kiện kinh tế xã hội của

những người bị ngộ độc thức ăn do vi khuẩn này gây ra, các nhà nghiên cứu đã thấy

rằng càng những người có mức sống cao trong xã hội lại càng dễ nhiễm V

parahaemolyticus Nguyên nhân được cho là tại Khánh Hòa, do giá hải sản tươi

tương đối cao nên những gia đình có điều kiện kinh tế eo hẹp thường khó có thể sử dụng thường xuyên nguồn dinh dưỡng này [58]

1.1.3 Đặc điểm lâm sàng

Có tất cả ba dạng bệnh cảnh lâm sàng khi bị nhiễm V parahaemolyticus:

nhiễm trùng vết thương, nhiễm trùng máu thứ cấp và bệnh đường ruột Khi xâm

nhiễm vào cơ thể, V parahaemolyticus sẽ gây ra tình trạng tiêu chảy với các triệu

chứng buồn nôn, nôn và sốt Thông thường những triệu chứng này xảy ra trong vòng 24 tiếng sau khi bị phơi nhiễm Các triệu chứng trên tương tự như do

Salmonella nhưng trầm trọng hơn Salmonella tác động lên vùng bụng trong khi V parahaemolyticus tác động lên bao tử người bệnh [1]

Thông thường, bệnh sẽ tự khỏi trong vòng 3 ngày, tuy nhiên với những trường hợp nặng, thường hay xảy ra với những người có hệ miễn dịch yếu, bệnh có thể kéo dài lâu hơn

1.1.4 Phòng và chống bệnh

 Phòng bệnh

Do V parahaemolyticus có đặc điểm ưa mặn nên hải sản tươi được coi là ổ

chứa vi khuẩn này và là nguyên nhân chính cho các vụ ngộ độc thực phẩm Ở những tháng ấm áp trong năm, cá tươi và động vật có vỏ có thể chứa đến 106 cfu/g

vi khuẩn này [46] Các loại thực phẩm khác cũng có thể lây nhiễm chéo thông qua các quá trình chế biến

Số lượng của V parahaemolyticus trong các thực phẩm nhiễm khuẩn thường

thấp, xấp xỉ 102 cfu/g nhưng có thể tăng lên gấp 10 lần vào mùa hè [9] và có thể gây bệnh cho người khỏe mạnh Việc làm sạch hải sản không có hiệu quả trong việc loại

bỏ V parahaemolyticus và không thể sử dụng làm công cụ để kiểm soát chất lượng

động vật có vỏ [12] mà phải dựa vào kiểm soát quy trình chế biến, không để lây nhiễm chéo xảy ra giữa thức ăn sống với thức ăn chín và phải kiểm soát quá trình phát triển của vi khuẩn trên thức ăn đã chế biến

Chính vì vậy, để phòng bệnh cần phải thực hiện các biện pháp:

- Giữ gìn nơi chế biến thức ăn sạch sẽ

- Bảo quản lạnh và riêng biệt hải sản tươi sống, không để tiếp xúc với các thức ăn khác

- Rửa tay sạch sẽ, vệ sinh dao, thớt trước và sau khi chế biến hải sản

- Nấu chín hải sản

 Điều trị

Ngộ độc thức ăn do V parahaemolyticus gây ra thường không cần phải điều

trị Cho đến nay, vẫn chưa có bằng chứng nào cho thấy việc điều trị bằng kháng sinh sẽ làm giảm tính dữ dội của ca bệnh hay nhanh khỏi bệnh Để điều trị, chủ yếu bệnh nhân nên uống thật nhiều nước để thay thế lượng nước đã mất khi bị tiêu chảy Tuy nhiên, đối với những ca bệnh nặng kéo dài có thể sử dụng các kháng sinh như Tetracycline, Ampicillin hoặc Ciprofloxacin nhưng việc lựa chọn loại kháng sinh nào cần phải dựa trên kháng sinh đồ của vi khuẩn gây bệnh

1.2 Vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus

1.2.1 Định danh

Chi Vibrio nằm trong họ Vibrionaceae Ngoài chi Vibrio, họ này còn bao gồm các chi Aeromonas, Plesiomonas, và Photobacterium Do có đặc tính ưa mặn nên tất cả loài Vibrio đều hiện diện trong môi trường nước biển Trong 30 loài thuộc chi Vibrio có 13 loài có khả năng gây bệnh cho con người, bao gồm V cholerae, V

mimicus, V fluvialis, V parahaemolyticus, V algiolyticus, V cincinnatiensis, V hollisae , V vulnificus, V furnissii, V damsela, V metshnikovii và V carchariae

Tất cả các phẩy khuẩn trên đều gây bệnh thông qua con đường thực phẩm, tuy nhiên

V cholerae O1, V parahaemolyticus và V vulnificus là những vi khuẩn gây bệnh

1.2.3 Hình thái và tính chất hóa sinh

 Hình thái

Vibrio parahaemolyticus là trực khuẩn Gram âm, không có nha bào, kích

thước rộng 0,5 đến 0,8 m và dài 1,4 đến 2,6 m Tuy nhiên, khi nuôi cấy trong phòng thí nghiệm, chúng thường mọc ở dạng thẳng hình que Các phẩy khuẩn thường di dộng nhờ một lông dài ở đầu và thuộc dạng hiếu khí hay hiếu khí tùy tiện

Hầu hết các loài đều sinh oxidase, catalase và lên men đường glucose mà không

sinh hơi Đặc biệt V vulnificus có kiểu hình tương đối giống V parahaemolytic

Tuy nhiên có thể phân biệt hai loài này dựa vào đặc tính lên men đường lactose và khả năng sản sinh -D-galactosidase của V vulnificus để phân biệt với V

parahaemolyticus [54]

Tính chất khuẩn lạc Vibrio parahaemolyticus trên môi trường TCBS: khuẩn

lạc tròn, có đường kính từ 3-5 mm, màu xanh dương (do không lên men đường saccharose) [1]

Trên môi trường Chrom: khuẩn lạc V parahaemolyticus tròn, bóng, màu hoa

Bảng 1.1 Tính chất hóa sinh của Vibrio parahaemolyticus

1.2.4 Đặc điểm sinh thái

V parahaemolyticus thường gặp ở thủy sản loại nhuyễn thể và giáp xác

trong nước biển lẫn nước ngọt, tuy nhiên vi khuẩn này thường không lây truyền từ

người qua người Các trường hợp nhiễm Vibrio parahaemolyticus thường xảy ra

vào mùa hè Nguyên nhân là do các vi khuẩn này thường được tìm thấy trên bề mặt nước ở các vùng duyên hải, trên cá và các động vật giáp xác vào mùa hè ấm áp, còn

trong những tháng mùa đông lạnh, V parahaemolyticus lại có xu hướng nằm ở trong lớp phù sa hoặc bùn ở đáy nước nên khả năng gây nhiễm giảm V

parahaemolyticus có mặt ở khắp các vùng nước ven biển mặc dù thể sinh bệnh

không thể hồi phục từ nước ở vùng cửa biển trong suốt mùa đông ở nhiệt độ thấp

[65] Chủng V parahaemolyticus cũng được tìm thấy ở rất nhiều món ăn chế biến

từ hải sản ở Thái Lan, Hồng Kông, Indonesia và Việt Nam [61] Trong suốt các

tháng mùa hè những năm 1960, ngộ độc thực phẩm do V parahaemolyticus gây ra

chiếm gần một nửa các ca ngộ độc thức ăn ở Nhật Bản nơi có tập quán ăn hải sản sống do vi khuẩn này có rất nhiều trên bề mặt nước biển [65]

Vibrio parahaemolyticus có thể phát triển ở nhiệt độ từ 5-430C, nhiệt độ tối

ưu là 370

C, pH tối ưu từ 7,8 đến 8,6 Vi khuẩn này có thể phát triển ở nồng độ muối

từ 0,5-10%, nồng độ muối tối ưu là 3% Có khả năng sống ở nước đá, tuy nhiên số

lượng vi khuẩn giảm từ 10-100 lần [1] Vibrio parahaemolyticus bị bất hoạt ở 650

C trong 10 phút và chết ở 0-50C

Giới hạn phát triển của V parahaemolyticus được tổng kết trong bảng 1.2

[46]

Bảng 1.2 Các điều kiện tối ưu

cho giới hạn phát triển của V parahaemolyticus

Điều kiện phát triển tối ưu Giới hạn phát triển

ỏi 102

cfu/g ban đầu trong hải sản có thể tăng đến 105 cfu/g [46] Gooch và cs [15]

đã chứng minh rằng tại vùng Vịnh ở Mỹ, tại nhiệt độ 260C, vi khuẩn này tăng sinh một cách nhanh chóng ở hàu sống (1,7 log cfu/g trong 10h và 2,9 log trong 24 giờ)

Trong khi đó, nếu để ở tủ lạnh, con số này chỉ là 0,8 log cfu/g trong 14 giờ [15] V

parahaemolyticus sẽ chết dần ở nhiệt độ 470C, tốc độ chết này sẽ tăng nhanh hơn ở nhiệt độ 600C nên nấu hải sản ở nhiệt độ trên 650C là cách hiệu quả để loại bỏ vi khuẩn Trong quá trình bảo quản lạnh, số lượng vi khuẩn ban đầu cũng sẽ giảm dần tới một mức độ và duy trì ổn định trong một thời gian dài trong hải sản [46]

V parahaemolyticus nhạy cảm với môi trường axít và không phát triển ở pH

dưới 4,8 V parahaemolyticus cần phải có ion kiềm để tồn tại và phát triển và có thể

chịu được độ mặn lên tới 8% NaCl Trong khi đó sức chịu đựng hoạt độ nước tối thiểu lại phụ thuộc vào lượng chất hòa tan trong dung dịch [59]

Nhóm kháng nguyên K 4, 5, 6, 7, 8, 9 và 19 có thể kết hợp với hai nhóm O

Vibrio parahaemolyticus có ba loại kháng nguyên H, O và K Kháng nguyên

H có ở tất cả các chủng nhưng ít có giá trị trong phân loại type huyết thanh Kháng nguyên K (kháng nguyên vỏ) bị hủy ở nhiệt độ 1000C trong 1 hoặc 2 giờ Kháng nguyên O (kháng nguyên thân) rất bền với nhiệt độ Có tất cả 13 nhóm kháng nguyên O và hơn 70 nhóm kháng nguyên K Tuy nhiên do 7 kháng nguyên K có thể kết hợp với 2 nhóm kháng nguyên O nên có tổng cộng 81 type huyết thanh (bảng

1.3) Định danh bằng huyết thanh học thường không được dùng để phân lập V

parahaemolyticus vì thử nghiệm này có thể xảy ra phản ứng chéo với rất nhiều các

vi khuẩn ưa mặn khác Tuy nhiên, trong quá trình điều tra vụ dịch, thử nghiệm này vẫn có thể được sử dụng làm công cụ điều tra dịch tễ Mặc dù có rất nhiều chủng

huyết thanh khác nhau của vi khuẩn này có thể gây bệnh, tuy nhiên O3:K6 là chủng nổi trội nhất trong hầu hết các vụ dịch từ năm 1996 trên toàn thế giới [27]

1.2.6 Bộ gen của V parahaemolyticus

Bộ gen của V parahaemolyticus chứa hai chromosome bao gồm 3288558 bp

và 1877212 bp Hai chromosome này có tổng cộng 4832 gen Khi so sánh bộ gen

của V parahaemolyticus với V cholerae, các nhà khoa học đã nhận thấy có sự cấu

trúc lại ở bên trong mỗi chromosome và giữa hai chromosome này Điều đặc biệt là

gen cho hệ thống tiết type III (TTSS) đã được tìm thấy ở bộ gen của V

parahaemolyticus; đây là gen thường thấy ở những vi khuẩn gây tiêu chảy như Shigenlla, Salmonella và E coli nhưng V cholerae không có những gen này Gen

gây độc tdh có trọng lượng phân tử 42 000 bao gồm hai dưới đơn vị 21 000 chủ yếu

nằm trên chromosome Tuy nhiên, có một vài trường hợp lại tìm thấy gen này nằm

trên plasmid tdh mã hóa cho 189 axít amin, đây là các axít amin có chức năng ly giải hồng cầu và một số các hoạt động sinh hóa khác Gen gây độc trh khác gen tdh

ở sự thay đổi các base, tuy nhiên hai gen này có sự tương đồng về tỷ lệ G-C khá

giống nhau Cũng giống tdh, trh mã hóa một đoạn polypeptide dài 189 axit amin

trh được tạo bởi hai dưới đơn vị và có trọng lượng phân tử là 23 000

1.2.7 Độc tố và cơ chế gây bệnh

Có rất nhiều yếu tố gây độc được cho là có vai trò trong khả năng gây bệnh

của V parahaemolyticus bao gồm: mối liên quan với ly giải hồng cầu beta, các nhân tố bám dính, các loại enzyme và khả năng sản sinh độc tố của các gen tdh, trh

và ure Trước đây, khả năng gây bệnh của V parahaemolyticus được cho là có liên

quan tới kiểu hình Kangawa (KP) [54] Kato và cs [24] đã tiến hành nghiên cứu và

thấy rằng các chủng V parahaemolyticus phân lập được từ phân của bệnh nhân

nhiễm trùng đường ruột có khả năng ly giải hồng cầu trên môi trường thạch máu có

nồng độ muối đặc biệt Trong khi đó, các chủng V parahaemolyticus phân lập từ

hải sản hoặc môi trường nước mặn lại không có khả năng này Wagatsuma [60] sau

đó đã thay đổi môi trường thạch máu này để tránh việc nhầm lẫn với khả năng ly

giải hồng cầu của V parahaemolyticus trên môi trường thạch 5% máu truyền thống Hầu như các chủng lâm sàng của V parahaemolyticus phân lập được đều là KP

dương tính, trong khi đó chỉ 1 đến 2% các chủng phân lập từ ngoại cảnh có kiểu hình này [32, 33, 47, 48, 50] Các nghiên cứu cho thấy khả năng ly giải hồng cầu có

thể do yếu tố ly giải hồng cầu trực tiếp chịu nhiệt TDH (thermostable direct

haemolysin) gây ra Sở dĩ protein này được đặt tên như vậy vì nó không bị bất hoạt bởi nhiệt độ (1000C trong 10 phút) và có khả năng trực tiếp ly giải hồng cầu bởi hoạt tính ly giải của nó không được tăng cường khi bổ sung lecithin Kapper và cs

(1984) là những người đầu tiên tách dòng được gen mã hóa hóa cho protein TDH (được định danh là tdh 1) từ chủng lâm sàng V parahaemolyticus WP1 Các nhà khoa học này sau đó đã sử dụng các đầu dò thu được từ gen này để tìm các gen tdh

ở các chủng V parahaemolyticus khác Tiếp theo sau, Hida và Yamamoto (1990) đã phát hiện ra rằng V parahaemolyticus WP1 còn có chứa một gen tdh thứ 2 riêng biệt được định danh là tdh 2 Một nghiên cứu được thực hiện bởi Nishibuchi và Kaper (1990) đã chỉ ra rằng tất cả các chủng V parahaemolyticus KP dương tính (chủng lâm sàng) đều chứa 2 gen tdh [54] Mặc dù hai gen này không tương đồng

và các trình tự axít amin của gen sinh ra cũng khác nhau, nhưng chúng lại có đặc

tính miễn dịch giống nhau [37] TDH là yếu tố được nghiên cứu tập trung nhất và là

một yếu tố ly giải hồng cầu, gây độc, có khả năng làm chết chuột, gây ngộ độc đường ruột, gây hại cho tim và là độc tố gây phá vỡ màng tế bào [19].Trong khi đó,

các chủng V parahaemolyticus lâm sàng hoặc ngoại cảnh có phản ứng ly giải hồng cầu yếu hoặc trung bình trên thạch Wagatsuma chỉ có duy nhất 1 gen tdh Khi xem

xét các chủng KP âm tính (hầu hết phân lập được từ môi trường ngoại cảnh), 16%

các chủng này chứa 1 phiên bản gen tdh, các chủng còn lại không có gen này Điều

này cho thấy, hầu hết các chủng KP âm tính không có khả năng sản xuất protein

TDH [35, 37] Đôi khi, các chủng Vibrio khác như V holisae, V cholerae non O1

và V mimicus cũng sở hữu gen tdh [37]

Tuy tầm quan trọng của phản ứng Kanagawa và protein TDH ở các chủng V

parahaemolyticus đã được nghiên cứu chứng minh, các chủng V parahaemolyticus

KP âm tính đôi khi vẫn gây ra các vụ tiêu chảy Honda và cs (1987,1988) đã đưa ra

báo cáo về một số chủng V parahaemolyticus KP âm tính vẫn gây bệnh cho người

Những chủng này có khả năng sản sinh ra một loại protein ly giải hồng cầu có liên

quan đến TDH và được định danh là TRH Protein này gần giống nhưng không tương đồng với protein TDH và được tìm thấy đầu tiên ở chủng V

parahaemolyticus O3:K6 [54] Thêm vào đó, protein ly giải hồng cầu mới này lại có

ở hầu hết các chủng ngoại cảnh phân lập được và có khả năng gây chết chuột thí nghiệm khi tiêm vào màng bụng chuột [49] Gen chỉ đạo việc tổng hợp ra protein

này được định danh là trh Gen này cũng có hải biến thể là trh 1 và trh 2 Khi so sánh tdh và trh, người ta nhận thấy trình tự nucleotid của hai gen này tương đồng

tới 69%, điều này dẫn đến giả thuyết có thể hai gen này bắt nguồn từ một gen

chung [39] Một số chủng lâm sàng chứa cả hai gen tdh và trh, trong khi đó các

chủng ngoại cảnh hầu hết đều không có hai gen này [62] Trong một loạt các thí nghiệm đột biến mất đoạn, các nhà khoa học đã làm mất một phần hoặc toàn bộ gen

trh và quan sát thấy hoạt tính ly giải hồng cầu của protein này không còn nữa Tuy

nhiên, một cách nào đó, những đột biến này vẫn còn có khả năng gây độc tế bào trên thực nghiệm và là nguyên nhân gây ra tình trạng tích nước cục bộ ở đoạn thắt

của ruột non thỏ Điều này cho thấy có những nhân tố gây độc khác ngoài TDH và

TRH có liên quan đến khả năng gây bệnh của V parahaemolyticus Tuy nhiên theo

khuyến cáo của CDC gần đây, các chủng V parahaemolyticus không có cả hai gen

này vẫn có liên quan đến những ca nhiễm trùng với triệu chứng trầm trọng mà bệnh nhân cần phải nhập viện [64]

Trước kia, một số nghiên cứu cũng chỉ ra rằng “các nhân tố bám dính” đóng

một vai trò quan trọng trong khả năng gây bệnh của V parahaemolyticus Hackney

và cs (1980) đã tìm ra các chủng V parahaemolyticus lâm sàng và ngoại cảnh mà

họ tiến hành làm thí nghiệm có khả năng bám dính vào tế bào biểu mô ruột non của thai nhi dù mức độ bám dính khác nhau Các chủng phân lập được từ bệnh nhân có

khả năng bám dính cao không có liên quan đến phản ứng Kanagawa, trong khi đó những chủng Kanagawa âm tính phân lập được từ hải sản có khả năng bám dính

yếu Yamamoto và Yokota (1989) đã chỉ ra khả năng bám dính của chủng V

parahaemolyticus lâm sàng với niêm mạc ruột non có liên quan chặt chẽ với mức

độ đông tụ hồng cầu người hoặc chuột lang

Ngoài ra, còn có rất nhiều enzyme được cho là có vai trò trong khả năng gây

bệnh của V parahaemolyticus Baffone và cs (2001) đã thí nghiệm với một số

enzyme (lipase, gelatinase và hemolysin) để xem xét tính chất sinh hóa (khả năng bám dính, gây độc tế bào, và gây độc đường ruột) và các cơ chế gây bệnh đường

ruột của các chủng V parahaemolyticus phân lập được từ nước biển và tìm ra rằng

tất cả các chủng thí nghiệm đều có lipase và gelatinase hoạt động trong khi chỉ 10% dương tính với hoạt độ của hemolysin

Thêm vào đó, các nhà khoa học cũng chứng minh rằng khả năng phân giải

ure cũng có thể là một chỉ thị để xem xét đến khả năng gây bệnh của các chủng V

parahaemolyticus Abbot và cs (1989) là những người đầu tiên công bố về hiện

tượng này, kết quả nghiên cứu cho thấy các chủng có kiểu hình urease dương tính đều thuộc typ huyết thanh O4:K12 Kaysner và cs (1994a) cũng nghiên cứu và thấy

rằng những chủng có tdh dương tính phân lập được từ bệnh phẩm lâm sàng hay

ngoại cảnh đều có urease dương tính, trong khi Osawa và cs (1996) lại đưa ra báo

cáo rằng tất cả các chủng lâm sàng hay ngoại cảnh dương tính với trh đều sản sinh

ra urease [54] Iida và cs (1997) cũng phát hiện ra gen ure chịu trách nhiệm cho việc sản xuất urease ở V parahaemolyticus và nhận thấy giữa gen ure và trh có mối liên

kết về mặt di truyền khi cho cắt bằng enzyme nội bào Nguyên nhân được cho là do

các gen tdh, trh và ure có vị trí ở ngay gần nhau trên nhiễm sắc thể của các chủng V

parahaemolyticus gây bệnh [23] Những số liệu này cho thấy sự hiện diện của một

vùng gen riêng biệt có khả năng gây bệnh do hệ quả của quá trình chuyển gen do số

lượng GC của hai gen tdh và trh thấp hơn lượng GC trung bình của toàn bộ bộ gen ADN của V parahaemolyticus Khả năng gây bệnh giả định của đoạn gen riêng biệt

Một giả thuyết được đưa ra là chuyển gen được thực hiện qua filamentous phage

Do vậy, các nhà khoa học đã tiến hành thí nghiệm lai Southern blot để chứng minh

sự kết hợp của bộ gen filamentous phage vào ADN nhiễm sắc thể của V

parahaemolyticus [5] và một số giả thuyết khác cho rằng filamentous phage có liên

quan đến các chủng gây dịch (O3:K6, O4:K68 và O1:K không xác định) [22] Sự

chuyển gen qua plasmid cũng là một cách để V parahaemolyticus có thể nhận được các gen gây bệnh Có rất nhiều tài liệu chứng minh rằng gen tdh được tìm thấy ở rất nhiều loài Vibrio [20, 35, 36, 38] Có một số nghiên cứu khác lại nghiêng về giả thuyết có sự chuyển gen tdh qua trung gian plasmid giữa V parahaemolyticus và V

cholerae non-O1 [2, 20] Lin và cs 1993 đã khẳng định V parahaemolyticus

AQ3815 chứa operon ToxRS, đây là một gen điều hòa điều khiển quá trình biểu hiện của gen tdh tương tự như V cholerae [54]

1.2.8 Chủng V parahaemolyticus gây dịch type huyết thanh O3:K6

1.2.8.1 Nguồn gốc phát sinh chủng O3:K6 mới

Trong quá trình điều tra về bệnh nhân tiêu chảy nhập viện ở Calcutta, thành phố miền đông bắc Ấn Độ, bắt đầu từ tháng 2 năm 1996, các nhà khoa học nhận

thấy có sự gia tăng đột biến số lượng bệnh nhân tiêu chảy cấp do V

parahaemolyticus gây ra Khi phân tích các chủng phân lập được từ các bệnh nhân

này, người ta đã phát hiện ra đây là một type huyết thanh O3:K6 mới chưa từng xuất hiện từ trước tới nay ở Calcutta Chủng O3:K6 mới này lần đầu tiên được phân lập từ một người du lịch từ Indonesia đến Nhật vào năm 1995 Đáng chú ý nhất là

vụ dịch tả lần thứ 7 do Vibrio cholerae O1 gây ra cũng có xuất xứ từ đảo Sulawesi

của Indonesia Tuy nhiên, dựa theo hồ sơ nhập viện, nhóm bệnh nhân bị bệnh do type huyết thanh này lại bắt đầu từ tháng 2 năm 1996 Do vậy, với môi trường xã hội Calcutta tại thời điểm đó đã tạo điều kiện cho vi khuẩn này lây lan rất nhanh trong cộng đồng dân cư Thống kê các vụ dịch tiêu chảy tại Đài Loan cũng chỉ ra rằng type huyết thanh O3:K6 có thể đã xuất hiện từ tháng 10 năm 1995, khi các nhà

khoa học phân lập được ba chủng này từ một vụ dịch Bốn chủng O3:K6 tdh âm

tính phân lập được ở Nhật giữa năm 1983 và 1988 được nhóm với nhánh O3:K6

mới và kiểm tra bằng AP-PCR đã cho thấy trình tự ToxRS tương đồng Theo Okura

và cs, chủng O3:K6 này có thể có nguồn gốc từ những chủng không gây dịch sau

khi sở hữu gen tdh Do vậy, tại thời điểm này, các nhà khoa học cho rằng chủng

O3:K6 mới này có thể bắt nguồn từ Nhật Bản Thông thường, ở mỗi khu vực địa lý

lại có một type huyết thanh V parahaemolyticus đặc hiệu Những nghiên cứu ban

đầu tại Calcutta cho thấy type huyết thanh O1:K56 chiếm ưu thế trong các ca bệnh tiêu chảy, ca chứng và người lành mang trùng [43, 51] Dọc theo bờ vịnh phía tây

của Mexico và Mỹ, V parahaemolyticus O4:K13 là type huyết thanh nổi trội gây

nhiễm trùng Tuy nhiên, các ca bệnh nhiễm trùng do O3:K6 mới gây ra đã làm thay đổi sự phân bố type huyết thanh của vi khuẩn này Type huyết thanh này có khả năng lây lan nhanh chóng và trở thành type huyết thanh nổi trội thay thế các type huyết thanh khác tại cộng đồng dân cư mà nó gây bệnh Tại quận Aichi của Nhật

Bản, các vụ dịch do V parahaemolyticus O3:K6 gây ra tăng từ 3% trong khoảng

thời gian năm 1988 đến 1995 lên đến 75% trong khoảng thời gian từ năm 1996 đến

2001 [63]

1.2.8.2 Các biến thể của type huyết thanh O3:K6

Bằng các phương pháp đặc hiệu, các nhà khoa học đã xác định một cách dễ dàng nhanh chóng type huyết thanh O3:K6 mới và các type huyết thanh khác như O4:K68, O1:K25 và O1:KUT (không xác định) là những chủng cũng có trình tự

ToxRS, dữ liệu AP-PCR, ribotype và dữ liệu PFGE tương tự nhau Việc tìm ra

filamentous phage f237 ở chủng O3:K6 đã đem lại khả năng phát triển một phương pháp PCR đặc hiệu với mục tiêu là khuếch đại gen ORF8 của f237 Đây được coi là một chỉ thị phân tử của chủng O3:K6 Sau đó, các nhà khoa học đã phát hiện ra có một số type huyết thanh khác ngoài O3:K6 cũng có gen này Ngoài các type huyết thanh O4:K68, O1:K25, O1:KUT, các nhà khoa học cũng tìm thấy ở Đài Loan một type huyết thanh khác là O6:K18 cũng có các chỉ thị phân tử tương đồng với

khác cũng có các kiểu gen và dữ liệu phân tử tương đồng với chủng O3:K6 mới và được coi là các “biến thể” của chủng O3:K6 này Các type huyết thanh này có thể được tạo ra bằng cách thay đổi kháng nguyên O:K và mặc nhiên trở thành một dòng phát sinh từ type huyết thanh O3:K6

1.3 Các phương pháp chẩn đoán

1.3.1 Phương pháp nuôi cấy phân lập

 Nguyên lý

Dựa vào tính chất V parahaemolyticus không lên men đường saccharose nên

có thể sử dụng môi trường thạch TCBS hay môi trường thạch Chrom để phân lập vi khuẩn này

- Trên môi trường thạch TCBS: khuẩn lạc V parahaemolyticus có màu

xanh ghi, đường kính từ 3-5 mm

Hình 1.2 Khuẩn lạc V parahaemolyticus trên môi trường thạch TCBS

- Trên môi trường thạch Chrom: khuẩn lạc V parahaemolyticus có màu

tím hoa cà, đường kính từ 3-5 mm

Hình 1.3 Khuẩn lạc V parahaemolyticus trên môi trường thạch Chrom

Hình 1.4 Tính chất sinh hóa của V parahaemolyticus

 Ưu, nhược điểm

- Đối với môi trường thạch TCBS: Là môi trường truyền thống thường

được dùng để phân lập V cholerae và V parahaemolyticus với các chỉ thị

màu khuẩn lạc đặc trưng Tuy nhiên, môi trường này lại không phân biệt

rõ giữa V parahaemolyticus và V vulnificus vì đều có khuẩn lạc màu xanh dương

Bảng 1.4 So sánh đặc điểm khuẩn lạc trên môi trường thạch TCBS

Vi khuẩn Đặc điểm khuẩn lạc

V parahaemolyticus Xanh dương

V vulnificus Xanh dương

- Đối với môi trường thạch Chrom: phân lập V parahaemolyticus từ môi

trường thạch Chrom là phương pháp mới tiến bộ hơn dùng môi trường thạch TCBS Nó khắc phục nhược điểm của TCBS và là môi trường thuận lợi hơn cho sự phát triển của vi khuẩn này [17]

Bảng 1.5 So sánh đặc điểm khuẩn lạc trên môi trường thạch Chrom

Vi khuẩn Đặc điểm khuẩn lạc

V parahaemolyticus Tím hoa cà

- Đây là phương pháp đơn giản, dễ thực hiện, tuy nhiên có thể bỏ sót vi khuẩn gây bệnh do dựa nhiều vào các đặc điểm sinh hóa truyền thống trong khi các tính chất này có thể bị thay đổi do tác động của ngoại cảnh

1.3.2 Phương pháp sinh học phân tử

1.3.2.1 Kỹ thuật lai ADN

ADN tổng số được tách ra và xử lý với enzym giới hạn (có trường hợp không cần xử lý với enzym giới hạn) sau đó điện di trên gel agarose và chuyển lên màng lai Mẫu dò được chuẩn bị và lai với màng ADN ở trên Kết quả phép lai cho biết sự khác biệt giữa các mẫu ADN khác nhau

Năm 1985, Nishibuchi và cs đã nghiên cứu thành công mẫu dò ADN đặc

hiệu nhằm phát hiện sự có mặt của V parahaemolyticcus thông qua gen tdh Tuy

nhiên, mẫu dò này lại có phản ứng chéo với một số chủng KP âm tính Một thời gian ngắn sau đó, năm 1986, Nishibuchi và cs đã đánh giá 4 mẫu dò ribonucleotid

tổng hợp tương ứng với các vùng khác nhau của tdh và phát hiện ra trong điều kiện

lai chặt chẽ, hai trong số 4 mẫu dò vẫn có khả năng phân biệt các chủng KP dương tính với âm tính hoặc với dương tính yếu [54]

1.3.2.2 Kỹ thuật PCR

Kỹ thuật PCR dựa trên sự xúc tác của enzym ADN polymerase để nhân bản một đoạn ADN nhờ hai đoạn mồi oligonucleotid (primers) tương hợp với hai đầu 3`

ở hai mạch đơn của đoạn ADN

Sau khi phân lập bệnh phẩm trên môi trường đặc hiệu, các khuẩn lạc nghi

ngờ sẽ được tiến hành tách ADN làm khuôn mẫu cho PCR để tìm gen ToxR là gen đặc trưng cho V parahaemolyticus

Phương pháp này có những ưu điểm là độ đặc hiệu cao, khắc phục được nhược điểm của các thử nghiệm sinh hóa Tuy nhiên đây là một phương pháp đòi hỏi phải có máy móc, trang thiết bị và sinh phẩm đắt tiền nên không phải phòng thí nghiệm nào cũng có khả năng thực hiện

1.3.2.3 Kỹ thuật Real-time PCR

Real-time PCR là phản ứng PCR mà quá trình nhân bản ADN (hay ARN) được theo dõi trực tiếp trên máy luân nhiệt theo từng chu kỳ nhiệt Do đó có thể phát hiện và định lượng được nồng độ sản phẩm sau mỗi chu kỳ nhiệt dựa trên cường độ phát huỳnh quang Phương pháp Real-time PCR cho phép kiểm tra sự tồn tại của vi khuẩn gây bệnh trong thực phẩm

Blackstone và cs 2003 là người đầu tiên nghiên cứu ứng dụng Real-time

PCR để phát hiện gen tdh của V parahaemolyticus Sau đó, năm 2004, Davis và cs

đã phát triển phương pháp này để phát hiện thêm các gen tlh, tdh và trh với các mẫu

dò TaqMan đính huỳnh quang khác nhau [54] Gần đây, kỹ thuật Real-time PCR

còn được nghiên cứu phát hiện gen ToxR để phát hiện V parahaemolyticcus trong

sò và nước biển [56]

1.4 Ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử trong nghiên cứu và chẩn đoán V

parahaemolyticus

1.4.1 Trên thế giới

Các phương pháp định loại dịch tễ học kinh điển như nuôi cấy, định type huyết thanh, định type sinh học, giúp điều tra mô tả các đặc điểm dịch tễ học của

các vụ dịch do V parahaemolyticus gây ra Tuy nhiên các phương pháp xác định

kiểu hình này (mô tả hiện tượng) đòi hỏi nhiều công sức, thời gian và thường cho

những kết quả khác nhau trong việc phân biệt các chủng vi khuẩn V

parahaemolyticus từ các vụ dịch khác nhau

Để khắc phục những hạn chế này, các nhà khoa học đã dựa vào hệ gen của vi

khuẩn V parahaemolyticus để nghiên cứu tính đa dạng của vi khuẩn và phát triển các phương pháp sinh học phân tử để xác định mối liên quan giữa các chủng V

parahaemolyticus phục vụ cho công tác giám sát dịch tễ học của các vụ ngộ độc

thức ăn do vi khuẩn này gây ra Dưới đây là một số phương pháp sinh học phân tử

thường dùng để nghiên cứu các đặc tính và phân loại V parahaemolyticus:

1.4.1.1 Phương pháp PCR

Ngoài việc sử dụng kỹ thuật PCR để chẩn đoán nhiễm khuẩn có nguyên nhân

do V parahaemolyticus, phương pháp này còn được sử dụng để nghiên cứu đặc tính của các chủng V parahaemolyticus phân lập được

Bej và cs (1999) đã thiết kế ra một phản ứng PCR đa mồi để phát hiện các

gen tdh, trh và tlh của các chủng V parahaemolyticus gây bệnh Tiếp tục nghiên

cứu sâu hơn về chủng vi khuẩn gây dịch O3:K6, các nhà khoa học trên thế giới đã

tiến hành nghiên cứu và đưa ra kết luận V parahaemolyticus O3:K6 dòng mới là

nguyên nhân cho sự gia tăng số lượng các ca bệnh tiêu chảy trên thế giới bắt đầu từ năm 1996 Việc tách dòng O3:K6 mới này được khẳng định bằng cách giải trình tự

gen ToxRS, đây là một trình tự thường dùng để phân tích lập cây phả hệ của họ

Vibrio Gen ToxR được phát hiện ra đầu tiên ở Vibrio cholerae và là gen điều hòa

độc tố tả [10, 31] Sau đó, ToxR cũng được tìm thấy ở V parahaemolyticus với vai trò điều hòa tương tự [29] Gen này được hỗ trợ bởi gen toxS ở ngay trình tự phía

dưới Hai gen này kết hợp điều hòa các gen gây độc trong vi khuẩn này [10] Quá

trình nghiên cứu cho thấy trình tự ToxRS của các chủng thuộc dòng O3:K6 mới

khác với các chủng O3:K6 phân lập được trước năm 1995 ở ít nhất 7 vị trí base trong vùng dài 1346 bp Do vậy, các nhà khoa học đã thiết lập một phương pháp PCR mới để tìm ra 2 vị trí base đặc hiệu duy nhất của dòng O3:K6 mới và được gọi

là GS-PCR (hình 1.5) GS-PCR phân biệt rõ các điểm khác nhau của tất cả các

chủng thuộc dòng O3:K6 mới với những chủng O3:K6 đã được phân lập trước đây Phương pháp PCR mới này cũng được dùng để kiểm tra các chủng huyết thanh

khác ngoài O3:K6 Kết quả đã phát hiện ra các chủng có gen tdh dương tính và không có gen trh thuộc chủng O4:K68 và O1:K không xác định, những chủng phân

lập được ở ba nước và những chủng từ những người du lịch từ năm 1997 đều cho kết quả dương tính Các dữ liệu của AP-PCR cũng cho thấy những chủng này tương

đồng với những chủng thuộc dòng O3:K6 mới, và trình tự ToxRS thì tương đồng

100% Kết quả này chỉ ra rằng những chủng này có thể bắt nguồn từ dòng O3:K6 mới bằng cách thay đổi kháng nguyên O:K Nghiên cứu này đã chỉ ra những bằng

chứng thuyết phục cho việc sử dụng phản ứng PCR xác định gen ToxRS là cực kỳ

hữu ích trong việc theo dõi điều tra sự phát tán của dịch bệnh [30]

Hình 1.5 Vị trí cặp mồi khuếch đại trình tự ToxRS

và vị trí các base khác nhau giữa dòng O3:K6 cũ và mới

1.4.1.2 Phương pháp xác định genotype

Trước đây công tác phân loại vi sinh vật vẫn căn bản dựa trên các đặc tính hình thái, sinh lý và hóa vi sinh vật: nhuộm, hình dạng tế bào khuẩn lạc, khả năng di động, nhu cầu dinh dưỡng, khả năng sinh axít trong môi trường cũng như sắc tố tạo thành v.v… Các đặc trưng này đôi khi cũng bộc lộ những hạn chế do các đặc tính được dùng cho nhóm vi sinh vật này (Enterobacteriaceae) nhưng lại không có ý nghĩa đối với nhóm khác (vi khuẩn gram âm - gram negative bacteria) Hạn chế của các phương pháp phân loại truyền thống dẫn đến nhiều trường hợp phải xác định lại tên phân loại của một số vi sinh vật Từ trước đến nay, đơn vị cơ bản của định tên vi sinh vật là loài, bao gồm nhóm các vi sinh vật có mức độ tương đồng cao về các đặc điểm hình thái Chính vì vậy, việc sử dụng phương pháp sinh học phân tử trong phân loại vi sinh vật là phương pháp hiệu quả đưa lại độ chính xác cao

Nguyên lý

Phương pháp PFGE sử dụng kỹ thuật điện di trong trường xung điện (điện di trong trường điện thay đổi, PFGE) [66] Trước tiên các mẫu đưa vào phân tích phải được xử lý trước bằng loại enzyme giới hạn Kết quả phải tạo ra được các mảnh ADN có kích thước lớn (50 kb-12 Mb) Với kích thước này, các mảnh ADN không thể điện di theo phương pháp thông thường mà chỉ có thể tách ra bằng kỹ thuật PFGE Kỹ thuật PFGE lần đầu tiên được Schwartz va Cantor (1984) giới thiệu Mục đích của kỹ thuật này là tăng khả năng di động của các mảnh ADN có kích thước lớn trong điện trường, do đó các thành phần gel và đệm hầu như không thay đổi theo các phương pháp điện di thông thường Khi tiến hành điện di trong PFGE lực làm thay đổi khả năng di động của ADN là trường điện tích thay đổi liên tục dẫn đến các mảnh ADN có kích thước khác nhau thay đổi hướng di động Kết quả thu được là các mảnh ADN có kích thước khác nhau sẽ có khả năng di động khác nhau Kích thước càng lớn thì mức độ di động càng chậm Sự di động khác nhau của ADN chủ yếu phụ thuộc vào kích thước chứ không phải do gel agarose như ở

Tiêu chuẩn đánh giá kết quả PFGE

Qua qua trình tiến hóa và chọn lọc tự nhiên, vi khuẩn thay đổi nhiều dạng do đột biến gen Bằng kỹ thuật PFGE sự liên quan về gen của các chủng vi khuẩn với chủng vi khuẩn gây dịch được chia làm 4 mức độ [65]:

- Giống nhau hoàn toàn: không có băng khác nhau

- Mối liên quan gần (Closed related): 2-3 băng khác nhau

- Có thể liên quan gần (Posible related): 4-6 băng khác nhau

- Khác nhau hoàn toàn (Diferent): ): ≥ 7 băng khác nhau

Phân tích kết quả PFGE

- Dựa vào số lượng băng giống hoặc khác nhau giữa các chủng vi khuẩn Các chủng vi khuẩn được coi là đồng dạng di truyền nếu hoàn toàn giống hệt nhau về số lượng và kích thước băng PFGE Các chủng vi khuẩn được coi là khác nhau nếu có một hay nhiều băng khác nhau Theo Tenover và

cs, các băng ADN của các chủng được định danh là type A khi chúng có kiểu gen PFGE hoàn toàn giống với chủng gây dịch Những chủng có kiểu gen liên quan gần hoặc có khả năng liên quan đến chủng gây dịch được phân type tiếp thành type A1, A2, v.v Đây là những chủng có khả năng

có mối liên quan dịch tễ với chủng gây dịch Những chủng có kiểu gen không liên quan, không giống với chủng gây dịch được định danh type B, type C, v.v và được cho là không có mối liên quan dịch tễ với chủng gây dịch

- Phân tích dựa vào phần mềm: phân tích mức độ giống hoặc khác nhau qua cây phả hệ (UPGMA)

Tuy nhiên, kỹ thuật này vẫn còn phải lưu ý tại một số điểm sau:

- Đòi hỏi phải có trang thiết bị chuyên dụng, kỹ thuật cũng như kinh nghiệm vì việc tách nhiễm sắc thể đôi khi gặp khó khăn trên một số đối tượng vi sinh vật

- Kỹ thuật PFGE không đủ nhạy để phát hiện những sai khác nhỏ giữa các mẫu, đặc biệt khi thực hiện với một enzyme thì kết quả có thể giống nhau nhưng không chắc chắn là hai mẫu giống nhau hoàn toàn Điều đó có nghĩa là kỹ thuật này nên dùng để xác định sự khác nhau giữa các mẫu,

kỹ thuật không đủ tin cậy để xác định sự giống nhau giữa các mẫu Tuy nhiên ngay cả khi xác định sự khác nhau, đôi khi các mẫu có plasmid nhỏ hay thực khuẩn thể cũng cần xét đến vì chính nguồn ADN này cũng tạo

ra những sai khác giả

- Sự khác biệt giữa các mẫu có thể phát hiện được khi dùng các enzyme giới hạn khác nhau

Wong và cs (1996) đã nghiên cứu 130 chủng V parahaemolyticus phân lập

từ Đài Loan bằng phương pháp PFGE Kết quả thu được có 14 kiểu PFGE và 39 phân đoạn; các chủng lâm sàng phân lập được ở nội địa được nhóm vào 4 loại và có rất ít sự tương đồng với các chủng lâm sàng ở nước khác Khi dùng phương pháp

PFGE để phân loại 315 chủng V parahaemolyticus từ các hải sản bị nhiễm khuẩn,

kết quả thu được là 96 phân đoạn và 22 loại Gần đây, Hara-Kudo và cs (2003) đã

sử dụng phương pháp PFGE để nghiên cứu và thấy rằng các chủng TDH âm tính khác xa so với chủng TDH dương tính và dù không cùng chung chủng huyết thanh, các chủng TDH dương tính vẫn có quan hệ gần gũi với nhau [54]

1.4.1.3 Kỹ thuật Ribotyping

Đây là một phương pháp định loại phổ biến sử dụng ADN nhiễm sắc thể và một đoạn dò ARN của ribosome Do tất cả các chủng vi khuẩn có một hay nhiều operon ARN thông tin phân bố quanh nhiễm sắc thể, trình tự các operon này có tính bảo tồn cao Do vậy vi khuẩn có thể được định loại bằng việc sử dụng các đoạn dò hướng trực tiếp tới trình tự ADN mã hóa các ARN thông tin này

DePaola và cs 2003 đã sử dụng phương pháp định danh bằng ribotyping và

định danh bằng huyết thanh để xem xét đặc tính của các chủng V parahaemolyticus