Áp dụng các kỹ thuật sinh học phân tử trong chẩn đoán trước sinh và sau sinh bệnh tăng sản thượng thận bẩm sinh

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI --- NGUYỄN THỊ PHƯƠNG MAI ÁP DỤNG CÁC KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ TRONG CHẨN ĐOÁN TRƯỚC SINH VÀ SAU SINH BỆNH TĂNG SẢN THƯỢNG THẬN

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

-

NGUYỄN THỊ PHƯƠNG MAI

ÁP DỤNG CÁC KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ TRONG CHẨN ĐOÁN TRƯỚC SINH VÀ SAU SINH BỆNH TĂNG SẢN THƯỢNG THẬN BẨM SINH

Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC

1 GS TS Đặng Thị Thu

2 BS Ngô Diễm Ngọc

Hà Nội - 2011

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đối với Giáo sư Tiến sỹ Đặng Thị Thu và Thạc sỹ Bác sỹ Ngô Diễm Ngọc, những người thầy đã tận tình dạy dỗ, giúp đỡ, động viên tôi trong thời gian học tập và nghiên cứu để hoàn thành luận văn

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đối với Ban giám hiệu trường Đại học Bách Khoa

Hà Nội, các thầy cô khoa Công nghệ Sinh học, các cán bộ, nhân viên Viện Đào tạo Sau đại học Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội đã dành cho tôi sự động viên và hỗ trợ vô cùng quý báu trong quá trình học tập và làm luận văn

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Ban giám đốc Bệnh viện Nhi trung ương, Khoa Nội Tiết- Chuyển hoá- Di truyền và các phòng ban chức năng Bệnh viện Nhi trung ương đã cổ vũ và tạo điều kiện cho tôi hoàn thành luận văn

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới các đồng nghiệp khoa Di truyền và Sinh học phân tử, Bệnh viện Nhi trung ương đã giúp đỡ, tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi thực hiện đề tài này

Tôi xin trân trọng cảm ơn các bệnh nhi và các gia đình bệnh nhi, những người đã góp phần lớn nhất cho sự thành công trong đề tài của tôi

Cuối cùng, tôi vô cùng biết ơn sự chăm sóc, động viên của cha mẹ, chồng con, sự quan tâm giúp đỡ và những tình cảm quý báu của người thân, bạn bè đã dành cho tôi

Nguyễn Thị Phương Mai

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Những số liệu, kết quả nêu trong luận án là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Nguyễn Thị Phương Mai

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

CRH Corticotropin- releasing hormone

DHEA Dehydroepiandrosteron DOC Deoxycorticosteron

FSH Follicule stimulating hormone

NTCHDT Nội tiết- Chuyển hoá- Di truyền

PCR Polymerase chain reaction

TSTTBS Tăng sản thượng thận bẩm sinh

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 3

1.1 Lịch sử nghiên cứu 3

1.1.1 Thế giới 3

1.1.2 Việt Nam 4

1.2 Tuyến TT và hormone vỏ TT 6

1.2.1 Bào thai học 6

1.2.2 Cấu tạo của tuyến TT 6

1.2.3 Cấu tạo vỏ thượng thận 6

1.2.4 Cơ chế tác dụng của hormone vỏ TT 7

1.2.5 Tác dụng của các hormone vỏ TT 8

1.2.5.1 Tác dụng của cortisol 8

1.2.5.2 Tác dụng aldosteron 8

1.2.3.3 Tác dụng của hormone sinh dục nam androgen 9

1.3 Các enzym tham gia vào sự tổng hợp corticoid 10

1.4 Hội chứng TSTTBS 11

1.4.1 TSTTBS do thiếu hụt enzym 21 hydroxylase 12

1.4.1.1 Sinh bệnh học 12

1.4.1.2 Biểu hiện lâm sàng 12

1.4.2 TSTTBS do thiếu các enzym khác 13

1.4.2.1 TSTTBS do thiếu enzym cholesteron desmolase 13

1.4.2.2 TSTTBS do thiếu enzym 17α- hydroxylase (17- OH) 14

1.4.2.3 TSTTBS do thiếu hụt enzym 3β- hydroxysteroid dehydrogenase 14

1.4.2.4 TSTTBS do thiếu hụt enzym 11β- hydroxylase 14

1.4.2.5 TSTTBS do thiếu hụt enzym 18- dehydrogenase 14

1.5 Cơ sở di truyền trong TSTTBS do thiếu hụt 21- OH 15

1.6 Những tiến bộ trong chẩn đoán 16

1.7 Chẩn đoán và điều trị trước sinh 17

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19

2.1 Đối tượng nghiên cứu 19

2.2 Hoá chất sử dụng 19

2.3 Trang thiết bị 19

2.4 Phương pháp nghiên cứu 20

2.1.1 Quy trình tách chiết DNA 20

2.4.1.1 Tách chiết DNA tổng số từ máu ngoại vi 20

2.4.1.2 Tách chiết DNA tổng số từ dòng tế bào dịch ối sau nuôi cấy 20

2.4.1.3 Xác định nồng độ DNA tổng số 21

2.4.2 Phương pháp PCR sàng lọc 5 đột biến thường gặp trên gen CYP21A2 21

2.4.2.1 Phản ứng PCR sàng lọc đột biến PRO 30 LEU (Exon 1) 22

2.4.2.2 Phản ứng PCR sàng lọc đột biến mất 8 nucleotide (Exon 3) 22

2.4.2.3 Phản ứng PCR sàng lọc đột biến ILE172ASP (Exon 4) 23

2.4.2.4 Phản ứng PCR sàng lọc đột biến cụm trên exon 6 (Exon 6 Cluster) 24

2.4.2.5 Phản ứng PCR sàng lọc đột biến V281L (Exon 7) 24

2.4.3 Phương pháp điện di trên Agarose 25

2.4.4 Phương pháp Multiplex Ligation- dependent probe amplification 26

2.4.5 Phương pháp giải trình tự gen 28

2.4.5.1 Phản ứng PCR khuếch đại gen CYP21A2: 28

2.4.5.2 Tinh sạch sản phẩm PCR 30

2.4.5.3 PCR mồi đơn 30

2.4.5.4 Kết tủa cồn 32

2.4.5.5 Phân tích trình tự gen 32

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 33

3.1 Lựa chọn phương pháp SHPT phát hiện các đột biến trên gen CYP21A2 33

3.1.1 Phương pháp PCR sàng lọc 5 đột biến điểm 33

3.1.1.1 Phản ứng PCR sàng lọc đột biến P30L (Exon 1) 34

3.1.1.2 Phản ứng PCR sàng lọc đột biến mất 8 nucleotide 35

3.1.1.3 Phản ứng PCR sàng lọc đột biến I172N (Exon 4) 36

3.1.1.4 Phản ứng PCR sàng lọc đột biến cụm trên exon 6 37

3.1.1.5 Phản ứng PCR sàng lọc đột biến V281L 39

3.1.3 Phương pháp Multiplex Ligation- dependent Probes amplification 40

3.1.4 Phương pháp giải trình tự gen 44

3.2 Chẩn đoán sau sinh và trước sinh cho bệnh TSTTBS 46

3.2.1 Nghiên cứu quy trình chẩn đoán sau sinh bệnh TSTTBS 46

3.2.2 Nghiên cứu quy trình chẩn đoán trước sinh bệnh TSTTBS 50

3.2.2.1 Gia đình 1 50

3.2.2.2 Gia đình 2 51

KẾT LUẬN 54

KIẾN NGHỊ 55 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC 1

PHỤ LỤC 2

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Tên các enzym và tên gen tương ứng 10

Bảng 3.1 Độ lớn và vị trí các probes trong phản ứng MLPA 40

Bảng 3.2 Thứ tự các peak sau khi được phân tích bằng phần mềm Coffalyser 42

Bảng 3.3 Tỷ lệ tín hiệu với các dạng đột biến 43

Bảng 3.4 Đột biến được tìm thấy trên các gia đình TSTTBS 47

Bảng 3.5 Tỷ lệ các kiểu đột biến trên gen CYP21A2 48

Bảng 3.6 So sánh tỷ lệ các đột biến với các nghiên cứu trên thế giới 49

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Vị trí tuyến TT và cấu tạo vỏ TT 6

Hình 1.2 Cơ chế tác dụng của hormone vỏ TT 7

Hình 1.3 Sinh tổng hợp hormone vỏ thượng thận 11

Hình 1.4 Vị trí gen CYP21A2 trên nhiễm sắc thể số 6 15

Hình 1.5 Các đột biến thường gặp có liên quan đến kiểu hình 16

Hình 2.1 Trình tự mẫu dò MLPA 26

Hình 2.2 Sơ đồ vùng nhiễm sắc thể 6p21.3 27

Hình 2.3 Lai các đầu dò 27

Hình 2.4 Ghép nối các đầu dò 27

Hình 2.5 Khuếch đại 28

Hình 2.6 Phương pháp giải trình tự gen CYP21A2 28

Hình 3.1 Điện di đồ phản ứng PCR sàng lọc đột biến P30L .34

Hình 3.2 Điện di đồ phản ứng PCR sàng lọc đột biến mất 8 nucleotide .35

Hình 3.3 Điện di đồ phản ứng PCR sàng lọc đột biến I172N 36

Hình 3.4 Điện di đồ phản ứng PCR sàng lọc đột biến cụm trên Exon 6 38

Hình 3.5 Điện di đồ phản ứng PCR sàng lọc đột biến V281L 39

Hình 3.6 Kết quả MLPA của mẫu không mang đột biến 42

Hình 3.7 Điện đi đồ sản phẩm PCR 1 trên agarose 1% 44

Hình 3.8 Điện đi đồ sản phẩm PCR 2 trên agarose 1% 45

Hình 3.9 Quy trình chẩn đoán sau sinh bệnh TSTTBS 49

Hình 3.10 Kết quả MLPA sàng lọc các đột biến thường gặp của thai nhi 51

Hình 3.11 Trình tự vùng promotor của gen giả CYP21A2 51

Hình 3.12 Kết quả MLPA sàng lọc các đột biến thường gặp của thai nhi 52

Hình 3.13 Thai nhi Dị hợp tử đột biến P30L, dị hợp với đột biến Intron 2G 52

Hình 3.14 Quy trình chẩn đoán trước sinh bệnh TSTTBS 53

MỞ ĐẦU

Bệnh Tăng sản thượng thận bẩm sinh (TSTTBS) là bệnh di truyền lặn trên NST thường (26) Cơ chế bệnh sinh là do sự rối loạn tổng hợp hormone vỏ thượng thận do thiếu hụt các enzym tổng hợp corticosteroid (4), (8), (9), (24)

Bệnh TSTTBS là bệnh di truyền không thể chữa khỏi với các dấu hiệu suy thượng thận cấp có thể dẫn đến tử vong ở thể mất muối hay trẻ có các biểu hiện nam tính hoá ở trẻ gái, giả dậy thì sớm ở trẻ trai… gây ảnh hưởng nặng nề đến sự phát triển chiều cao, chắc năng sinh dục, sinh sản và tâm lý (5), (27), (29)

Trẻ mắc bệnh phụ thuộc vào điều trị bổ sung hydrocortisol suốt đời, ảnh hưởng lớn đến quá trình phát triển tâm lý và thể chất, cũng như phải chịu nhiều biến chứng của bệnh và của thuốc trong quá trình điều trị (3), (6), (7), (12)

Việc phòng bệnh tốt nhất là chẩn đoán trước sinh cho những gia đình có tiền

sử sinh con đầu tiên mắc TSTTBS (4) Vì vậy, muốn chẩn đoán trước sinh cho thai nhi thì việc đầu tiên là xác định được kiểu gen đột biến di truyền của gia đình Chẩn đoán xác định bệnh TSTTBS là phương pháp sử dụng các kỹ thuật sinh

học phân tử để xác định kiểu đột biến trên gen CYP21A2 của gia đình người bệnh,

từ đó giúp xác định kiểu đột biến trên gen CYP21A2 của thai nhi

Hiện nay, tại Khoa Nội tiết- Chuyển hoá- Di truyền, Bệnh viện Nhi trung ương đang quản lý khoảng hơn 500 gia đình có con đầu mắc bệnh TSTTBS, và tiếp nhận khoảng 30 trường hợp mắc mới mỗi năm Hầu hết các gia đình này đều ở trong độ tuổi sinh đẻ, do dó nhu cầu tiếp tục sinh con khoẻ mạnh của họ là rất lớn Khoa Di truyền và Sinh học Phân Tử - Bệnh Viện Nhi TƯ, từ đầu năm 2009,

là đơn vị đầu tiên nghiên cứu triển khai các kỹ thuật sinh học phân tử phục vụ chẩn đoán trước và sau sinh bệnh TSTTBS

Dựa trên cơ sở đó, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Áp dụng các kỹ

thuật sinh học phân tử trong chẩn đoán bệnh tăng sản thượng thận bẩm sinh”

Mục tiêu nghiên cứu:

1 Lựa chọn kỹ thuật sinh học phân tử để nhận biết các đột biến trên gen

CYP21A2

2 Chẩn đoán trước và sau sinh cho bệnh TSTTBS

3 Đề xuất quy trình chẩn đoán trước sinh và sau sinh cho bệnh TSTTBS

Trong những thế kỷ tiếp theo, các trường hợp nam hoá gây chuyển giới ở trẻ gái vẫn tiếp tục được phát hiện Trẻ trai mắc hiện tượng này được mô tả như những Heraclex (một nhân vật có sức mạnh phi thường trong truyện thần thoại Hy Lạp) hoặc Samson (một nhân vật quật chết sư tử trong Kinh thánh) (4), (25)

Năm 1865, Crecchio- nhà giải phẫu học người Italia- đã mô tả một trường hợp rất đặc biệt về một người phụ nữ lúc mới sinh ra là trẻ gái, nhưng sau này đã trưởng thành và sống như một người nam giới Sau khi giải phẫu Crecchio đã phát hiện ra người phụ nữ này có bộ phận sinh dục bên ngoài giống của nam giới, nhưng bộ phận sinh dục bên trong là của nữ giới và có tuyến thượng thận lớn (4)

Sau nhiều thập kỷ, thuật ngữ “hội chứng sinh dục thượng thận” đã ra đời để

mô tả chi tiết hơn về những bệnh nhân có tuyến thượng thận lớn và có hiện tượng nam hoá bộ phận sinh dục ngoài Vào đầu những năm 50 của thế kỷ XX, bệnh TSTTBS chỉ là một phần trong Hội chứng sinh dục thượng thận Hội chứng này được định nghĩa là do cường androgen gây nam tính hoá (7)

Trường hợp TSTTBS thể mất muối đầu tiên đã được Wilkins và Butler mô tả năm 1939 - 1940 Sau đó, đến năm 1950 - 1951, Wilkins, Butler và cộng sự đã thấy việc dùng thuốc cortison có thể gây ức chế được quá trình tổng hợp thừa androgen trong HCSDTT do TSTTBS (7), (14)

Từ năm 1950 đến năm 1960, TSTTBS được cho là một trường hợp đặc biệt do hàm lượng hormone steroid tăng cao trong máu và nước tiểu Hai thập kỷ sau, mối

liên hệ di truyền giữa kháng nguyên bạch cầu người (Human leukocyte antigens- HLA) và TSTTBS đã được xác lập, và tìm ra được gen có liên quan đến bệnh TSTTBS, mã hoá cho enzym 21 hydroxylase nằm ở gần vùng phức hợp gen HLA Ngay sau đó, vào năm 1984, White và cộng sự đã phát hiện ra các ảnh hưởng di truyền của gen 21 hydroxylase và đã chứng minh nó là nguyên nhân gây bệnh TSTTBS (10), (13)

Kể từ đó, Hội chứng sinh dục thượng thận (HCSDTT) do TSTTBS được nghiên cứu sâu rộng, từ các thể lâm sàng đến các rối loạn tổng hợp hormone do thiếu hụt enzym và các gen mã hoá tổng hợp các enzym vỏ TT Dựa trên những hiểu biết về cơ chế bệnh sinh của bệnh, người ta đã không còn dùng tên chung là HCSDTT, mà đã sử dụng danh từ TSTTBS cho nhóm bệnh rối loạn tổng hợp hormone vỏ TT do thiếu hụt enzym này (17), (18), (26)

Ngày nay, trên thế giới đã phát hiện được trên 100 loại đột biến khác nhau trên

gen CYP21A2 Tỷ lệ các đột biến này thay đổi tuỳ thuộc vào chủng tộc (11), (15),

(22)

1.1.2 Việt Nam

Năm 1974, trong “Hội chứng dậy thì sinh dục sớm ở trẻ em”, N.T Nhạn đã

mô tả một bệnh nhân 26 tháng tuổi với các dấu hiệu dậy thì sớm kèm theo các thay đổi sinh hoá phù hợp với HCSDTT (8)

Năm 1990, N.T Nhạn và cộng sự đã tổng kết có 36 bệnh nhân mắc “hội chứng sinh dục thượng thận” trong giai đoạn từ năm 1981- 1990, chiếm tỷ lệ 1.9% tổng số bệnh nhân mắc các bệnh nội tiết, với tỷ lệ tử vong là 5.5% (2/36 bệnh nhân TSTTBS) (8)

Năm 1994, N.T Nhạn và cộng sự đã tổng kết các dấu hiệu lâm sàng và thay đổi sinh hoá của 55 bệnh nhân TSTTBS được điều trị tại khoa NTCHDT - Viện BVSKTE từ năm 1976 - 1993 Báo cáo này cho thấy, bệnh TSTTBS được chẩn đoán dựa vào lâm sàng và các xét nghiệm sinh hoá như: progesteron, testosteron, cortisol, FSH, LH, điện giải đồ và glucose trong máu, 17-CS và 17-OHCS trong nước tiểu…

Năm 1996, N T Phượng và cộng sự đã nghiên cứu phương diện di truyền trên

31 bệnh nhân mắc HCSDTT Tác giả nhận xét thấy các bệnh nhân mang đủ đặc tính của một bệnh di truyền lặn trên NST thường như không phân biệt giới tính và bệnh gặp trong một thế hệ, không liên tục qua các thế hệ trong dòng họ Tác giả còn nhận xét thấy bệnh nhân có rải rác ở khắp các địa phương, tuy nhiên chưa có điều kiện phát hiện dị hợp tử

Năm 2000, V T Lan và cộng sự đã nghiên cứu áp dụng kỹ thuật sinh học

phân tử trong sàng lọc một số đột biến thường gặp của gen CYP21A2 ở bệnh nhân

nghi ngờ mắc TSTTBS Tác giả sử dụng kỹ thuật PCR và RFLP để sàng lọc 3 đột biến: 8bpEx3, Exon 6 cluster và V281L trên 8 bệnh nhân Có 1/8 bệnh nhân mang đột biến đồng hợp tử 8bpEx3 Tỷ lệ đột biến được tìm thấy thấp do số lượng bệnh nhân còn ít và chỉ sàng lọc 3 đột biến (6)

Năm 2003, N.N Dao và cộng sự nghiên cứu đột biến trên 1 gia đình có con mắc bệnh TSTTBS Tác giả đã tìm thấy người mẹ mang dị hợp tử đột biến

654A/C→G, người bố mang dị hợp tử đột biến P30L, người con mắc bệnh TSTTBS mang cả hai đột biến trên và có kiểu hình TSTTBS thể mất muối (2)

Đây là những nghiên cứu ban đầu phát hiện các đột biến trên gen CYP21A2

cho bệnh TSTTBS tại Việt Nam Tuy nhiên, những nghiên cứu trên có hạn chế là

chỉ tìm những đột biến đã biết, vì vậy tỷ lệ tìm thấy đột biến trên gen CYP21A2 còn

thấp

Lần đầu tiên tại Khoa Di truyền, bệnh viện Nhi Trung ương, chúng tôi đã áp dụng các kỹ thuật sinh học phân tử để phát hiện các đột biến trên toàn bộ gen

CYP21A2 Xét nghiệm này sẽ làm tăng độ chính xác trong chẩn đoán TSTTBS, từ

đó bệnh nhân được đưa ra phác đồ điều trị sớm và kịp thời

1.2 Tuyến TT và hormone vỏ TT

1.2.1 Bào thai học

Ở những thai nhi bình thường, vỏ thượng thận được hình thành khi được bốn tuần tuổi Sang tuần thứ sáu, hormone steroid thượng thận bắt đầu tiết ra và tuyến sinh dục bắt đầu được hình thành Từ tuần thứ sáu đến tuần thứ tám, bắt đầu hình thành bộ phần sinh dục ngoài của trẻ nam

1.2.2 Cấu tạo của tuyến TT

Hình 1.1 Vị trí tuyến TT và cấu tạo vỏ TT (35)

Tuyến TT gồm hai tuyến nhỏ hình tam giác nằm ở cực trên hai thận Mỗi tuyến nặng khoảng từ 3,5 – 4,5 gram (9) Tuyến thượng thận gồm hai phần riêng biệt, mỗi phần sản xuất ra những hormone riêng:

− Phần vỏ ngoài gọi là vỏ thượng thận gồm những tế bào tuyến Vỏ thượng thận chứa lipid và sản xuất ra những hormone steroid

− Phần ở trong gọi là phần tuỷ gồm những tế bào thần kinh Tuỷ thượng thận sản xuất ra adrenalin và noradrenalin và một lượng nhỏ dopamin

1.2.3 Cấu tạo vỏ thượng thận

Vỏ thượng thận được chia thành ba lớp khác nhau, mỗi lớp sản xuất ra những hormone khác nhau (9):

- Hormone chuyển hoá muối (Mineralocorticoid - MC), tổng hợp ở vùng cầu

- Hormone chuyển hoá đường (Glucocorticoid - GC), tổng hợp ở vùng bó

- Hormone sinh dục nam (androgen), tổng hợp ở vùng lưới

1.2.4 Cơ chế tác dụng của hormone vỏ TT

Hình 1.2 Cơ chế tác dụng của hormone vỏ TT qua hoạt hoá hệ gen tổng hợp

protein (38)

Hormone vỏ TT đến tế bào, khuếch tán thụ động qua màng tế bào, vào bào tương và gắn với thụ thể đặc hiệu trong bào tương Phức hợp hormone - thụ thể

khuếch tán vào nhân, hoạt hoá các gen đặc hiệu để sao mã hình thành mRNA Sau

đó, các mRNA lại khuếch tán vào bào tương, tiến hành dịch mã tại ribosom, sinh tổng hợp protein mới Các protein mới này có chức năng enzym hoặc có chức năng vận chuyển hoặc cấu trúc Ví dụ: tác dụng của hormone chuyển hoá đường là tạo các protein - enzym tham gia vào quá trình chuyển hoá, đồng hoá hoặc dị hoá các chất như glucid, protid, lipid hoặc tác dụng của hormone chuyển hoá muối là tạo các protein vận chuyển, tham gia vào tái hấp thu natri và thải kali trong ống thận (9)

1.2.5 Tác dụng của các hormone vỏ TT

1.2.5.1 Tác dụng của cortisol

Cortisol là hormone tiêu biểu của nhóm hormone chuyển hoá đường (Glucocorticoid- GC) Cortisol có tác dụng lên các chuyển hoá glucid, lipid và protein Một sự sản xuất quá thừa cortisol dẫn đến tăng glucose máu, tăng lipid máu

Cortisol ở gan có tác dụng làm tăng cường quá trình tổng hợp, còn cortisol ở

cơ xương và mô mỡ có tác dụng làm tăng cường sự thoái hoá, do sự thu nhận glucose ở các mô trên bị ức chế bởi cortisol Với chuyển hoá protein, cortisol có tác dụng kìm hãm sự tổng hợp protein và kích thích sự thoái hoá protein Với chuyển hoá lipid, cortisol kích thích sự phân huỷ lipid ở mô mỡ làm tăng nồng độ glycerol

và acid béo tự do trong máu

Trong trường hợp nồng độ GC giảm, bệnh nhân sẽ bị hạ glucose máu, hạ huyết

áp và rối loạn điện giải, dẫn đến cơn suy thượng thận cấp Ngược lại, khi nồng độ hormone này tăng kéo dài, bệnh nhân sẽ xuất hiện hội chứng giả Curshing như béo phì (chủ yếu ở mặt và thân), chậm lớn, cao huyết áp và có thể loét dạ dày

1.2.5.2 Tác dụng aldosteron

Hormone đặc trưng của nhóm hormone chuyển hoá muối (Mineralocorticoid- MC) là aldosteron, có chức năng chính trong chuyển hoá nước và điện giải Vị trí

Trong các hormone chuyển hoá muối, aldosteron có 95% tiềm năng giữ muối, Deoxycorticosteron (DOC) chỉ có 15% tiềm năng này so với aldosteron

Trong trường hợp nồng độ aldosteron giảm, bệnh nhân sẽ mất natri và tăng kali, nếu không điều trị kịp thời bệnh nhân sẽ truỵ mạch và tử vong

1.2.3.3 Tác dụng của hormone sinh dục nam androgen

Hai hormone sinh dục thượng thận là Dehydroepiandrosteron (DHEA) và androstenedion được bài tiết vào máu và được biến đổi thành dạng có hoạt tính sinh học là testosteron và estrogen Tuy nhiên, người ta cho rằng DHEA và androstenedion có thể có một số tác dụng trực tiếp như làm phát triển lông nách và lông mu ở tuổi dạy thì

Testosteron có các tác dụng sau:

ƒ Trong thời kỳ bào thai: thúc đẩy biệt hoá trung tâm hướng sinh dục vùng đồi thị, tạo phương thức điều hoà chức năng sinh dục nam và biệt hoá mầm sinh dục thành cơ quan sinh dục nam như hình thành dương vật và bìu Vì vậy, trong trường hợp bệnh lý, nồng độ aldrogen tăng từ trong bào thai có thể gây chuyẻn giới bộ phận sinh dục ngoài ở thai nhi nữ hoặc gây to dương vật ở thai nhi nam

ƒ Trong tuổi dậy thì: làm phát triển và hoàn thiện cơ quan sinh dục gồm làm to dương vật và bìu, làm xuất hiện các đặc tính sinh dục phụ theo kiểu nam như phát triển và phân bố lông, tóc mang đặc thù nam, giọng trầm và tăng tiết chất

dài, tăng hoạt động các tế bào tạo xương, tăng chiều dày của xương và tăng lắng đọng canxi trong xương

Trong trường hợp tăng nồng độ testosteron kéo dài, sự cốt hoá các đầu xương dài xảy ra nhanh chóng dẫn đến đóng sớm các đầu xương, làm cho bệnh nhân ngừng lớn và trở thành lùn

1.3 Các enzym tham gia vào sự tổng hợp corticoid

Hormone steroid, trong đó có hormone vỏ TT, được tổng hợp nhờ sự tham gia trực tiếp của một chuỗi các enzym (1), (9)

Phản ứng hydroxyl hoá giữ vai trò quan trọng trong sự tổng hợp cholesterol cũng như quá trình chuyển hoá cholesterol thành hormone steroid và muối mật Vì vậy, các enzym tham gia tổng hợp hormone vỏ TT là những enzym xúc tác quá trình hydroxyl hoá, gọi chung là các hydroxylase

Trừ enzym 3β- hydroxysteroid dehydrogenase (3β- HSD), các enzym tổng hợp corticoid đều thuộc họ protein cytochrom P-450, viết tắt là CYP

Các enzym CYP được phân bố trong các microsom hoặc trong các ty thể của

tế bào vỏ TT và sinh dục Trong quá trình xúc tác tổng hợp hormone, các CYP ty thể cần protein chứa sắt (Adrenodoxin) và flavoprotein làm trung gian vận chuyển điện tử, còn các CYP microsom chỉ cần flavoprotein Cả hai loại enzym này đều cần điện tử khử từ NADPH (chất cho điện tử)

Các gen mã hoá tổng hợp các enzym được gọi theo tên của enzym nên có chữ đầu chung là CYP

Bảng 1.1 Tên các enzym và tên gen tương ứng Tên đơn giản

(gọi theo chức năng) Enzym

Vị trí trong

tế bào Gen

Vị trí gen trên NST

Lưới nội

HSDII) 17α- hydroxylase/ 17, 20

lyase

P450c17 (CYP17)

Hình 1.3 Sinh tổng hợp hormone vỏ thượng thận (21)

TSTTBS là bệnh di truyền lặn trên nhiễm sắc thể thường, được đặc trưng bởi

sự thiếu hụt hoạt động của một trong các enzym cần thiết để tổng hợp cortisol từ cholesterol của vỏ thượng thận như: 21-hydroxylase (21-OH), 11β-hydroxylase (11-

OH), 17- hydroxylase (17-OH), 3β- hydroxysteroid dehydrogenase (3β- HSD) và 20/22 Desmolase (16), (19), (20)

Khi thiếu một trong các enzym trên, một hoặc nhiều con đường tổng hợp hormone bị gián đoạn làm cho hormone tương ứng không được sản xuất đủ, đặc biệt là cortisol Nồng độ cortisol thấp, qua cơ chế điều hoà ngược âm tính, kích tích tuyến yên sản xuất và bài tiết ACTH gây nên (9), (23) :

- Tăng sản tuyến yên (tên bệnh được gọi theo cơ chế này)

- Kích thích các tế bào chứa melanin tạo sắc tố đen và làm phân tán sắc tố này trên biểu bì da, vì trong phân tử ACTH có 13 acid amin đầu giống với hormone kích thích tế bào sắc tố (melanocyte stimulating hormone- MSH)

- Tăng ứ đọng các hormone và các tiền chất trước chỗ gián đoạn dẫn đến tăng sản xuất các hormone ở đường tổng hợp không bị gián đoạn khác

1.4.1 TSTTBS do thiếu hụt enzym 21 hydroxylase

chuyển thành corticosteron và aldosteron

- Trong đường tổng hợp GC, enzym 21-OH có tác dụng chuyển 17-OHP thành 11- deoxycortisol Sau đó với sự tham gia của enzym 11β-OH, 11-

deoxycortisol chuyển thành cortisol

Sự ứ đọng các hormone và các tiền chất trước chỗ gián đoạn là 17-OHP và progesteron, cùng với sự tăng bài tiết ACTH làm tăng sản xuất androgen

1.4.1.2 Biểu hiện lâm sàng

Sự thiếu hụt hoạt động của 21-OH dẫn đến sự thiếu hụt cortisol và/ hoặc thiếu hụt aldosteron cũng như thừa androgen thượng thận (8), (29) Biểu hiện lâm sàng của TSTTBS tuỳ thuộc vào mức độ thiếu hụt hoạt động của enzym, bao gồm:

- Thể nam hoá đơn thuần: trong thể này, enzym 21-OH thiếu không hoàn

toàn nên sự tăng ACTH đủ làm cho nồng độ cortisol trở về bình thường Tuy nhiên, do ACTH tăng tối đa và không có dự trữ cortisol ở vỏ TT nên trong trường hợp có stress thì bệnh nhân không có khả năng tăng bài tiết cortisol để chống lại Trẻ gái có biểu hiện nam hoá bộ phận sinh dục ngoài

và tình trạng giả dạy thì sớm ở trẻ trai

- Thể mất muối: Enzym 21-OH không có hoặc rất ít, nên nồng độ cortisol

và aldosteron không thể quay về bình thường theo cơ chế bù trừ dù nồng

độ ACTH và hoạt tính renin luôn tăng cao Dưới tác dụng của ACTH, sự tổng hợp các tiền chất trước chỗ gián đoạn dẫn đến tăng tổng hợp androgen Bệnh nhân có các triệu chứng lâm sàng tương tự như thể nam hoá đơn thuần, và có kèm theo thiếu hụt aldosterone ở trẻ sơ sinh Nếu không được điều trị sớm, bệnh nhân có thể tử vong do cơn suy thượng thận cấp

- Thể không cổ điển hoặc khởi phát muộn: Trong thể này, nồng độ của

enzym 21-OH chỉ giảm nhẹ Bệnh nhân có các triệu chứng lâm sàng như giả dậy thì sớm ở trẻ gái, hội chứng rậm lông, buồng trứng đa nang và giảm khả năng thụ tinh (6, 8)

1.4.2 TSTTBS do thiếu các enzym khác

1.4.2.1 TSTTBS do thiếu enzym cholesteron desmolase

TSTTBS do thiếu enzym cholesteron desmolase còn được gọi là hội chứng Prader Gurtner Trong hội chứng này, do thiếu enzym desmolase, cholesterol không chuyển được thành pregnenolon nên sự tổng hợp của cả ba loại steroid là MC, GC

và androgen đều giảm

Sau khi ra đời, trẻ bị suy thượng thận với biểu hiện mất muối, mất nước và truỵ mạch Trẻ trai có bộ phận sinh dục ngoài giống như trẻ gái Đây là bệnh hiếm gặp, có tỷ lệ tử vong cao

1.4.2.2 TSTTBS do thiếu enzym 17α- hydroxylase (17- OH)

TSTTBS do thiếu enzye 17α- hydroxylase còn được gọi là hội chứng Biglieri Trong hội chứng này, do thiếu enzym 17- OH, pregnenolon không chuyển được thành 17- hydroxypregnenolon và progesteron không chuyển được thành 17 hydroxyprogesteron nên sự tổng hợp GC và androgen giảm Trong khi đó đường sinh tổng hợp MC không bị gián đoạn nên sự sản xuất các steroid trong đường đó tăng lên

Bệnh nhân có biểu hiện lâm sàng cao huyết áp và giả ái nam ái nữ ở trẻ trai Đây là bệnh hiếm gặp, có thể điều trị được bằng hormone GC

1.4.2.3 TSTTBS do thiếu hụt enzym 3β- hydroxysteroid dehydrogenase

TSTTBS do thiếu hụt enzym 3β- hydroxysteroid dehydrogenase còn được gọi

là hội chứng Bongiovani Do thiếu enzym này, sự tổng hợp các steroid có liên kết đôi Delta 4 giảm gây giảm tổng hợp GC, MC và androgen, trong khi đó, sản xuất DHA và androstendiol delta 5 tăng

Trẻ trai có biểu hiện dị dạng bộ phận sinh dục ngoài như tật lỗ đái thấp và không có bìu Trẻ gái có thể phì đại âm vật và môi lớn dính giống bìu Đôi khi có trường hợp có kèm theo biểu hiện mất muối Đây là bệnh hiếm gặp, có thể điều trị được bằng hormone GC

1.4.2.4 TSTTBS do thiếu hụt enzym 11β- hydroxylase

Đây là loại TSTTBS gặp phổ biến sau TSTTBS do thiếu hụt enzym 21- OH

Do thiếu enzym 11β, DOC không chuyển được thành corticosteron và 11- deoxycortisol không chuyển thành cortisol gây thiếu GC, tăng DOC và androgen Bệnh nhân có biểu hiện tăng huyết áp, dậy thì sớm ở trẻ trai và giả ái nam ái nữ ở trẻ gái Bệnh có thể điều trị được bằng hormone GC

1.4.2.5 TSTTBS do thiếu hụt enzym 18- dehydrogenase

TSTTBS do thiếu hụt enzym 18- dehydrogenase còn được gọi là hội chứng Olick Do thiếu enzym này, corticosteron không chuyển được thành aldosteron gây

hội chứng mất muối trên lâm sàng Đây là bệnh hiếm gặp và có thể điều trị được bằng hormone MC

1.5 Cơ sở di truyền trong TSTTBS do thiếu hụt 21- OH

TSTTBS do thiếu hụt enzym 21- OH là bệnh di truyền lặn do đột biến gen trên NST thường Khả năng sinh con bị bệnh là 25% và sinh con dị hợp tử mang gen bệnh lặn là 50% Những người dị hợp tử này rất khó phát hiện và là người truyền gen bệnh cho các thế hệ tiếp theo Tỷ lệ nam và nữ bị bệnh như nhau Bệnh xảy ra không liên tục, ngắt quãng qua các thế hệ (30), (31)

Tần suất người mang gen bệnh TSTTBS do thiếu hụt enzym 21- OH là 1/60

Sự kết hôn trong dòng họ hoặc trong quần thể cô lập làm tăng khả năng sinh con bệnh và tăng tần số người mang gen bệnh lặn trong quần thể

Hình 1.4 Vị trí gen CYP21A2 trên nhiễm sắc thể số 6 (Wilkins, 1994)

Sự phát triển của di truyền phân tử trong những năm 90 của thế kỉ 20 đã cho phép hiểu sâu hơn về cơ chế của bệnh Người ta đã xác định được vùng gen mã hoá cho enzym 21- OH nằm trên cánh ngắn của nhiễm sắc thể số 6 (6p2.1-3) có độ lớn

xấp xỉ 30kb Vùng gen này gồm hai gen: gen CYP21A2 và gen giả CYP21A1P-

nằm giữa vùng phức hợp hoà hợp mô chủ yếu (Major Histiocompatibility Complex- MHC- cạnh gen HLA) (13)

Gen CYP21A2 và CYP21A1P nằm xen kẽ với hai gen mã hoá cho bổ thể C4A và C4B Gen CYP21A2 là thành viên của nhóm P450 mà đặc hiệu bởi C21

trong tiền chất steroid vỏ thượng thận Gen CYP21A1P là gen bất hoạt, gen

CYP21A2 mã hoá cho enzym 21-OH (5, 7) Mỗi gen CYP21A2 và CYP21A1P có

độ lớn xấp xỉ 3kb gồm 10 exon, hai gen này có trình tự tương đồng giống nhau đến 98% Trình tự của giả gen CYP21A1P có các loại đột biến thường thấy trên bệnh nhân TSTTBS Qua quá trình phân bào giảm nhiễm, sự bắt chéo không đồng đều giữa các cặp nhiễm sắc thể sẽ dẫn tới việc các trình tự ở vùng giả gen sẽ chuyển

sang gen CYP21A2 gây nên đột biến trên gen (7, 8) 95% các đột biến trên gen

CYP21A2 là do đột biến chuyển đoạn từ giả gen CYP21A1P, 5% còn lại là do tự

gen CYP21A2 bị đột biến Kiểu đột biến có liên quan chặt chẽ đến kiểu hình của

bệnh TSTTBS (11)

Hình 1.5 Các đột biến thường gặp có liên quan đến kiểu hình (21)

1.6 Những tiến bộ trong chẩn đoán

Trong TSTTBS do thiếu hụt enzym 21-OH, nồng độ aldosteron, cortisol và các sản phẩm chuyển hoá của chúng thường giảm Ngược lại, nồng độ các hormone

và các tiền chất trước chỗ gián đoạn là progesteron, 17-OHP, các hormone theo con đường tổng hợp không tắc là androgen và các sản phẩm chuyển hoá thường tăng Tuy nhiên, thay đổi sinh hoá còn phụ thuộc vào mức độ rối loạn tổng hợp hormone Ví dụ: nồng độ aldosteron thay đổi không rõ trong thể NHĐT và thể không cổ điển, nhưng lại giảm rất rõ trong thể mất muối

Trong các thập kỷ 50, 60 của thế kỷ XX, để chẩn đoán bệnh TSTTBS, về mặt sinh hoá, người ta dựa chủ yếu vào định lượng trong máu ba sản phẩm cuối của ba đường tổng hợp hormone vỏ TT là aldosteron, cortisol và testosteron cùng các chất chuyển hoá tương ứng trong nước tiểu Nhưng sự thay đổi ba loại hormone này còn

Từ thập kỷ 70 đến nay, dựa trên sự phát triển các kỹ thuật sinh hoá như miễn dịch enzym, miễn dịch huỳnh quang và miễn dịch phóng xạ, người ta đã định lượng được trong máu hầu hết các hormone và các tiền chất hormone ở nồng độ cực nhỏ như nmol hoặc pmol, trong đó có 17-OHP

Nồng độ 17-OHP trong máu tăng là chỉ số đặc trưng, nói lên thiếu enzym

21-OH làm cho 17-21-OHP không chuyển được thành 11 deoxycortisol Vì vậy, định lượng nồng độ 17-OHP đã trở thành tiêu chuẩn vàng trong chẩn đoán TSTTBS do thiếu hụt enzym 21-OH, nhờ tính đặc hiệu cao

Từ giữa những năm 80, khi kỹ thuật phản ứng khuếch đại gen (Polymerase chain reaction- PCR) ra đời, các nghiên cứu về DNA trong sinh học phân tử nói chung và y học nói riêng có những bước tiến nhảy vọt Ưu điểm của phương pháp phân tử được áp dụng trong Y sinh học là nhanh, nhạy và chính xác, có thể phân tích gen từ một lượng DNA rất nhỏ Đặc biệt trong chẩn đoán trước sinh, sử dụng các kỹ thuật sinh học phân tử chẩn đoán có độ chính xác cao, tránh tình trạng nhiễm máu của mẹ dẫn đến kết quả chấn đoán không chính xác (22)

1.7 Chẩn đoán và điều trị trước sinh

Nếu cả vợ và chồng đều mang dị hợp tử một đột biến trên gen CYP21A2 thì

khả năng sinh con mắc bệnh TSTTBS là 25% Vì vậy, trong quá trình mang thai, bà

mẹ sẽ được điều trị bằng thuốc Dexamethasone (0.5mg 2 lần/ ngày hoặc 3 lần/ ngày) với liều lượng thích hợp nhằm làm giảm khả năng thai nhi nữ bị nam hoá

Từ tuần thứ 6- 8, bắt đầu hình thành bộ phận sinh dục ngoài của nam Vì vậy, nếu thai nhi là trẻ gái thì điều trị bằng Dexamethasone phải được bắt đầu càng sớm càng tốt (trước 6 tuần) mới có hiệu quả Nếu thai nhi là trẻ trai thì sẽ dừng điều trị Quá trình điều trị bằng thuốc trong thời gian mang thai cho tới nay vẫn chưa

có một tài liệu chính thức nào công bố về những tác dụng phụ thường gặp Tuy nhiên, trong một số tài liệu có công bố một vài trường hợp khi điều trị thuốc kéo dài trong quá trình mang thai dẫn tới chậm phát triển tinh thần của thai nhi, hoặc sản phụ có khả năng bị giảm cân trong ba tháng đầu, tăng huyết áp, tăng đường huyết, trầm cảm…

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

- Mẫu đối chứng: 2ml máu ngoại vi của 10 người bình thường, không mắc

bệnh TSTTBS

- Mẫu chẩn đoán sau sinh: 2ml máu ngoại vi của 15 gia đình, mỗi gia đình

gồm bố, mẹ và con đầu đã được chẩn đoán mắc bệnh TSTTBS

- Mẫu chẩn đoán trước sinh: 15ml dịch ối vô trùng của 02 bà mẹ có tiền sử

sinh con mắc TSTTBS, đang mang thai ở tuần thai 18

2.2 Hoá chất sử dụng

- Tách chiết DNA từ máu ngoại vi và từ dòng tế bào dịch ối sau nuôi cấy: sử

dụng kit tách chiết DNA tổng số của hãng Qiagen (QIAamp DNA mini kit)

- Các hoá chất dùng trong kỹ thuật PCR: primer (Ivitrogen), Taq High Fidelity

(Roche), dNTPs (Invitrogen)

- Ethidium Bromide (Invitrogen), Agarose (Biorad), TBE10X (Invitrogen)

- Kit tinh sạch sản phẩm PCR (QIAquick PCR purification kit- Qiagen, Đức)

- Sequencing kit v3.1 (ABI)

- Salsa MLPA kit P050B2 CAH (MRC- Hà Lan)

- Máy soi DNA (Mini transilluminator- Biorad), máy điện di (Biorad)

- Lò vi sóng (Sharp- Nhật), cân phân tích, pipet man các loại (Eppendorf-

Đức)

- Máy giải trình tự gen 3130 Gentic Analyser (ABI- Mỹ)

2.4 Phương pháp nghiên cứu

2.1.1 Quy trình tách chiết DNA

2.4.1.1 Tách chiết DNA tổng số từ máu ngoại vi

- Cho 200µl máu ngoại vi vào ống, lắc đều

- Cho 20µl Protease vào ống eppedorf 1.5ml vô trùng

- Thêm 200µl dung dịch AL, sau đó lắc đều trong 15 giây

- Ủ mẫu ở nhiệt độ 560C trong 10 phút

- Thêm 200µl cồn tuyệt đối vào và lắc đều trong 15 giây

- Chuyển toàn bộ dịch trong ống sang cột lọc, sau đó ly tâm với vận tốc

- Định lượng hàm lượng DNA tổng số trên máy Nano Drop

2.4.1.2 Tách chiết DNA tổng số từ dòng tế bào dịch ối sau nuôi cấy

- Nuôi cấy tế bào dịch ối: Dịch ối được nuôi cấy trong dung dịch Amniomax

Fluid – là môi trường nuôi cấy đặc hiệu chỉ cho tế bào dịch ối Sau khi nuôi cấy từ 10 đến 14 ngày, các tế bào dịch ối được thu hoạch và rửa sạch bằng

dung dịch PBS 1X

- Tách chiết DNA tổng số từ dòng tế bào dịch ối: Dòng tế bào dịch ối sau

nuôi cấy được hoà với 200µl dung dịch PBS 1X sau đó sử dụng kit tách

DNA tổng số QIAamp DNA mini kit (Qiagen- Đức) để tách DNA tổng số

- Định lượng DNA sau khi tách chiết trên máy Nano Drop 1000

2.4.1.3 Xác định nồng độ DNA tổng số

Nguyên tắc: Việc xác định nồng độ DNA sẽ cho phép tính toán thành phần phản ứng PCR đạt hiệu quả tốt Nồng độ DNA được xác định bằng máy Nano Drop

ở bước sóng 269nm Tiến hành đo 5 lần với mỗi mẫu để tránh sai số

2.4.2 Phương pháp PCR sàng lọc 5 đột biến thường gặp trên gen CYP21A2

Nguyên tắc của kỹ thuật PCR là sử dụng DNA polymerase chịu nhiệt, ví dụ

Taq DNA polymerase được tách chiết từ vi khuẩn Thermus aquaticus để tổng hợp

trong ống nghiệm các đoạn DNA mới từ mạch khuôn trong môi trường có dư các dNTP và cặp mồi đặc hiệu

Một chu kỳ PCR bao gồm ba bước được lặp lại nhiều lần:

- Biến tính (Denature): DNA từ dạng sợi kép sang dạng sợi đơn bằng cách nâng cao nhiệt độ lên 940C – 950C trong thời gian ngắn

- Tiếp hợp đoạn mồi (Anneal): hạ nhiệt độ xuống 500C – 600C Hai đoạn mồi là các oligonucleotide dài khoảng 15 – 30 base sẽ tổng hợp theo nguyên tắc bổ sung với đoạn DNA tương đồng ở hai đầu của đoạn DNA cần nhân

- Kéo dài (Extend): Enzym DNA polymerase tổng hợp phân tử DNA kéo dài từ đoạn mồi Để tránh hiện tượng tiếp hợp không đặc hiệu, phản ứng tiếp hợp được thực hiện ở 720C

Như vậy, sau mỗi chu kỳ phản ứng từ 1x đoạn DNA cần nhân sẽ có 2x đoạn được tổng hợp, sau n chu kỳ sẽ có 2n bản sao đoạn DNA mong muốn, chiều dài thực tế của đoạn DNA được nhân bản bằng đúng khoảng cách giữa hai đầu xuất phát của hai đoạn mồi

Phản ứng PCR bao gồm các thành phần sau:

- DNA khuôn

- Cặp mồi đặc hiệu có chiều dài 15- 30 nucleotide

- Bốn loại deoxyribonucleotide triphosphate (dATP, dTTP, dGTP, dCTP)

- Enzym DNA polymerase chịu nhiệt

Phản ứng PCR được sử dụng để tìm 5 đột biến trên gen CYP21A2 là P30L

(Exon 1); 8 bp deletion (Exon 3); I172D (Exon 4); Exon 6 cluster (Exon 6); V281L (Exon 8)

2.4.2.1 Phản ứng PCR sàng lọc đột biến PRO 30 LEU (Exon 1)

Mồi xuôi (10µl) 1 Mồi ngược (10µl) 1 dH2O 15.7 Taq polymerase 0.3

Mồi ngược (10µl) 1 dH2O 15.7 Taq polymerase 0.3

2.4.4 Phương pháp Multiplex Ligation- dependent probe amplification (MLPA)

Phương pháp MLPA (Multiplex ligation-dependent probe amplification) là phương pháp sử dụng nhiều phản ứng PCR cho phép khuếch đại nhiều đoạn gen khác nhau với chỉ một cặp mồi duy nhất Mỗi một đầu dò (probe) bao gồm 1 cặp mồi (primer), cặp mồi này sẽ bắt cặp từ hai đầu của vùng gen quan tâm, sau đó hai cặp mồi này sẽ được nối lại với nhau thành một trình tự đích hoàn chỉnh Ưu điểm của các đầu dò phân đôi này là chỉ có các trình tự đầu dò sau khi ghép nối lại mới được khuếch đại chứ không phải mẫu DNA ban đầu Mỗi một đầu dò được thiết kế

có thêm một trình tự DNA đặc biệt có độ dài định trước gọi là trình tự thêm (stuffer sequence) Khi điện đi trên máy, trình tự thêm này đảm bảo các trình tự đã được khuếch đại có độ dài chính xác trên bản điện di Độ dài các trình tự thêm ở các đầu

dò là khác nhau, điều này sẽ tránh được các giới hạn phân giải trong phương pháp multiplex PCR Các đầu dò này cũng được gắn huỳnh quang nên cường độ của các tín hiệu có liên quan đến chất lượng của phản ứng khuếch đại

Hình 2.1 Trình tự mẫu dò MLPA (37)

Hỗn hợp đầu dò trong kit MLPA bao gồm 5 probe cho exon 1, 3, 4, 6, 8 của

gen CYP21A2 tương đương với các đột biến P30L, mất đoạn 8bp, I172N, Exon 6

cluster và Q318 Trong hỗn hợp đầu dò, còn có 3 đầu dò đặc hiệu cho gen giả

CYP21A2P, 3 đầu dò cho gen TNXB, 1 đầu dò cho các yếu tố bổ thể và 1 đầu dò

cho gen CREBL1 gen ở cạnh cánh dài của vùng TNXB Ngoài ra, hỗn hợp đầu dò này còn bao gồm 19 đầu dò đặc hiệu cho bộ gen người để làm mẫu đối chứng, 3 đầu

dò khuếch đại ngoài vùng gen 6p21.3 và 1 đầu dò đặc biệt cho nhiễm sắc thể Y (UTY gen) Kit MLPA được thiết kế để sàng lọc các mất đoạn lớn như mất đoạn

Hình 2.2 Sơ đồ vùng nhiễm sắc thể 6p21.3 (b), (c), (d): các loại mất đoạn được

nhận biết bởi kỹ thuật MLPA (37)

Nguyên lý:

Phương pháp MLPA gồm 4 bước:

- Bước 1: Biến tính sợi DNA (Denaturation)

- Bước 2: Lai các đầu dò (Hybridization)

ƒ Hỗn hợp đầu dò MLPA sẽ được thêm vào mẫu DNA đã được biến tính

ƒ Hai phần của đầu do sẽ được bắt cặp với trình tự đích

Hình 2.3 Lai các đầu dò (37)

- Bước 3: Ghép nối

ƒ Các đầu dò sẽ được ghép nổi nhờ enzym lai ghép chịu nhiệt

Hình 2.4 Ghép nối các đầu dò (37)

- Bước 4: Khuếch đại

ƒ 1 cặp mồi duy nhất sẽ được sử dụng để khuếch đại tất cả các đầu dò

đã được ghép nối

ƒ Mỗi sản phẩm khuếch đại của các đầu dò có độ lớn khác nhau và không trùng với nhau (130 480 bp)

Hình 2.5 Khuếch đại (37)

2.4.5 Phương pháp giải trình tự gen

2.4.5.1 Phản ứng PCR khuếch đại gen CYP21A2:

promoter cho đến hết gen

CYP21A2

- Mồi xuôi A và mồi ngược B là hai mồi đặc hiệu chỉ bắt cặp trên gen

CYP21A2 Mồi ngược A và mồi xuôi B có thể bắt cặp với gen CYP21A2 và

giả gen CYP21A2P.

- Giải trình tự hai sản phẩm PCR trên sẽ nhận biết được các chuyển đoạn lớn

và nhỏ

Hình 2.6 Phương pháp giải trình tự gen CYP21A2

Phản ứng PCR 1