Ảnh hưởng của các yếu tố vật lý đến hiệu suất tách chiết polysaccharide từ nấm linh chi

Nội dung nghiên cứu chính: - Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tách chiết như: trạng thái nguyên liệu, nhiệt độ, thời gian, loại dung môi để tách chiết polysaccharide từ nấm Li

NGUYỄN HOÀNG NGỌC MINH

ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC YẾU TỐ VẬT LÝ ĐẾN HIỆU SUẤT TÁCH CHIẾT POLYSACCHARIDE

TỪ NẤM LINH CHI

CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC

PGS.TS QUẢN LÊ HÀ

Hà Nội – Năm 2015

LỜI CAM ĐOAN

Tôi là Nguyễn Hoàng Ngọc Minh, tôi xin cam đoan nội dung trong luận văn

này với đề tài ―Ản ƣởn ủ u tố vật l n iệu suất t i t Pol s ride từ nấm Linh chi‖ là công trình nghiên cứu do chính tôi thực hiện

dưới sự hướng dẫn của PGS.TS Quản Lê Hà Các số liệu, kết quả trình bày trong luận văn là hoàn toàn trung thực và chưa được công bố trong bất cứ công trình khoa học nào khác

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành luận văn này, trước tiên tôi xin gửi lời chân thành cảm ơn tới các thầy cô giáo trong Viện Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm – Trường Đại học Bách khoa Hà Nội đã tận tình giảng dạy, hướng dẫn tôi trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu vừa qua

Đặc biệt, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến PGS.TS Quản Lê Hà đã tận tình giúp đỡ, trực tiếp chỉ bảo, hướng dẫn tôi trong thời gian thực hiện luận văn

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến gia đình, bạn bè đã tạo điều kiện, quan tâm, giúp đỡ, động viên và góp ý cho tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn

Xin chân thành cảm ơn!

Học viên

N u ễn Hoàn N ọ Min

DANH MỤC BẢNG

DANH MỤC HÌNH

1

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Tổn qu n về nấm Lin i 3

1.1.1 Tên khoa học và phân loại 3

1.1.2 Đặc điểm hình thái 4

1.1.3 Đặc điểm sinh trưởng 5

1.1.4 Thành phần hóa học và dược tính sinh học 6

1.1.5 Tác dụng của Linh chi 8

1.2 Pol s ride tron nấm Lin i 9

1.2.1 Thành phần Polysaccharide 10

1.2.2 Vai trò dược học của Polysaccharide 10

1.3 Beta – glucan (β-glucan) 11

1.3.1 Giới thiệu về β-glucan 11

1.3.2 Tính chất của β-glucan 11

1.4 C u tố ản ưởn n qu trìn t i t 12

1.4.1 Nguyên liệu 12

1.4.2 Dung môi 13

1.4.3 Yếu tố kỹ thuật 13

1.5 C t n ân vật l 14

1.6 Tìn ìn nuôi trồn và n iên ứu nấm Lin i 18

1.6.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 19

1.6.2 Tình hình nghiên cứu trong nước 22

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24

2.1 Đối tượn n iên ứu 24

2.2 Hó ất và t i t bị t í n iệm 24

2.2.1 Hóa chất 24

2.2.2 Thiết bị thí nghiệm 25

2.3 P ươn p p n iên ứu 25

2.3.1 Quy trình thí nghiệm tổng quan 25

2.3.2 Xác định độ ẩm nguyên liệu 27

2.3.3 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tách chiết 28

2.4 P ươn p p p ân tí 30

2.4.1 Phương pháp phân tích polysaccharide tổng số 30

2.4.2 Phương pháp xác định hàm lượng β-glucan 31

2.4.3 Phương pháp sắc ký bản mỏng TLC 33

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 34

3.1 K ảo s t iều kiện t i t tron dun môi nướ 34

3.1.1 Ảnh hưởng của trạng thái nguyên liệu 34

3.1.2 Ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu và nước 35

3.1.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian đến quá trình tách chiết 36

3.2.2 Khảo sát nhiệt độ siêu âm thích hợp 40

3.2.3 Khảo sát thời gian siêu âm thích hợp 41

3.2.4 Khảo sát ảnh hưởng của vi sóng đến quá trình tách chiết 43

3.2.5 Sử dụng vi sóng và siêu âm hỗ trợ quá trình tách chiết 45

3.2.6 Khảo sát thời gian siêu âm kết hợp vi sóng 46

3.3 K ảo s t iều kiện t i t tron dun môi kiềm 49

3.3.1 Xác định nồng độ dung môi thích hợp 49

3.3.2 Xác định thời gian tách chiết thích hợp 50

3.3.3 Xác định nhiệt độ tách chiết thích hợp 51

3.4 Điều kiện t í ợp t i t pol s ride từ nấm Lin i 52

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 56

TÀI LIỆU THAM KHẢO 57

PHỤ LỤC 62

UHF Ultra High Frequency wave UAE Ultrasonic-assisted extraction

HPAEC – PAD High performance anion exchange

chromatography - pulsed amperometric detection

Bảng 1.2: Các hoạt chất sinh học và dẫn xuất trong nấm Linh chi 7 Bảng 1.3: Một số ứng dụng của sóng siêu âm trong công nghệ thực phẩm 15 Bảng 3.1: Lượng polysaccharide thu được 55

Hình 1.1: Các loại nấm Linh chi 4

Hình 1.2: Cấu tạo cắt ngang của Nấm Linh chi 5

Hình 1.3: Công thức hóa học của β-glucan trong nấm Linh chi 11

Hình 1.4: Phân loại các loại sóng theo tần số 15

Hình 1.5: Phân tử phân cực sắp xếp lại vị trí trong trường điện từ 18

Hình 3.1: Nấm nghiền nhỏ dạng bột 34

Hình 3.2 : Nấm dạng mảnh 2x10mm 34

Hình 3.3: Ảnh hưởng của trạng thái nguyên liệu đến quá trình tách chiết 34

Hình 3.4: Ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu/nước đến quá trình tách chiết 35

Hình 3.5: Ảnh hưởng của thời gian đến quá trình tách chiết 37

Hình 3.6: Ảnh hưởng của nhiệt độ siêu âm đến quá trình tách chiết 40

Hình 3.7: Ảnh hưởng của thời gian siêu âm đến quá trình tách chiết 41

Hình 3.8: Dịch tách chiết bằng vi sóng lần lượt từ 1 phút ÷ 5 phút 43

Hình 3.9: Ảnh hưởng của thời gian vi sóng đến quá trình tách chiết 44

Hình 3.10: Kết hợp vi sóng và siêu âm 46

Hình 3.11: Mẫu tách chiết hỗ trợ vi sóng từ 30 giây ÷ 210 giây 47

Hình 3.12: Khảo sát thời gian tách chiết thích hợp sử dụng vi sóng 47

Hình 3.13: Ảnh hưởng của dung môi đến quá trình tách chiết 49

Hình 3.14: Thời gian tách chiết thích hợp bằng dung môi NaOH 5% 50

Hình 3.15: Nhiệt độ tách chiết thích hợp bằng NaOH 5% 51

Hình 3.16: Kết quả sắc ký từ dịch thủy phân của polysaccharide sản phẩm 55

MỞ ĐẦU

Nấm Linh chi (hay Lingzhi – tiếng Trung Quốc; Reishi – tiếng Nhật Bản) là một loại nấm dược liệu đặc biệt được biết đến trong nền y học phương Đông Tác phẩm "Thần nông bản thảo kinh" của Trung Quốc xếp Linh chi vào loại ―thần dược‖ cao hơn cả nhân sâm "Bản thảo cương mục" của Lý Thời Trân xem Linh chi là loại thuốc quý, có tác dụng bảo vệ gan, giải độc, bổ tim, bổ óc, tiêu đờm, lợi niệu, bổ dạ dày Gần đây, rất nhiều các nghiên cứu đến từ Trung Quốc, Nhật Bản, Mỹ… với các

kỹ thuật của khoa học hiện đại đã phát hiện nấm Linh chi có tác dụng phòng và chữa một số bệnh

Nhiều công trình nghiên cứu trên thế giới đã xác định được các hoạt chất của Linh chi và tác dụng dược lý của chúng Quả thể, sợi nấm và bào tử nấm Linh chi có chứa một số các chất có hoạt tính sinh học mạnh như: Acid ganoderic, acid oleic, ganodosteron, ganoderans, beta-D-glucan… Các nhà khoa học Việt Nam tìm thấy trong nấm Linh chi có chứa 21 nguyên tố vi lượng cần thiết cho sự vận tải và chuyển hóa các chất của cơ thể như: Đồng, sắt, kali, mangan, natri, canxi… [5]

Ngày nay, polysaccharide tách chiết từ nấm Linh chi được chứng minh có hoạt tính dược lý như: Chống ung thư, kháng u, chống oxi hóa, làm tăng khả năng miễn dịch trong cơ thể, diệt tế bào ung thư [32]

Việc chiết xuất polysaccharide là một quá trình quan trọng trong các nghiên cứu

và ứng dụng polysaccharide sau này Về cơ bản, chiết bằng nước nóng là phương pháp được sử dụng rộng rãi nhất trong việc chiết xuất polysaccharide Tuy nhiên, phương pháp này có năng suất thấp, tiêu tốn thời gian, cần duy trì nhiệt độ cao, bởi vậy cần thiết phải tìm một phương pháp khác khắc phục được các nhược điểm trên [14],[60]

Phương pháp tách chiết với sự hỗ trợ của sóng siêu âm và vi sóng có thể thúc đẩy quá trình chiết xuất bởi vậy hứa hẹn sẽ cải thiện và đảm bảo hiệu suất tách chiết

Trên cơ sở đó, chúng tôi tiến hành đề tài nghiên cứu: ―Ản ƣởn ủ u

tố vật l n iệu suất t i t Pol s ride từ nấm Lin i‖

Mục đích của đề tài:

Cải thiện năng suất chiết và nâng cao nồng độ polysaccharide sản phẩm bằng hỗ trợ của phương pháp vật lý: Sóng siêu âm và vi sóng

Nội dung nghiên cứu chính:

- Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tách chiết như: trạng thái nguyên liệu, nhiệt độ, thời gian, loại dung môi để tách chiết polysaccharide từ nấm Linh chi đạt hiệu suất tốt nhất

- Khảo sát khả năngtách chiết polysaccharide từ nấm Linh chi bằng phương pháp tách chiết trong dung môi ở điều kiện thường và có hỗ trợ của tác nhân vật lý: Sóng siêu âm, vi sóng

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tổn qu n về nấm Lin i

1.1.1 Tên khoa học và phân loại

Nấm Linh chi có tên khoa học là Ganoderma lucidum, thuộc họ Nấm lim (Ganodermataceae) Nấm Linh cho còn có những tên khác như Tiên thảo, Nấm trường

Cách đây 400 năm, nhà y dược nổi tiếng của Trung Quốc Lý Thời Trân (1595)

đã phân ra các nhóm Linh chi chính theo màu sắc và khái quát tác dụng trị liệu của chúng:

1 Nấm Linh chi xanh: Còn gọi là Thanh chi hay Long chi có màu xanh, vị chua,

tính bình, không độc, có tác dụng sáng mắt, bổ gan, an thần, tăng trí nhớ (Hình 1.1.a)

2 Nấm Lin i ỏ: Còn được gọi là Hồng chi, Xích chi hay Đơn chi có màu đỏ,

vị đắng, tính bình, không độc, giúp tăng trí nhớ, dưỡng tim, trị tức ngực (Hình 1.1.b)

3 Nấm Linh chi vàng: Còn được gọi là Hoàng chi hay Kim chi, màu vàng vị

ngọt, tính bình, không độc, chuyên trị an thần, ích khí (Hình 1.1.c)

4 Nấm Lin i trắn : Còn gọi là Bạch chi hay Ngọc chi, màu trắng vị cay, tính

bình, không độc, bổ phổi, thông mũi, an thần, chữa ho, nghịch hơi (Hình 1.1.d)

5 Nấm Linh chi tím: Còn được gọi với tên Tử chi hay Mộc chi, màu tím vị ngọt,

tính ôn, không độc, đặc trị đau nhức khớp xương, gân cốt (Hình 1.1.e)

6 Nấm Lin i en: Còn được gọi là Hắc chi hay Huyền chi, màu đen, vị mặn,

tính bình, không độc, trị chứng bí tiểu, bổ thận (Hình 1.1.f)

Hình 1.1: Các loại nấm Linh chi (a) Linh chi xanh; (b) Linh chi đỏ; (c).Linh chi vàng; (d) Linh chi trắng;

(e) Linh chi tím; (f) Linh chi đen

Trong đó, Linh chi đỏ là loại nấm có dược tính mạnh nhất, được sử dụng phổ biến nhất ở Bắc Mỹ, Nhật, Hàn Quốc, Đài Loan, Trung Quốc…

1.1.2 Đặc điểm hình thái

Quả thể nấm Linh chi bao gồm: Mũ nấm và cuống nấm:

Cuống nấm: Thường hình trụ, cong, ít phân nhánh, dài từ 5 đến 15cm, đường kính khoảng 0,5 đến 1cm Lớp vỏ cuống có thể màu đỏ, nâu đỏ hoặc nâu đen, không có lông trên bề mặt

Mũ nấm: Khi non có hình trứng, lớn dần có hình quạt, đuờng kính 2 - 15cm, dày 0,8 – 1,2cm Trên mặt mũ có vân gạch đồng tâm màu sắc từ vàng chanh - vàng nghệ - vàng nâu - vàng cam - đỏ nâu - nâu tím, nhẵn bóng như láng vecni Mặt dưới phẳng, màu trắng hoặc vàng, có nhiều lỗ li ti

Hình 1.2: Cấu tạo cắt ngang của Nấm Linh chi

Phần thịt nấm dày từ 0,4 – 2,2cm, màu vàng kem – nâu nhạt – trắng kem, phân chia kiểu lớp trên lớp dưới Trên lát cắt trên giải phẫu hiển vi, chỉ thấy đầu trên các sợi phình hình chùy, màng rất dày, đan khít vào nhau, tạo thành lớp vỏ láng (dày khoảng 0,2 – 0,5mm) Nhờ lớp láng bóng không tan trong nước đó mà nấm chịu được mưa nắng [8],[9]

1.1.3 Đặc điểm sinh trưởng

Trong tự nhiên nấm Linh chi phân bố rất rộng, đặc biệt trong các khu rừng thưa của các nước nhiệt đới và cận nhiệt đới Chúng có thể mọc trên gốc, rễ của các cây gỗ Nấm Linh chi hợp với bóng râm, ánh sáng khuếch tán nhẹ, nhiệt độ thích hợp từ 22 –

280C, độ ẩm 80 – 90%, môi trường có pH = 5,5 – 7 Nấm Linh chi sử dụng nguồn dinh dưỡng trực tiếp từ cellulose, phát triển tốt trong môi trường giàu cacbon, nitơ, và các chất khoáng [8]

1.1.4 Thành phần hóa học và dược tính sinh học

Từ những năm 1980 đến nay, bằng các phương pháp hiện đại: phổ kế UV (tử ngoại), IR (hồng ngoại), sắc ký khối phổ (GC – MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân và đặc biệt là kỹ thuật sắc ký lỏng cao áp (HPLC) cùng phổ kế plasma (ICP), đã xác định chính xác gần 100 hoạt chất và dẫn xuất trong nấm Linh chi, các thành phần hóa học được tổng quát như sau:

Bảng 1.1: Thành phần hóa học của nấm Linh chi

Thành phần khác K, Zn, Ca, Mn, Na, khoáng thiết yếu, nhiều

vitamin, amino acid, enzyme và hợp chất alcaloid

[7]

Nấm Linh chi cung cấp một lượng đáng kể các hoạt chất sinh học như polysaccharide (giàu ß–glucan), triterpenoid, steroid, saponin… Trong đó, polysaccharide đuợc xem là nhóm chất rất quan trọng vì chúng là hợp chất quyết định chất lượng của nấm Linh chi [42]

Bảng 1.2: Các hoạt chất sinh học và dẫn xuất trong nấm Linh chi [7]

Adenosine Nucleotide Tăng sự lưu thông máu

Thư giãn cơ, giảm đau

Quả thể

Adenosine Nucleotide Tăng sự lưu thông máu

Thư giãn cơ, giảm đau

Hệ sợi nấm

Uridine, Uracil Nucleotide Phục hồi sự dẻo dai Hệ sợi nấm Beta – D - Glucan Polysaccharide Chống khối u

Kích thích hệ miễn dịch Giảm luợng đuờng huyết

Bổ tim

Quả thể

Beta – D -glucan Polysaccharide Chống khối u

Kích thích hệ miễn dịch Tăng sản suất kháng thể

Hệ sợi nấm

Ganoderic Acids Triterpenoid Chống dị ứng

Bảo vệ gan

Ức chế tổng hợp cholesterol

Quả thể

Ganodermic Acid

T– O

Triterpenoid Ức chế tổng hợp cholesterol Hệ sợi nấm

Ganodermadiol Triterpenoid Giảm huyết áp

Ức chế ACE

Quả thể

Ling Zhi – 8 Protein Chống dị ứng

Điều hòa huyết áp

Hệ sợi nấm

1.1.5 Tác dụng của Linh chi

1.1.5.1 Tăng cường hệ miễn dịch

Nhiều thành phần trong nấm Linh chi đã được chứng minh có tác dụng tăng cường sự sinh trưởng và phát triển của các tế bào lympho (các tế bào chuyên biệt của

hệ miễn dịch), các bạch cầu đơn nhân, các tế bào NK (tế bào diệt tự nhiên) Một số nghiên cứu được tiến hành trên chuột BALB/c cho thấy dịch chiết nấm Linh chi chứa nhiều polysaccharide có tác dụng tăng cường hệ miễn dịch nhờ sự phát triển của các tế bào lá lách và hoạt tính của các đại thực bào, ngoài ra nó còn có tác dụng làm tăng khả năng hoạt động của các tế bào lympho T ở người [50]

1.1.5.2 Chống ung thư

- Bảo vệ những tế bào khỏe mạnh khỏi tế bào ung thư

- Tăng cường khả năng hoạt động của hệ thống miễn dịch để tìm và tiêu diệt những tế bào ung thư

- Giúp kiểm soát lại quá trình phân chia và lão hóa tế bào

- Giúp ngăn cản sự di căn của tế bào ung thư

Trong đó một số nghiên cứu trên động vật cho thấy rằng β-glucan chiết xuất từ nấm Linh chi ngăn cản sự phát triển của ung thư ruột già, phổi, dạ dày, tuyến tiền liệt, bàng quang và não cũng như bệnh bạch cầu…

1.1.5.3 Chống oxy hóa

Những hợp chất có trong nấm Linh chi chủ yếu là các polysaccharide và các triterpene có tác dụng chống lại quá trình oxy hoá tế bào Những hợp chất chống oxi hoá trong nấm Linh chi có tác dụng ngăn ngừa ung thư cũng như những căn bệnh nan y khác Ngoài ra chúng còn bảo vệ các thành phần có trong màng tế bào chống lại những tổn thương do quá trình oxy hoá gây nên, qua đó giúp làm giảm những nguy cơ gây ra đột biến và ung thư cũng như góp phần bảo vệ các tế bào miễn dịch [50]

1.1.5.4 Điều trị bệnh đái tháo đường

Những thành phần của nấm Linh chi đã được chứng minh là có tác dụng hạ đường huyết đối với động vật Hàng loạt các nghiên cứu của Shufeng Zhou chứng minh rằng polysaccharide và triterpene tác động hữu hiệu trong việc điều trị bệnh đái đường type 2 [49] Các ganoderan A và B là hai polysaccharide được chiết tách từ thân nấm Linh chi, sau khi được tiêm cho chuột bị tiểu đường với liều lượng 100mg/kg, cho thấy tác dụng làm tăng lượng insulin và tác dụng hạ đường huyết vẫn tiếp tục kéo dài suốt 24 giờ Trong một nghiên cứu khác cũng được tiến hành trên chuột, người ta đã chứng minh được rằng một polysaccharide khác có trong nấm Linh chi được gọi là ganoderan C cũng có tác dụng hạ đường huyết [50]

1.1.5.5 Khả năng kháng HIV

Để khảo sát khả năng kháng HIV của các hợp chất trong nấm Linh chi, Masao Hattori (2001) đã sử dụng dịch chiết từ quả thể trong thử nghiệm kháng virus HIV – 1 trên các tế bào lympho T ở người Kết quả cho thấy có sự ức chế mạnh mẽ hoạt động sinh sản của loại virus này [38]

1.2 Polysaccharide tron nấm Linh chi

Polysaccharide trong nấm Linh chi là những hợp chất cao phân tử cấu tạo từ nhiều monosaccharide kết hợp lại với nhau Chúng không tan trong các dung môi kém

phân cực và phân cực trung bình như alcohol, acetone, n-hexane, benzen, ethyl acetate, tetrachloromethane, chloroform…nhưng tan trong các dung môi phân cực như nước, NaOH, formamide và dimethylsulfoxide.

1.2.1 Thành phần Polysaccharide

Thành phần Polysaccharide ở nấm Linh chi nay đã được xác định, phân ly thành hơn 200 loại, các phân đoạn có trọng lượng phân tử khác nhau, trong đó có 2 loại polysaccharide chính:

- GL-A: Galactose: Glucose: Rham: Xyl (3,2: 2,7: 1,8: 1,0) M = 23.000 Da

- GL-B: Glucose: Rham: Xyl (6,8: 2,0: 1,0) M = 25.000 Da

Ngoài polysaccharide từ quả thể, polysaccharide cũng được thu nhận từ quá trình nuôi cấy trong môi trường dịch lỏng và rắn, chúng vẫn có hoạt tính sinh học

1.2.2 Vai trò dược học của Polysaccharide

Polysaccharide là một trong những thành phần hữu hiệu nhất chứa trong nấm Linh chi, rất được các nhà y dược học coi trọng Qua những nghiên cứu gần đây, polysaccharide có hoạt tính dược lý rộng, góp phần quan trọng trong việc phòng chống

- Bảo vệ cơ thể chống lại tia bức xạ;

- Tăng chức năng gan;

- Duy trì khả năng tái sinh tủy và cơ;

- Tham gia tổng hợp ADN, ARN và protein

Năm 1994, Lin Zhibin và Lei Lin Sheng đã xác định được trọng lượng phân tử

của polysaccharide từ Ganoderma lucidum là khoảng 7.100 – 9.300 đvC Những tổng

kết về vai trò sinh dược học của nhóm polysaccharide ở các loài nấm Linh chi đã được giới thiệu tại Hội thảo Bắc Kinh với các báo cáo của các tác giả Đài Loan, Trung Quốc, Hoa kỳ Đặc biệt các phức hợp polysaccharide – protein có hoạt tính chống khối u và tăng tính miễn dịch đã được chỉ ra từ lâu Lei L.S và Lin L.B (1993) đã chứng minh tác dụng tăng sinh tổng hợp IL – 2 (Interleukine-2) và hoạt tính ADN polymerase ở chuột già tuổi bởi polysaccharide, càng soi sáng thêm khả năng trẻ hóa, tăng tuổi thọ của nấm Linh chi [7]

1.3 Beta – glucan (β-glucan)

1.3.1 Giới thiệu về β-glucan

Hình 1.3: Công thức hóa học của β-glucan trong nấm Linh chi [28]

β-glucan (beta-glucan) là một trong những polysaccharide phong phú nhất trong thành tế bào nấm, được tạo nên từ các đơn phân tử D-glucose gắn với nhau qua liên kết β-glycoside Hình thức phổ biến nhất của β-glucan là chứa các đơn nguyên D-glucose với các liên kết 1,3 gắn vào vị trí 1,6 tạo thành β-glucan 1,3 / 1,6

1.3.2 Tính chất của β-glucan

β-glucan không hòa tan trong ethanol, aceton nhưng lại tan trong NaOH

và (CH3)2SO4 Sự hòa tan này do sự giảm bậc trong cấu trúc hóa học dưới tác động của

chất oxy hóa mạnh β-glucan có nguồn gốc sinh học, thường tác động đến sự tăng cường đáp ứng miễn dịch tế bào từ các loại kháng nguyên, nhiễm trùng, ung bướu

Đặc biệt, β-glucan trong nấm Linh chi có thể giúp cải thiện sức khỏe cho những người bị suy giảm chức năng miễn dịch, giảm hàm lượng cholesterol trong máu, một

số bệnh dị ứng, bệnh nhiễm trùng, làm chậm quá trình lão hóa, đem lại lợi ích cho sức khỏe đối với bệnh nhân mắc bệnh về động mạch vành ở tim hay cơ chế giải độc cho cơ thể

1.4 C u tố ản ƣởn n qu trìn t i t

Chiết rắn – lỏng là một quá trình phân tách dưới tác dụng của một dung môi lỏng để chuyển chất tan từ pha rắn sang pha lỏng Để tách các hợp chất ra khỏi nguyên liệu rắn ban đầu, thông thường người ta sử dụng các dung môi để hòa tan chất cần tách

(tách chiết chất rắn), sau đó sẽ loại bỏ dung môi và thu hồi chất cần tách [19]

1.4.1 Nguyên liệu

Màng tế bào: Đối với thực vật non hoặc các bộ phận mỏng, mềm, thành phần

màng tế bào chủ yếu là cellulose không tan trong nước và các dung môi hữu cơ khác, bền với nhiệt độ, có tính mềm dẻo và đàn hồi, với loại nguyên liệu này, không nên nghiền mịn khi chiết để hạn chế tạp chất lẫn trong dịch chiết Ngược lại, đối với thực vật đã già hoặc các bộ phận rắn chắc như hạt, thân gỗ, vỏ, rễ thì màng tế bào thường bị

gỗ hóa, cutin hóa, khoáng hóa… do đó dung môi chiết rất khó thấm vào trong tế bào, các loại nguyên liệu dạng này cần nghiền nhỏ để tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình chuyển chất

Màng nguyên sinh: Có tính đàn hồi, không tan trong nước, kém bền nhiệt, là

môi trường dị thể phức tạp tạo thành những hợp chất cao phân tử tan trong nước Do

đó, để hạn chế ảnh hưởng đến quá trình chiết, cần xử lý làm biến tính màng nguyên sinh chất bằng các biện pháp như dùng nhiệt

Cấu tử cần chiết trong nguyên liệu: Bản chất các cấu tử chiết ảnh hưởng tới việc

lựa chọn dung môi chiết Nếu là chất phân cực thì thường chọn các dung môi phân cực như nước, NaOH… ngược lại nếu là chất không phân cực hoặc phân cực yếu thì lựa chọn các dung môi hữu cơ khác như n-hexane, acetone, chloroform, ethyl acetate…

Tạp chất trong dược liệu: Pectin, tinh bột, chất béo, tinh dầu, nhựa, và enzym…

thường có trong các phần của thực vật và có ảnh hưởng nhất định tới quá trình chiết Nếu hàm lượng các chất này trong nguyên liệu chiết cao thì cần có biện pháp xử lý dể hạn chế ảnh hưởng xấu

1.4.2 Dung môi

Dung môi là yếu tố rất quan trọng trong quá trình chiết Muốn chiết một chất ra khỏi một hỗn hợp chất ta phải chọn dung môi chiết có độ hòa tan chất cần chiết nhiều hơn các chất còn lại Để đảm bảo chất lượng sản phẩm thu được bằng phương pháp tách chiết, dung môi cần đảm bảo các yếu tố sau:

- Nhiệt độ sôi thấp: Để dễ dàng tách sản phẩm ra khỏi dung môi bằng phương pháp chưng cất, nhưng không được thấp quá vì sẽ gây tổn thất dung môi, dễ gây cháy

và khó thu hồi dung môi (khó ngưng tụ) Dung môi không tác dụng hóa học với sản phẩm;

- Sức căng bề mặt và độ nhớt: Dung môi cần có khả năng thấm ướt nguyên liệu

và có độ nhớt không cao tránh ảnh hưởng tới quá trình trao đổi chất;

- Dung môi không ăn mòn thiết bị, không gây mùi lạ cho sản phẩm và đặc biệt không gây độc hại;

- Dung môi phải rẻ tiền và dễ mua

1.4.3 Yếu tố kỹ thuật

Nhiệt độ: Từ định luật Fick, khi nhiệt độ chiết tăng thì lượng chất khuếch tán

cũng tăng Tuy nhiên, nhiệt độ cao cũng có bất lợi do làm trương nở tinh bột, tăng độ

tan không chỉ của chất cần thiết mà cả các tạp chất Bên cạnh đó, chiết ở nhiệt độ cao cũng làm tăng lượng dung môi thất thoát

Thời gian: Thời gian đầu của quá trình chiết, các chất có phân tử lượng thấp

khuếch tán trước tiếp đó mới đến các chất có phân tử lượng cao Vì vậy, cần chọn thời gian chiết phù hợp để giảm tạp chất vào dịch chiết

Khuấy trộn: Có tác dụng tạo ra chênh lệch nồng độ ở màng tế bào, tăng cường

tốc độ khuếch tán Bên cạnh đó còn tránh được hiện tượng nhiệt cục bộ có thể gây cháy khét

Ngoài ra, các yếu tố về áp suất, dùng sóng siêu âm, lò vi sóng… cũng có những tác động lên quá trình chiết

1.5 C t n ân vật l

1.5.1 Ứng dụng phương pháp siêu âm trong tách chiết

Siêu âm (ultrasound) là sóng cơ học hình thành do sự lan truyền dao động của các phần tử trong không gian có tần số lớn hơn giới hạn trên ngưỡng nghe của con người (16-20kHz) Ngoài ra, sóng siêu âm có bản chất là sóng dọc (longitudinal wave) hay sóng nén (compression wave), nghĩa là trong trường siêu âm các phần tử dao động theo phương cùng với phương truyền của sóng [47]

Hình 1.4: Phân loại các loại sóng theo tần số

Siêu âm là một lĩnh vực đang được nghiên cứu và có tiềm năng phát triển trong ngành công nghệ thực phẩm Sóng siêu âm có tần số từ 20kHz đến trên 40kHz thường được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực:

Bảng 1.3: Một số ứng dụng của sóng siêu âm trong công nghệ thực phẩm

Ứn dụn iệu ứn ơ ọ Ứn dụn iệu ứn ó ọ và ó sin

Tiệt trùng thiết bị công nghiệp

Sử dụng siêu âm hỗ trợ tách chiết mang lại kết quả cao, Wang, X và cộng sự (2007) đã thành công trong việc sử dụng máy siêu âm để hỗ trợ tách chiết polysaccharide từ nấm Linh chi trong dung môi nước làm tăng hiệu suất tách chiết polysaccharide thô lên khoảng 3% so với phương pháp tách chiết truyền thống thông thường [56]

1.5.1.1 Ưu, nhược điểm của phương pháp tách chiết bằng sóng siêu âm

1.5.1.2 Sử dụng sóng siêu âm trong quá trình tách chiết (UAE)

Sóng siêu âm sử dụng trong tách chiết có ba tác động sinh học sau:

- Rung: Chuyển động sóng siêu âm tạo ra là rất nhanh, tác động lên các mô, tất cả các tác động khác của sóng (nhiệt và tạo bong bóng) đều dựa trên tác động rung này

- Nhiệt: Chuyển động do sóng siêu âm là nguyên nhân chính tạo ra tác dụng nhiệt Trong một vài trường hợp sóng siêu âm có thể làm tăng tốc độ phản ứng lên gần một triệu lần

- Sự tạo và vỡ bọt: Khi sóng siêu âm được truyền vào môi trường chất lỏng, các chu trình kéo và nén liên tiếp được tạo thành Trong suốt chu trình kéo/nén, bọt khí kéo giãn và kết hợp lại cho đến khi đạt được cân bằng hơi nước ở bên trong và bên ngoài bọt khí Diện tích bề mặt bọt khí trong chu trình kéo lớn hơn trong chu trình nén vì vậy

sự khuyếch tán khí trong chu trình kéo lớn hơn và kích cỡ bọt khí cũng tăng khiến các bọt khí nổ tung dữ dội Khi đó các phân tử va chạm với nhau mãnh liệt tạo nên sự sốc sóng trong lòng chất lỏng, kết quả là hình thành những điểm có nhiệt độ và áp suất cao

áp suất cao và vô hại đối với sinh vật

Với những tính năng vượt trội, vi sóng đã được ứng dụng trong các lĩnh vực:

- Hỗ trợ chiết xuất;

- Phân tích: Hóa vô cơ, đo độ ẩm, thủy giải…;

- Hỗ trợ công việc phòng thí nghiệm: Sấy khô các vật dụng thủy tinh, tăng hoạt sắc ký bản mỏng, hoạt hóa tái tạo chất hấp thu sắc ký, chất hút ẩm…;

- Trong công nghiệp: Sấy khô thực phẩm, sát trùng thực phẩm, sấy gỗ…

1.5.2.2 Ưu, nhược điểm của vi sóng

Ưu điểm:

- Thời gian chiết nhanh;

- Hiệu suất chiết cao hơn so với một số phương pháp chiết thông thường Sản phẩm tách chiết chất lượng tốt;

- Thiết bị dễ sử dụng, an toàn và bảo vệ môi trường (Năng lượng sạch, dễ chế tạo

1.5.2.3 Sử dụngvi sóng trong quá trình tách chiết

Sự gia nhiệt bằng vi sóng là một tiến trình làm tăng nhiệt độ của vật chất một cách đặc biệt Tiến trình này không phụ thuộc vào sự dẫn nhiệt của vật chứa và vật chất Sự tăng nhiệt cục bộ tức thời của vật chất do sự quay lưỡng cực và sự dẫn truyền ion:

- Nhiệt sinh ra do sự dẫn truyền ion là kết quả của sự tăng trở kháng của môi trường chống lại sự dịch chuyển của các ion trong trường điện từ

- Cơ chế quay lưỡng cực là quá trình đổi hướng của một phân tử phân cực theo chiều của điện trường

Hình 1.5: Phân tử phân cực sắp xếp lại vị trí trong trường điện từ

Trong nghiên cứu của Huang, P và cộng sự (2007) đã tối ưu quá trình tách chiết polysaccharide từ bào tử nấm Linh chi bằng hỗ trợ lò vi sóng (MAE) với dung môi nước ở 1290

C trong 27 phút với tỷ lệ dung môi/mẫu 31:1 Với công nghệ này, năng suất tách chiết của polysaccharide từ nấm Linh chi tăng lên đến 2,64% [24]

1.6 Tìn ìn nuôi trồn và n iên ứu nấm Lin i

Nấm Linh chi, từ lâu không những chỉ được quan tâm ở Á Đông, mà hiện nay

đã trở thành một trong những đối tượng được quan tâm nghiên cứu phát triển và ứng dụng tại các nước phát triển trong các ngành y dược, chế biến thực phẩm, mỹ phẩm và thực phẩm chức năng…

1.6.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Linh chi hiện nay đang được nuôi trồng ở khắp nơi trên thế giới Sản lượng nấm Linh chi trên thế giới vào khoảng 4.300 tấn/năm, trong đó riêng Trung Quốc chiếm 3.000 tấn Nhật Bản tuy là quốc gia đã tìm ra cách trồng nhưng đến nay mới chỉ sản xuất khoảng 500 tấn mỗi năm, còn lại là Hàn Quốc, Đài Loan

Năm 1936, nấm Linh chi nuôi trồng đại trà thành công ở Nhật Bản thì trào lưu nghiên cứu về hóa sinh học nấm càng trở nên mạnh mẽ Sản lượng nấm nuôi trồng trên thế giới ngày một cao, cung cấp đủ nguyên liệu cho các nhà dược học đi đầu trong nghiên cứu thành phần hóa học của nấm Linh chi

Vào thập niên 70 – 80, bất đầu một trào lưu khảo cứu hóa dược học các nấm Linh chi chủ yếu ở Trung Quốc, Nhật Bản, Hàn Quốc, Đài Loan và Việt Nam Gần đây một số phòng thí nghiệm ở Hoa Kỳ và vùng Đông Nam Á cũng bắt đầu tham gia vào tiến trình này

Chiết xuất polysaccharides là một quá trình quan trọng cho các nghiên cứu và ứng dụng trong đời sống Trong những năm gần đây, nhiều công trình nghiên cứu để khai thác các polysaccharides từ thực vật hoặc nấm đã được thực hiện

Từ lâu, việc sử dụng nước nóng để chiết xuất polysaccharide từ nấm Linh chi là phương pháp phổ biến nhất vì khả năng tương thích, an toàn và thân thiện với môi trường Nhiệt độ cao có thể đẩy nhanh sự tan rã của polysaccharide trong thành tế bào của nấm [45] Các phương pháp sử dụng dung dịch kiềm, dung dịch muối pha loãng… với các nồng độ khác nhau cũng được sử dụng để tách chiết polysaccharide theo nguyên tắc cơ bản là phá vỡ thành tế bào từ bên ngoài vào bên trong Hơn nữa, một số phương pháp khác như lò vi sóng, siêu âm, siêu âm kết hợp lò vi sóng, và phương pháp enzyme cũng được sử dụng, có thể thúc đẩy sự phá vỡ thành tế bào và làm tăng hiệu suất tách chiết polysaccharide

Năm 1981, Miyazaki và Nishijima với phương pháp tách chiết bằng nước nóng, phân đoạn ethanol, và sắc ký gel đã phân lập được một loại β-(1-3)-, (1-6)-, (1-4)-, α-

(1-4) Arabinoxyloglucan từ quả thể nấm Linh chi và chứng minh nó có hoạt tính chống ung thư [41]

Năm 1985, Sone và cộng sự nghiên cứu cấu trúc và hoạt động chống ung thư và nuôi trồng hệ sợi nấm Linh chi, tiến hành tách chiết từ quả thể nấm bằng nước nóng kết hợp kiềm thu được Heteropolysaccharides tan trong nước và từ hệ sợi nấm thu được phân nhánh β-(1-3)-glucan [51]

Năm 1993, Wang và cộng sự đã nghiên cứu thành phần chống ung thư của polysaccharide trong nấm Linh chi, tác giả tiến hành tách chiết từ quả thể nấm bằng nước nóng, dung dịch (NH4)2C2O4 1% và dung dịch NaOH 5% thu được hợp chất chứa glucogalactans và β-(1-3)-glucan [55]

Năm 2001 và 2002, Bao và cộng sự nghiên cứu cấu trúc polysaccharide ảnh hưởng đến hệ miễn dịch của con người, sử dụng phương pháp tách chiết bằng nước nóng từ bào tử nấm và quả thể nấm thu được β-(1-3)-glucan và α-(1-4)-, β-(1-6) Heteroglucan Nhóm chuyên gia Trung Quốc ở Auckland, New Zealand và Thượng Hải, Trung Quốc đã hoàn thiện quy trình tách chiết Polysaccharide hiệu suất khá cao ở nhiệt độ 700C, trong vòng 2h, nhờ đó giảm hiện tượng mất hoạt tính khi chiết ở 1000C [12],[ 13]

Năm 2006, tại Nhật Bản, Jie Liu và cộng sự đã tiến hành chiết trong 24h, với cồn 95% hiệu suất thu hồi chiết là 3,81%, với cồn 30% hiệu suất là 5% [35]

Tuy nhiên, trong các báo cáo sơ bộ cho thấy vẫn còn rất nhiều polysaccharide trong dư lượng tách chiết bằng dung môi nước Kim (1980) đã báo cáo rằng nếu chiết xuất bằng dung môi kiềm có thể tách chiết được thêm 4 loại polysaccharide nữa có khả năng chống khối u cao [32]

Chen và cộng sự (1998) phân tích cấu trúc hóa học của polysaccharide không tan trong nước, sử dụng dung dịch kiềm ở 250

C và 650C tách chiết từ quả thể được (1-3)-glucan [17] Ukai và cộng sự (1982) nghiên cứu cấu trúc polysaccharide hòa tan

α-trong kiềm bằng phương pháp tách chiết quả thể nấm Linh chi bằng dung môi kiềm và thu được β-(1-3)-glucan không tan trong nước [54]

Năm 2008, Ye, Zhang, Zhou và cộng sự cũng chiết xuất từ quả thể nấm bằng nước nóng và sử dụng phương pháp HPAEC – PAD (Phương pháp sắc ký trao đổi anion hiệu năng cao - phương pháp phát hiện xung dòng điện) để phân tích thành phần polysaccharide trong nấm Amaral và cộng sự (2008) sử dụng nước nóng và kiềm có

hỗ trợ của siêu âm để tách chiết quả thể nấm Linh chi thu được β-(1-3)-glucan [11]

Năm 2009, Ye và cộng sự chiết xuất polysaccharide từ quả thể nấm Linh chi để nghiên cứu đặc điểm cấu trúc của heteropolysaccharide [58]

Năm 2010, Liu mô tả đặc tính và hoạt động của polysaccharide chiết xuất từ quả thể nấm bằng nước nóng thu được β-(1-3) (1-4) (1-6)glucan [36]

Trong nghiên cứu của Huang SQ (2010) đã sử dụng phương pháp đáp ứng bề mặt (RSM) để tối ưu hóa quá trình tách chiết hỗ trợ siêu âm kết hợp vi sóng (UMAE), kết quả cho thấy điều kiện khai thác tối ưu công suất siêu âm là 50W, sau đó sử dụng

vi sóng với công suất là 284W trong 701s bằng dung môi nước tỷ lệ dung môi và nguyên liệu: 11,6:1 [27]

Năm 2011, Huang và cộng sự nghiên cứu đặc điểm cấu trúc của polysaccharide GLP-F1-1 chiết xuất từ quả thể nấm Linh chi có hỗ trợ của sóng siêu âm kết hợp lò vi sóng [26]

Năm 2012, Dong và cộng sự tách chiết bào tử nấm bằng nước nóng, kết tủa bằng etOH thu được β -(1-6)-Glucan hòa tan trong nước [22] Zhang và cộng sự (2012) nghiên cứu về đặc điểm cấu trúc của hoạt tính sinh học mới trong polysaccharide được chiết xuất từ quả thể nấm [59]

Năm 2013, Gunjan Sood sử dụng phương pháp đáp ứng bề mặt (RSM) để tối ưu hóa quá trình tách chiết polysaccharide bằng dung môi NaOH 6%, 1000C trong 3h, đạt hiệu suất 4,96% [23]

Năm 2015, Kan và cộng sự đưa ra điều kiện tối ưu cho quá trình tách chiết polysaccharide từ nấm Linh chi bằng dung môi nước ở 660C trong 137phút, tỷ lệ nguyên liệu/dung môi 1:35, hiệu suất đạt 2,44% [31]

1.6.2 Tình hình nghiên cứu trong nước

Nấm Linh chi ở Việt Nam được quan tâm từ những năm 80, 90 của thế kỷ XX, hiện nay đang phát triển và ngày càng lan rộng đến nhiều tỉnh thành trong cả nước với sản lượng khoảng 10 tấn/năm

Tại Việt Nam, năm 2013, dự án ―Hoàn thiện công nghệ sản xuất cao nấm Linh chi và trà nấm Linh chi hòa tan‖ vừa được thí điểm thành công tại Hợp tác xã sản xuất nấm ăn, nấm dược liệu Cựu Chiến binh xã Long Hưng, huyện Văn Giang, tỉnh Hưng Yên Kết quả cho thấy sản phẩm trà nấm Linh chi hòa tan và cao nấm Linh chi tạo ra

có chất lượng tốt, các chỉ tiêu hóa lý vi sinh đều đạt các tiêu chuẩn an toàn vệ sinh thực phẩm

Ngoài ra, các đề tài sản xuất nước Linh chi đóng lon, thực phẩm chức năng từ nấm Linh chi đang ngày càng được quan tâm, điều đó cho thấy nhu cầu ngày càng lớn

về thực phẩm chức năng được chiết xuất từ nấm Linh chi

Nhóm nghiên cứu Viện công nghệ Thực phẩm của Trương Thị Hòa đã tách chiết nấm Linh chi chủng Nhật Bản trên các dung môi cồn có nồng độ khác nhau với tỷ

lệ 1/10 (nguyên liệu/dung môi), chiết 3 lần trong thời gian 48h, kết quả hiệu suất tách chiết cao có thể đạt 8,8%; Tác giả Nguyễn Anh Dũng (XNĐPTU 24 Mekophar) tiến hành tách chiết với cồn tinh khiết đạt hiệu suất 4 – 6% [2]

Nước nóng là dung môi chiết đã được sử dụng phổ biến từ lâu, nhưng điều kiện tối ưu cho quá trình tách chiết các chất hòa tan từ nấm Linh chi vẫn chưa được xác định rõ ràng Nhóm nghiên cứu của TS Trương Thị Hòa đã tiến hành chiết Linh chi

(Ganoderma lucidum) chủng Nhật Bản trên dung môi nước ở các nhiệt độ 800C, 900C,

1000C, 3 lần chiết, tỷ lệ nguyên liệu/dung môi là 1/10, kết quả hiệu suất tách chiết cao nhất là 8,4% ở nhiệt độ 1000C trong thời gian 3,5h [9]

Năm 2007, Nguyễn Tuấn Anh và cộng sự tiến hành khảo sát để chiết xuất các thành phần hoạt tính sinh học từ nấm Linh chi trong nước nóng và ethanol 96%, và đưa

ra kết quả dung môi nước tách chiết cao hơn ethanol 1,9% ở 1000

C trong 60 phút [44] Năm 2009, Nguyễn Thị Minh Tú đã tiến hành nghiên cứu quá trình khai thác hoạt tính sinh học từ nấm Linh chi và khảo sát trên một số dung môi như nước, ethanol, chloroform, trong đó dung môi nước phù hợp nhất [43]

2 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượn n iên ứu

Nguyên liệu nấm Linh chi (Ganoderma lucidum) được sử dụng từ nguồn nấm

Linh chi được sản xuất của Trung tâm công nghệ sinh học thực vật – thuộc Viện di truyền nông nghiệp – Viện Khoa Học Nông Nghiệp Việt Nam (VAAS)

Nguyên liệu được thu hái ngoài tự nhiên ở tuổi nấm vừa thành thục, đã được phơi khô ở cơ sở nuôi trồng, đóng gói trong túi kín Tuy nhiên, do quá trình nghiên cứu diễn ra lâu dài, nguyên liệu cần phải bảo quản trong túi nilon, giữ kín sau mỗi lần sử dụng, bảo đảm độ ẩm ổn định, tránh ẩm mốc phát triển

2.2 Hó ất và t i t bị t í n iệm

2.2.1 Hóa chất

Hóa chất sử dụng trong nghiên cứu có nguồn gốc rõ ràng đã được kiểm định đảm bảo tiêu chuẩn sử dụng trong phòng thí nghiệm bao gồm:

- NaOH khan (Trung Quốc)

- Ethanol 96% (Việt Nam)

- HCl đặc (Trung Quốc)

- H2SO4 đặc (Trung Quốc)

- D – glucose tinh khiết(Sigma-Mỹ)

- Acid dinitrosalicylic (DNS) (Sigma-Mỹ)

- Muối tartrat kép (KNaC4H4O6.4H2O) (Trung Quốc)

- Bộ kit xác định hàm lượng β-glucan (Megazyme-Ireland)

- N – butanol 99% (Trung Quốc)

- Aceton 99% (Trung Quốc)

2.3 P ƣơn p p n iên ứu

2.3.1 Quy trình thí nghiệm tổng quan

Các bước tiến hành:

Bướ 1: C uẩn bị mẫu

- Nấm Linh chi nghiền mịn dạng bột

- Dung môi (nước cất hoặc NaOH)

Bướ 2: T i t

Khảo sát với các điều kiện thay đổi gồm:

1 Loại dung môi: Nước cất, nồng độ NaOH

2 Nhiệt độ tách chiết

3 Thời gian tách chiết

4 Sử dụng tác nhân vật lý: Gia nhiệt, siêu âm, vi sóng

Bướ 3: K t tủ pol s ride

- Sử dụng giấy lọc và phễu lọc hỗn hợp tách chiết

- Hút 1ml dịch lọc vào ống falcon 15ml, bổ sung 5ml etOH 96%

- Trữ lạnh qua đêm

- Ly tâm 6000 v/phút, trong 15 phút, loại dịch nổi

- Sấy khô kết tủa trong mỗi ống

2.3.2 Xác định độ ẩm nguyên liệu [6]

Theo phương pháp sấy đến khối lượng không đổi ở nhiệt độ xác định Cân khoảng 3 - 5g bột nấm Linh chi cho vào hộp nhôm đã được sấy cùng nắp đến khối lượng không đổi, cho hộp và nắp vào tủ sấy (4 mẫu), nâng nhiệt độ lên 1050C Sấy mẫu trong 6h, sau đó đậy nắp hộp, làm nguội trong bình hút ẩm và đem cân (cân điện tử 4

số chính xác đến 0,0001g) Sau khi cân lần thứ nhất sấy lại mẫu ở nhiệt độ trên trong 2h, lặp lại các thao tác này cho đến khi chênh lệch các kết quả giữa 2 lần kế tiếp nhau không vượt quá 0,0001g

Độ ẩm được xác định theo công thức:

Bướ 4: T ủ p ân pol s rite

- Bổ sung vào mỗi ống 0,8ml HCl 10M, vortex đều

- Bổ sung tiếp 3,2ml nước cất, vortex đều

- Đun cách thủy 1000C trong 30 phút

- Làm nguội, trung hòa mỗi ống bằng 4ml NaOH 2M thử bằng giấy quỳ tím (pH 7 -10)

( )

Trong đó :

- M1: trọng lượng hộp nhôm và mẫu trước khi sấy (g)

- M2: trọng lượng hộp nhôm và mẫu sau khi sấy (g)

- M: trọng lượng hộp nhôm (g)

Sau 3 lần tiến hành xác định độ ẩm nguyên liệu, nấm Linh chi được chúng tôi sử dụng trong nghiên cứu này có độ ẩm: 7,1 ± 0,1%

2.3.3 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tách chiết:

Dựa vào quy trình thí nghiệm tổng quát mục [2.3.1], chúng tôi tiến hành khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tách chiết như sau:

2.3.3.1 Khảo sát các điều kiện tách chiết trong dung môi nước

2.3.3.1.1 Khảo sát ảnh hưởng của trạng thái nguyên liệu

Cách tiến hành: Nấm Linh chi được thái lát mỏng, 1 phần đem nghiền nhỏ thành dạng bột mịn như bông, 1 phần được cắt nhỏ dạng mảnh 2x10mm

Cân chính xác 2g nguyên liệu trên và 40ml nước cất đổ vào bình tam giác: Mỗi mẫu bột nấm Linh chi được nghiền nhỏ và nấm Linh chi dạng mảnh 2x10mm được đặt vào bể ổn nhiệt và bể siêu âm để tiến hành tách chiết trong 1 giờ ở 600C

Sau đó sản phẩm được lọc, kết tủa, và xác định hàm lượng đường tổng số

2.3.3.1.2 Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu và nước:

Cách tiến hành: Cân chính xác 2g bột nấm Linh chi và 20ml, 40ml, 60ml, 80ml nước cất đổ lần lượt vào các bình tam giác theo các tỷ lệ: 1:10, 1:20, 1:30, 1:40 (w/v) Đặt các mẫu vào bể ổn nhiệt và vào bể siêu âm ở 600C tách chiết trong 1 giờ

Sau đó sản phẩm được lọc, kết tủa, và xác định hàm lượng đường tổng số

2.3.3.1.3 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian và nhiệt độ

Cách tiến hành: Cân chính xác 2g bột nấm Linh chi và 40ml nước cất vào bình tam giác, đánh dấu: mẫu A1, B1, C1(1 giờ); A2, B2, C2 (1,5 giờ); A3, B3, C3 (2 giờ); A4,

B4,C4 (2,5 giờ); A5, B5, C5 (3 giờ) Mẫu A1, A2, A3, A4, A5 được đặt vào bể ổn nhiệt

300C, mẫu B1, B2, B3, B4, B5 được đặt vào bể ổn nhiệt 600C và mẫu C1, C2, C3, C4, C5được đặt vào bể ổn nhiệt 1000C để tách chiết theo các mốc thời gian 1 giờ ’ 3 giờ

Sau đó tiến hành các bước lọc dịch, kết tủa,xác định hàm lượng đường tổng số

2.3.3.2 Khảo sát ảnh hưởng của tác nhân vật lý đến quá trình tách chiết trong dung môi nước

2.3.3.2.1 Ảnh hưởng của chế độ siêu âm đến quá trình tách chiết

Cách tiến hành: Cân chính xác 2g bột nấm Linh chi và 40ml nước cất vào bình tam giác, đánh dấu các mẫu và tiến hành tách chiết trong bể siêu âm ở các mốc nhiệt

độ 300C ÷ 600C trong các khoảng thời gian 15 phút, 30 phút, 60 phút, 90 phút, 120 phút

Sau đó tiến hành các bước lọc dịch, kết tủa, xác định hàm lượng đường tổng số

2.3.3.2.2 Ảnh hưởng của vi sóng đến quá trình tách chiết

Cách tiến hành: Cân chính xác 2g bột nấm Linh chi và 40ml nước cất vào bình tam giác, đánh dấu và tiến hành tách chiết trong lò vi sóng (công suất 350W) từ 1 phút

÷ 5 phút

Sau đó tiến hành các bước lọc dịch, kết tủa, xác định hàm lượng đường tổng số