Nghiên cứu và phát triển chế phẩm vi khuẩn lactic có khả năng ức chế vi sinh vật độc hại và ứng dụng trong lên men rau quả

Chỉ có một số ít loài vi khuẩn lactic có khả năng sinh tổng hợp các chất nitơ hữu cơ từ nguồn nitơ vô cơ, đôi khi trong một số trường hợp sự phát triển của một vài loài vi khuẩn lactic n

CAO THỊ BÍCH NGỌC

NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CHẾ PHẨM VI KHUẨN LACTIC CÓ KHẢ NĂNG ỨC CHẾ VI SINH VẬT ĐỘC HẠI VÀ ỨNG DỤNG TRONG LÊN MEN RAU QUẢ

LUẬN VĂN THẠC SỸ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

HÀ NỘI - 2009

MỤC LỤC 1

MỞ ĐẦU 4

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 6

1.1.VIKHUẨNLACTIC 6

1.1.1 Đặc điểm hình thái 6

1.1.2 Đặc điểm sinh lý sinh hóa 7

1.1.3 Phân loại vi khuẩn lactic 10

1.2.LÊNMENLACTIC 12

1.2.1 Lên men đồng hình (Homofermentation) 12

1.2.2 Lên men dị hình (Heterofermentation) 13

1.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men lactic 15

1.2.4 Quá trình tạo sinh khối và các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tạo sinh khối .18

1.3.KHẢNĂNGỨCCHẾVISINHVẬTĐỘCHẠICỦAVIKHUẨNLACTIC 21

1.3.1 Cơ chế ức chế vi sinh vật độc hại của vi khuẩn lactic 21

1.3.2 Các sản phẩm phụ của lên men lactic có khả năng ức chế vi sinh vật độc hại 21

1.4.CHẾPHẨMVIKHUẨNLACTIC 24

1.4.1 Chất mang cho chế phẩm 25

1.4.2 Các phương pháp sấy 27

1.5.ỨNGDỤNGCỦAVIKHUẨNLACTIC 30

1.5.1 Ứng dụng vi khuẩn lactic dùng làm chủng giống khởi động trong bảo quản và chế biến thực phẩm 30 1.5.2 Ứng dụng vi khuẩn lactic trong bảo quản và chế biến thức ăn chăn nuôi 30

1.5.3 Ứng dụng vi khuẩn lactic trong sản xuất các loại đồ uống lên men 31

1.5.4 Ứng dụng vi khuẩn lactic trong sản xuất chế phẩm probiotic để tăng cường sức khỏe và vật nuôi và cải thiện môi trường 32

1.5.5 Ứng dụng vi khuẩn lactic trong muối chua rau, củ, quả 33

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 37

2.1.VẬTLIỆUVÀĐỐITƯỢNGNGHIÊNCỨU 37

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 37

2.1.2 Hóa chất và thiết bị chính dùng cho nghiên cứu 37

2.1.3 Môi trường nuôi cấy (xem phụ lục) 38

2.2.PHƯƠNGPHÁPNGHIÊNCỨU 38

2.2.1 Phân lập và giữ giống vi khuẩn lactic 38

2.2.2 Một số đặc điểm hình thái 39

2.2.3 Một số đặc điểm sinh lý, sinh hóa 40

2.2.4 Xác định các vi sinh vật độc hại 43

2.2.5 Phân loại vi khuẩn lactic 45

2.2.6 Tạo chế phẩm vi khuẩn lactic 47

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 50

3.1.PHÂNLẬPVÀTUYỂNCHỌNCHỦNGVIKHUẨNLACTICTHUẦN KHIẾTĐỂKHỞIĐỘNGQUÁTRÌNHLÊNMENLACTICTRÊNRAUQUẢ 50

3.1.1 Phân lập chủng vi khuẩn lactic sinh bacteriocin có khả năng ức chế sự phát triển của Lactobacillus sp .50

3.1.2 Tuyển chọn chủng vi khuẩn lactic có khả năng kháng khuẩn, chịu nhiệt, chịu axit, chịu NaCl 51

3.1.3 Khả năng ức chế vi sinh vật gây bệnh của 2 chủng CM3 và CM22 52

3.1.4 Định tên chủng vi khuẩn lactic CM 3 55

SINHKHỐICỦACHỦNGL.PLANTARUMCM3 61

3.2.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy tới khả năng phát triển của chủng Lactobacillus plantarum CM 3 61

3.2.2 Ảnh hưởng của pH ban đầu tới sự phát triển của chủng L.plantarum CM 3 62

3.2.3 Động thái quá trình lên men lactic của chủng L.plantarum CM 3 64

3.2.4 Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến khả năng phát triển của chủng L.plantarum CM 3 66

3.3.NGHIÊNCỨUTẠOCHẾPHẨMVIKHUẨNL.PLANTARUMCM3 68

3.3.1 Ảnh hưởng của chất mang và tỷ lệ chất mang 68

3.3.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ sấy 71

3.3.3 Ảnh hưởng của thời gian sấy 72

3.4.ỨNGDỤNGCHẾPHẨMTRONGMUỐICHUACÀPHÁO 73

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 76

TÀI LIỆU THAM KHẢO 78

MỞ ĐẦU

Việt Nam có khí hậu nhiệt đới gió mùa, được thiên nhiên ưu đãi nên rau quả được trồng quanh năm, chủng loại rau quả cũng rất đa dạng Hàng năm rau quả được sản xuất với số lượng lớn nên có ý nghĩa rất quan trọng trong tăng trưởng kinh tế và phát triển công nghiệp chế biến, bảo quản thực phẩm Tuy nhiên, việc tiêu thụ rau quả

ở Việt Nam đang gặp nhiều khó khăn, giá cả bấp bênh gây thiệt hại cho nhà nông Do

đó, tìm một hướng mới tiêu thụ các sản phẩm rau quả trong mùa vụ là điều cần thiết, phương pháp bảo quản rau bằng cách muối chua là phương pháp chế biến cổ truyền ở nước ta và một số nước phổ biến trên thế giới

Việc muối chua rau quả vừa được xem là phương pháp chế biến vừa là phương pháp bảo quản dưới tác dụng của axit lactic được tạo ra trong quá trình lên men và muối được bổ sung vào trong quá trình muối Ngoài ra, axit lactic và các sản phẩm khác được tạo ra trong quá trình muối sẽ tạo cho sản phẩm có hương vị đặc trưng và trạng thái dòn hấp dẫn Các sản phẩm rau quả muối có thể được sử dụng ngay hoặc được sử dụng làm bán thành phẩm cho các quá trình chế biến khác như đóng hộp Nhưng cho dù được sử dụng với mục đích nào đi nữa thì các sản phẩm rau quả muối chua cần phải đạt yêu cầu chất lượng nhất định Nhưng với đặc tính của rau quả là loại nguyên liệu rất dễ bị tổn thương và hư hỏng do các tác động bên ngoài như nhiệt độ, ánh sáng cũng như các yếu tố tác động trong quá trình muối chua đặc biệt là sự nhiễm tạp của các vi sinh vật gây hư hỏng từ nguyên liệu, môi trường và các công đoạn chế biến Trong khi đó, các sản phẩm rau quả muối chua ở nước ta chủ yếu được sản xuất ở mức độ thủ công, lên men tự nhiên và chỉ mới bắt đầu sản xuất công nghiệp ở qui mô nhỏ Do đó khả năng nhiễm tạp rất cao, chất lượng không đảm bảo, ảnh hưởng đến sức khỏe người tiêu dùng Hơn nữa ở nước ta hiện nay chế phẩm vi khuẩn lactic thuần chủng ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm chủ yếu là nhập ngoại và để sản xuất sữa chua là chủ yếu Chế phẩm lactic thuần chủng cho sản xuất thực phẩm lên men

truyền thống nói chung và lên men rau quả nói riêng hầu như chưa có Vì vậy việc nghiên cứu đưa ra chủng giống khởi động cho quá trình lên men lactic và hoàn thiện chế phẩm lactic ứng dụng trong sản xuất rau quả lên men có khả năng hạn chế các vi sinh vật gây ngộ độc, tạo khả năng công nghiệp hóa cho việc sản xuất rau quả lên men

có ý nghĩa quan trọng Xuất phát từ những lý do nói trên, chúng tôi đã tiến hành đề tài:

“Nghiên cứu và phát triển chế phẩm vi khuẩn lactic có khả năng ức chế vi sinh vật độc hại và ứng dụng trong lên men rau quả"

Mục tiêu của luận văn:

- Tuyển chọn các giống vi khuẩn lactic thuần khiết có khả năng ức chế vi sinh vật

có hại dùng làm chủng khởi động quá trình lên men lactic trên rau quả

- Xác định các điều kiện nuôi cấy tối ưu quá trình tạo sinh khối của chủng vi khuẩn

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN

1.1 VI KHUẨN LACTIC

Axit lactic được con người sử dụng từ rất lâu để bảo quản và chế biến thực phẩm (như muối dưa cà, tôm chua, nem chua…) Axit này lần đầu được phát hiện và tách ra từ sữa bò lên men chua bởi nhà hóa học người Thụy Điển Sheele năm 1780 Năm 1857 Louis Pasteur đã chứng minh được rằng việc làm chua sữa là kết quả của hoạt động của một số nhóm vi sinh vật đặc biệt gọi là vi khuấn lactic Năm 1878 Lister

phân lập thành công vi khuẩn lactic đầu tiên và đặt tên là Bacterium lactic (hiện nay gọi là Streptococcus lactic) [4] Từ đó đến nay nhiều loài vi khuẩn lactic khác nhau đã

được phân lập và nghiên cứu

Vi khuẩn lactic được xếp chung vào họ Lactobacillaeace Nhóm vi khuẩn này

không đồng nhất về mặt hình thái (gồm cả vi khuẩn hình que và hình cầu), song về mặt sinh lý chúng tương đối đồng nhất Tất cả đều có đặc điểm chung là vi khuẩn Gram (+), không tạo bào tử, không di động, chúng thu nhận năng lượng nhờ phân giải hydratcacbon và sinh ra axit lactic, chúng là các vi khuẩn sống từ kỵ khí đến vi hiếu khí [4]

1.1.1 Đặc điểm hình thái

Tùy theo hình dạng tế bào mà người ta chia vi khuẩn lactic thành dạng hình cầu

và hình que Dạng hình que thường ngắn kích thước 0,5 – 0,7µm, đôi khi có sợi dài tới 8µm Chúng đứng riêng rẽ, kết đôi hoặc kết chuỗi Dạng hình cầu hay oval đường kính 0,5 – 1µm đứng riêng rẽ, kết đôi hoặc kết chuỗi có chiều dài khác nhau Sự thay đổi hình dạng và kích thước tế bào thường xảy ra trong quá trình sinh trưởng và thay đổi tùy từng loài khác nhau Tuy nhiên hình thái tế bào còn phụ thuộc vào môi trường và điều kiện nuôi cấy

1.1.2 Đặc điểm sinh lý sinh hóa

Nhu cầu về dinh dưỡng của vi khuẩn lactic khác nhau là khác nhau, đặc biệt là

nhu cầu vitamin và nitơ Chẳng hạn, Lactobacillus được coi là nhóm vi khuẩn có nhu

cầu về dinh dưỡng cao nhất, chúng đòi hỏi không chỉ là các cơ chất phức tạp chứa cacbon, nitơ, photphat và lưu huỳnh mà còn có nhu cầu rất lớn về các yếu tố cần cho sự phát triển như vitamin và muối vô cơ

1.1.2.1 Nhu cầu dinh dưỡng nitơ

Hầu hết các vi khuẩn lactic đều không tự tổng hợp được các hợp chất nitơ hữu

cơ phức tạp Tuy nhiên nitơ lại là nguồn dinh dưỡng rất quan trọng, nó đảm bảo cho sự phát triển bình thường của các vi khuẩn lactic với vai trò:

- Là thành phần của protein, enzim, các axit nucleic

- Là chất cho và nhận điện tử trong quá trình chuyển hóa

Vì vậy để đảm bảo cho sự phát triển của tế bào chúng phải sử dụng nguồn nitơ

có sẵn trong môi trường Chỉ có một số ít loài vi khuẩn lactic có khả năng sinh tổng hợp các chất nitơ hữu cơ từ nguồn nitơ vô cơ, đôi khi trong một số trường hợp sự phát

triển của một vài loài vi khuẩn lactic như Lactobacillus helveticus có thể bị kích thích

bởi sự có mặt của muối amoni trong môi trường

1.1.2.2 Nhu cầu dinh dưỡng cacbon

Nguồn năng lượng quan trọng nhất cho vi khuẩn lactic là monosaccarit và disaccarit Các nguồn cacbon này được dùng để cung cấp năng lượng xây dựng cấu trúc tế bào và sinh ra các axit hữu cơ như axit malic, piruvic, fumaric, axetic…[14]

Vi khuẩn lactic có thể sử dụng được rất nhiều loại hydratcacbon, từ các đường đơn (glucoza, fructoza, manoza, galactoza ), các đường đôi (saccaroza, lactoza, maltoza…) cho đến các polysaccarit (tinh bột, dextrin) Tuy nhiên khả năng sử dụng

các nguồn thức ăn cacbon khác nhau còn tùy thuộc vào từng loài Ví dụ: Lactobacillus

debbrueckii có thể sử dụng các đường maltoza, glucoza, galactoza, saccaroza, dextrin

mà không sử dụng được lactoza; L.bulgaricus có thể sử dụng glucoza, lactoza, nhưng

không sử dụng maltoza và saccaroza, một số vi khuẩn lactic có thể sử dụng được dextrin và tinh bột [14]

Nguồn cacbon khác nhau trong quá trình nuôi cấy có ảnh hưởng lớn đến khả năng chống chịu của vi khuẩn lactic với các quá trình xử lý sau này Ví dụ như tỉ lệ tế

bào L.bulgaricus sống sót sau khi sấy đông khô phụ thuộc vào loại đường được bổ

sung trong quá trình nuôi cấy và khi thu hồi chế phẩm, nếu lên men từ đường manitol thì tỷ lệ tế bào chết nhiều hơn hẳn so với lên men từ đường fructoza và lactoza [24]

1.1.2.3 Nhu cầu về vitamin

Các vi khuẩn lactic, đặc biệt là loài Lactobacillus, rất cần vitamin cho sự phát

triển Thường thì phải bổ sung vào môi trường các chất có chứa vitamin như nước giá

đỗ, nước khoai tây, nước chiết ngô… Các vitamin đóng vai trò là coenzym trong quá trình trao đổi chất của tế bào, rất ít vi khuẩn lactic có khả năng sinh tổng hợp được vitamin [26]

Nhu cầu vitamin B6 ở cả dạng tự do và dạng liên kết (pyridoxin, pyridoxan,

pyridoxamin…) là đặc biệt lớn đối với các loài Streptococcus và Lactobacillus Các

vitamin nhóm B này kích thích sự phát triển của vi khuẩn lactic [31]

Rogosa và cộng sự [41] đã chỉ ra rằng axit nicotinic và axit pantotenic rất cần thiết cho sự phát triển của tất cả các loài vi khuẩn lactic Trong khi đó vi khuẩn lactic lên men dị hình rất cần thiamin, nhưng axit folic và axit paminobenzoic không ảnh

hưởng đến sự phát triển của các loài Lactobacillus Người ta cho rằng tế bào của loài

Lactobacillus leichmannii và Lactobacillus delbruekii có chứa vitamin B12 hấp thụ từ môi trường với tỷ lệ khoảng 0,5µg/g chất khô Khi đó hầu như toàn bộ lượng vitamin này được phát hiện thấy ở trong thành tế bào liên kết chặt chẽ với các chuỗi polypeptit

ở đó Nhu cầu vitamin còn bị ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố như nhiệt độ nuôi cấy, pH, lượng CO2 ban đầu và thế oxy hóa khử của môi trường, chẳng hạn khi thay đổi nhiệt

độ khoảng 3 – 4oC thì nhu cầu trao đổi riboflavin với môi trường bên ngoài của

Lactobacillus heboeticus thay đổi khoảng 25% Nhu cầu vitamin cũng ảnh hưởng bởi

thành phần môi trường

1.1.2.4 Nhu cầu về muối vô cơ

Để đảm bảo cho sinh trưởng và phát triển đầy đủ, vi khuẩn lactic cần rất nhiều các hợp chất vô cơ như sắt, đồng, natri, kali, photpho, lưu huỳnh, mangan, magie… đặc biệt là mangan Chính mangan ngăn cản quá trình tự phân của tế bào và nó cần thiết

cho quá trình sống bình thường của vi khuẩn này Đối với Lactobacillus thì Mn2+,

Mg2+, Fe2+ có tác động tích cực lên sự phát triển và sản sinh axit lactic [30] Chẳng hạn như Mg2+ là chất hoạt động trong quá trình lên men lactic vì chúng giúp vi khuẩn lactic

sử dụng tốt hơn các loại đường Phức hợp các chất khoáng còn có tác dụng làm giảm

độ axit trong môi trường nuôi cấy các vi khuẩn lactic

1.1.2.5 Nhu cầu một số chất hữu cơ khác

Ngoài axit amin và vitamin ra vi khuẩn lactic còn có nhu cầu rất lớn về các hợp chất hữu cơ khác cho sự phát triển của chúng Dưới đây là một số chất hữu cơ ảnh hưởng đến sự phát triển hoặc kích thích sự phát triển của vi khuẩn lactic [14]

- Các bazơ nitơ: Adenin, Guamin, Thimin…

- Axit hữu cơ: axit axetic và nhiều axit hữu cơ không bay hơi khác

- Axit amin: L-asparagin, L-glutamin…

Axit xitric, xitrat, axetat, axit axetic có tác động quan trọng đến sự sinh trưởng của tế bào Axetat được dùng làm chất đệm cho môi trường khi nuôi cấy nhiều loài vi khuẩn lactic Xitrat do ảnh hưởng tốt đến tốc độ sinh trưởng của vi khuẩn lactic nên ngày nay người ta thường sử dụng xitrat làm thành phần môi trường để nuôi cấy, phân lập và bảo quản các chủng vi khuẩn lactic

Một số axit hữu cơ quan trọng có ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của hầu hết các loài vi khuẩn lactic là axit oleic (có thể thay thế bằng axit linoleic và axit linolenic) Đó

chính là lý do tại sao mà người ta lại sử dụng Tween 80, một dẫn xuất của axit oleic trong thành phần môi trường phân lập và nuôi cấy vi khuẩn latic Ngoài ra Tween 80 còn có hoạt tính bề mặt giúp cho vi khuẩn sinh trưởng và khuếch tán đều trong dung dịch.[14]

1.1.3 Phân loại vi khuẩn lactic

Các loại vi khuẩn lactic bao gồm 4 giống sau đây: Streptococcus, Leuconostoc,

Pediococcus và Lactobacillus Trong số 4 giống trên thì Lactobacillus là trực khuẩn,

còn lại các giống là cầu khuẩn [42]

Giống Lactobacillus có dạng hình que Đây là loại lactic phổ biến nhất Hình

dáng của chúng thay đổi từ hình cầu méo ngắn cho đến hình que dài Ví dụ

Lactobacillus plantarum có dạng hình que kích thước từ 0,7 – 1,1µm đến 3 - 8µm, sắp

xếp thành chuỗi hay đứng riêng lẻ Trong khi Lactobacillus casei có dạng hình que

ngắn hoặc hình que dài, tế bào hình que mảnh, đôi khi hơi cong sắp xếp thành cặp hay chuỗi

Giống Streptococcus có tế bào hình tròn hoặc oval, đường kính khoảng 0,1µm,

sắp xếp riêng biệt, cặp đôi hoặc thành hình chuỗi dài Tuy nhiên, một số chủng thuộc loài này có thể có dạng hơi giống trực khuẩn vì có kích thước chiều dài lớn hơn chiều

rộng, chẳng hạn như Streptococcus lactis

Giống Leuconostoc có hình dạng hơi dài hoặc oval, đường kính từ 0,5 – 0,8µm

và chiều dài khoảng 1,6µm Đôi khi chúng có dạng hơi tròn, chiều dài khoảng 1 - 3µm, sắp xếp thành chuỗi và không tạo thành một đám tập chung

Giống Pediococcus có hình cầu, đường kính 0,6 – 1µm, sắp xếp thành đám, cặp

đôi, cặp bốn

Tuy nhiên gần đây theo khóa luận phân loại mới vi khuẩn lactic được chia

thành 11 giống sau: Lactobacillus, Lactococcus, Streptococcus, Leuconostoc,

Aerococcus, Weisella, Carnobacterium, Vagococcus, Tetragenococcus, và Oenococcus, Enterobacterium [14], [29]

Hiện nay các nhà khoa học thường sử dụng 3 phương pháp phân loại vi khuẩn lactic sau đây:

- Phương pháp phân loại truyền thống: là phương pháp phân loại cổ điển nhất,

dựa trên các đặc điểm hình thái tế bào khuẩn lạc, có đặc điểm sinh lý, sinh hóa… cho đến nay phương pháp này vẫn dùng phổ biến trong nghiên cứu phân loại vi khuẩn lactic

- Phương pháp phân loại dùng Kit chuẩn: đây là phương pháp xác định nhanh

đến loài của một loài vi khuẩn lactic nào đó, nhưng phương pháp này phải sơ bộ biết được vi khuẩn đó là Gram (+) hay Gram (-), kỵ khí hay hiếu khí, trong quá trình xác định kết quả thu được đôi khi cũng khác so với bảng chuẩn Tùy từng loài vi khuẩn khác nhau mà chúng ta sử dụng những bộ Kit chuẩn khác nhau

- Phương pháp phân loại bằng sinh học phân tử: đây là phương pháp hiện đại

nhất, phương pháp này dựa trên cắt các đoạn gen bằng enzym giới hạn, chọn dòng phân tử, hội nhập vào một vectơ, cắt và nối với một phân tử khác Sử dụng phương pháp kỹ thuật lai phân tử, cuối cùng đọc trình tự của đoạn gen Đối chiếu với phả hệ của gen đã được công bố trên ngân hàng gen

Hiện nay phương pháp thường được sử dụng để phân loại là dựa vào phân tích trình tự ARN riboxom (rARN) Riboxom là cơ quan tổng hợp protein có cấu tạo là những hạt hình cầu, kích thước khoảng 25 – 30nm Thành phần cấu tạo nên riboxom là protein và rARN, nó gồm hai tiểu phần: tiểu phần lớn và tiểu phần nhỏ Tiểu phần nhỏ chứa một phân tử rARN và nhiều loại protein khác Tiểu phần lớn chứa hai rARN và nhiều loại protein khác Các tiểu phần của riboxom khác nhau ở tế bào nhân sơ và nhân thực Riboxom của tế bào nhân sơ có hằng số lắng là 70S gồm hai tiểu đơn vị 50S và 30S Tiểu đơn vị 50S có chứa hai dạng rARN 5S và 23S với 34 protein Tiểu đơn vị 30S có rARN 16S và 21 protein Riboxom của tế bào nhân thực có kích thước lớn hơn,

thành phần rARN và protein phức tạp hơn Chúng có hằng số lắng 80S gồm hai tiểu đơn vị 60S và 40S Tiểu đơn vị 60S có ba dạng rARN 28S; 5,8S và 5S với 45 protein Tiểu đơn vị 40S có chứa rARN 18S và 33 protein

Vi khuẩn lactic thuộc loại tế bào nhân sơ vì vậy riboxom của nó có hằng số lắng

là 70S Các nhà khoa học đã nghiên cứu và phân loại các loài dựa vào trình tự mã hóa cho rARN của chúng Vì vậy mỗi loài sẽ có những trình tự gen mã hóa cho rARN rất đặc thù Họ cũng chứng minh được rằng rARN 23S có dung lượng thông tin phát sinh loài cao hơn rARN 16S Tuy nhiên trình tự hoàn chỉnh của 23S cho đến nay vẫn được xác định rất ít trong khi trình tự mã hóa rARN 16S hoàn chỉnh đã được xác định rất phong phú và đa dạng Riêng đối với vi khuẩn đã có hơn 450 loài đã xác định được đầy

đủ và chính xác gen mã hóa cho 16S rARN [34] Dựa vào nguồn gốc của sự phát sinh các nhà khoa học đã tiến hành tách chiết và xác định trình tự gen mã hóa cho 16S rARN (đối với sinh vật nhân sơ) và 18S rARN (đối với sinh vật nhân thật) Sau đó đưa trình tự này lên máy tính và sử dụng phần mềm fasta để so sánh trình tự mới với trình

tự đã được công bố trên ngân hàng gen để tìm ra nguồn gốc phát sinh và có thể định tên chính xác loài đó

1.2 LÊN MEN LACTIC

Tùy theo cách lên men đường mà vi khuẩn lactic được chia làm hai nhóm: vi khuẩn lên men đồng hình và lên men dị hình, quá trình lên men được thể hiện ở sơ đồ 1.1

1.2.1 Lên men đồng hình (Homofermentation)

Lên men lactic đồng hình là kiểu lên men cho sản phẩm chủ yếu là axit lactic

Vi khuẩn lactic lên men đồng hình phân giải đường theo con đường EMP Mayerhof- Panas) Mặc dù chỉ tạo thành hai ATP khi phân giải 1 phân tử đường glucoza thành 2 phân tử axit lactic nhưng các vi khuẩn này lại có ý nghĩa to lớn trong công nghiệp thực phẩm Vì để đảm bảo cung cấp đủ năng lượng cho hoạt động sống, cho sự sinh trưởng và phát triển, chúng cần phải phân giải một lượng lớn đường thành

(Embden-một lượng lớn axit lactic - (Embden-một sản phẩm có vai trò quan trọng trong chế biến thực phẩm

C6H12O6 + 2ADP 2CH3-CHOH-COOH + 2ATP

Các vi khuẩn lactic đồng hình thường gặp: Lactobacillus cremoris,

L.acidophilus, L.plantarum, L.Bulgaricus, L.casei, Streptococcus lactic, S.cremoris, S thermophilus

1.2.2 Lên men dị hình (Heterofermentation)

Lên men lactic dị hình là quá trình lên men tạo ra ngoài axit lactic còn có các sản phẩm khác như axit axetic, rượu etylic, axit sucinic, CO2…

Phương trình tóm tắt của quá trình này:

Các vi khuẩn lên men lactic dị hình thường gặp là: Leuconostoc mensenteroides,

L.oenos, L.cremoris, Lactobacillus brevis, L.fermentum, Bifidobacterium bifidum

Lên men lactic dị hình bởi Bifidobacterium đặc biệt ở chỗ không tạo ra CO2 như lên men lactic dị hình thông thường

Vi khuẩn lactic Lên men đồng hình

Glucoza

Glucoza 6P

Glucoza Glucoza 6P

Axetyl P Axit axetic Dihydroxiaxeton P

1.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men lactic

1.2.3.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ

Nhiệt độ là yếu tố rất quan trọng, ảnh hưởng đến sự phát triển của vi khuẩn lactic và hiệu suất lên men lactic

Giới hạn nhiệt độ cho vi khuẩn lactic phát triển khá rộng, từ 5 – 55oC, tốt nhất là

15 - 40oC [43] Nhóm ưa ấm thích hợp trong khoảng 20 - 40oC, nhóm ưa nhiệt thích hợp trong khoảng 40 - 45oC Trong phạm vi nhiệt độ thích hợp, nếu nhiệt độ càng tăng thì sự lên men lactic càng mạnh, thời gian lên men càng ngắn Các nghiên cứu cho thấy giới hạn nhiệt độ thích hợp cho sự sinh sản và lên men của vi khuẩn lactic cũng chính

là giới hạn hoạt động của enzim nội bào từ 30 - 45oC

Bảng 1.1: Nhiệt độ phát triển của nhóm vi khuẩn lactic

Nhóm Nhiệt độ tối ưu Nhiệt độ phát triển

Hoạt động của vi khuẩn lactic, đặc biệt của hệ enzim chịu tác động mạnh của

pH môi trường Độ pH ban đầu thích hợp cho quá trình lên men của vi khuẩn lactic từ 5,8 - 6,3

Các vi khuẩn lactic có pH tối ưu cho sự phát triển là 5,5 - 6,2 (Lactobacillus); 5,5 - 6,5 (Pediococcus); 6,3 - 6,5 (Leuconostoc) Giá trị pH cuối cùng mà mỗi giống vi khuẩn lactic có thể chịu được là khác nhau Chẳng hạn Lactobacillus có thể chịu được

pH 3,2 - 3,5; Pediococcus có thể chịu được pH 3,5 – 4,4; Leuconostoc có thể chịu được

pH 5

Trong quá trình lên men lactic, sự tích tụ các axit lactic trong giai đoạn đầu có tác dụng ức chế các vi sinh vật khác nhau Sau đó, lượng axit lactic tiếp tục phát triển làm cho pH của môi trường giảm, dẫn đến ức chế cả vi khuẩn lactic và kìm hãm quá trình lên men Như vậy chính axit lactic là chất ức chế Lượng axit lactic quá nhiều sẽ làm giảm tốc độ phát triển và làm giảm số lượng sản phẩm trao đổi chất của vi khuẩn lactic

1.2.3.3 Ảnh hưởng của oxy

Vi khuẩn lactic là loài hô hấp tùy tiện Chúng là nhóm vi khuẩn không có hệ enzym hô hấp xitocrom cũng như hệ enzym catalaza Tuy vậy, chúng vẫn có khả năng oxy hóa rất nhiều chất nhờ sử dụng oxy phân tử Điều này được thực hiện nhờ hệ FAD (Flavin Adenin Dinucleotit)

Người ta thấy rằng trên môi trường thạch, một số chất trong môi trường chỉ có

thể được sử dụng khi có mặt oxy Chẳng hạn Streptomyces faccium, Pediococcus sp.,

Lactobacillus plantarum có thể đồng hóa được glyxerin trong điều kiện hiếu khí Một

vài loài Leuconostoc có thể cần sự có mặt của oxy trong giai đoạn đầu để đồng hóa hexoza Lactobacillus brevis, Lactobacillus buchneri cần oxy để oxy hóa hexoza,

gluconat Sự ảnh hưởng của oxy đôi khi còn phụ thuộc vào cả nhiệt độ, một vài chủng

của loài Lactobacillus brevis, Lactobacillus buchneri phát triển tốt ở 30oC trong điều kiện yếm khí, trong khi ở 37oC nó chỉ phát triển trong điều kiện hiếu khí [22]

Người ta đã chứng minh được rằng hệ enzym peroxylaza có trong vi khuẩn lactic có thể thực hiện các chức năng thay cho hệ enzym dehydrogenaza, khi đó oxy được sử dụng như là chất nhận hydro Quá trình oxy hóa ở vi khuẩn lactic thường kèm theo việc tạo thành H2O2 đồng thời một số vi khuẩn lactic (Streptococcus faccalis,

Streptococcus brevis, Leuconostoc mesenteroides) có thể khử được H2O2 thành nước cùng với sự tham gia của một số chất bị oxy hóa

Nói chung vi khuẩn lactic có hệ enzym peroxydaza sử dụng NDAH2 làm chất nhận điện tử và phân giải H2O2

NADH2 + H+ + H2O2 NAD+ + 2H2O

Quan hệ với oxy giữa các loại vi khuẩn khác nhau là khác nhau Trong điều kiện

kỵ khí nghiêm ngặt thì các trực khuẩn lên men dị hình chậm phát triển Các vi khuẩn lactic lên men dị hình khi lên men arabinoza đạt tối ưu trong điều kiện kỵ khí, còn các loài không sử dụng được pentoza thì phát triển rất kém trong điều kiện này Trong quá trình lên men axit lactic nếu lượng oxy vượt quá giới hạn thì sẽ làm vô hoạt enzym lactat dehydrogenaza, do đó quá trình tạo thành axit lactic không xảy ra

1.2.3.4 Ảnh hưởng của các chất ức chế

Sự phát triển của phần lớn vi khuẩn lactic bị ức chế bởi nồng độ NaCl (≥ 5%) Khi đó nồng độ ion trong tế bào tăng cao sẽ làm ức chế hoạt động các enzym và làm giảm hiệu suất quá trình lên men

Người ta có thể làm tăng khả năng chịu áp suất thẩm thấu của vi khuẩn lactic bằng cách bổ sung ion K+, gluxit hoặc axit amin hay các sản phẩm tương tự Sự bổ sung những chất này làm giảm chênh lệch giữa áp suất nội bào và ngoại bào của vi khuẩn lactic, bởi vì khi nồng độ các ion cao thì ức chế hoạt tính enzym của tế bào nên

vi khuẩn lactic sử dụng các chất hòa tan tương ứng này để duy trì mức độ trương cứng của tế bào, trong khi những chất này không tác động xấu đến protein của tế bào [37]

Nếu trong môi trường lên men việc cung cấp các chất dinh dưỡng lớn hơn nhu cầu của vi khuẩn lactic thì có thể làm ức chế hoạt động của vi khuẩn, dẫn đến ức chế quá trình lên men

1.2.3.5 Ảnh hưởng của nồng độ đường

Đường là nguồn cacbon chủ yếu cho vi khuẩn lactic, nồng độ đường trong môi trường càng cao thì lượng axit lactic sinh ra càng nhiều Tuy nhiên, nồng độ đường quá cao làm cho áp suất thẩm thấu môi trường cao gây ra hiện tượng co nguyên sinh ảnh hưởng đến sự phát triển tế bào của vi khuẩn lactic do đó giảm axit lactic tạo ra

1.2.4 Quá trình tạo sinh khối và các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tạo sinh khối

1.2.4.1 Quá trình tạo sinh khối

Quá trình tạo sinh khối của vi khuẩn được chia thành 4 pha chính [4]:

* Pha tiền phát:

Là giai đoạn từ khi bắt đầu nuôi cấy đến khi tốc độ sinh trưởng của vi khuẩn bắt đầu tăng mạnh Trong thời gian này vi khuẩn làm quen và thích nghi môi trường Lúc này vi khuẩn chưa sinh sản hoặc mới bắt đầu sinh sản, tốc độ còn rất chậm Thời gian của pha này phụ thuộc vào khả năng thích nghi của vi khuẩn đối với môi trường nuôi cấy mới Ở giai đoạn này vi khuẩn cũng bắt đầu tổng hợp một số chất cao phân tử: protein, enzim…

* Pha phát triển logarit:

Đây là pha tăng trưởng mạnh nhất Giai đoạn này, tế bào sinh trưởng với tốc độ lớn nhất (tăng theo hàm số mũ), do đó hàm lượng sinh khối cũng tăng nhanh, tế bào ở pha này trẻ về sinh lý, có hoạt tính sinh học cao, kích thước tế bào cũng lớn lên Kích thước tế bào, số lượng tế bào, thành phần hóa học nói chung thay đổi theo thời gian Tốc độ sinh sản đạt mức cực đại và không thay đổi trong suốt thời gian của giai đoạn phát triển logarit Tế bào sinh ra nhanh, lượng cơ chất giảm rõ rệt và tỷ lệ nghịch với lượng tế bào sinh ra

* Pha cân bằng:

Trong pha cân bằng, quần thể vi khuẩn ở trạng thái cân bằng động học, số tế bào mới sinh ra bằng số tế bào cũ chết đi nên nhìn chung số lượng tế bào và cả sinh khối không thay đổi

Nguyên nhân tồn tại của pha này là do sự suy giảm thức ăn do giai đoạn trước gây nên Cơ chất bị thiếu hụt không đủ đáp ứng cho mọi tế bào, do đó một số tế bào nhạy cảm, già cỗi dễ bị chết ngay còn một số khác còn có khả năng hô hấp Sự hình thành các sản phẩm trao đổi chất (như các loại rượu, axit hữu cơ…) sẽ làm thay đổi

dần dần tính chất của môi trường

* Pha suy vong:

Trong pha này, quá trình sinh sản gần như ngừng hẳn Số lượng tế bào chết ngày càng cao (mặc dù số tế bào tổng cộng có thể không giảm) Sự cân bằng động học

bị phá vỡ hoàn toàn Tế bào ở giai đoạn này không còn tính chất đặc trưng, một số tế bào tự phân, một số chuyển sang dạng tiềm ẩn

Thông qua đánh giá các pha sinh trưởng của vi khuẩn, ta có thể xây dựng đường cong sinh trưởng của vi khuẩn Từ đó, ta có thể thấy rõ giai đoạn phát triển của

vi khuẩn ở từng pha và thời điểm nào thì vi khuẩn phát triển mạnh nhất để thu được hàm lượng sinh khối lớn nhất

Thời điểm thu hồi sinh khối có ý nghĩa rất quan trọng vì nó sẽ ảnh hưởng đến

số lượng tế bào sống sót trong quá trình sấy và bảo quản sau này Nếu thu hồi sinh khối

ở pha cân bằng, khi đó đã xuất hiện nhiều tế bào già và chết, nếu thu hồi sinh khối ở pha phát triển logarit thì tế bào còn non yếu chưa phát triển đầy đủ, khả năng chịu đựng với các phương pháp xử lý nhiệt sẽ kém Theo một số nghiên cứu về vi khuẩn lactic thì sinh khối được thu hồi khi vi khuẩn phát triển đạt đến cuối pha phát triển logarit và đầu pha cân bằng là tốt nhất (vì khi đó lượng sinh khối tạo ra lớn nhất, tế bào lại có khả năng chịu đựng các tác động tốt)

1.2.4.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tạo sinh khối

* Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy

Trong quá trình lên men thu sinh khối thì môi trường nuôi cấy tốt nhất phải là môi trường đảm bảo cho hiệu suất thu hồi sinh khối cao trong thời gian ngắn nhất và giá thành thấp nhất

Vi khuẩn lactic muốn sinh trưởng và phát triển tốt thì trong môi trường nuôi cấy phải có đầy đủ các thành phần chủ yếu như C, H, N, O và các nguyên tố vi lượng

để kích thích sự phát triển của tế bào vi khuẩn Mỗi nguồn dinh dưỡng cung cấp không chỉ ảnh hưởng đến sự phát triển của vi khuẩn trong quá trình nuôi cấy mà còn ảnh hưởng không nhỏ đến quá trình thu và bảo quản chế phẩm sinh khối sau này

Ví dụ: nếu hàm lượng đường trong môi trường nuôi cấy càng cao thì lượng sinh khối

tạo thành càng nhiều song hiệu suất thu hồi sinh khối lại thấp Nguyên nhân là do hàm lượng đường tăng mà tỉ lệ tiếp giống không đổi sẽ gây nên hiệu ứng thừa cơ chât, ức chế sự sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn dẫn đến hiệu suất thu hồi sinh khối giảm

* Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy

- Nhiệt độ nuôi cấy: Nhiệt độ ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng và phát triển của

vi khuẩn Nhiệt độ ảnh hưởng trực tiếp đến các phản ứng enzim của tế bào vi sinh vật Nhiệt độ nuôi cấy quá cao hay quá thấp đều có thể gây ức chế các enzim, làm đình trệ các phản ứng trao đổi chất, do đó ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn kéo theo là hiệu suất thu hồi sinh khối cũng giảm Nhiệt độ thích hợp cho quá trình lên men của vi khuẩn lactic từ 15-40oC

- pH: Hoạt động của vi khuẩn lactic, đặc biệt của hệ enzim chịu tác động mạnh của

pH môi trường Nếu pH không thích hợp vi khuẩn lactic có thể bị ức chế, phát triển kém hay bị tiêu diệt Độ pH ban đầu thích hợp cho quá trình lên men của vi khuẩn lactic từ 5,8 - 6,3

- Tỉ lệ tiếp giống: Tỷ lệ tiếp giống có ảnh hưởng không nhỏ đến sự phát triển của vi

khuẩn Nếu tỷ lệ tiếp giống quá thấp sẽ kéo dài thời gian nuôi cấy, dễ nhiễm tạp, hiệu suất thu hồi sinh khối thấp Nếu tỷ lệ tiếp giống quá cao, mặc dù thời gian nuôi

cấy rút ngắn nhưng hàm lượng sinh khối không cao do vi khuẩn phát triển nhanh quá làm nguồn thức ăn chóng cạn kiệt, và chúng sinh ra một số sản phẩm gây ức chế quá trình sinh trưởng Vì vậy chọn tỷ lệ tiếp giống thích hợp (thường là 5-10%)

sẽ tiết kiệm canh trường giống, đảm bảo quá trình lên men hiệu quả, rút ngắn thời gian lên men

1.3 KHẢ NĂNG ỨC CHẾ VI SINH VẬT ĐỘC HẠI CỦA VI KHUẨN LACTIC 1.3.1 Cơ chế ức chế vi sinh vật độc hại của vi khuẩn lactic

Cơ chế kháng khuẩn hay cạnh tranh môi trường của vi khuẩn lactic với các vi

khuẩn gây hỏng (như B.subtilis, P.vulgaris, B.mensenterium…) và vi khuẩn gây bệnh (như E.coli, B.cereus, S.aureus, Coliorm, Clostridium perfringers …) thông qua một số

cơ chế như cạnh tranh oxi và dưỡng chất, cạnh tranh vị trí tấn công, bám dính và sản sinh ra một loạt các chất ức chế như axit hữu cơ, diaxetyl, axetaldehyt, H2O2, đặc biệt

Bacteriocin tấn công màng tế bào nhạy cảm, gây tổn thương màng không thể khắc phục được Tế bào sẽ chết do nội chất bị thoát ra ngoài Sở dĩ bacteriocin có thể tấn công vì nó ở dạng hòa tan, dễ dàng xâm nhập vào tế bào, làm mất lực đẩy proton (PMF) làm giảm thế năng của màng sinh chất và thay đổi pH nội bào, từ đó tạo ra các

lỗ thủng không khắc phục được trên màng nguyên sinh chất Nội chất của tế bào sẽ bị thoát ra ngoài theo các lỗ này Cho dù quá trình sinh tổng hợp trong tế bào vẫn tiếp tục

diễn ra nhưng nội chất lại liên tục bị thất thoát Do đó, tế bào không thể tổng hợp được màng tế bào và tế bào bị chết [38]

Các bacterioxin của vi khuẩn lactic thuộc các giống Lactobacillus, Lactococcus,

Pediococcus, Leuconostoc và Carnobacterium đang được nghiên cứu rộng rãi Hai

nhóm chính là Lactobacillus, Lactococcus đóng vai trò tăng cường chức năng trong thực phẩm lên men, có khả năng ức chế Listeria và các vi khuẩn Gram (+) khác Các nhóm Pediococcus, Leuconostoc và Carnobacterium đang thu hút sự quan tâm của các

nhà nghiên cứu vì chúng là nguồn tìm ra kháng sinh và bacterioxin [38]

Cho đến nay vẫn chưa có một hệ thống phân loại chính thức các bacterioxin, tuy nhiên chúng có thể được phân loại dựa vào: trọng lượng phân tử, thành phần các axit amin trong phân tử, hay phổ kháng khuẩn [27] Trong đó hệ thống phân loại dựa vào kích thước phân tử, thành phần axit amin và một số yếu tố cấu trúc khác nhau của bacterioxin hiện đang được chấp nhận rộng rãi

Theo hệ thống do Kalaenhammer công bố [33], bacterioxin được chia thành 4 nhóm như sau:

¾ Nhóm 1 (nhóm Lantibiotic): gồm các bacterioxin có phân tử lượng nhỏ hơn 5kDa,

có chứa các axitamin dị thường lanthionin, đặc trưng là nisin, lactixin 481, carnoxin U149 và lactoxin S Nhóm 1 lại được chia làm 2 nhóm nhỏ dựa trên cơ

sở cấu trúc của chúng Nhóm 1a bao gồm các phân tử có hình xoắn ốc, có khối lượng phân tử 2,3-3,5kDa, mang điện tích dương Nhóm 1b bao gồm các phân tử hình cầu có khối lượng phân tử 2kD

¾ Nhóm 2: gồm các nhóm bacterioxin có phân tử lượng nhỏ hơn 10kDa, bền nhiệt nhưng không chứa lanthionin Nhóm 2 lại được chia làm 3 nhóm nhỏ Nhóm 2a

gồm các bacterioxin có khả năng ức chế mạnh Listeria, tiêu biểu là pedioxin

Nhóm 2b gồm các bacterioxin chứa 2 peptit khác nhau, tiêu biểu là lactococxin G, lactococxin M và lactixin F Nhóm 2c gồm các bacterioxin được hoạt hóa bởi nhóm thiol, tiêu biểu là lactococxin B

¾ Nhóm 3: gồm các nhóm bacterioxin có phân tử lượng lớn hơn 30kDa, bền nhiệt, tiêu biểu là helvetixin J, helvetixin V-1829, acidophiluxin A, lactixin A và B, caseixin 80 Nhóm này bao gồm cả các enzim ngoại bào làm tan vi khuẩn

¾ Nhóm 4 (nhóm bacterioxin phức hợp): là nhóm mà trong cấu trúc của chúng ngoài protein còn chứa một hay nhiều loại chất khác (như lipit, cacbonhydrat…), tiêu biểu là là plantarixin S, leuconoxin S, lactoxin 27 và pedioxin SJ-1

1.3.2.2 Axit hữu cơ

Trong quá trình lên men vi khuẩn lactic sản sinh ra các axit hữu cơ (axit lactic, axit axetic, axit propionic ) Theo Mariae và Thomas [38], một số vi sinh vật gây bệnh

(như Salmonella, Listeria sp…) và một số vi sinh vật sinh độc tố (như S.aureus,

B.cereus, Clostridium botulinum…] bị ức chế thậm chí bị tiêu diệt khi pH môi trường

giảm nhanh Sự phát triển của E.coli bị ức chế ở pH= 5,1 còn Staphylococcus thì bị ức

chế ở pH< 5,3 trong khi các vi khuẩn lactic có thể chịu tới pH = 3

Axit lactic và axetic được tạo ra dễ ức chế các vi khuẩn gây hại do chúng tác động lên màng tế bào chất của vi khuẩn, ảnh hưởng đến chức năng bảo vệ và ức chế quá trình vận chuyển chủ động của màng tế bào Axit lactic dễ dàng thấm qua màng tế bào, làm giảm pH nội bào, làm dừng quá trình trao đổi chất gây chết những tế bào nhạy cảm với nó Khả năng ức chế của axit lactic sẽ tăng đáng kể khi trong môi trường có mặt axit axetic

1.3.2.3 H 2 O 2 (Hydrogen peroxide)

Trong quá trình lên men lactic dị hình khi có mặt oxi vi khuẩn lactic có thể sản sinh ra H2O2 Trong khi đó vi khuẩn lactic không có enzim catalaza để phân hủy H2O2

được tạo thành trong quá trình trên

Sự ức chế của H2O2 xảy ra là do tác dụng oxi hóa mạnh của H2O2 lên lipit và protein của màng tế bào, gây ra những biến đổi không thể khắc phục được trên màng tế bào

Các vi khuẩn không mong muốn như Pseudomonas sp và S.aureus nhạy cảm

với H2O2 gấp 2-10 lần so với vi khuẩn lactic Chỉ cần 6µg H2O2/l đủ để kìm hãm sự

phát triển của S.aureus, 20µg H2O2/l thì tiêu diệt hoàn toàn vi sinh vật này H2O2 có

khả năng ức chế một số vi khuẩn gram (-) như Pseudomonas, Flavobacter,

Archromobacter…[40]

1.3.2.4 Diacetyl:

Diacetyl được tạo ra trong quá trình lên men citrat bởi vi khuẩn lactic Diacetyl

có đặc tính kháng khuẩn tốt, đặc biệt là điều kiện pH<7 Nhiều loại vi khuẩn lactic có hoạt tính α-acetolactate decarboxylaza có khả năng chuyển hóa diacetyl thành sản phẩm cuối cùng là acetoin Ngược lại chúng không có hoạt tính α-acetolactate decarboxylaza thì lượng diacetyl tạo ra nồng độ cao, nhất là trong các sản phẩm sữa

Diacetyl ức chế mạnh vi khuẩn gram (-), nấm mốc đặc biệt là Micrococus tuberculosis

1.3.2.5 Acetadehyt

Acetadehyt được tạo ra bởi Lactobacillus delbrueckii và Lactobacillus

bulgaricus, acetaldehyt có nồng độ 10 – 100ppm có thể ức chế sinh trưởng Staphylococcus aureus, Salmonella typhimurium và Escherichia coli trong sữa

1.4 CHẾ PHẨM VI KHUẨN LACTIC

Để ứng dụng vi khuẩn lactic có khả năng ức chế vi sinh vật độc hại trong các sản phẩm lên men ở quy mô công nghiệp thì việc tạo chế phẩm vi khuẩn lactic là rất cần thiết và là vấn đề mới, đang thu hút sự quan tâm của nhiều nhà nghiên cứu trong và ngoài nước

Cơ sở của quá trình tạo chế phẩm là bao bọc các tế bào vi khuẩn lactic bằng chất mang ở đó vi khuẩn lactic vẫn giữ được những đặc tính, tính chất của tế bào Việc bao bọc này nhằm hạn chế mọi sự vận động vật lý bằng cách cố định chúng trên các chất mang bằng nhiều phương pháp khác nhau mà quá trình này không ảnh hưởng tới hoạt tính sinh học của vi khuẩn lactic và có thể sử dụng chúng lâu dài

Với mục đích ứng dụng chế phẩm vi khuẩn lactic cho các sản phẩm lên men như là chủng khởi động thì việc lựa chọn chất mang, phương pháp sấy là khá quan trọng trong quá trình tạo chế phẩm

1.4.1 Chất mang cho chế phẩm

Đối với chế phẩm vi khuẩn lactic thì việc lựa chọn thành phần chất mang có ý nghĩa rất quan trọng, vì nó ảnh hưởng đến tỷ lệ sống sót của tế bào vi khuẩn trong quá trình sấy và bảo quản sau này Theo Hubalek [30] có 3 nhóm hợp chất bảo vệ có vai trò khác nhau:

¾ Loại hấp thụ qua được cả thành tế bào và màng nguyên sinh chất (ví dụ: monosacarit, disacarit, glyxerol…) làm thành tế bào dẻo hơn và liên kết với nước tức là chúng ngăn cản sự tách nước, giảm bớt tính độc của muối và ngăn cản sự tạo thành tinh thể bên trong tế bào trong quá trình sấy khô

¾ Loại thấm qua thành tế bào nhưng không qua màng nguyên sinh chất (ví dụ: oligosacarit, axitamin, các polyme phân tử thấp có thể kể đến như là dextrin như maltodextrin…) gây ra co nguyên sinh của tế bào trước khi lạnh đông và tập trung vào giữa màng tế bào và thành tế bào như một lớp đệm chống lại sự tạo thành băng và do đó tạo thành sự bảo vệ cơ học dưới màng, maltodextrin 10-20 nhóm dextroza được sử dụng như một vật liệu bao bọc bởi khả năng phân tán trong nước đến 35,5% ở dạng hòa tan mà không hình thành thể huyền phù

¾ Loại không thấm qua thành tế bào hoặc không trực tiếp tương tác với thành hoặc màng (ví dụ: các polyme phân tử lượng cao như protein, polysacarit) được hấp thụ trên bề mặt của các vi sinh vật ở đó chúng tạo thành một lớp nhày, do

đó kìm hãm được tốc độ tạo băng thông qua sự gia tăng tính nhày của dung dịch

và giữ cấu trúc vô định hình của băng ở trạng thái gần với trạng thái của tế bào

1.4.1.1 Đường và dẫn xuất của đường

Các loại đường như: glucoza, fructoza, saccaroza…, rượu sorbitol đều có tác dụng bảo vệ đối với rất nhiều loại vi khuẩn lactic trong quá trình sấy và bảo quản chế phẩm

Theo nghiên cứu của Carvalho và cộng sự thì nguồn đường cung cấp trong quá trình nuôi cấy có ảnh hưởng lớn đến khả năng chống chịu của vi khuẩn lactic với các quá trình xử lý sau này [21] Còn đối với sorbitol nó sẽ ngăn chặn sự phá hủy màng tế bào bằng cách tương tác với màng tế bào và ngăn chặn sự oxy hóa lipit nhờ vào đặc tính chống oxy hóa của nó, đồng thời ổn định cấu trúc protein và duy trì liên kết sorbitol-protein [36]

Ngoài việc bảo vệ cấu trúc và chức năng của protein trong quá trình sấy các loại đường còn có thể giảm thiểu sự biến đổi đột ngột của nhiệt độ tới màng tế bào bằng cách luân chuyển nước giữa các đầu lipit, chính điều này sẽ làm cho khả năng hydrat hóa trở lại dễ dàng hơn

1.4.1.2 Các hợp chất khác

Ngoài các loại đường thì một số chất như glutamat natri, các loại polysaccarit (tinh bột, dextrin, maltodextrin, inulin…), sữa gầy cũng có khả năng bảo vệ vi khuẩn trong quá trình xử lý tạo chế phẩm Theo Carvalho và cộng sự thì số vi khuẩn lactic sống sót tăng lên sau quá trình bảo quản khi chất mang có bổ sung glutamat natri do sự liên kết giữa nhóm amin của glutamat và nhóm cacboxyl của protein thành tế bào [21]

Một số polysaccarit như tinh bột, dextrin… mặc dù không kết hợp được lên thành tế bào nhưng chúng lại được hấp thu lên bề mặt vi khuẩn tạo nên một lớp keo dính bảo vệ tế bào trước những tác động của nhiệt, vì vậy sẽ tạo lớp bảo vệ cơ học cho màng tế bào

¾ Maltodextrin là các loại polysacarit không ngọt là sản phẩm thủy phân tinh bột không hoàn toàn, nó được thừa nhận là phụ gia cho thực phẩm và dược phẩm an toàn cho người dùng trực tiếp Là chất có khả năng giữ ổn định hương vị của sản

phẩm thực phẩm, là chất trợ sấy, là chất tăng năng lượng cho thực phẩm ăn kiêng… giúp thực phẩm dễ hòa tan, dễ tiêu hóa, tăng giá trị dinh dưỡng

¾ Inulin là polymer của fructose có trọng lượng phân tử khoảng 5000-6000, inulin

có năng lượng thấp chỉ khoảng 1,5kcal/g nên nó được sử dụng như chất tạo ngọt thay thế đường, là chất tạo cấu trúc, ổn định hương vị, cải thiện vị giác cho các sản phẩm thực phẩm mà không làm mất bất kỳ đặc tính của sản phẩm

Glyxerol cũng có khả năng thâm nhập vào màng tế bào làm cho màng tế bào trở nên dẻo dai hơn và kết hợp được với nước để chống sự thoát hơi nước quá nhiều, đồng thời ngăn chặn sự hình thành tinh thể đá bên trong tế bào khi làm lạnh [21]

Bột sữa gầy được lựa chọn như một thành phần chất mang bởi nó có khả năng bảo vệ tế bào khỏi những tổn thương trong quá trình xử lý bằng cách ổn định các cấu

tử màng tế bào, đồng thời tạo ra cấu trúc hình cầu cho sản phẩm đông khô (như vậy nó

sẽ dễ dàng hydrat hóa trở lại) và nó chứa các protein tạo nên lớp áo bảo vệ tế bào [21] Hơn nữa, trong sữa gầy còn chứa các axit amin, oligosacarit và các peptit mạch ngắn hoạt động như là chất bán thấm Hợp chất bán thấm này sẽ làm nguyên sinh chất co lại trước khi lạnh đông và cô đặc thành một lớp đệm nằm giữa thành và màng tế bào chống lại sự phát triển của tinh thể đá, vì vậy sẽ cung cấp lớp bảo vệ cơ học cho màng

tế bào Bổ sung sữa gầy cùng với các tác nhân bảo vệ sẽ tăng cường khả năng bảo vệ tế bào trong quá trình sấy cũng như bảo quản chế phẩm

1.4.2 Các phương pháp sấy

Việc lựa chọn phương pháp sấy trong việc tạo chế phẩm có ý nghĩa quan trọng bởi nó quyết định tỷ lệ sống sót của tế bào trong chế phẩm cũng như khả năng bảo quản sau này Hiện nay người ta thường sử dụng 3 phương pháp sấy chính là: sấy đông khô, sấy chân không, sấy phun

1.4.2.1 Sấy đông khô

Sấy đông khô là phương pháp sấy đặc biệt là tách nước ra khỏi tế bào bằng cách chuyển nước từ trạng thái rắn sang trạng thái hơi không qua trạng thái lỏng, nước mất đi khi tế bào ở trạng thái rắn nên hình dạng tế bào vẫn được giữ nguyên Vật liệu sấy được sấy trong môi trường chân không nên có thể ngăn chặn nguy cơ phá hủy bởi nhiệt, các phân tử không kết hợp lại với nhau khi cô đặc, tránh được quá trình vi sinh xảy ra làm giảm chất lượng sản phẩm sấy Vật liệu trước khi sấy được làm lạnh đông nhanh nhằm chuyển toàn bộ nước có trong vật liệu sang trạng thái rắn, các cấu tử hòa tan được cố định sao cho không kết hợp lại với nhau Dưới áp suất thấp nước sẽ bay hơi, hơi ẩm sẽ bay sang thiết bị ngưng tụ và ngưng tụ thành nước đá Trong quá trình làm lạnh sâu có thể vi sinh vật bị chết nên ta phải sử dụng chất mang để nhũ hóa bảo vệ hỗn dịch Chất mang thường được sử dụng là sữa gầy, các loại đường, chất chiết nấm men…

Theo một kết quả nghiên cứu cho thấy chế phẩm vi khuẩn Lactococcus lastic

TL6 dùng cho muối chua rau quả sau khi sấy đông khô có chất mang cho tỉ lệ tế bào

sống sót đạt 52% trong khi sấy đông khô không có chất mang tỉ lệ sống sót chỉ đạt 32% [10]

1.4.2.2 Sấy phun

Sấy phun là phương pháp sấy dựa trên nguyên tắc bay hơi nước nhờ sự chênh lệch nhiệt độ giữa chế phẩm và không khí nóng, nhiệt độ đầu vào khoảng 100-120oC, nhiệt độ đầu ra khoảng 60-90oC Tuy nhiên, so với phương pháp sấy đông khô và sấy chân không thì phương pháp sấy phun cho tỷ lệ tế bào sống sót thấp nhất do nhiệt độ sấy quá cao so với khả năng chống chịu của vi khuẩn, nhưng bù vào đó phương pháp sấy phun có tính kinh tế hơn

Chế phẩm sấy phun có thời hạn sử dụng ngắn, số tế bào chết tăng nhanh trong quá trình bảo quản do đã bị suy yếu trong quá trình sấy và không đủ khả năng chống

chịu tiếp trong quá trình bảo quản, tỷ lệ tế bào chết có thể lên đến 70-79% sau 2-3 tháng bảo quản

Theo nghiên cứu của Brian C.S To và Mark R Etzel thì khả năng sống sót của

vi khuẩn lactic sau khi sấy phun phụ thuộc vào nhiều loại vi khuẩn và nhiệt độ đầu ra

của máy sấy Tỉ lệ sống sót của Lc.cremoris dao động từ 2,95 ± 0,07% đến 0,35 ±

0,07% khi tế bào được sấy ở nhiệt độ đầu ra là 65 - 90oC, còn của Lb.pseudoplantarum

là 14,7 ± 0,3% và 13 ± 1% với nhiệt độ đầu ra là 65 và 70oC [23]

1.4.2.3 Sấy chân không

Sấy chân không dựa trên nguyên lý áp suất càng cao thì nhiệt độ sôi càng cao

và ngược lại Do đó mà người ta thường sấy ở áp suất thấp nhằm giảm nhiệt độ sấy đảm bảo cho tế bào có khả năng sống sót cao sau khi sấy Trong môi trường sấy áp suất thấp, nên nước nguyên liệu dễ thoát ra ngoài, nguyên liệu nhanh khô nhưng không gây ứng lực bên trong, do đó chất lượng sấy cao

Phương pháp sấy chân không cho tỷ lệ tế bào sống nhỏ hơn và độ ẩm chế phẩm thu được cao hơn phương pháp sấy đông khô Phương pháp này được ứng dụng với điều kiện độ ẩm chế phẩm không quá cao, như thế thời gian sấy sẽ không quá lâu, không ảnh hưởng tới khả năng sống của tế bào

Theo nghiên cứu của Phan Thanh Tâm thì tỉ lệ tế bào sống sót của chủng

L.plantarum H1.40 đạt 36,45 – 41,71% sau khi sấy chân không ở 40oC trong 2 giờ với chất mang là glucoza [16] Còn theo nghiên cứu của C Santivarangkna và cộng sự thì

khi bổ sung 1% sorbitol vào chế phẩm chứa vi khuẩn Lactobacillus helveticus bằng

phương pháp sấy chân không thì tỉ lệ tế bào sống sót cao hơn 10% so với không bổ sung chất mang [25]

1.5 ỨNG DỤNG CỦA VI KHUẨN LACTIC

1.5.1 Ứng dụng vi khuẩn lactic dùng làm chủng giống khởi động trong bảo quản

và chế biến thực phẩm

Từ lâu trong ngành công nghiệp sữa người ta đã sử dụng các loài giống thuần khiết và giống hỗn hợp để sản xuất các sản phẩm khác nhau như phomat, các loại sữa chua… Vào khoảng năm 1955 người ta đã bắt đầu sử dụng vi sinh vật cho các sản phẩm thịt khác nhau, đặc biệt là xúc xích thô và các thực phẩm ướp muối, các vi sinh vật này được cấy vào các thực phẩm này để tiến hành các quá trình lên men nhất định

Chẳng hạn Pediococcus cerevisiae được dùng làm giống khởi động cho loại xúc xích mùa hè của Mỹ, hay các chủng Micrococcus được dùng cho các loại xúc xích của Châu

Âu Thông thường các vi khuẩn này được cấy dưới dạng hỗn hợp với các loại

Lactobacillus, đặc biệt là Lactobacillus plantarum Các vi sinh vật này giữ vai trò tạo

màu, làm giảm độ pH và tạo thành các chất thơm đặc thù Ngoài ra chúng còn ngăn cản

sự phát triển của vi sinh vật không mong muốn [2]

Ở Việt Nam nhóm tác giả Nguyễn La Anh và cộng sự - Viện công nghiệp thực

phẩm đã nghiên cứu và ứng dụng thành công chủng Lactobacillus plantarum NCDN4

làm giống khởi động nhằm nâng cao chất lượng sản phẩm lên men truyền thống [1]

1.5.2 Ứng dụng vi khuẩn lactic trong bảo quản và chế biến thức ăn chăn nuôi

Trong quá trình ủ tươi thức ăn chăn nuôi, có sự tích tụ axit do quá trình hoạt động của vi khuẩn tạo axit, làm lên men các chất chứa đường trong thực vật và biến những chất này thành axit Vi khuẩn lactic đóng vai trò chủ yếu trong quá trình ủ tươi thức ăn, nhờ nó mà sản sinh ra axit lactic và một phần axit axetic; những chất này làm cho thức ăn có mùi thơm ngon nên con vật thích ăn Nếu trong thức ăn ủ chua, oxy lọt vào thì tạo điều kiện vi khuẩn thối phát triển, còn môi trường yếm khí thì vi khuẩn lactic đã phát triển mạnh, axit lactic đã được tích lũy do đó mà thức ăn trở nên chua dần rồi đạt đến độ pH nhất định và các loài vi khuẩn ngừng phát triển Trong thức ăn ủ

tươi tốt, lượng axit tích lũy có thể đạt đến 6 – 8% trọng lượng chất khô của thức ăn hoặc 1,5 – 2% trọng lượng thức ăn ướt Khối lượng này gồm chủ yếu là axit lactic, nhưng cũng có khi là axit axetic do sự lên men lactic không điển hình

Các loài vi khuẩn lactic thường được sử dụng để ủ chua là Lactobacillus

plantarum, L.mesenteroides…

1.5.3 Ứng dụng vi khuẩn lactic trong sản xuất các loại đồ uống lên men

Đồ uống lên men chua thực chất là sản phẩm của quá trình lên men lactic chưa kết thúc Đây là loại nước lên men giàu dinh dưỡng, có hương vị độc đáo, hấp dẫn, có tác dụng làm đẹp và nâng cao sức khỏe cho người tiêu dùng Có thể sản xuất đồ uống lên men từ một số loại quả giàu đường (như chuối, dứa, vải…) hay các loại quả ít đường (như: táo, ổi, nho…) hoặc từ nguyên liệu giàu tinh bột như lúa mì, đại mạch, cao lương, ngô, gạo… qua quá trình đường hóa Các loại đồ uống lên men chua từ nguyên liệu hạt thường có giá trị dinh dưỡng cao, kích thích tiêu hóa nên thích hợp với thị hiếu người tiêu dùng

Các loại đồ uống lên men có thể là sản phẩm lên men bởi các loại vi khuẩn đơn thuần như Yourmost, Yakult (Nhật) hoặc tổ hợp nấm men với vi khuẩn lactic như Kvass (Nga), Buza (Thổ Nhĩ Kỳ) hoặc bởi tổ hợp vi khuẩn lactic, vi khuẩn axetic và nấm men như Keffia (Châu Phi)

Bảng 1.2: Một số dạng đồ uống lên men bản xứ [39]

Tên sản phẩm Nơi sản xuất Nguồn nguyên liệu Vi sinh vật

(Indonexia)

Đậu tương Ngũ cốc

Rhizopus oligosporus Aspergillus oryzae

lactic

Soybean milic Trung quốc

Nhật bản

Đậu tương Vi khuẩn lactic

Sorghum beer

Kaffirbeen Nam phi Cây lúa miến Vi men khuẩn lactic và nấm

đường Lactobacillus sp Saccharomyces sp

1.5.4 Ứng dụng vi khuẩn lactic trong sản xuất chế phẩm probiotic để tăng cường sức khỏe và vật nuôi và cải thiện môi trường

Những năm gần đây vi khuẩn lactic được sử dụng trong chế phẩm probiotic là giải pháp an toàn và hiệu quả trong nuôi trồng thủy sản để giảm ô nhiễm ao nuôi và tăng khả năng phòng chống bệnh Trong phát triển chăn nuôi gia súc gia cầm, chế phẩm probiotic không chỉ đơn thuần là góp phần cải thiện nâng cao chất lượng vật nuôi

mà còn có rất nhiều tác dụng như: tiêu hóa thức ăn, làm giảm bớt sự rối loạn tiêu hóa, đẩy mạnh sự tổng hợp vitamin và một số enzim tiêu hóa, cải thiện sự dung nạp lactose, cải thiện chức năng miễn dịch, ngăn chặn những chỗ loét trong hệ thống tiêu hóa, giảm

tỉ lệ chết non, làm giảm số lượng vi khuẩn gây bệnh, tăng trọng nhanh…

1.5.5 Ứng dụng vi khuẩn lactic trong muối chua rau, củ, quả

Rau, củ, quả đóng vai trò quan trọng trong bữa ăn của con người Trong rau, củ, quả có rất nhiều các chất dinh dưỡng như các loại đường (glucoza, fructoza, tinh bột, xelluloza…), các axit hữu cơ, vitamin, tanin, pectin và các chất khoáng…

Thành phần hóa học của rau, củ, quả chủ yếu là nước (65 - 95%) ở dạng dịch bào (trong dịch này chứa các hợp chất hữu cơ, các chất khoáng hòa tan) Hàm lượng chất khô trong rau quả dao động trong khoảng 10-20% Ngoài ra chúng còn chứa các chất thơm, chất màu, kháng sinh thực vật (fitoxit) [13] Các chất dinh dưỡng trong rau,

củ, quả khá đầy đủ nên cũng là môi trường thuận lợi cho nhiều vi sinh vật phát triển

Rau quả muối chua là sản phẩm chế biến từ rau quả, bằng cách làm cho đường

có sẵn trong nguyên liệu chuyển hóa thành axit lactic Axit lactic và các sản phẩm khác của quá trình lên men tạo thành làm cho sản phẩm có hương vị đặc trưng Ngoài ra axit lactic còn có tính chất sát trùng, có khả năng ức chế sự hoạt động của nhiều vi sinh vật gây hư hỏng sản phẩm Trong sản phẩm rau quả muối chua muối ăn cũng có nhiều tác dụng Trước hết, muối tạo hương vị đặc trưng cho sản phẩm Ngoài ra, muối còn có tác dụng bảo quản sản phẩm, tuy rằng đa số vi sinh vật chỉ bị ức chế với nồng độ muối ăn tương đối cao (5 - 7%) Muối có tác dụng chủ yếu là gây ra hiện tượng co nguyên sinh

ở tế bào rau quả, làm dịch bào tiết ra Trong dịch bào có chứa nhiều đường và một số chất dinh đưỡng khác, tạo điều kiện thuận lợi cho vi khuẩn lactic phát triển, làm cho sản phẩm đạt được chất lượng cao

Đặc điểm của các biến đổi sinh lý xảy ra trong khi muối chua rau quả phụ thuộc vào điều kiện của các quá trình Các yếu tố chủ yếu ảnh hưởng đến quá trình là nồng

độ muối ăn, hàm lượng đường có trong sản phẩm (đường có sẵn trong nguyên liệu và đường bổ sung thêm), độ pH của sản phẩm, hệ vi sinh vật trong sản phẩm và nhiệt độ của sản phẩm Dung dịch muối ăn ở nồng độ cao sẽ ức chế sự phát triển của các vi sinh vật, kể cả vi khuẩn lactic Khi tiến hành muối chua cần tạo điều kiện cho vi khuẩn lactic phát triển và ức chế sự phát triển của vi sinh vật lạ Do vậy cần dùng nồng độ

muối không quá cao: thường sử dụng muối ăn với tỷ lệ 3 - 5%, hoặc sử dụng nước muối có nồng độ 6 - 10% Đường trong sản phẩm rau muối chua là nguồn tích tụ axit lactic Trong trường hợp hàm lượng đường trong sản phẩm không đủ thì hàm lượng axit lactic tích tụ trong sản phẩm cũng không đạt mức yêu cầu Khi ấy sản phẩm có hương vị kém và dễ bị hư hỏng trong quá trình bảo quản Độ axit trong sản phẩm cũng ảnh hưởng lớn tới quá trình muối chua vì các vi sinh vật rất nhạy cảm với độ pH của môi trường (độ pH tối ưu cho các vi khuẩn lactic phát triển là 3,0 - 4,5) Trong quá trình lên men của rau quả muối chua, axit lactic tích tụ với hàm lượng 0,5% cũng đã ức chế hoạt động của nhiều vi sinh vật lạ gây ảnh hưởng xấu cho quá trình lên men Khi tích tụ với hàm lượng cao hơn (1 - 2%), axit lactic ức chế hoạt động của các vi khuẩn lactic và quá trình lên men lactic do vậy cũng bị kìm hãm Nồng độ axit lactic giới hạn đạt được trong quá trình lên men lactic phụ thuộc vào lượng đường có trong sản phẩm, vào nồng độ muối, vào nhiệt độ lên men và vào dạng vi khuẩn lactic

Quá trình lên men lactic trong sản phẩm rau quả muối chua có thể phân tách làm

3 giai đoạn [9]:

Giai đoạn 1: Đường và các chất hòa tan có trong dịch bào của mô bào thực vật được

thẩm thấu ra ngoài, nhờ vậy tạo điều kiện thuận lợi cho vi khuẩn lactic và một số vi sinh vật khác phát triển Điều này dễ nhận thấy là bề mặt khối dịch lên men có nhiều bọt khí Khí tạo thành do hoạt động của sinh vật tạo khí Trong giai đoạn này vi khuẩn

Leuconostoc mensenteroide phát triển rất mạnh Loài vi khuẩn này sinh ra axit lactic và

sinh khí Lượng axit lactic ở giai đoạn này rất nhỏ (<1%)

Giai đoạn 2: Trong giai đoạn này số lượng vi khuẩn lactic đạt lớn nhất, đồng thời axit

lactic tích tụ rất nhiều, pH dịch lên men giảm nhanh Do tác dụng của axit lactic mà các

vi khuẩn gây thối giảm mạnh Trong giai đoạn này, hương vị đặc trưng của sản phẩm lên men bắt đầu hình thành, chất lượng sản phẩm cuối cùng phụ thuộc nhiều ở giai đoạn này Cuối giai đoạn 2 lượng axit lactic đạt cực đại và tác dụng ngược lại với vi khuẩn lactic, quá trình lên men chuyển sang giai đoạn thứ 3

Giai đoạn 3: Ở giai đoạn này vi khuẩn lactic chết dần trong khi nấm sợi và nấm men

phát triển dần về số lượng Do sự giảm mạnh của nấm sợi, axit lactic bắt đầu giảm dần tới sự hư hỏng nhanh chóng của sản phẩm Khối rau quả lên men bắt đầu bị các vi khuẩn gây thối tấn công Để kéo dài giai đoạn 3 nên đưa sản phẩm kết thúc ở giai đoạn

2 vào điều kiện lạnh (2-4oC) hay dùng hóa chất chống nấm sợi nấm men và vi khuẩn gây thối, thường sử dụng axit sorbic và benzoat natri

Trên thế giới có rất nhiều loại rau quả lên men khác nhau Ví dụ như ở Đức có Sauerkraut là sản phẩm rau bắp cải lên men bởi nhiều giống vi khuẩn lactic khác nhau

như Leuconostoc, Lactobacillus và Pediococcus Ở Hàn Quốc có kim chi là thực phẩm

lên men truyền thống, đây là sản phẩm rau cải bắp lên men được bổ sung thêm nhiều gia vị khác nhau như gừng, tỏi, ớt bột… Ở Đài loan có Dochi là sản phẩm lên men từ hạt đậu đen, ở Malaysia có Tempeh là sản phẩm lên men từ các loại đậu…

Ở Việt Nam từ giữa thế kỷ XVIII nhân dân ta đã tiếp thu kinh nghiệm của người Hoa làm ra sản phẩm muối chua từ các loại rau, củ, quả khác nhau và hiện nay các loại sản phẩm muối chua chủ yếu ở nước ta là cải bẹ, cà pháo, cà bát, hành củ, su hào, bắp cải…

Nói chung các sản phẩm muối chua ở các cơ sở chế biến ở nước ta thường được sản xuất theo phương pháp truyền thống nên chất lượng không ổn định, không đồng đều, mức độ hư hỏng lớn, thời gian bảo quản ngắn, khả năng nhiễm tạp cao, không đảm bảo vệ sinh an toàn thực phẩm Hiện nay đã có một vài cơ sở tiến hành các phương pháp muối chua theo quy mô công nghiệp có áp dụng các tiến bộ kỹ thuật nên chất lượng đã ổn định hơn và phần nào đáp ứng được yêu cầu chất lượng cho xuất khẩu

Tuy nhiên hương vị của sản phẩm chưa đặc trưng do quy trình muối thực tại của

cơ sở thì quá trình lên men lactic chưa được phát huy thế mạnh với vai trò tạo hương vị

và trạng thái đặc trưng cho sản phẩm và tạo ra axit lactic- một nhân tố kìm hãm sự phát triển của vi sinh vật gây thối hỏng sản phẩm Hơn nữa quá trình lên men này nhờ

chủng vi sinh vật tự nhiên có trong nguyên liệu hoặc trong môi trường tức là lên men

tự nhiên nên trong một trường hợp nào đó khi lượng vi sinh vật gây hư hỏng bị nhiễm tạp vào sản phẩm với một lượng lớn sẽ không bị ức chế ngay bởi lượng axit lactic tạo thành vốn rất ít vì vậy dễ gây cho sản phẩm một chất lượng không tốt Vì vậy để khắc phục vấn đề này trong quá trình muối cần bổ sung ngay từ ban đầu một lượng chế phẩm vi khuẩn lactic thích hợp nhằm tạo ra môi trường axit ngăn cản sự phát triển của

vi sinh vật gây thối hỏng, đồng thời điều chỉnh quá trình lên men thông qua việc điều chỉnh quá trình sinh trưởng và phát triển của chủng vi khuẩn lactic bổ sung nhằm tạo cho sản phẩm có hương vị, màu sắc và trạng thái theo ý muốn

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 VẬT LIỆU VÀ ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Các mẫu cà muối chua thu thập ở các chợ Hà Nội trong thời gian từ tháng 11/2008 dùng để phân lập các chủng vi khuẩn lactic dùng cho nghiên cứu

Các chủng vi khuẩn gây bệnh như: Salmonella, E coli, Staphylococcus aureus

và Bacillus cereus – Viện Kiểm nghiệm thuốc TW cung cấp

Chủng vi khuẩn kiểm định Lactobacillus sp do Bộ môn Công nghệ sinh học

Sau thu hoạch - Viện Cơ điện NN và Công nghệ sau thu hoạch cung cấp

2.1.2 Hóa chất và thiết bị chính dùng cho nghiên cứu

- Máy li tâm EBA 21 (Đức)

- Máy quang phổ (Thermo)

- Cân phân tích 10-4, 10-2 (Mettler Toledo)

- Tủ cấy vô trùng class II biological safety (USA)

- Tủ nuôi cấy Sanyo (Nhật Bản)

- Pipetman các loại (Đức)

- Nồi hấp tự động Sturdy (Đài Loan)

- Máy sấy chân không Vacucell (Đức)

- Máy xác định trình tự ADN tự động ABI 377 PRISM

- Máy PCR

- Hệ thống điện di

- Máy soi chụp ảnh gel, Pharmacia, Mỹ

2.1.3 Môi trường nuôi cấy (xem phụ lục)

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1 Phân lập và giữ giống vi khuẩn lactic

2.2.1.1 Phân lập từ cà pháo

Cân 30g mẫu cà pháo muối chua, cắt nhỏ cho vào bình tam giác có 270ml nước cât vô trùng, lắc trên máy lắc 30 phút Pha loãng thập phân mẫu phân tích vào ống nghiệm chứa 9 ml nước cất vô trùng tới nồng độ thích hợp để dễ cho việc quan sát khuẩn lạc Dùng pipet hút 1ml mẫu đã pha loãng ở trên cho vào đĩa petri, rót môi trường MRS đã đun chảy để nguội đến 40oC lên, lắc nhẹ cho thạch dàn đều trên mặt đĩa Nuôi trong tủ ấm ở 37oC trong 48 giờ Sau 48 giờ tách từng khuẩn lạc riêng rẽ cấy vào các ống nghiệm khác nhau

2.2.1.2 Giữ giống và cấy truyền

Giống này được bảo quản trong tủ lạnh 4oC, thời gian tốt nhất là 1 tháng Chủng vi khuẩn lactic này trước khi sử dụng được hoạt hóa Nếu bảo quản lâu hơn được bảo quản trong glyxerin 20-25% ở điều kiện lạnh sâu [8]

2.2.1.3 Nhân giống

Môi trường nhân giống là môi trường MRS lỏng được chuẩn bị và thanh trùng trong bình tam giác Chủng vi khuẩn được lấy từ ống giống cấy vào ống nghiệm chứa 10ml môi trường đã khử trùng Sau 24 giờ phát triển thì tiếp tục cấy sang bình tam giác (tỷ lệ tiếp giống là 10%) Tùy thuộc quy mô thí nghiệm mà có các cấp nhân giống thích hợp

2.2.2 Một số đặc điểm hình thái

2.2.2.1 Soi tiêu bản sống [8]

Dùng que cấy vô trùng lấy tế bào vi khuẩn lactic từ ống nghiệm dàn đều trong một giọt nước vô trùng đã nhỏ sẵn trên lam kính, đậy lamen Quan sát tiêu bản dưới kính hiển vi quang học độ phóng đại 1000 lần

2.2.2.2 Nhuộm Gram [8]

Sử dụng tế bào vi khuẩn lactic được nuôi trong 24 giờ để làm tiêu bản Làm vết bôi trên phiến kính, để khô, cố định vết bôi trên ngọn lửa đèn cồn Nhuộm vết bôi bằng tím gentian trong 1-2 phút, đổ thuốc nhuộm đi, xử lý tiêu bản bằng dung dịch lugol trong 1-2 phút cho đến khi thẫm lại Đổ lugol đi và rửa bằng etanol 96o trong 1-2 phút Rửa sạch tiêu bản bằng nước sau đó nhuộm bổ sung bằng dung dịch fucsin trong 1-2 phút, rửa sạch bằng nước cho tới khi hết màu thì thôi Để tiêu bản khô thì quan sát bằng vật kính dầu có độ phóng đại 1000 lần Vi khuẩn Gram (+) bắt màu lam tím, vi khuẩn Gram (-) bắt màu đỏ

2.2.2.3 Khả năng di động [32]

Chủng vi khuẩn được cấy chọc thẳng vào môi trường MRS thạch đứng, nuôi cấy ở 37oC Sau 48 giờ lấy ra xem kết quả Nếu vi khuẩn chỉ mọc thẳng đứng theo đường cấy chứng tỏ vi khuẩn không có khả năng di động Nếu vi khuẩn mọc lan ra xung quanh đường cấy chứng tỏ vi khuẩn có khả năng di động