Đánh giá và lựa chọn các chủng xạ khuẩn nội cộng sinh trên cây quế thu thập tại tỉnh yên bái có khả năng sinh kháng sinh cao

Bảng 3.1 Số liệu thống kê khả năng kháng vi sinh vật kiểm định của 105 chủng xạ khuẩn nội cộng sinh phân lập từ cây quế 33 Bảng 3.2 Bảng số liệu khả năng kháng 9 loại vi sinh vật kiểm đị

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các số liệu và các kết quả thí nghiệm trình bày trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác Những số liệu trong các bảng biểu phục

vụ cho việc phân tích, nhận xét, đánh giá được chính tác giả thu thập từ các nguồn khác nhau có ghi rõ trong phần tài liệu tham khảo

Nếu phát hiện có bất kỳ sự gian lận nào tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về nội dung luận văn của mình

Hà Nội, ngày 01 tháng 03 năm 2016

Đinh Thị Mỹ Linh

LỜI CẢM ƠN

Trước hết tôi xin bày tỏ sự biết ơn sâu sắc tới TS Vũ Thu Trang, Viện Công Nghệ Thực Phẩm, Đại Học Bách Khoa Hà Nội, TS Phí Quyết Tiến, Phòng Công nghệ lên men, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành đề tài

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới TS Chu Kỳ Sơn, Viện Công Nghệ Thực Phẩm, Đại Học Bách Khoa Hà Nội, tới ThS Vũ Hạnh Nguyên, ThS Quách Ngọc Tùng cùng các cán bộ Phòng Công nghệ lên men, Viện Công nghệ sinh học đã động viên và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài

Tôi xin cảm ơn các Thầy, Cô, các Lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học và Công Nghệ Thực Phẩm, Đại Học Bách Khoa Hà Nội, đã giảng dạy và chỉ bảo tôi trong quá trình tích luỹ kiến thức và nghiên cứu khoa học

Tôi xin cảm ơn Lãnh đạo Viện Công nghệ Sinh học - Viện Hàn lâm Khoa Học và Công nghệ Việt Nam, Phòng Thí nghiệm trọng điểm công nghệ gen Quốc gia, nơi tôi làm việc, đã tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thiện khóa luận

Cuối cùng, tôi xin tỏ lòng biết ơn đến gia đình và bè bạn, những người luôn động viên khích lệ, giúp tôi vượt qua những khó khăn trong quá trình học tập và nghiên cứu

Hà Nội, ngày 01 tháng 03 năm 2016

Đinh Thị Mỹ Linh

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

4 EDTA Ethylene diamine tetra-acetic acid

11 PKS-II Polyketide synthases II

12 NRPS Nonribosomal peptide synthetase

14 PCR Phản ứng chuỗi trùng hợp (Polymerase

chain reaction)

Bảng 3.1 Số liệu thống kê khả năng kháng vi sinh vật kiểm định của

105 chủng xạ khuẩn nội cộng sinh phân lập từ cây quế

33

Bảng 3.2 Bảng số liệu khả năng kháng 9 loại vi sinh vật kiểm định của

36 chủng xạ khuẩn

36

Bảng 3.3 Khuếch đại gen mã hóa PKS-I, PKS-II, NRPS và khả năng

sinh anthracycline của 436 chủng xạ khuẩn nội cộng sinh

41

Bảng 3.4 Màu sắc khuẩn lạc của chủng YBQ75 khi nuôi cấy trên các

môi trường khác nhau

45

Bảng 3.5 Khả năng đồng hóa nguồn carbon và sử dụng nguồn nitơ của

chủng xạ khuẩn YBQ75 sau 7-14 ngày nuôi cấy ở 30oC

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ

Hình 1.1 Ảnh quét hiển vi điện tử của bề mặt lá dưa chuột sau 8 ngày

gây nhiễm với Streptomyces sp

13

Hình 3.1 Hoạt tính kháng P vulgaris (A), S epidermidis ATTC 12228

(B) của một số chủng xạ khuẩn nội cộng sinh

34

Hình 3.2 Phổ kháng khuẩn của 36 chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng

khuẩn

38

Hình 3.3 Điện di đồ sản phẩm PCR khuếch đại gen pks-I của một số

chủng xạ khuẩn đại diện

39

HÌnh 3.4 Điện di đồ sản phẩm PCR khuếch đại gen pks-II của một số

chủng xạ khuẩn đại diện

40

Hình 3.5 Điện di đồ sản phẩm PCR khuếch đại gen nrps của một số

chủng xạ khuẩn đại diện

40

Hình 3.6 Sự thay đổi màu sắc theo pH môi trường của chủng YB50 tại

thời điểm trước (A) và sau (B) khi thử phản ứng màu

43

Hình 3.7 Điện di đồ sản phẩm PCR khuếch đại gen pks-I, pks-II và

nrps của chủng YBQ75

44

Hình 3.8 Đặc điểm hình thái của chủng YBQ75 trên các môi trường

nuôi cấy khác nhau (A) Khuẩn ty khí sinh, (B) Khuẩn ty cơ

chất

46

Hình 3.9 Hình thái khuẩn lạc trên môi trường ISP2 47

Hình 3.10 Hình ảnh bề mặt chuỗi bào tử (A) dưới kính hiển vi điện tử

MỤC LỤC

Trang

LỜI CAM ĐOAN 2

LỜI CẢM ƠN 3

DANH MỤC CÁC BẢNG 5

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ 6

MỞ ĐẦU 10

PHẦN I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 12

1.1 Xạ khuẩn nội cộng sinh trên thực vật và cây dược liệu 12

1.1.1 Khái niệm xạ khuẩn nội cộng sinh và mối tương tác giữa xạ khuẩn với thực vật.……….12

1.1.2 Đặc điểm sinh học và phân loại của xạ khuẩn nội cộng sinh 14

1.1.3 Ứng dụng của xạ khuẩn nội cộng sinh 16

1.1.4 Tình hình nghiên cứu xạ khuẩn nội cộng sinh 18

1.1.4.1 Tình hình nghiên cứu xạ khuẩn nội cộng sinh trên thế giới 18

1.1.4.2 Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam 19

1.2 Khả năng sinh kháng sinh của xạ khuẩn nội cộng sinh trên cây dược liệu và một số gen chức năng liên quan 20

1.2.1 Đánh giá khả năng sinh kháng sinh của xạ khuẩn nội cộng sinh 20

1.2.2 Gen mã hoá enzyme polyketide (PKS-I, PKS-II) và nonribosomal peptide synthetase (NRPS) sinh tổng hợp kháng sinh 21

1.2.2.1 Gen chức năng gen pks-I, pks-II 22

1.2.2.2 Gen chức năng NRPS 22

1.2.3 Chất kháng sinh và kháng ung thư nhóm anthracycline 23

1.3 Tác dụng của cây quế và tiềm năng khai thác xạ khuẩn nội cộng sinh trên cây quế 24

PHẦN II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 26

2.1 Vật liệu nghiên cứu 26

2.1.1 Chủng giống 26

2.1.2 Hóa chất 26

2.1.3 Thiết bị 26

2.1.4 Môi trường nuôi cấy 27

2.2 Phương pháp nghiên cứu 27

2.2.1 Đánh giá hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định 27

2.2.2 Phương pháp xử lý số liệu 28

2.2.3 Khuếch đại gen mã hoá PKS-I, PKS-II, NRPS 28

2.2.4 Nghiên cứu đặc điểm sinh học của chủng xạ khuẩn YBQ75 29

2.2.4.1 Quan sát đặc điểm hình thái khuẩn lạc, khả năng sinh melanin 29

2.2.4.2 Quan sát đặc điểm cuống sinh bào tử và bề mặt bào tử 30

2.2.4.3 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa 30

2.2.5 Phân loại chủng xạ khuẩn HBQ75 dựa trên phân tích trình tự gen 16S rDNA ……… 31

PHẦN III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 33

3.1 Khả năng kháng vi sinh vật kiểm định của các chủng xạ khuẩn phân lập từ cây Quế…… ……… 33

3.1.1 Khả năng kháng vi sinh vật kiểm định của các chủng xạ khuẩn phân lập từ cây Quế……… ……… 33

3.1.2 Xác định gen mã hoá polyketide synthase (PKS-I, PKS-II) và nonribosomal peptide synthetase (NRPS) tham gia sinh tổng hhợp kháng sinh của các chủng xạ khuẩn……….………39

3.1.3 Khả năng sinh hợp chất thuộc nhóm anthracyline của các chủng xạ khuẩn……… ……… 43

3.2 Đặc điểm sinh học và phân loại của chủng xạ khuẩn YBQ 075 44

3.2.1 Đặc điểm hình thái và bề mặt chuỗi bào tử 45

3.2.2 Đặc điểm sinh hóa 48

3.2.2.1 Khả năng đồng hóa các nguồn cacbon và sử dụng nguồn nito 48

3.2.2.2 Ảnh hưởng của nồng độ muối, pH, nhiệt độ đến sinh trưởng của chủng xạ khuẩn 49

3.2.3 Phân loại dựa trên xác định trình tự gen mã hoá 16s rDNA của chủng xạ

khuẩn YBQ75……… ……… 50

3.2.3.1 Khuếch đại gen 16S rDNA 50

3.2.3.2 Phân tích trình tự gen 16S rDNA 51

PHẦN IV KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 53

PHỤ LỤC 60

Trong số 8.000 chất kháng sinh đã được biết đến trên thế giới thì trên 80% là

do xạ khuẩn sinh ra Nhiều loại thuốc kháng sinh mới đã được phát hiện từ xạ khuẩn như munumbicins A-D, celastramycins A-B, kakadumycins hay demethylnovobiocins Bên cạnh khả năng sinh sản phẩm trao đổi chất có hoạt tính sinh học như chất kháng sinh Một số công bố cho thấy các hợp chất chuyển hóa thứ cấp do xạ khuẩn nội cộng sinh tạo ra trên cây dược liệu rất đa dạng về chức năng như chống ôxi hóa và kiểm soát sinh học Trong 15 năm gần đây, nhiều công trình nghiên cứu công bố kết quả khai thác các chất kháng sinh từ xạ khuẩn nội cộng sinh trên các loại cây dược liệu khác nhau như: Năm 2002, kháng sinh munumbicins A-

D sinh ra bởi chủng xạ khuẩn Streptomyces sp.NRRL 30562 trên cây mộc lan; Năm

2007, chất chống ung thư Naphthomycin K sinh ra bởi chủng Steptomyces sp.CS

nội cộng sinh trên cây mỹ đăng mộc

Cây Quế (Cinnamomum sp.) là loài dược liệu phổ biến ở Việt Nam, được

biết đến như vị thuốc bổ được sử dụng rộng rãi trong đông y cổ truyền và thực phẩm Các nghiên cứu đã chứng minh, tinh dầu của cây quế có tính chất chống co mạch, làm tăng bài tiết, tăng nhu động ruột, chống oxy hóa với hiệu quả 55,94% và 66,9% khi dùng nồng độ 100 ppm và 200 ppm (parts per million) Hoạt chất cinnamaldehyde trong tinh dầu quế có hoạt tính kháng khuẩn cao đối với cả vi

khuẩn Gram (+) và vi khuẩn Gram (-) Ngoài giá trị dược lý từ thành phần của cây

mang lại, cây quế còn là môi trường sinh trưởng của xạ khuẩn nội cộng sinh Song song với tác dụng dược phẩm thu nhận từ xạ khuẩn nội cộng sinh như nguồn thuốc kháng sinh mới, một vài nhà sinh vật học đã chứng minh xạ khuẩn thúc đẩy tăng trưởng của cây chủ, cũng như giảm nguy cơ nhiễm mầm bệnh và tăng cường ái lực với các điều kiện sống khác nhau Những hiểu biết về sinh lý và mối tương tác phân

tử giữa xạ khuẩn và thực vật là chìa khóa để sử dụng những đặc tính có lợi của xạ khuẩn nội cộng sinh trong kích thích sinh trưởng ở thực vật

Tuy nhiên, cho đến nay, chưa có nhiều công trình nghiên cứu về xạ khuẩn nội cộng sinh trên cây quế nói riêng và cây dược liệu nói chung được công bố Tại Việt Nam, nhóm tác giả Quách Ngọc Tùng thuộc Viện Công Nghệ Sinh Học, Viện Hàn Lâm và Khoa Học Việt Nam đã có những bước đầu trong nghiên cứu xạ khuẩn nội cộng sinh trên cây quế Nối tiếp thành công của nhóm tác giả và xuất phát từ

những định hướng trên, chúng tôi thực hiện nghiên cứu đề tài: "Đánh giá và lựa chọn các chủng xạ khuẩn nội cộng sinh trên cây quế thu thập tại tỉnh Yên Bái có khả năng sinh kháng sinh cao"

Đề tài được kết hợp thực hiện tại Phòng Công nghệ lên men, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam và Viện Công nghệ sinh học và Công nghệ thực phẩm – Đại học Bách Khoa Hà Nội, gồm 3 nội dung chính:

1 Đánh giá khả năng kháng vi sinh vật kiểm định các chủng xạ khuẩn nội cộng

sinh được phân lập tại Tỉnh Yên Bái

2 Đánh giá sự có mặt của ba gen mã hóa các enzyme tham gia vào quá trình

tổng hợp kháng sinh gồm polyketide synthases (PKS-I, PKS-II) và nonribosomal peptide synthetase (NRPS)

3 Tuyển chọn, nghiên cứu đặc điểm sinh học và phân loại của một chủng xạ

khuẩn có khả năng sinh tổng hợp kháng sinh cao

PHẦN I TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Xạ khuẩn nội cộng sinh trên thực vật và cây dược liệu

1.1.1 Khái niệm xạ khuẩn nội cộng sinh và mối tương tác giữa xạ khuẩn với

thực vật

Đã có nhiều định nghĩa về vi sinh vật nội cộng sinh được đưa ra từ khi Smith

phân lập thành công chủng xạ khuẩn Micromonospora sp, có khả năng ức chế nấm bệnh Fusarium oxysporum trong mô tế bào cà chua không nhiễm bệnh vào năm

1957 [45] Hiện nay, định nghĩa của Bacon và White (2000): "VSV nội cộng sinh là những VSV sinh trưởng trong mô tế bào thực vật, mà không gây ra những hiệu ứng xấu nào tới cây chủ" đã được các nhà vi sinh vật học thừa nhận [8] Ngoài ra, VSV còn đóng vai trò khác như kích thích sinh trưởng, tăng cường khả năng trao đổi chất, kháng VSV [7]

Trong số các VSV nội cộng sinh, xạ khuẩn được chú ý bởi khả năng tổng hợp kháng sinh ức chế VSV gây bệnh [30] Sự đa dạng của xạ khuẩn cộng sinh trong cây chủ là vô cùng phong phú về mặt số lượng và hoạt tính sinh học Khi nghiên cứu về xạ khuẩn nội cộng sinh, câu hỏi đặt ra là làm sao xạ khuẩn có thể hình thành mối quan hệ cộng sinh với cây chủ? Để làm sáng tỏ câu hỏi trên, các nhà nghiên cứu phải giải thích được cách xâm nhập và sự sinh trưởng của xạ khuẩn trong các bộ phận của cây và mô tế bào Các nhà khoa học đã gây nhiễm chủng

Streptomyces scabies trên bề mặt củ khoai tây Sau 4-6 ngày, chủng Streptomyces scabies hình thành mạng lưới phủ trên bề mặt củ khoai tây và xâm nhập vào củ

thông qua lỗ trên bề mặt vỏ non hay vết thương khi khoai tây đang trong giai đoạn

phát triển Nối tiếp thí nghiệm trên, tiến hành lây nhiễm chủng S ipomoeae trên rễ

khoai tây đã cho kết quả tương tự Từ kết quả nghiên cứu này, các nhà vi sinh vật học đã khẳng định rằng hầu hết xạ khuẩn hình thành hệ sợi phát triển trên bề mặt cây và xâm nhập vào vật chủ thông qua các lỗ hở tự nhiên hay tổn thương do côn trùng [30]

Xạ khuẩn nội cộng sinh xâm nhập vào cây chủ rất sớm và ảnh hưởng đến sự phát triển của vật chủ Gần đây, Franco (2007) đã quan sát khuẩn lạc của chủng xạ khuẩn EN27-GFP ở rễ tinh, đặc biệt tại các điểm nối, nhận thấy tại các vết nứt xung quanh rễ hình thành bào tử trong 3-4 tuần [17] Kết quả cho thấy sự lây nhiễm chủng xạ khuẩn vào rễ cây thông qua các đường nứt trên rễ và sau đó nhân lên trong các mô tế bào Trong nghiên cứu của mình, Shimizu và cộng sự đã nuôi cấy

Streptomyces sp MBCu-56 trên lá dưa chuột và theo dõi sự phát triển Ban đầu,

khuẩn ty phát triển mạnh trên bề mặt lá và hình thành khối hệ sợi dày đặc, nhất là ở nhánh phân chia các tế bào biểu bì Một số sợi đã xâm nhập lớp biểu bì và phát triển

sang các tế bào biểu bì khác (Hình 1.1) [41]

Năm 2005, Suzuki và cộng sự đã chứng minh quá trình xâm nhập vào mô lá

cây đỗ quyên của chủng S galbus MBR-5, xác nhận rằng hệ sợi của chủng xâm

nhiễm vào mô tế bào lá đã bị tổn thương thông qua các lỗ không khí Ngoài ra, chủng MBR-5 được chứng minh là có khả năng sinh các enzyme thủy phân cellulose, xylanase và pectinase Hỗn hợp enzyme từ khuẩn ty tăng cường khả năng bám dính [47]

Hình 1.1 Ảnh quét hiển vi điện tử của bề mặt lá dưa chuột sau 8 ngày gây

nhiễm với Streptomyces sp MBCu-56 (A) Hệ sợi trên bề mặt lá (B) Hệ sợi của

xạ khuẩn xâm nhập và phát triển dưới bề mặt của lớp biểu bì [41]

1.1.2 Đặc điểm sinh học và phân loại của xạ khuẩn nội cộng sinh

Theo hệ thống phân loại hiện nay, xạ khuẩn thuộc nhóm Prokaryota, thuộc giới Monera trong hệ 5 giới của Whittaken, còn theo hệ thống phân loại chia sinh giới thành 7 giới thì xạ khuẩn thuộc giới Prokaryota [1] Xạ khuẩn nội cộng sinh sống trong các cơ quan khác nhau (rễ, thân, lá, hoa, quả và hạt) của cây chủ và chủ yếu cư trú trong khoảng không giữa các mô hoặc nội bào Đáng chú ý, thực vật có khoảng 300.000 loài trên trái đất [15], mỗi loài thực vật là nơi

cư trú của rất nhiều loài xạ khuẩn nội cộng sinh

* Đặc điểm hình thái tế bào, bào tử

Đặc điểm nổi bật của xạ khuẩn là có hệ sợi phát triển, phân nhánh mạnh

và không có vách ngăn (chỉ trừ cuống bào tử khi hình thành bào tử) Hệ sợi xạ khuẩn mảnh hơn của nấm mốc với đường kính thay đổi trong khoảng 0,2 - 1μm đến 2 - 3μm, chiều dài có thể đạt tới một vài centimet [1] Kích thước và khối lượng hệ sợi thường không ổn định và phụ thuộc vào điều kiện sinh lý và nuôi cấy Đây là một trong những đặc điểm phân biệt khuẩn lạc của xạ khuẩn và khuẩn lạc của nấm mốc vì hệ sợi của nấm mốc có đường kính rất lớn thay đổi từ

5 - 50 μm, dễ quan sát bằng mắt thường

Hình dạng khuẩn lạc của xạ khuẩn thường chắc, xù xì, có dạng da, dạng vôi, dạng nhung tơ hay dạng màng dẻo Đường kính của mỗi khuẩn lạc từ 0,5 – 2mm Màu sắc khuẩn lạc rất đa dạng: đỏ, da cam, vàng, nâu, xám, trắng… Trên môi trường cơ chất đặc hiệu, hệ sợi của xạ khuẩn phát triển thành hai loại: một loại cắm sâu vào trong môi trường gọi là hệ sợi cơ chất (khuẩn ty cơ chất – KTCC) với chức năng dinh dưỡng, một loại phát triển trên bề mặt thạch gọi là hệ sợi khí sinh (khuẩn ty khí sinh – KTKS) với chức năng chủ yếu là sinh sản

Theo Pridham và cộng sự chia cuống sinh bào tử xạ khuẩn chia thành 3 nhóm: RF cho những cuống sinh bào tử thẳng và lượn song; RA cho những cuống sinh bào tử xoắn, thô sơ và ngắn; S cho những cuống sinh bào tử phát triển mạnh và xoắn Bề mặt bào tử có ba dạng chính Sm (trơn nhẵn), sp (gai), wa (xù xì), ru (nếp nhăn), ha (tóc) [38]

* Đặc điểm sinh lý – sinh hóa

Đặc điểm sinh lý, sinh hóa là khả năng đồng hóa các nguồn cacbon và sử dụng các nguồn nitơ, nhu cầu về các chất kích thích sinh trưởng, khả năng biến đổi các chất khác nhau nhờ hệ thống enzyme Ngoài ra còn có nhu cầu về oxy, giới hạn pH, nhiệt độ tối ưu, khả năng chịu muối và các yếu tố khác của môi trường, mối quan hệ với chất kìm hãm sinh trưởng và phát triển khác nhau, tính chất đối kháng và nhạy cảm với chất kháng sinh, khả năng tạo thành chất kháng sinh và các sản phẩm trao đổi chất đặc trưng khác của xạ khuẩn

* Phân loại xạ khuẩn bằng phân tích trình tự gen 16S - rDNA

Năm 1957, Gauze và cộng sự đã công bố hệ thống phân loại mới, hệ thống này dựa vào màu sắc KTKS, KTCC, hình dạng bào tử và cuống sinh bào

tử, hệ thống này cũng được chỉnh lí và tái bản năm 1983 Số lượng hệ thống phân loại xạ khuẩn ngày một tăng trong những năm gần đây Đó là hình thức phân loại dựa trên đặc điểm hình thái và tính chất nuôi cấy

Từ những năm 80 trở lại đây, với sự phát triển mạnh mẽ của sinh học phân tử, các nhà khoa học đã có một công cụ mới để phân loại sinh vật đó là phân loại học phân tử Phương pháp này có ưu điểm là thời gian ngắn và có độ chính xác cao Phân loại học phân tử có thể dựa trên các gen hoặc các sản phẩm của gen Trong hệ thống phân loại xạ khuẩn hiện nay, thường sử dụng 3 phương pháp chính là lai DNA, lai RNA và phân tích trình tự gen mã hóa 16S – rDNA

Hiện nay, việc nghiên cứu phân tử rDNA là phương pháp hữu hiệu nhất

để xác định mối quan hệ trên cây phát sinh chủng loại, vì rDNA có mặt trong tất

cả các sinh vật, có chức năng xác định và có tính bảo thủ cao Chúng chỉ khác nhau rất ít giữa các nhóm sinh vật Tuy nhiên, dựa vào sự khác nhau này người

ta có thể đánh giá được mối quan hệ phát sinh chủng loại và phân loại các chủng

vi sinh vật Trong tế bào vi sinh vật nhân sơ, ribosome tồn tại trong tế bào chất, ribosome có cấu trúc gồm 2 tiểu phần, mỗi tiểu phần gồm có rDNA và protein riêng rẽ Ribosome ở VSV nhân sơ (70S) gồm 2 tiểu đơn vị 50S (gồm rDNA 5S, rDNA 23S và 34 phân tử protein) và 30S (gồm rDNA 16S và 21 phân tử

protein)

Các gen mã hóa 5S-rDNA, 16S-rDNA, 23S-rDNA nằm cạnh nhau, có cùng một operon và có cơ chế điều hòa chung Trong các loại rDNA thì 16S-rDNA là phù hợp nhất cho nghiên cứu phân loại xạ khuẩn vì gen mã hóa 16S-rDNA có kích thước khoảng 1540bp phù hợp cho nghiên cứu phân loại; còn gen

mã hóa 5S-rDNA có kích thước khoảng 120bp, tuy dễ xác định trình tự nhưng lại không đặc hiệu cho phân loại; còn gen mã hóa 23S-rDNA cũng là một gen tiềm năng cho phân tích so sánh trình tự để phân loại sinh vật nhân sơ nhưng trình tự của gen này lại tương đối lớn 2900bp, gây khó khăn cho tách dòng và phân tích trình tự nên ít được sử dụng hơn

Giá trị tương đồng 98,6% của trình tự 16S-rDNA được coi là ngưỡng để phân biệt hai loài khác nhau

1.1.3 Ứng dụng của xạ khuẩn nội cộng sinh

* Kháng ung thư và kháng viêm

Trong những năm gần đây, nhu cầu tìm kiếm chất có hoạt tính kháng và

ức chế tế bào ung thư từ chủng xạ khuẩn nội cộng sinh đang là hướng đi mới của các nhà khoa học Báo cáo đầu tiên về nghiên cứu tách chiết và sản xuất thuốc kháng tế bào ung thư từ xạ khuẩn nội cộng sinh trên tế bào ung thư như chất

paclitaxel, phổ biến trên cây thông đỏ (Taxus sp.) được tách chiết từ chủng xạ khuẩn Kitasatospora sp [30]

Một số nghiên cứu gần đây cho thấy, tỷ lệ phát hiện ra các kháng sinh mới trên xạ khuẩn nội cộng sinh có tỷ lệ khá cao so với xạ khuẩn phân lập từ đất hoặc

bề mặt thực vật Ví dụ chất ansamycin có thêm nhóm chức chlorine mới còn gọi

là naphthomycin K, được tìm thấy từ Streptomyces sp CS nội cộng sinh trong cây thuốc Maytenus hookeri [31] Hay chất kháng u mạnh-maytansinoid được tìm thấy ở nhóm thực vật bậc cao như Celastraceae, Rhamnaceae và

Euphorbiaceae, cũng như một số loài rêu và đặc biệt từ xạ khuẩn

Actinosynnema pretiosum [24, 26] Do đó, xạ khuẩn nội cộng sinh là nguồn tiềm

năng cần được quan tâm nhằm khai thác các chất có hoạt tính sinh học mới và

thúc đẩy sự khám phá các loại thuốc mới

* Kích thích sinh trưởng

Xạ khuẩn nội cộng sinh được quan tâm vì chúng có nhiều đặc tính kích thích sinh trưởng thực vật bao gồm: kiểm soát sinh học; sản xuất chất kích thích tăng trưởng thực vật như auxin, cytokinin và giberelin; cung cấp chất dinh dưỡng (nitơ, phosphate, khoáng) hoặc ức chế sản xuất ethylene nhờ 1-aminocyclopropane-1-carboxylate (ACC) [46]

Năm 2006, Meguro và cộng sự đã công bố chủng Streptomyces sp

MBR-52 làm tăng khối lượng và chiều dài rễ Khi nuôi cấy mô cây đỗ quyên được xử

lý bằng Streptomyces sp MBR-52 trong bình tam giác, chủng này đã xâm nhập

vào các cây con và phát triển ở đó ngay cả sau khi trồng chúng trong đất Sự phát triển của rễ đã tăng nhanh trong cây nuôi cấy mô có bổ sung thêm MBR-52, điều này cho thấy chủng này sinh một số loại hormone trên thực vật [34]

* Kiểm soát sinh học

Xạ khuẩn nội cộng sinh chiếm hữu các cơ quan bên trong để lấy chất dinh dưỡng và sự bảo vệ từ cây chủ Đổi lại, chúng tăng cường sức đề kháng cho các cây chủ bằng cách sản xuất một loạt các chất chuyển hóa có hoạt tính sinh học bệnh bởi đặc tính cư trú của chúng trong các cây chủ và hoạt tính kháng nấm Chúng kích thích sự tăng trưởng của cây trồng bằng cách cố định nitơ hoặc sản xuất phytohormones hay kiểm soát sinh học

Ngoài ra, các chủng xạ khuẩn giúp tăng cường hệ thống miễn dịch (ISR) của thực vật nhờ kích thích các thụ thể tế bào Chẳng hạn như chủng

Streptomyces galbus R-5 không chỉ sinh cellulase, pectinase mà còn sản xuất

actinomycin X2 và fungichromin để tạo ra sức đề kháng trong cây đỗ quyên con [47] Mối liên hệ giữa xạ khuẩn nội cộng sinh với các cây chủ và các sản phẩm

tự nhiên có hoạt tính sinh học tạo ra cơ hội tìm ra các loại thuốc đặc hiệu có tiềm năng, ứng dụng trong bảo vệ thực vật, tăng năng suất cây trồng và kiểm soát sinh học

1.1.4 Tình hình nghiên cứu xạ khuẩn nội cộng sinh

1.1.4.1 Tình hình nghiên cứu xạ khuẩn nội cộng sinh trên thế giới

Sự đa dạng của xạ khuẩn cộng sinh trong cơ thể thực vật rất phong phú hứa hẹn tiềm năng ứng dụng các hợp chất có hoạt tính sinh học được xạ khuẩn sinh ra trong nhiều lĩnh vực Có thể nhận thấy, không ít các bài báo quốc tế được công bố từ các nhóm nghiên cứu trên thế giới, đặc biệt từ Ấn Độ, Trung Quốc Tuy nhiên, so với sự đa dạng của thế giới thực vật, số lượng các nghiên cứu về

xạ khuẩn nội cộng sinh trên cơ thể thực vật là rất hạn chế, vì vậy cơ hội để phân lập được các loài xạ khuẩn mới hay kháng sinh mới trong các cây dược liệu hứa

hẹn nhiều bất ngờ trong y dược học

Trong hơn 10 năm (từ 2001-2012), nhóm các nhà khoa học thuộc Viện Vi sinh vật học Vân Nam, Trung Quốc không ngừng nghiên cứu, tối ưu hóa các điều kiện phân lập và đã phân lập thành công, đưa vào bảo tàng giống hơn 5.000 chủng xạ khuẩn nội cộng sinh phân lập từ hơn 100 loài thực vật [39] Zhao và cộng sự (2005) đã phân lập được 560 chủng xạ khuẩn từ 26 cây dược liệu khác nhau tại vùng cao nguyên Panxi, Trung Quốc Các chủng xạ khuẩn thuộc nhiều

chi khác nhau như : Streptomyces, Micromonospora, Oerskovia, Nonomuraes,

Promicromonospora, Rhodococcus Trong đó, 60 chủng có hoạt tính kháng ít

nhất một loại vi sinh vật kiểm định (chiếm 10,7%) Theo thống kê có 15 chủng

có khả năng kháng mạnh với S aureus, 38 chủng kháng ít nhất 5 loại vi sinh vật gây bệnh và tất cả các chủng có hoạt tính đều thuộc chi Streptomyces Và tỷ lệ xạ

khuẩn mang gen PKS-I, PKS-II, NRPS chiếm tỷ lệ cao, đạt lần lượt 53%; 82%; 53% [52]

Tại rừng nhiệt đới Xishuangbama, Trung Quốc, nhóm nghiên cứu của TS Chen đã phân lập được 2174 chủng xạ khuẩn nội cộng sinh từ những cây dược liệu bằng các phương pháp phân lập khác nhau dựa trên quá trình xử lý mẫu, môi trường phân lập Các chủng này đại diện cho 10 bộ phụ khác nhau và 32 chi, đã phát hiện ít nhất 19 loài mới [13] Trong đó, một chi mới và hai loài mới được

phân lập trên cây dó bầu ( Maytenus austroyunnanesis)

Li và cộng sự (2008) áp dụng phương pháp xử lý nhiệt khô và xử lý mẫu thực vật với nitơ đông khô trước khi phân lập đã phân lập được từ cây ngải 228 chủng xạ khuẩn, trong đó 31 chủng có hoạt tính phổ rộng kháng khuẩn, 7 chủng

có hoạt tính amylase mạnh, 10 chủng có hoạt tính protease mạnh, 1 chủng có hoạt tính lipase mạnh và 19 chủng có hoạt tính ức chế sự phát triển của cỏ dại Cũng trên đối tượng này, nhóm nghiên cứu đã sử dụng các phương pháp xử lý bề mặt mẫu khác nhau cũng như sử dụng các loại môi trường khác nhau để phân lập được 312 chủng xạ khuẩn nội cộng sinh tại Vân Nam, Trung Quốc [28]

1.1.4.2 Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam

Cho đến năm 2015, một số nghiên cứu về vi sinh vật nội cộng sinh tại Việt Nam có thể được kể đến như:

Nhóm nghiên cứu TS Văn Thị Phương Như tại tỉnh Phú Yên đã phân lập

191 chủng vi khuẩn nội cộng sinh, trong đó 27 chủng thuộc các chi

Burkholderia, Enterobacter, Bacillus có khả năng cố định đạm, hòa tan lân và

tổng hợp indol-3-acetic acid (IAA) tốt từ 54 mẫu cây lúa (Oryza sativa L) Đây

là nghiên cứu đầu tiên về vi khuẩn nội cộng sinh tại Việt Nam [5]

Dương Minh Lam và cộng sự (2014) đã phân lập 52 chủng xạ khuẩn nội

sinh trên cây bần chua (Sonneratia caseolaris), cây bần (Sonneratia paracaseolaris) và cây cóc trắng (Lumnitzera racemosa) tại tỉnh Nam Định Ba mươi tám chủng ức chế với Aspergillus niger và 40 chủng ức chế Candida

ở mức độ khác nhau; 13 chủng mang gen PKS-I, 12 chủng mang gen PKS-II và

4 chủng mang gen NRPS Hai chủng xạ khuẩn tiềm năng được định danh:

Streptomyces angustmyceticus HBQ19 và Streptomyces graminisoli HBQ33 [6]

Tuy nhiên, hiện tại chưa có nhiều công trình công bố về xạ khuẩn nội cộng sinh cũng như thu nhận các chất có hoạt tính sinh học từ cây quế nói riêng

và cây dược liệu nói chung Trong tương lai, hy vọng sẽ có nhiều công trình nghiên cứu về xạ khuẩn liên quan đến cây dược liệu tại Việt Nam

1.2 Khả năng sinh kháng sinh của xạ khuẩn nội cộng sinh trên cây dƣợc liệu và một số gen chức năng liên quan

1.2.1 Đánh giá khả năng sinh kháng sinh của xạ khuẩn nội cộng sinh

Phần lớn các chất kháng sinh được sử dụng trong y học có nguồn gốc từ

xạ khuẩn Nhiều loài xạ khuẩn nội cộng sinh, đặc biệt là những loài được phân lập từ cây dược liệu có khả năng ức chế hoặc tiêu diệt nhiều loại VSV gây bệnh như vi khuẩn, nấm và virus [9] Như vậy, xạ khuẩn nội cộng sinh có tiềm năng

để phát triển các loại thuốc kháng sinh mới (Bảng 1.1)

Bảng 1.1 Các kháng sinh mới từ xạ khuẩn nội cộng sinh trên cây dược liệu

Streptomyces

sp.NRRL 30562

Hoa mộc lan (Kenndia

nigriscans) Munubicins A-D Kháng sinh Streptomyces

Nhiều loại thuốc kháng sinh mới đã được phát hiện như munumbicins

A-D, đây là kháng sinh có khả năng chống lại nhiều VSV gây bệnh ở người được

sinh ra bởi chủng xạ khuẩn nội cộng sinh Streptomyces sp.NRRL 3056, cộng sinh trên cây Kenndia nigriscans loài cây đặc hữu ở vùng Tây Úc, đặc biệt munumbicins D có khả năng kháng ký sinh trùng Plasmodium falciparum gây

bệnh sốt rét [12] Về khả năng kháng nấm, chất 6-Prenylindole được tách chiết

từ dịch lên men chủng Streptomyces sp TP-A0595 có hoạt tính kháng nấm gây bệnh thối cổ rễ gây ra bởi nấm Fusarium oxysporum Trước đó, chất 6-

Prenylindole được biết đến khi được thu nhận chủ yếu từ lá và thân cây rêu tản

(Hepatopsidae sp.) [39] Các hợp chất Lansai A–D [50], naphthomycin K [31] là

các chất chống ung thư cũng được biết đến do xạ khuẩn nội cộng sinh sinh ra Những nghiên cứu trên chứng minh và khẳng định xạ khuẩn nội cộng sinh là nguồn đầy hứa hẹn hợp chất kháng vi sinh vật gây bệnh

1.2.2 Gen mã hoá enzyme polyketide (PKS-I, PKS-II) và nonribosomal peptide synthetase (NRPS) sinh tổng hợp kháng sinh

Những tiến bộ vượt bậc trong lĩnh vực sinh học phân tử như kỹ thuật PCR (1985), giải trình tự gen (1983)… đã giúp các nhà Khoa học đạt được những thành tựu quan trọng trong việc tìm kiếm các chất kháng sinh từ tự nhiên

Polyketide là nhóm đại diện tiêu biểu cho các sản phẩm tự nhiên (sản phẩm trao đổi chất bậc hai) lần đầu tiên được phát hiện vào năm 1893 (Collie & Myers, 1893) trong một thí nghiệm hoá học và 55 năm sau đó, khoa học thế giới mới công bố Polyketide được tổng hợp từ nấm sợi và Eubacteria [10] Ngày nay, nhiều nghiên cứu chỉ ra Polyketide được sản xuất bởi cả vi khuẩn, nấm, xạ khuẩn

và thực vật Các kháng sinh dạng polyketide được sử dụng nhiều trong sản xuất thuốc điều trị các bệnh lâm sàng như tetracycline, daunorubicin, erythromycin, rapamycin và lovastatin… Polyketide được định nghĩa là các liên kết dạng polymer được cấu thành từ các đơn vị ketide, các hợp chất này được chia thành 2 loại gồm: polyketide synthase (PKS) và nonribosomal peptide synthetase (NRPS) [23] NRPS và PKS được tổng hợp bởi một hoặc nhiều nhóm enzyme

chuyên biệt, đa chức năng, có tác dụng xúc tác kéo dài, phát triển chuỗi và đóng vòng từ cấu trúc đơn giản ban đầu để tạo thành các sản phẩm tự nhiên

1.2.2.1 Gen chức năng gen pks-I, pks-II

Hiện nay, các nhà khoa học chú trọng và quan tâm đến sự có mặt của hai

gen pks-I, pks-II trong xạ khuẩn liên quan đến sinh tổng hợp kháng sinh dạng

polyketide Các polyketide đa vòng thơm được hình thành chủ yếu từ quá trình ngưng kết acyl acetate và nhóm β−carbonyl Sau khi tổng hợp, chuỗi polyketide được sắp xếp lại thành các hợp chất đa vòng thơm Oxytetracycline, actinorhodin

và anthracycline là các nhóm hợp chất kháng sinh, kháng ung thư đa vòng thơm được tạo thành từ quá trình trên [22] Gen mã hóa enzyme chịu trách nhiệm sinh

tổng hợp polyketide đa vòng thơm chủ yếu là polyketide synthase II (pks-II)

Hỗn hợp polyketide được hình thành dựa trên quá trình ngưng kết từ các đơn vị acetate, propionate, acyl butyrate và khử nhóm β−carbonyl Trong tổng hợp polyketide, các polyketide khác nhau được hình thành từ một hoặc nhiều quá trình ngưng tụ Các chuỗi polyketide tiếp tục phát triển, kéo dài và đóng vòng tạo thành sản phẩm cuối cùng thông qua 3 quá trình khác nhờ sự hỗ trợ của ketosynthase (KS), acyl transferase (AT) và acyl carrier protein (ACP) Các gen

mã hóa enzyme chịu trách nhiệm sinh tổng hợp tạo sản phẩm cuối cùng gọi là

polyketide synthase I (pks-I) [32]

1.2.2.2 Gen chức năng NRPS

NRPS là nhóm enzyme có khối lượng phân tử lớn, có cấu trúc gồm các module và mỗi module có chức năng chịu trách nhiệm về việc thành lập và sửa đổi một đơn vị axit amin Một NRPS thông thường gồm có 4 phần, bao gồm vùng A (adenyl hóa) chịu trách nhiệm kích hoạt axit amin; vùng T (thiolation) còn được gọi là protein vận chuyển peptidyl (PCP) của axit amin kích hoạt; vùng ngưng tụ (C) liên kết peptidyl và amino acyl để kéo dài chuỗi peptide phát triển; vùng E (epime hóa) tham gia sinh tổng hợp sản phẩm trao đổi chất bậc hai không thông qua ribosome tạo dạng peptide [33] Nhóm enzyme NRPS cũng được tìm thấy phổ biến trong nấm, xạ khuẩn, vi khuẩn, trong đó NRPS tham gia tổng hợp

peptide không thông qua ribosome, bao gồm: kháng sinh, chất độc, chất kháng viêm, chất ức chế miễn dịch (cyclosporine A) [22]

Việc sử dụng kỹ thuật PCR để khuếch đại trình tự gen PKS và NRPS từ

bộ gen xạ khuẩn bằng cách sử dụng mồi suy biến, được thiết kế với độ đặc hiệu cao Phân tích gen PKS và NRPS trong xạ khuẩn không chỉ để xác định các mối quan hệ tiến hóa của gen mã hóa kháng sinh mà còn để nghiên cứu những đặc điểm di truyền sinh tổng hợp sản phẩm trao đổi chất [22]

1.2.3 Chất kháng sinh và kháng ung thƣ nhóm anthracycline

Ở sinh vật bậc cao mỗi tế bào có chức năng nhất định được thực hiện trong mối tương tác hay liên hệ với các tế bào khác Khi tế bào mất liên hệ với các tế bào xung quanh và phân chia một cách không ngừng để tạo thành cấu trúc gọi là khối u hay ung thư Nhiều chất hóa học dùng trong hóa trị liệu ung thư là các sản phẩm thứ cấp do vi sinh vật sinh ra do đó được gọi là kháng sinh kháng

khối u [35]

Một số nhóm kháng sinh đã được dùng trong điều trị ung thư có thể kể đến là anthracyline, actinomycin và bleomycin Trong đó, anthracyline được sử dụng rộng rãi trong điều trị ung thư như ung thư máu, ung thư bạch huyết, ung thư tiền liệt tuyến, ung thư vú, ung thư bàng quang [19] Các công bố cho thấy

xạ khuẩn sinh kháng sinh thuộc nhóm anthracyline thể hiện khả năng ức chế tế bào ung thư với tỷ lệ cao Vì vậy, đánh giá sự có mặt kháng sinh thuộc nhóm anthracyline được xem như là một trong các phương pháp sàng lọc sơ bộ để tìm kiếm xạ khuẩn có khả năng kháng ung thư [19], là một trong những tiêu chí để xác định đặc tính sinh học của xạ khuẩn Vào những năm 1960, anthracycline được phát hiện từ chất màu của chủng xạ khuẩn S peucetius, nhóm kháng sinh

này cho đến nay đã được ghi nhận gồm daunorubicin (DNR), doxorubicin (DOX), epirubicin (EPI) và idarumycin (IDA) [21]

Về tính năng, DOX là thành phần thiết yếu trong điều trị ung thư vú, hình thành các khối u, ung thư bạch huyết Trong khi đó, DNR có tác dụng trong điều trị bệnh bạch cầu cấp tính EPI được sử dụng trong điều trị ung thư dạ dày, ung

thư vú, nội mạc tử cung, phổi, buồng trứng và ung thư tuyến tiền liệt… IDA có nhiều ưu điểm hơn DNR trong điều trị bệnh bạch cầu nguyên bào tủy cấp tính Hiện tại, cơ chế mà nhóm anthracycline ức chế tế bào ung thư vẫn chưa được

làm sáng tỏ [21]

1.3 Tác dụng của cây quế và tiềm năng khai thác xạ khuẩn nội cộng sinh trên cây quế

Cây quế có tên khoa học là Cinnamomum loureirii Nees, thuộc lớp hai lá

mầm, ngành hạt kín, loại thân gỗ và sống lâu năm Vỏ quế có vị thơm, cay nồng dùng làm thuốc, hương liệu hay da vị, sinh trưởng tốt ở vùng khí hậu nhiệt đới [4] Nhiều vùng khí hậu của nước ta có lượng mưa và nhiệt độ trung bình cao rất thích hợp cho cây quế phát triển Vì vậy, từ lâu đời nước ta đã hình thành 4 vùng trồng quế (Yên Bái, Quế Phong-Thường Xuân, Trà Mi-Trà Đồng, Quảng Ninh)

và mỗi vùng có những sắc thái riêng về tự nhiên

Trong quế chứa nhiều vitamin và khoáng chất như kali, canxi, sắt, mangan, kẽm, magiê, vitamin A, niacin…, ngoài ra còn giàu chất xơ và chất chống oxy hóa nên từ xưa, quế đã được dùng làm vị thuốc quý trong đông y Trong các bộ phận của cây quế như vỏ, lá, hoa, gỗ, rễ đều có chứa tinh dầu, đặc biệt trong vỏ có hàm lượng tinh dầu cao nhất, có khi đạt đến 4 – 5% Nhiều nghiên cứu đã chứng minh hàm lượng cinnamaldehyde chiếm 85% trên tổng số

các hợp chất trong tinh dầu quế và độ tinh khiết > 98% [29] Cinnamaldehyde có

khả năng ức chế sự sinh trưởng của nhiều loại VSV gây bệnh: vi khuẩn Gram

dương (Staphylococcus aureus); Gram âm (E coli, Enterobacter aerogenes,

Proteus vulgaris, Pseudomonas aeruginosa, Vibrio cholerae, Vibrio parahaemolyticus và Samonella typhymurium); nấm men (Candida albicans, C tropicalis, C glabrata và C krusei) [34] Ngoài ra, tinh dầu của cây quế còn có

tính chất chống đau, co mạch, làm tăng bài tiết, tăng nhu động ruột, chống oxy hóa với hiệu quả 55,94 và 66,9% khi dùng nồng độ 100 và 200 ppm [3]

Đến nay, rất ít công trình nghiên cứu về xạ khuẩn nội cộng sinh trên cây quế được công bố Do vậy, nghiên cứu về vi sinh vật nói chung và xạ khuẩn nội

cộng sinh trên cây quế tại Việt Nam giúp cung cấp các số liệu tham khảo cho các nhà khoa học trong và ngoài nước

PHẦN II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1 Vật liệu nghiên cứu

2.1.1 Chủng giống

105 chủng xạ khuẩn nội cộng sinh được phân lập từ các mẫu cây quế, thu thập tại tỉnh Yên Bái nhận từ Bộ sưu giống chủng VSV của Phòng Công nghệ lên men, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Các chủng vi sinh vật kiểm định: Salmonella enterica ATCC 14028,

Escherichia coli ATCC 11105, Sarcina lutea CNLM, Bacillus cereus ATCC

11778, Proteus vulgaris CNLM, Pseudomonas auroginosa CNLM, Candida

albicans ATCC 10231, Staphylococus epidermidis ATCC 12228, Enterobacter aerogenes ATCC 13048 nhận từ Bộ sưu tập giống VSV của Phòng Công nghệ

lên men, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

2.1.2 Hóa chất

Hóa chất: Cao malt (Himedia-Ấn Độ); Cao nấm men (Himedia-Ấn Độ); Raffinose (Trung Quốc); Trehalose (Trung Quốc); Sodium dodecyl sulfate (SDS); Ethylene diamine tetra-acetic acid (EDTA) (BioLabs, Mỹ); Phenol, Methanol, Isoamylalcohol, EtBr, Glycerol, Ethanol, Chloroform, Ampicillin, Acrylamide, (Merck, Đức); Agar (Fluka, Đức); các nguồn đường, acid amin (Sigma, Mỹ); kit PureLinkTM

– DNA Purification (Invitrogen, Mỹ)

Các cặp mồi 27F và 1429R dùng để khuếch đại gen 16S rDNA của xạ khuẩn do Integrated DNA Technologies (Mỹ) cung cấp

2.1.3 Thiết bị

Bảng 2.1 Các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu

Cân điện tử, AB 201, Mettler Toledo Thụy Sỹ

Máy đo pH, 320pH Metter, Mettler Toledo Thụy Sỹ

Máy PCR, GeneAmp® PCR System 9700,

Máy soi gel, PowerPac Basic, Bio-Rad Nhật Bản

2.1.4 Môi trường nuôi cấy

Các môi trường được sử dụng trong đánh giá khả năng kháng vi sinh vật kiểm định và xác định đặc điểm sinh học của chủng xạ khuẩn nội cộng sinh (Phụ lục 1)

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Đánh giá hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định

Khả năng kháng vi sinh vật kiểm định của các chủng xạ khuẩn nội cộng sinh được xác định bằng phương pháp đục lỗ thạch kết hợp hiệu chỉnh theo phương pháp đã được mô tả trước đây [2, 14] Đây là phương pháp sơ tuyển xạ khuẩn có hoạt tính kháng sinh

Chủng xạ khuẩn được nuôi cấy trên môi trường YIM38 ở nhiệt độ 30oC trên máy lắc tốc độ 200 vòng/phút trong 5 ngày, thu dịch kháng sinh thô bằng cách ly tâm dịch lên men với tốc độ 6.000-8.000 vòng/phút ở 4oC trong 5 phút Hút và trải đều dịch vi sinh vật kiểm định có mật độ tế bào đạt 5.108 CFU/ml lên trên bề mặt thạch trên đĩa Petri Khi thạch đông, dùng dụng cụ đục lỗ thạch vô

trùng đục lỗ và lấy các thỏi thạch ra Bổ sung 100 μL dịch vào các giếng thạch trên đĩa Petri và đặt các đĩa trong tủ lạnh khoảng 4-5 giờ để dịch từ các giếng khuếch tán ra môi trường nuôi cấy vi sinh vật Sau đó, đặt các đĩa vào tủ ấm 28 -

30oC trong 14 - 18 giờ đối với vi khuẩn kiểm định và 24 - 48 giờ với nấm kiểm định, quan sát vòng kháng khuẩn

Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định được xác định theo kích thước vòng kháng khuẩn (Vkk) theo công thức:

Vkk = D - d (mm), Trong đó: D: Đường kính vòng kháng khuẩn (mm)

d: Đường kính lỗ thạch (mm)

2.2.2 Phương pháp xử lý số liệu

Kết quả nghiên cứu được xử lý theo phương pháp thống kê sinh học trên phần mềm excel Phần mềm sử dụng các hàm tính toán dựa trên những công thức cơ bản của thống kê trong đó có công thức:

2.2.3 Khuếch đại gen mã hoá PKS-I, PKS-II, NRPS

Các chủng xạ khuẩn được nuôi trong môi trường YIM38 trong 48 giờ, ly tâm thu tế bào ở 10.000 vòng/phút trong 5 phút DNA tổng số được tách chiết theo phương pháp của Sambrook và Russell [40]

Sai số m:

Giá trị trung bình ( ):

Độ lệch chuẩn (  ):

Gen mã hóa PKS-I, PKS-II, NRPS được khuếch đại bằng phản ứng PCR dựa trên 3 bộ mồi đặc hiệu cho PKS-I (K1F: 5’-TSA AGT CSA ACA TCGGBC A-3’ và M6R: 5’-CGC AGG TTS CSG TAC CAGTA-3’); PKS-II (KSaF: 5’-TSG CST GCT TGG AYG CSA TC-3’ và KSaR: 5’-TGG AAN CCG CCG AAB CCG CT-3’); NRPS (A3F: 5’-GCS TACSYS ATS TAC ACS TCS GG-3’

và A7R: 5’-SAS GTCVCC SGT SCG GTA S-3’) theo chu trình nhiệt: 95o

C trong 5 phút, 30 chu trình (94oC trong 60 giây, 57oC (K1F/M6R, A3F/A7R) hay

58oC (KSaF/KSaR) trong 90 giây, 72oC trong 60 giây, 72oC trong 10 phút, giữ mẫu ở 4oC [28] Sản phẩm của phản ứng PCR được kiểm tra bằng điện di trên

gel agarose 1,0%

Khả năng sinh anthracycline của các chủng xạ khuẩn được sàng lọc bằng phép thử màu [48] Bản chất của phép thử như sau: Do có mặt của vòng anthraquinone trong cấu tạo hóa học, các anthracycline thay đổi màu sắc tùy theo pH của môi trường, cụ thể là có màu da cam ở pH acid và màu tím khi ở pH

2.2.4 Nghiên cứu đặc điểm sinh học của chủng xạ khuẩn YBQ75

2.2.4.1 Quan sát đặc điểm hình thái khuẩn lạc, khả năng sinh melanin

Đặc điểm hình thái của chủng xạ khuẩn được quan sát, so sánh trên các môi trường Gause 1, Gause 2, ISP1, ISP2, ISP3, ISP4, ISP5, ISP6, ISP7 ở nhiệt

độ 28-30o

C Sau 7, 14 và 21 ngày lấy mẫu quan sát màu sắc khuẩn ty khí sinh, khuẩn ty cơ chất và sắc tố tan trên môi trường theo phương pháp của Shirling và Gottlieb, 1966 và trên bảng màu của Tresner và Danga (1958) [42, 49]

- Màu sắc khuẩn lạc (khuẩn ty khí sinh): Màu sắc của khuẩn ty khí sinh

được so với 7 nhóm màu của Tresner và Backus [49]: xanh da trời, sẫm, xám,

xanh lá, đỏ, tím, trắng, vàng

- Màu sắc của khuẩn ty cơ chất: Chia vào 5 nhóm vàng nâu (gồm cả các loại không tiết săc tố); xanh da trời, xanh lá, đỏ da cam, tím

- Khả năng sinh sắc tố tan: được xác định trên môi trường ISP2, ISP5 Sắc

tố tan được xếp vào 5 nhóm giống màu của khuẩn ty khí sinh và khuẩn ty cơ chất: vàng nâu, xanh da trời, xanh lá, đỏ-da cam, tím

- Sự hình thành sắc tố melanin: để kiểm tra khả năng hình thành melanin, nuôi cấy xạ khuẩn trên môi trường ISP1, ISP6 và ISP7 ở nhiệt độ thích hợp Quan sát trong 14 ngày, nếu chủng sinh ra melanin thì màu của môi trường sẽ chuyển từ vàng nhạt sang nâu đậm cho đến màu đen

2.2.4.2 Quan sát đặc điểm cuống sinh bào tử và bề mặt bào tử

Chủng YB75 được nuôi cấy trên môi trường ISP3 và ISP 4 có đặt lamen nghiêng 45° trên mặt môi trường Sau cứ 7, 14 và 21 ngày nuôi ở nhiệt độ 28-

300C xạ khuẩn phát triển tốt lấy ra quan sát hình dạng chuỗi bào tử dưới kính hiển vi quang học và kính hiển vi quét

- Hình dạng chuỗi bào tử được ký hiệu: RF (thẳng hay hơi lượn sóng); RA (hình móc câu hay xoắn không hoàn toàn); S (dạng xoắn lò xo hay xoắn hoàn toàn); SRF (dạng xoắn lượn sóng); SRA (dạng xoắn có móc câu) [36]

- Bề mặt bào tử: Bề mặt của khuẩn ty khí sinh có bào tử được phủ platin trong 30 giây sau đó quan sát và chụp ảnh dưới kính hiển vi quét (Viện 69, Bộ

Tư lệnh lăng) để xác định đặc điểm bề mặt bào tử: Sm (trơn nhẵn), Sp (gai), Wa (xù xì), Ru (nếp nhăn), Ha (tóc)

2.2.4.3 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa

* Khả năng sử dụng nguồn cacbon:

Bổ sung các nguồn đường (1%, w/v): Glucose, Glactose, Mantose, L-Arabinose, α-Lactose, myo-Inositol, D-Manitol vào môi trường thạch khoáng ISP9-1 trong các ống nghiệm và khử trùng theo phương pháp của Pasteur Tiếp đó, cấy chủng xạ khuẩn vào ống thạch nghiêng Môi trường ISP9

D-có chứa glucose được lựa chọn làm mẫu đối chứng dương và không bổ sung nguồn đường là mẫu đối chứng âm Quan sát và đánh giá sự sinh trưởng và phát triển của các chủng xạ khuẩn

* Khă năng sử dụng nguồn nitơ:

Chủng xạ khuẩn được nuôi trên môi trường ISP9-2 bổ sung các nguồn nitơ (1%, w/v): L-Histidine monohydrat, L-Phenylalanin, L-Arginin, L-Lysin, L-Threonin, L-Cystein Quan sát và đánh giá khả năng sinh trưởng của chủng xạ khuẩn sau 7-14 ngày ở 28-30oC, so sánh với ống đối chứng âm (môi trường ISP9) và đối chứng dương (môi trường có L-Asparagine monohydrat)

* Xác định nhiệt độ, pH nuôi cấy thích hợp:

Chủng YBQ75 được nuôi trên môi trường Bennett ở các nhiệt độ khác nhau (10oC, 22oC, 30oC, 37oC, 45oC, 55oC) và pH 3-12 Sau 5-7 ngày nuôi cấy, quan sát sự sinh trưởng của xạ khuẩn

* Xác định nồng độ muối (NaCl) thích hợp:

Chủng YBQ75 được nuôi cấy trên môi trường Bennett lỏng có bổ sung NaCl với nồng độ tăng dần từ 1-10% (w/v) ở 30oC, sau 5-7 ngày nuôi cấy, quan sát sự sinh trưởng của xạ khuẩn

2.2.5 Phân loại chủng xạ khuẩn HBQ75 dựa trên phân tích trình tự gen 16S rDNA

Trình tự gen 16S rDNA của chủng xạ khuẩn được khuếch đại bằng phản ứng PCR sử dụng cặp mồi GR1 và GF1 có trình tự trong bảng 2.2

Bảng 2.2 Trình tự cặp mồi được sử dụng trong phản ứng PCR khuếch đại

- Phản ứng PCR được thực hiện trong hỗn hợp bao gồm:

Sản phẩm của phản ứng PCR được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1,0% Kích thước của các đoạn DNA thu được sau phản ứng PCR được so sánh với thang DNA chuẩn (Thermo scientific, Mỹ) Sản phẩm PCR được tinh sạch bằng bộ kit PureLinkTM – DNA Purification (Invitrogen, Mỹ) và giải trình tự trên máy đọc trình tự tự động ABI PRISM®

3100-Avant Genetic Analyzer (Applied Biosystems, Foster City, CA, Mỹ) tại Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam Trình tự gen 16S rDNA so sánh với các trình

tự tương ứng trên GenBank (NCBI) nhờ công cụ BLAST

PHẦN III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Khả năng kháng vi sinh vật kiểm định của các chủng xạ khuẩn phân lập từ cây Quế

3.1.1 Khả năng kháng vi sinh vật kiểm định của các chủng xạ khuẩn phân lập

từ cây Quế

Hiện nay, các nhà vi sinh vật học trên thế giới đã nhận định rằng để trở thành

cơ thể nội sinh, các chủng xạ khuẩn phải có khả năng kháng các chất kháng sinh, chất ức chế vi sinh vật, đáp ứng miễn dịch và sinh chất có hoạt tính ức chế vi sinh vật gây bệnh nội tại trong mô tế bào cây chủ Đặc biệt là đối với loại cây dược liệu

có chứa nhiều hoạt chất (eugenol, cinnamaldehyde, carvacrol) có khả năng ức chế mạnh sự sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật gây bệnh như cây quế [51] Kết quả nghiên cứu đánh giá hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của 105 chủng xạ khuẩn nội cộng sinh phân lập từ cây quế được thực hiện trong bảng 3.1 và hình 3.1

Bảng 3.1 Số liệu thống kê khả năng kháng vi sinh vật kiểm định của 105 chủng xạ

khuẩn nội cộng sinh

Chủng vi sinh vật kiểm định

Đường kính vòng kháng khuẩn (mm) Số