Nghiên cứu và phát triển bộ cảm biến miễn dịch điện hóa để phát hiện virus viêm não nhật bản

PHÁT TRIỂN BỘ CẢM BIẾN MIỄN DỊCH ĐIỆN HÓA SỬ DỤNG KHÁNG THỂ TỪ HUYẾT THANH BỆNH NHÂN ĐỂ PHÁT HIỆN VIRUS VIÊM NÃO NHẬT BẢN 3.2.6.1 Phát hiện gián tiếp kháng nguyên virus dựa trên sự tha

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

LUẬN ÁN TIẾN SĨ KHOA HỌC VẬT LIỆU

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

1 TS MAI ANH TUẤN

2 PGS.TS PHAN THỊ NGÀ

Hà Nội - 2012

ii

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan rằng đề tài: “Nghiên cứu và phát triển bộ cảm biến miễn

dịch điện hóa để phát hiện virus viêm não Nhật Bản” do chính tôi đề xuất và

thực hiện dưới sự giúp đỡ của các thầy hướng dẫn Tên đề tài và nội dung nghiên cứu không trùng lặp với bất kỳ công trình nghiên cứu nào khác ở Việt Nam cũng như trên thế giới Các kết quả trong luận án là hoàn toàn trung thực, chưa từng được công bố hay sử dụng để bảo vệ cho bất kỳ luận án nào khác Tất cả các công trình

đã công bố chung với thầy hướng dẫn khoa học và đồng nghiệp đều được sự đồng ý của các tác giả trước khi đưa vào luận án Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm với nội dung luận án này

Hà Nội, ngày 19 tháng 05 năm 2012

Tác giả luận án

Trần Quang Huy

LỜI CẢM ƠN

Trước tiên, tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Mai Anh Tuấn và PGS.TS Phan Thị Ngà - những người thầy đã nhiệt tình chỉ bảo, định hướng và giúp đỡ về mặt khoa học để tôi có thể hoàn thành đề tài luận án tiến sĩ

Tôi xin chân thành cảm ơn tới Ban giám đốc, toàn thể cán bộ Viện đào tạo quốc

tế về khoa học vật liệu (ITIMS); Viện đào tạo sau đại học - Trường Đại học Bách khoa Hà Nội đã tạo mọi điều kiện về cơ sở vật chất, hỗ trợ về chuyên môn cũng như thủ tục hành chính trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn tới Ban giám đốc; Ban chủ nhiệm khoa Virus; Phòng thí nghiệm Siêu cấu trúc và Công nghệ nano y sinh; Phòng thí nghiệm virus Arbo và các đồng nghiệp thuộc Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương đã tạo mọi điều kiện để hỗ trợ tôi trong thời gian đi học và đóng góp những ý kiến quí báu về mặt chuyên môn trong quá trình thực hiện đề tài luận án

Xin cảm ơn tới tất cả các thành viên nhóm cảm biến sinh học thuộc Viện ITIMS

đã nhiệt tình giúp đỡ để tôi hoàn thành tốt luận án này

Xin được coi thành quả của luận án như một món quà tinh thần để dành tặng cho bố mẹ tôi – bậc sinh thành, những người cả cuộc đời chỉ quẩn quanh bên đồng ruộng của vùng quê nghèo khó Bố mẹ luôn là điểm tựa và sẵn sàng hy sinh tất cả

để thổi bùng lên ngọn lửa hy vọng trong bước đường sự nghiệp của chúng con Thành quả này sẽ không trọn vẹn nếu không có được sự hỗ trợ về vật chất cũng như tinh thần của người vợ thân yêu, con gái Thùy Trang và các em của tôi- những người đã luôn đồng hành để động viên, chia sẻ những ngọt bùi và khó khăn của cuộc sống trong suốt thời gian vừa qua

Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn tới các thầy – cô giáo cũ, những người thân và bạn bè đã động viên về tinh thần, giúp đỡ về vật chất cũng như chuyên môn trong suốt quá trình thực hiện luận án

Luận án được sự hỗ trợ kinh phí từ Quỹ phát triển Khoa học và Công nghệ quốc gia (NAFOSTED), đề tài mã số: 106.16.181.09

Xin chân thành cảm ơn!

Tác giả luận án

Trần Quang Huy

1.1 Khái niệm cảm biến sinh học và cảm biến miễn dịch 6

1.2.4 Triển vọng của cảm biến miễn dịch trong phát hiện virus gây bệnh 12

1.7 Cảm biến miễn dịch điện hóa trên cơ sở vi điện cực 40

1.8 Cảm biến miễn dịch điện hóa sử dụng hạt nano vàng và protein A 41

Chương 2 CỐ ĐỊNH KHÁNG THỂ TỪ HUYẾT THANH BỆNH NHÂN CHO

2.2.3.2 Cố định kháng thể từ huyết thanh lên điện cực 49

2.2.3.3 Khảo sát đặc trưng bề mặt điện cực 51

2.3.1 Hình thái bề mặt điện cực quan sát bằng kính hiển vi điện tử quét 53 2.3.2 Hình thái bề mặt điện cực quan sát bằng kính hiển vi lực nguyên tử 57 2.3.3 Phổ hấp thụ bức xạ hồng ngoại biến đổi chuỗi Fourier 60

Chương 3 PHÁT TRIỂN BỘ CẢM BIẾN MIỄN DỊCH ĐIỆN HÓA SỬ DỤNG

KHÁNG THỂ TỪ HUYẾT THANH BỆNH NHÂN ĐỂ PHÁT HIỆN

VIRUS VIÊM NÃO NHẬT BẢN

3.2.6.1 Phát hiện gián tiếp kháng nguyên virus dựa trên sự thay đổi độ dẫn 79

3.2.6.2 Phát hiện trực tiếp kháng nguyên dựa trên sự thay đổi tổng trở

không faraday

80

3.3.1 Kiểm tra sự có mặt kháng nguyên virus trong mẫu phân tích 82 3.3.2 Phát hiện gián tiếp kháng nguyên virus dựa trên sự thay đổi độ dẫn 82 3.3.3 Phát hiện trực tiếp kháng nguyên virus dựa trên sự thay đổi tổng trở

không faraday

94

4.2.3 Quy trình tổng hợp phức hợp hạt nano vàng – protein A (Au/PrA) 114 4.2.4 Khảo sát hoạt tính sinh học của Au/PrA trong dung dịch 115 4.2.5 Khảo sát hoạt tính sinh học của Au/PrA trên bề mặt điện cực 115

4.2.6 Khảo sát tín hiệu cảm biến miễn dịch sử dụng phức hợp Au/PrA 116

4.3.2 Sự ổn định và sự phân bố kích thước hạt nano Au 118 4.3.3 Phổ hấp thụ tử ngoại-khả kiến (UV–vis) của phức hợp Au/PrA 120 4.3.4 Hoạt tính sinh học của phức hợp Au/PrA trong dung dịch 121 4.3.5 Hoạt tính sinh học của phức hợp Au/PrA trên bề mặt điện cực 123 4.3.6 Tín hiệu cảm biến miễn dịch sử dụng phức hợp Au/PrA 126

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

TT Viết tắt Từ tiếng Anh đầy đủ Nghĩa tiếng Việt

2 ADB Asian development bank Ngân hàng phát triển châu Á

3 ADN Deoxyribonucleic acid Axit deoxyribonucleic

4 AFM Atomic force microscopy Hiển vi lực nguyên tử

6 APTES 3-aminopropyl–triethoxy-silane 3-aminopropyl–triethoxy-silan

7 ARN Ribonucleic acid Axit ribonucleic

8 ATP Adenosine triphosphate Adenosin triphosphat

10 BSA Bovine serum albumin Albumin huyết thanh bò

11 EID50 50% embryo infective dose Liều nhiễm trùng phôi gà 50%

12 EIS Electrochemical impedance

14 EMS Electron microscopy science Khoa học hiển vi điện tử

15 FET Field effect transistor Tranzito hiệu ứng trường

16 FITC Fluorescein isothiocyanate Fluorescein isothiocyanat

24 FM Fluorescence microscopy Hiển vi huỳnh quang

17 FTIR Fourier transform infrared

22 HPV Human papillomavirus Virus papilloma ở người

23 HRP Horseradish peroxidase Peroxidaza cải ngựa

25 IOP Institute of Physics, UK Viện vật lý, vương quốc Anh

viii

TT Ký hiệu Từ tiếng Anh đầy đủ Nghĩa tiếng Việt

26 ISE Ion selective electrode Điện cực chọn lọc ion

27 ISFET Ion sensitive field effect transistor Tranzito hiệu ứng trường nhạy

ion

28 ISI Institute of Scientific Information Viện thông tin khoa học

29 ITIMS International Training Institute for

33 NADH Nicotinamide adenine

37 PBS Phosphate buffered saline Muối đệm phốt phát

38 PCR Polymerase chain reaction Phản ứng chuỗi polymeraza

41 QCM Quartz crystal microbalance Vi cân tinh thể thạch anh

42 SAM Self-assembled monolayer Đơn lớp tự sắp xếp

43 SARS Severe acute respiratory syndrome Hội chứng viêm đường hô hấp

45 SAW Surface acoustic wave Sóng âm bề mặt

47 SEM Scanning electron microscopy Hiển vi điện tử quét

48 SJR Scientific journal rankings Xếp hạng tạp chí khoa học

49 SPR Surface plasmon resonance Cộng hưởng plasmon bề mặt

50 TEM Transmission electron microscopy Hiển vi điện tử truyền qua

52 UV-vis Ultraviolet-visible Tử ngoại-khả kiến

51 WHO World Health Organization Tổ chức y tế thế giới

DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU

1 Bảng 1.1 Bệnh mới nổi và tái phát do virus ở khu vực Đông Nam Á 10

2 Bảng 1.2 Một số nghiên cứu về cảm biến miễn dịch để phát hiện virus

gây bệnh

14

3 Bảng 1.3 Cảm biến miễn dịch điện hóa dựa trên loại hình chuyển đổi tín

hiệu và đối tượng phân tích

17

4 Bảng 1.4 Một số nhóm chức phổ biến của protein và bề mặt chức năng 34

5 Bảng 1.5 Một số kết quả nghiên cứu sử dụng hạt nano Au để tăng cường

tín hiệu cảm biến miễn dịch điện hóa nhằm phát hiện virus gây bệnh

43

6 Bảng 2.1 Cỡ mẫu kiểm tra các đặc trưng bề mặt điện cực 53

7 Bảng 2.2 Số lượng điểm ảnh huỳnh quang trung bình (APTES–serum) 66

8 Bảng 2.3 Số lượng điểm ảnh huỳnh quang trung bình (APTES–GA–

12 Bảng 3.1 Số liệu tín hiệu điện thế của cảm biến miễn dịch thay đổi theo

thời gian và các nồng độ chất phân tích xác định đo bằng phương pháp

tổng trở không faraday

104

13 Bảng 3.2 Số liệu tín hiệu điện thế của cảm biến miễn dịch thay đổi theo

nồng độ chất phân tích đo bằng phương pháp tổng trở không faraday

106

14 Bảng 3.3 So sánh kết quả dò tìm kháng nguyên virus gây bệnh của một số

loại cảm biến miễn dịch

108

x

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

1 Hình 1.1 (a) 20.562 công trình liên quan đến cảm biến sinh học công bố từ

năm 1991 – 2010; (b) phân bố công trình công bố từ các nước

7

2 Hình 1.2 (a) 2.937 công trình liên quan đến cảm biến miễn dịch công bố từ

năm 1991–2010; (b) chỉ số đánh giá chất lượng công trình về cảm biến miễn dịch đã công bố

8

3 Hình 1.3 Đáp ứng miễn dịch (sinh kháng thể IgM, IgG) sau khi nhiễm virus

Dengue

9

4 Hình 1.4 Bản đồ địa lý vùng lưu hành các bệnh truyền nhiễm: (a) bệnh bắt

nguồn từ động vật hoang dại; (b) bệnh bắt nguồn từ động vật nuôi;

(c) bệnh kháng thuốc và (d) bệnh do vectơ truyền

9

6 Hình 1.6 Nguyên lý hoạt động của cảm biến miễn dịch 16

7 Hình 1.7 Một số kiểu điện cực sử dụng cho cảm biến miễn dịch điện hóa 16

9 Hình 1.9 Chuyển điện tử trực tiếp (xuyên hầm) từ tâm hoạt động của enzym

tới điện cực

23

10 Hình 1.10 Gắn kết bước đơn của kháng nguyên đơn trị trong dung dịch và

kháng thể đơn trị gắn trên bề mặt cảm biến

24

11 Hình 1.11 Gắn kết bước kép của kháng nguyên đơn trị trong dung dịch và

kháng thể 2 trị gắn trên bề mặt cảm biến

26

12 Hình 1.12 Gắn kết của kháng nguyên hai trị trong dung dịch và kháng thể hai

trị gắn trên bề mặt cảm biến (bước kép)

15 Hình 1.15 Kỹ thuật miễn dịch: (a) cạnh tranh đồng thể, (b) không cạnh tranh dị

thể, (c) cạnh tranh dị thể và (d) đo miễn dịch cạnh tranh dị thể

32

16 Hình 1.16 Sử dụng nhóm amin để cố định kháng thể lên bề mặt rắn đã được

biến đổi để tạo nhóm –NSH (a) và nhóm –CHO (b)

35

17 Hình 1.17 Sử dụng nhóm thiol để cố định protein lên bề mặt rắn được biến đổi

để tạo maleimide (a), nhóm disulfide (b) và nhóm vinyl sulfone (c)

36

18 Hình 1.18 Hoạt hóa nhóm –COOH để cố định protein lên bề mặt rắn đã biến

đổi để tạo nhóm amin

37

19 Hình 1.19 Cấu trúc chung của một bề mặt cảm biến trên cơ sở cố định đoạn

ADN sợi đơn (ssDNA) đã được biotin hóa thông qua cầu nối streptavidin

39

20 Hình 1.20 Cố định kháng thể thông qua phần tử trung gian protein A 39

21 Hình 2.1 (a) Mô phỏng cách tạo vi điện cực đan xen có cấu hình 10 m x 10

m, (b) vi điện cực thành phẩm kiểu trên dưới sau khi cắt phiến và phóng đại một phần với các thanh điện cực đan xen; (c) vi điện cực được gắn lên đế, sẵn sàng cho quá trình đo

48

22 Hình 2.2 Hình ảnh hiển vi điện tử quét bề mặt điện cực trước và sau khi cố

định với nồng độ huyết thanh thay đổi: 0,1 mg/ml; 0,5 mg/ml; 1 mg/ml (hàng dọc) tương ứng với từng phương pháp cố định (hàng ngang): A) APTES–serum; B) APTES–GA–serum; C) APTES–GA–

antiHIgG–serum; D) APTES–GA–PrA–serum

57

23 Hình 2.3 Hình ảnh hiển vi lực nguyên tử bề mặt điện cực: A) trước khi silan

hóa và B) sau khi silan hóa bằng APTES: C) APTES–serum; C) APTES–GA–serum; D) APTES–GA–antiHIgG–serum; E) APTES–

GA–PrA–serum

60

24 Hình 2.4 Phổ hấp thụ hồng ngoại biến đổi chuỗi Fourier trong vùng số sóng

1800–1300 cm-1 của bề mặt điện cực trước và sau khi cố định với 1 mg/ml huyết thanh chứa kháng thể kháng virus VNNB: (a) Bề mặt điện cực sau khi silan hóa; (b) APTES–serum; (c) APTES–GA–

serum; (d) APTES–GA–antiHIgG–serum; (e) APTES–GA–PrA–

serum

62

25 Hình 2.5 Hình ảnh hiển vi huỳnh quang bề mặt điện cực sau khi ủ với FITC–

Ab: A) APTES–serum; B) APTES–GA–serum; C) APTES–GA–

antiHIgG–serum; D) APTES–GA–PrA–serum Cột thứ nhất cố định với 1 mg/ml BSA thay cho huyết thanh bệnh nhân; cột thứ 2, 3, 4 tương ứng với các nồng độ huyết thanh bệnh nhân chứa kháng thể

65

xii

kháng virus VNNB: 0,1 mg/ml; 0,5 mg/ml; 1 mg/ml

26 Hình 2.6 So sánh số lượng điểm ảnh huỳnh quang (G) trung bình/ô giữa các

phương pháp theo từng nồng độ huyết thanh chứa kháng thể kháng virus VNNB cố định

69

27 Hình 3.1 Tóm tắt quá trình cố định kháng thể từ huyết thanh bệnh nhân lên bề

mặt điện cực 1) điện cực trước khi silan hóa, 2) điện cực sau khi silan hóa bằng APTES; cố định kháng thể bằng các phương pháp: (a) APTES–serum, (b) APTES–GA–antiHIgG–serum, (c) APTES–GA–

serum và (d) APTES–GA–PrA–serum

76

28 Hình 3.2 (a) Cảm biến vi điện cực trong quá trình đóng gói trên đế thiết kế với

khe cắm 3 chân; (b) lưu giữ cảm biến miễn dịch trong túi nilon hút chân không và (c) bảo quản ở 40C

77

29 Hình 3.3 Sơ đồ hệ đo sử dụng bộ khuếch đại Lock-in RS 830 78

30 Hình 3.4 Cảm biến miễn dịch trên cơ sở cố định kháng thể từ huyết thanh bệnh

nhân bằng phương pháp APTES–GA–PrA–serum để phát hiện gián tiếp virus: (a) bề mặt điện cực sau khi cố định kháng thế; (b) sau khi

ủ với kháng nguyên virus; (c) ủ với kháng thể thứ hai gắn enzym HRP (Ab-HRP) và nguyên lý đo độ dẫn

80

31 Hình 3.5 Cảm biến miễn dịch trên cơ sở cố định kháng thể từ huyết thanh bệnh

nhân bằng phương pháp APTES–GA–PrA–serum để phát hiện trực tiếp virus: (a) bề mặt điện cực sau khi cố định với kháng thể; (b) mô phỏng mạch điện tương đương đo sự thay đổi tổng trở không faraday

81

32 Hình 3.6 Hình ảnh hiển vi điện tử truyền qua của các hạt virus VNNB (kích

thước 45 nm) trong mẫu phân tích sau khi siêu ly tâm

82

33 Hình 3.7 Sự thay đổi độ dẫn của cảm biến miễn dịch theo nồng độ H2O2 trong

dung dịch 0,02 M PBS (pH 7,0) chứa 0,05 M KI và 0,15 M NaCl: (a) ủ với với huyết thanh chuột khỏe mạnh; ủ với 50 ng/ml kháng nguyên virus VNNB: (b) APTES–serum, (c) APTES–GA–

antiHIgG–serum, (d) APTES–GA–serum và (e) APTES–GA–PrA–

serum

85

34 Hình 3.8 Tín hiệu của cảm biến miễn dịch phụ thuộc vào nồng độ KI (A) và độ

pH của dung dịch phân tích (B); (a) APTES–serum; (b) APTES–

GA–antiHIgG–serum; (c) APTES–GA–serum và (d) APTES–GA–

87

PrA–serum

35 Hình 3.9 Thay đổi tín hiệu điện thế của cảm biến miễn dịch theo thời gian để

phát hiện kháng nguyên virus VNNB (25 ng/ml, 50 ng/ml; 0,1 µg/ml, 0,5 µg/ml và 1 µg/ml), tương ứng với các phương pháp cố định kháng thể: (a) APTES–serum; (b) APTES–GA–serum; (c) APTES–GA–antiHIgG–serum; (d) APTES–GA–PrA–serum

89

36 Hình 3.10 Thay đổi tín hiệu điện thế của cảm biến miễn dịch theo nồng độ

kháng nguyên virus VNNB tương ứng với các phương pháp cố định kháng thể: (a) APTES–serum; (b) APTES–GA–antiHIgG–

serum; (c) APTES–GA–serum và (d) APTES–GA–PrA–serum

91

37 Hình 3.11 So sánh khả năng phát hiện virus của cảm biến miễn dịch trên cơ sở

cố định kháng thể từ huyết thanh bệnh nhân sử dụng phương pháp APTES–GA–PrA–serum trước và sau 3 tháng bảo quản ở 40C

93

38 Hình 3.12 (a) Mạch điện tương đương của vi điện cực Pt trên cơ sở cố định

kháng thể từ huyết thanh bệnh nhân, trong đó Cdl, Rsol, Rcs và Cditương ứng cho điện dung lớp kép, điện trở dung dịch, điện trở bề mặt của phức hợp các phần tử sinh học giữa hai vi điện cực và điện dung lớp điện môi; (b) Phổ tổng trở của cảm biến vi điện cực trên

cơ sở kháng thể từ huyết thanh bệnh nhân trong dải tần số từ 1 Hz đến 1 MHz

99

39 Hình 3.13 Sự thay đổi tổng trở trên bề mặt cảm biến khi tiếp xúc với các nồng

độ khác nhau của kháng nguyên virus VNNB

101

40 Hình 3.14 Tín hiệu điện thế của cảm biến miễn dịch theo thời gian tương ứng

với chất phân tích: (SM) huyết thanh chuột pha loãng 50 lần; kháng nguyên virus VNNB: (J10) 10 µg/ml, (J20) 20 µg/ml, (J30) 30 µg/ml

và (J50) 50 µg/ml

102

41 Hình 3.15 Thay đổi tín hiệu điện thế của cảm biến miễn dịch theo nồng độ

kháng nguyên virus VNNB và kháng nguyên virus Dengue

105

42 Hình 4.1 Thiết kế quá trình tổng hợp phức hợp hạt nano vàng gắn protein A

(Au/PrA) và khảo sát các đặc trưng liên quan

114

43 Hình 4.2 (a1) Sự tạo thành hạt nano Au trước khi xử lý với PrA theo quy trình

1 và (a2) lược đồ phân bố kích thước của 386 hạt Au trong dung dịch (quy trình 1); (b1) Sự tạo thành hạt nano Au trước khi xử lý với PrA theo quy trình 2 và (b2) lược đồ phân bố kích thước của

118

xiv

283 hạt Au trong dung dịch (quy trình 2)

44 Hình 4.3 (a1) Phân bố hạt nano Au khử theo quy trình 1 và bao bọc bởi PrA,

các hạt Au có kích thước đồng đều cỡ 10 nm, có ảnh phóng đại góc trái dưới và (a2) độ ổn định của phức hợp Au/PrA sau 6 tháng lưu giữ ở – 200C (quy trình 1); (b1) Phân bố hạt nano Au khử theo quy trình 2 và bao bọc bởi PrA, các hạt Au có kích thước đồng đều cỡ 15

nm, có ảnh phóng đại góc trái dưới và (b2) độ ổn định của phức hợp Au/PrA sau 6 tháng lưu giữ ở – 200

C (quy trình 2)

119

45 Hình 4.4 (a1) Phổ hấp thụ tử ngoại-khả kiến (UV-vis) của phức hợp Au/PrA

sau khi mới tổng hợp và sau 6 tháng, (a2) hình ảnh hạt nano Au lưu giữ sau 6 tháng ở -200C (quy trình 1); (b1) Phổ hấp thụ tử ngoại-khả kiến (UV-vis) của phức hợp Au/PrA sau khi mới tổng hợp và sau 6 tháng, (b2) hình ảnh hạt nano Au lưu giữ sau 6 tháng ở -200C (quy trình 2)

121

46 Hình 4.5 (a) Hình ảnh hiển vi điện tử truyền qua của virus VNNB (mũi tên)

trước và (b) sau khi phản ứng với phức hợp Au/PrA (đầu mũi tên), hình dưới phía trái phóng đại hai hạt virus VNNB gắn bởi các hạt nano Au; (c) mô phỏng quá trình hình thành liên hợp giữa Au/PrA

và hạt virus

122

47 Hình 4.6 (a) Ảnh hiển vi điện tử quét của điện cực ở độ phóng đại thấp và (b)

một phần bề mặt điện cực sau khi gắn với phức hợp Au/PrA được phóng đại có các hạt nano Au kích thước 10 nm phân bố đều

124

48 Hình 4.7 (a) Điểm sáng huỳnh quang không xuất hiện trên bề mặt điện cực khi

ủ với BSA và FITC–Ab; (b) hình ảnh huỳnh quang của điện cực sau khi gắn với Au/PrA, kháng thể từ huyết thanh bệnh nhân kháng virus VNNB và FITC–Ab; (c) Mô hình điện cực cố định với kháng thể:

(c1) ủ trực tiếp với kháng thể, (c2) qua hạt nano Au, (c3) định hướng qua protein A và (c4) qua phức hợp Au/PrA

125

49 Hình 4.8 A) Tín hiệu cảm biến miễn dịch không sử dụng phức hợp Au/PrA

bằng phương pháp GA-serum (a) và phương pháp GA-PrA-serum (b); tín hiệu cảm biến sau khi sử dụng phức hợp Au/PrA (phương pháp APTES-Au/PrA-serum) (c) B) Phát hiện kháng nguyên virus của cảm biến miễn dịch sử dụng phức hợp Au/PrA

APTES-127

MỞ ĐẦU

Ngày nay, cùng với sự phát triển mạnh mẽ về kinh tế và tốc độ toàn cầu hóa nhanh chóng, dịch bệnh truyền nhiễm mới nổi và tái phát cũng không ngừng tăng và mang nhiều yếu tố bất ngờ như: sự biến chủng, độc tính cao hay tốc độ lây lan mạnh, gây ảnh hưởng nghiêm trọng tới sức khỏe cộng đồng và kinh tế- xã hội [59,66] Châu Á là khu vực thường xuyên phải đối mặt và tiềm ẩn nguy cơ xảy ra các vụ dịch nguy hiểm như: viêm đường hô hấp cấp tính (SARS), cúm A/H5N1, cúm A/H1N1, HIV, sốt xuất huyết Dengue, viêm não, tiêu chảy cấp [8,66,101] Khống chế và ngăn chặn kịp thời tác nhân gây bệnh truyền nhiễm luôn là yêu cầu cấp thiết không chỉ đối với ngành y tế mà của toàn xã hội Khi có dịch xảy ra, mẫu bệnh phẩm thu thập từ những bệnh nhân nghi mắc thường được chuyển tới phòng thí nghiệm chẩn đoán bệnh để xác định căn nguyên Một số kỹ thuật chẩn đoán phòng xét nghiệm được sử dụng phổ biến hiện nay như: phân lập, trung hòa, hấp phụ miễn dịch gắn men (ELISA), miễn dịch huỳnh quang, các kỹ thuật sinh học phân tử (PCR) [23,30,65,110] Tuy nhiên, hầu hết kỹ thuật trên đều yêu cầu mẫu bệnh phẩm phải được xử lý trước, thời gian phân tích lâu, cho kết quả sau hàng giờ tới vài ngày Hơn nữa, những kỹ thuật này còn đòi hỏi trang thiết bị, sinh phẩm và hóa chất đắt tiền, người thao tác phải được đào tạo chuyên nghiệp và xét nghiệm phải được thực hiện tại các phòng thí nghiệm chẩn đoán đạt tiêu chuẩn an toàn sinh học cao Trong khi đó, dịch truyền nhiễm thường xảy ra một cách bất ngờ, số lượng bệnh nhân có thể tăng lên nhanh chóng trong khoảng thời gian ngắn, do vậy hầu hết

kỹ thuật chẩn đoán phòng xét nghiệm hiện nay cũng như hóa chất, sinh phẩm cần thiết rất khó có thể đáp ứng kịp thời cho số lượng lớn mẫu bệnh phẩm cần xét nghiệm Việt Nam là nước có khí hậu nhiệt đới gió mùa, độ ẩm cao và thường xuyên chịu sự hoành hành của các vụ dịch truyền nhiễm [101] Chỉ riêng bệnh viêm não Nhật Bản, mặc dù đã có vắc xin phòng bệnh, nhưng tỷ lệ mắc hàng năm do virus này trong cả nước vẫn chiếm khoảng 30% trong tổng số các ca viêm não do virus [118] Chính vì vậy, đối với bệnh truyền nhiễm do virus nói chung, việc sử dụng kỹ thuật chẩn đoán nhanh có khả năng sàng lọc tại chỗ bằng một thiết bị đơn giản, dễ chế tạo, có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, thao tác mẫu dễ dàng vẫn là mấu chốt quan trọng để ngăn chặn quá trình lây nhiễm, từ đó có biện pháp cách ly bệnh nhân kịp thời và/hoặc đưa ra phác đồ điều trị hiệu quả [23] Một trong những thiết

bị được kỳ vọng đáp ứng được hầu hết yêu cầu trên và có triển vọng thay thế một

2

phần hay hoàn toàn các phương pháp chẩn đoán truyền thống được gọi là cảm biến miễn dịch [48,49,73,115] Cảm biến miễn dịch là một loại cảm biến sinh học được

thiết kế dựa trên phản ứng đặc hiệu kháng nguyên – kháng thể, thiết bị này có

những ưu điểm vượt trội như: dễ dàng tạo kiểu dạng đơn hoặc mảng [31,174]; dò tìm trực tiếp mầm bệnh tại chỗ mà không cần đến bệnh viện [36]; không sử dụng chất đánh dấu hay hóa chất, sinh phẩm đắt tiền [147]; dễ chế tạo phần tử dò [14,83,126] Theo Yang và Bashir [189], cảm biến miễn dịch điện hóa có thể được chế tạo dựa trên nhiều kiểu điện cực với các vật liệu khác nhau, nhưng việc sử dụng

vi điện cực kim loại với cấu hình đan xen có nhiều ưu điểm vượt trội, bởi cấu hình này có khả năng cho tỉ lệ tín hiệu/nhiễu cao, thể tích mẫu phân tích nhỏ, tạo ra sự thay đổi tổng trở tối đa trên bề mặt vùng điện cực Ngoài ra, hầu hết các cảm biến miễn dịch hiện nay đều sử dụng kháng thể tinh chế để làm phần tử dò, phần tử này được cố định trên bề mặt bộ chuyển đổi khác nhau như: điện hóa, quang học, vi khối lượng hay nhiệt [83,115] Tuy nhiên, sự thay đổi tín hiệu sinh hóa trên bề mặt này thường rất nhỏ Do vậy, để phát triển thành công một bộ cảm biến miễn dịch không những phụ thuộc vào sự nhạy cảm của bề mặt điện cực được chế tạo như thế nào, kỹ thuật dò tìm ra sao mà còn phụ thuộc rất lớn vào quá trình chọn lựa phương thức cố định kháng thể hay kháng nguyên lên bề mặt điện cực làm phần tử dò cũng như quá trình tăng cường tín hiệu cảm biến Công việc này là sự kết hợp đa ngành giữa vật lý, hóa học, khoa học vật liệu, điện tử và y sinh Trong đó, quá trình cố định quyết định tới số lượng và chất lượng phần tử dò trên bề mặt điện cực, đảm bảo sự định hướng tốt nhất cũng như nâng cao được hiệu suất phát hiện của cảm biến miễn dịch [25,116,125] Theo Jones và cộng sự [59], bệnh truyền nhiễm chủ yếu bắt nguồn từ động vật sau đó lây truyền sang người (60,3%), trong đó 71,8% mầm bệnh bắt nguồn từ động vật hoang dại, nên khó có thể dự đoán khi nào sẽ xảy

ra dịch, dẫn đến khó khăn trong việc chủ động nguồn sinh phẩm, hóa chất hay loại kháng thể tinh chế cần thiết Chính vì vậy, việc nghiên cứu sử dụng trực tiếp kháng thể thu thập từ huyết thanh bệnh nhân mà không cần phải tinh chế để làm phần tử

dò cho cảm biến miễn dịch sẽ mang lại lợi ích to lớn cả về kinh tế, xã hội cũng như giảm thiểu thiệt hại về sức khỏe cộng đồng Hơn nữa, theo Frost & Sullivan [38], doanh thu từ cảm biến sinh học năm 2009 đạt 6,72 tỷ đô la Mỹ và dự đoán rằng con

số này sẽ tăng lên 14,42 tỷ đô la vào năm 2016 Về mặt khoa học, có khoảng 3000 công trình từ các nước nghiên cứu về cảm biến miễn dịch phát hiện tác nhân gây bệnh đã được công bố trong khoảng 20 năm trở lại đây (1991 – 2010) [56] Tuy

nhiên, khái niệm “cảm biến miễn dịch” vẫn còn mới ở Việt Nam và chưa có công trình nào được công bố quốc tế tính đến năm 2008

Xuất phát từ thực tiễn trên, đề tài nghiên cứu với tiêu đề: “Nghiên cứu và phát

triển bộ cảm biến miễn dịch điện hóa để phát hiện virus viêm não Nhật Bản”

đã được đề xuất cho luận án tiến sĩ Đây là nghiên cứu đầu tiên ở Việt Nam về lĩnh vực cảm biến miễn dịch hướng tới phát hiện virus gây bệnh trong các vụ dịch truyền nhiễm Đề tài được thực hiện với 02 mục tiêu chính: (1) phát triển bộ cảm biến miễn dịch điện hóa trên cơ sở cấu hình vi điện cực đan xen để phát hiện virus gây bệnh; (2) sử dụng trực tiếp kháng thể từ huyết thanh bệnh nhân không qua tinh chế làm phần tử dò cho cảm biến miễn dịch để phát hiện virus viêm não Nhật Bản (VNNB) Đối tượng được tập trung nghiên cứu gồm: cảm biến điện hóa trên cơ sở vi điện cực

có cấu trúc đan xen, huyết thanh bệnh nhân chứa kháng thể kháng virus viêm não Nhật Bản Ngoài ra, hạt nano vàng gắn protein A cũng được nghiên cứu nhằm hướng tới khả năng tăng cường độ nhạy và tín hiệu của cảm biến miễn dịch điện hóa Nội dung nghiên cứu được chia thành ba phần: (1) nghiên cứu các phương pháp cố định kháng thể từ huyết thanh bệnh nhân lên bề mặt vi điện cực có cấu hình đan xen; (2) phát triển bộ cảm biến miễn dịch điện hóa sử dụng kháng thể từ huyết thanh bệnh nhân để phát hiện kháng nguyên virus VNNB; (3) thử nghiệm tổng hợp hạt vàng có kích thước nano gắn protein A hướng tới tăng cường khả năng phát hiện

và tín hiệu cảm biến miễn dịch điện hóa Đề tài được thực hiện tại Viện đào tạo quốc tế về khoa học vật liệu (ITIMS), Trường Đại học Bách khoa Hà Nội và Viện

Vệ sinh Dịch tễ Trung ương Thành công của đề tài sẽ mở ra một hướng nghiên cứu mới nhằm phát triển một thiết bị chẩn đoán có độ nhạy, độ chọn lọc cao, kích thước nhỏ gọn, tiện dụng, có khả năng phát hiện và sàng lọc mầm bệnh tại chỗ trong các

vụ dịch bệnh truyền nhiễm

Kết quả nghiên cứu về lý thuyết và thực nghiệm được trình bày trong 4 chương của luận án:

Chương 1: Lý thuyết về cảm biến miễn dịch

Chương 1 tổng quan về lý thuyết cơ bản liên quan đến việc phát triển bộ cảm biến miễn dịch như: nguyên lý hoạt động, cơ chế chuyển điện tử, động học tương tác của phản ứng kháng nguyên – kháng thể, các phương pháp cố định phần tử dò

sử dụng phổ biến hiện nay Một số khái niệm cơ bản cũng được đề cập như: virus gây bệnh; kháng thể; kháng nguyên; hạt nano vàng, protein A (để tăng cường khả năng phát hiện và tín hiệu cảm biến miễn dịch điện hóa) Hơn nữa, chương này

4

cũng trình bày về tính cấp thiết và cơ sở lý luận cho việc đưa ra giả thuyết nghiên cứu của đề tài thông qua việc tổng quan những công trình liên quan được công bố gần đây trên các tạp chí khoa học ở trong và ngoài nước

Chương 2: Cố định kháng thể từ huyết thanh bệnh nhân cho cảm biến miễn dịch

Chương 2 trình bày về những kết quả nghiên cứu về khả năng sử dụng kháng thể từ huyết thanh bệnh nhân để cố định lên bề mặt vi điện cực có cấu hình đan xen Thông qua các phép phân tích đặc trưng bề mặt điện cực của 4 phương pháp cố định khác nhau nhằm tìm ra phương pháp tối ưu nhất cho mục đích phát triển bộ cảm biến miễn dịch điện hóa để phát hiện virus gây bệnh

Chương 3: Phát triển bộ cảm biến miễn dịch điện hóa sử dụng kháng thể từ huyết

thanh bệnh nhân để phát hiện virus viêm não Nhật Bản

Chương 3 trình bày những kết quả nghiên cứu phát triển bộ cảm biến miễn dịch điện hóa trên cơ sở vi điện cực có cấu hình đan xen sử dụng kháng thể từ huyết thanh bệnh nhân làm phần tử dò Hai bộ cảm biến miễn dịch điện hóa đã phát triển thành công để phát hiện virus viêm não Nhật Bản thông qua hai kỹ thuật đo tín hiệu:

đo gián tiếp dựa trên sự thay đổi độ dẫn và đo trực tiếp dựa trên sự thay đổi tổng trở không faraday

Chương 4: Tăng cường tín hiệu cảm biến miễn dịch điện hóa sử dụng hạt nano

vàng gắn protein A

Chương 4 trình bày quá trình thử nghiệm tổng hợp hạt vàng có kích thước nano gắn với protein A (Au/PrA) hướng tới ứng dụng để tăng cường tín hiệu cảm biến miễn dịch điện hóa Đặc trưng hình thái, kích thước, độ ổn định và hoạt tính sinh học của phức hợp Au/PrA tổng hợp cũng được trình bày Kết quả khảo sát ban đầu

về khả năng sử dụng phức hợp Au/PrA để tăng cường giới hạn phát hiện kháng nguyên virus và tín hiệu của cảm biến miễn dịch điện hóa trong dung dịch cũng như

từ bề mặt điện cực

6

1.1 Khái niệm cảm biến sinh học và cảm biến miễn dịch

Theo từ điển bách khoa toàn thư về khoa học và công nghệ McGraw-Hill

(McGraw-Hill Encyclopedia of Science & Technology) [88]: cảm biến sinh học là

thiết bị tích hợp gồm một yếu tố nhận biết sinh học gắn trên một phần tử chuyển đổi, có khả năng dò tìm sự thay đổi từ các phản ứng sinh học và chuyển đổi thành tín hiệu điện ở đầu ra Yếu tố nhận biết sinh học thường là enzym, thụ thể, peptide, oligonucleotide, tế bào sống, kháng thể hoặc kháng nguyên Trong đó, nếu yếu tố

nhận biết sinh học là kháng thể hay đoạn kháng thể thì được gọi là cảm biến miễn

dịch Phần tử chuyển đổi được thiết kế trên đế pha rắn để cảm nhận sự thay đổi sinh

ra từ các phản ứng sinh hóa trên bề mặt đế và chuyển đổi thành tín hiệu điện Phản ứng sinh hóa có thể dẫn tới sự thay đổi về độ pH, chuyển điện tử hoặc ion, chỉ số khúc xạ, sự phát quang, huỳnh quang, thay đổi vi khối lượng hay truyền tải nhiệt Bốn loại chuyển đổi chính thường được thiết kế để cảm nhận sự thay đổi này bao gồm: điện hóa, quang học, vi khối lượng và nhiệt [83,95]

North là người đầu tiên đề xuất khái niệm cảm biến miễn dịch (immunosensor) trong một công trình công bố trên tạp chí “Trends in Biotechnology” năm 1985

[105], tác giả định nghĩa cảm biến miễn dịch là một loại cảm biến sinh học trên cơ

sở kháng thể Tuy nhiên, hiểu theo nghĩa đầy đủ hơn thì cảm biến miễn dịch là một

loại cảm biến sinh học được phát triển trên cơ sở phản ứng đặc hiệu kháng nguyên – kháng thể Trong đó, kháng thể hay phức hợp gắn kháng thể hoặc kháng nguyên được lựa chọn để cố định lên bề mặt phần tử chuyển đổi và đóng vai trò là yếu tố nhận biết sinh học (phần tử dò) nhằm phát hiện phần tử miễn dịch còn lại (phần tử đích)

Cảm biến sinh học chủ yếu được thiết kế dựa trên hai cơ sở: xúc tác sinh học (sử dụng enzym để xúc tác một phản ứng sinh hóa) hoặc ái lực sinh học (dựa trên

sự gắn kết đặc hiệu của protein, lectin, thụ thể, axit nucleic, tế bào sống, kháng thể hoặc cơ chất có liên hệ với kháng thể) [83]

Theo tra cứu trên trang “ISI Web of Science” của Viện thông tin khoa học (Institute of Scientific Information, Thomson Reuters) [56], tác giả đã phân tích mối liên hệ từ những công trình cứu công bố quốc tế liên quan đến cảm biến sinh học trong 20 năm trở lại đây (1991-2010) Với từ khóa “biosensor” (cảm biến sinh học)

có 20.562 công trình công bố được tìm thấy, trong đó số lượng công bố lớn nhất từ Hoa Kỳ với 4885 công trình (24%), Trung Quốc: 3703 công trình (18%), Nhật Bản:

1490 công trình (7%), Đức: 1352 công trình (7%), Pháp: 1026 công trình (5%) và Anh: 1022 công trình (5%), số còn lại từ các quốc gia khác Chỉ có tổng cộng 400 công trình (2%) công bố từ các nước thuộc khu vực Đông Nam Á, trong đó Singapore: 260 công trình, Thái Lan: 67 công trình, Malaysia: 42 công trình và Việt Nam có 17 công trình được công bố Hình 1.1 mô tả số lượng công trình liên quan tới cảm biến sinh học được công bố từ năm 1991 – 2010, hình này cho thấy lĩnh vực cảm biến sinh học thực sự được quan tâm và phát triển nhanh chóng trong khoảng

10 năm trở lại đây

Hình 1.1 (a) 20.562 công trình liên quan đến cảm biến sinh học công bố từ năm 1991 –

2010; (b) sự phân bố công trình công bố từ các nước

Tra cứu với từ khóa “immunosensor” (cảm biến miễn dịch), có 2.937 công trình được tìm thấy công bố từ năm 1991 đến 2010 và tập trung chủ yếu trong khoảng 10 năm trở lại đây (hình 1.2a) Tổng số trích dẫn khoảng 49.164 lượt, trung bình mỗi công trình được trích dẫn 16,74 lượt, chỉ số Hirsch (H-index) là 79 (hình 1.2b) Chỉ

số Hirsch là một trong những chỉ số quan trọng, gần đây được sử dụng để đánh giá chất lượng nghiên cứu của các nhà khoa học, cơ quan nghiên cứu hay tạp chí khoa học chuyên ngành dựa trên số lượng công trình công bố được trích dẫn [51]

8

Hình 1.2 (a) 2.937 công trình liên quan đến cảm biến miễn dịch công bố từ năm 1991 -

2010; (b) chỉ số đánh giá chất lượng công trình về cảm biến miễn dịch đã công bố

Cảm biến miễn dịch được chứng minh là thiết bị phân tích có triển vọng lớn để thay thế một phần hay toàn phần những thiết bị và phương pháp chẩn đoán truyền thống trong các phòng thí nghiệm nhằm phát hiện nhanh, chính xác tác nhân gây bệnh [73,95,115] Ngoài ra, cảm biến miễn dịch còn được hướng tới ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau như: kiểm soát ô nhiễm môi trường [132,135], phân tích

an toàn thực phẩm [131], phát hiện tác nhân gây khủng bố sinh học [42,141],

Theo thông tin nghiên cứu thị trường của Frost & Sullivan, doanh thu từ cảm biến sinh học năm 2009 đạt 6,72 tỷ đô la Mỹ và dự đoán rằng con số này sẽ tăng lên 14,42 tỷ đô la vào năm 2016 [38]

1.2 Cảm biến miễn dịch phát hiện virus gây bệnh

1.2.1 Khái niệm về virus gây bệnh

Virus là thực thể sinh học có kích thước rất nhỏ (khoảng 20 ÷ 300 nm) có khả năng xâm nhiễm vào cơ thể sống Virus tự nhân lên bằng cách sử dụng bộ máy hoạt động của tế bào vật chủ sau khi xâm nhiễm Virus mang duy nhất một loại vật liệu

di truyền (ADN hoặc ARN), được bao quanh bởi lớp áo ngoài (vỏ capsid) có cấu tạo bằng protein, glycoprotein [23] Khi người hay động vật bị nhiễm virus, cơ thể

sẽ có sự đáp ứng miễn dịch (sinh ra kháng thể) để chống lại sự xâm nhập này Kháng thể sinh ra chủ yếu bao gồm IgG và IgM, thường đạt hiệu giá cao nhất sau khoảng 1 – 2 tuần kể từ khi bị nhiễm virus (hình 1.3) [23,46]

Hình 1.3 Đáp ứng miễn dịch (sinh kháng thể IgM, IgG) sau khi nhiễm virus Dengue [46]

1.2.2 Bệnh truyền nhiễm do virus

Bệnh truyền nhiễm do virus là những bệnh nguy hiểm có khả năng gây ra những hậu quả nặng nề đến sức khỏe cộng đồng, kinh tế xã hội và môi trường [10,94] Bệnh truyền nhiễm tăng nhanh theo thời gian và chủ yếu xuất phát từ các loài động vật (chiếm 60,3%) sau đó lây truyền sang người, trong đó 71,8% mầm bệnh bắt nguồn từ động vật hoang dại [59] Do vậy, dịch bệnh truyền nhiễm thường mang yếu tố bất ngờ và khó dự đoán trước

Hình 1.4 mô tả những điểm nóng (vàng và đỏ, theo cấp độ) của vùng, miền địa

lý lưu hành bệnh truyền nhiễm

Hình 1.4 Bản đồ địa lý vùng lưu hành các bệnh truyền nhiễm: (a) bệnh bắt nguồn từ động

vật hoang dại; (b) bệnh bắt nguồn từ động vật nuôi; (c) bệnh kháng thuốc và (d) bệnh do

vectơ truyền [59]

10

Đông Nam Á nằm trong điểm nóng của sự lưu hành các bệnh truyền nhiễm mới nổi và tái phát, là nơi thường xuyên xảy ra đại dịch Trong 10 năm trở lại đây, khu vực này chịu tác động của các vụ dịch lớn do virus như: virus Nipah (1998 – 1999) [81], viêm đường hô hấp cấp tính – SARS (2002-2003) [180], cúm A H5N1 (2004 đến nay) [178], cúm A H1N1 (2009 đến nay) [180] Các vụ dịch truyền nhiễm tái phát khác xảy ra hàng năm như sốt xuất huyết Dengue, HIV/AIDS, dại, viêm não Nhật Bản Gần đây, Koker và cộng sự [66] đưa ra những con số thiệt hại khổng lồ trong bài tổng quan về tình hình dịch bệnh truyền nhiễm ở khu vực Đông Nam Á (bảng 1.1), đồng thời cảnh báo những thách thức phải đối mặt nhằm ngăn chặn và khống chế các dịch bệnh này

Bảng 1.1 Bệnh mới nổi và tái phát do virus ở khu vực Đông Nam Á [8,45,66]

Bệnh truyền nhiễm mới nổi

Cúm gia cầm A/H5N1 Từ động vật sang người (có

liên hệ gần với gia cầm)

325 trường hợp được báo cáo, 224 trường hợp tử vong ở Indonesia, Việt Nam, Thái Lan, Campuchia, Lào và Myanma

Trường hợp đầu tiên được ghi nhận ở Malaysia;

276 trường hợp được báo cáo, trong đó 106 tử vong ở Malaysia và Singapore

Bệnh truyền nhiễm tái phát

Sốt do virus

Chikungunya Vectơ truyền

Dịch xảy ra ở nhiều nước Đông Nam Á, tái phát ở Malaysia (2007), Singapore (2008), Thái Lan (2009) và Indonesia (2010)

Sốt Dengue Vectơ truyền

Bắt nguồn từ Đông Nam Á; 398.340 trường hợp nhiễm và 1.596 trường hợp tử vong năm 2008 với

sự bùng phát cao ở Indonesia, Việt Nam, Thái Lan, Malaysia, Philipin, Myanma và Campuchia

Viêm não Nhật Bản Vectơ truyền và lây truyền

từ động vật

68 trường hợp ghi nhận ở Thái Lan năm 2009 và dịch thường xảy ra ở các nước khác trong khu vực

Dại Từ động vật sang người

(qua vết cắt hoặc vết xước)

587 trường hợp nhiễm và tử vong năm 2009 ở Indonesia, Philipin, Việt Nam, Myanma và Thái Lan

HIV/AIDS Tiêm chích, quan hệ tình

dục, từ mẹ sang con

Hơn 200.000 người dương tính với HIV ở Thái Lan, Việt Nam, Indonesia và Myanma

Ở Việt Nam, số bệnh truyền nhiễm do virus có xu hướng tăng như thủy đậu từ 39.753 ca trong giai đoạn 1990 – 1999 lên 129.745 ca giai đoạn 2000 – 2009 (tăng 2,3 lần), bệnh quai bị tăng 29,8%; dịch sốt Dengue/sốt xuất huyết Dengue tăng mạnh trong năm 2008 – 2009 với hàng chục nghìn ca mắc bệnh; vụ dịch cúm A/H1N1 có 2.069 ca dương tính được xét nghiệm tại Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương từ các mẫu bệnh phẩm thu thập ở miền Bắc, trong đó có 15 ca tử vong tính đến hết năm 2009 [101] Số tử vong do cúm A/H1N1 ở Việt Nam thực tế cao gần gấp đôi so với nguồn của Koker và cộng sự ghi nhận được ở khu vực Đông Nam Á [66]

Theo ước tính của ngân hàng phát triển châu Á (ADB) [1], chi phí cho dịch SARS ở Đông và Đông Nam Á tiêu tốn khoảng 18 tỷ đô la Mỹ, trung bình khoảng 2 triệu đô la Mỹ/người bị nhiễm, chi phí này được tính cho cả những thiệt hại liên quan đến sự giảm sút của ngành công nghiệp dịch vụ và du lịch Năm 2006, ngân hàng thế giới cũng đã ước tính chi phí toàn cầu khoảng 1,25 đến 2 nghìn tỷ đô la Mỹ/đại dịch cúm [12] Chỉ tính riêng vụ dịch cúm A/H5N1 xảy ra năm 2003 – 2004, Việt Nam đã phải thiêu huỷ 45 triệu gia cầm, ước tính thiệt hại lên đến 118 triệu đô

la Mỹ [133] Ngoài ra, từ năm 2003 đến năm 2009, miền Bắc Việt Nam đã có 77 ca bệnh dương tính với virus H5N1, trong đó 32 ca tử vong (tỷ lệ chết/mắc là 41,6%) [101]

1.2.3 Bệnh do virus viêm não Nhật Bản

Virus viêm não Nhật Bản (VNNB) có dạng hình cầu, kích thước trung bình 45-

50 nm, vật liệu di truyền là ARN, thuộc họ Flaviviridae, chi Flavivirus [100] Virus

VNNB lưu hành rộng rãi ở châu Á và miền Bắc nước Úc Muỗi là véc tơ truyền bệnh từ các ổ chứa virus như chim, lợn gây nên dịch VNNB Theo thống kê, tỷ lệ mắc do virus VNNB ở Việt Nam trong những năm gần đây chiếm khoảng 30% trong tổng số các ca viêm não do virus, nguy cơ cao ở trẻ em từ 1 đến 15 tuổi Tỷ lệ

tử vong từ 0,3 đến 60% phụ thuộc vào thời gian phát hiện bệnh và phương thức điều trị [118] Thông thường, sau khi nhiễm virus VNNB từ 3 đến 5 ngày, trong huyết thanh bệnh nhân sẽ có kháng thể (chủ yếu là IgM và IgG) chống lại virus này, hiệu giá kháng thể đạt giá trị cao nhất sau 1 đến 2 tuần Hiện nay chưa có thuốc điều trị đặc hiệu với bệnh VNNB mà chỉ có vắc xin phòng bệnh

Một số phương pháp chẩn đoán phòng xét nghiệm thường được sử dụng để xác định virus VNNB như: ức chế hồng cầu, trung hòa giảm đám hoại tử, PCR và đặc biệt là kỹ thuật MAC-ELISA để dò tìm kháng thể IgM trong huyết thanh bệnh nhân

12

trong giai đoạn đầu bị nhiễm [181] Tuy nhiên, các phương pháp này đều mất thời gian từ vài giờ đến hàng tuần để biết được kết quả Hơn nữa, hầu hết các xét nghiệm phải thực hiện trong các phòng thí nghiệm an toàn sinh học bậc cao, cần đến sinh phẩm và hóa chất đắt tiền Do vậy, việc nghiên cứu và phát triển một thiết bị thông minh có những tính năng ưu việt, có khả năng cho kết quả nhanh và chính xác virus VNNB cũng rất cần thiết

1.2.4 Triển vọng của cảm biến miễn dịch trong phát hiện virus gây bệnh

Phát hiện sớm virus gây bệnh truyền nhiễm là một trong những chìa khóa quan trọng để ngăn chặn dịch bệnh lây lan và có phác đồ điều trị kịp thời Các phương pháp phát hiện virus được sử dụng phổ biến hiện nay bao gồm: (1) phân lập virus, (2) phát hiện thông qua vật liệu di truyền (PCR) và (3) phát hiện thông qua kháng nguyên, kháng thể (ELISA, huỳnh quang ) hoặc những dấu hiệu liên quan đến virus [23,30,65] Cũng giống như phát hiện virus VNNB, các phương pháp chẩn đoán virus này chỉ cho biết kết quả sau vài giờ đến vài ngày, sinh phẩm và hóa chất đắt tiền Đặc biệt, thiết bị chẩn đoán thường cồng kềnh, không tiện dụng khi vận chuyển đến những nơi vùng sâu, vùng xa trung tâm hay những trường hợp cần

chăm sóc tại chỗ (point of care)

Trong khi đó, cảm biến sinh học nói chung và cảm biến miễn dịch nói riêng được chứng minh có khả năng khắc phục được hầu hết những nhược điểm của các phương pháp trên Trong tương lai gần, cảm biến sinh học có triển vọng thay thế một phần hay toàn phần các kỹ thuật chẩn đoán truyền thống để phát hiện tác nhân gây bệnh [73] Trong khoảng hơn 10 năm trở lại đây, nhờ sự phát triển mạnh mẽ của công nghệ micro-nano, độ nhạy của các loại cảm biến sinh học được cải thiện một cách rõ rệt Cùng với việc giảm kích thước cảm biến nhỏ hơn hàng trăm lần so với những phiên bản trước đây thì khả năng tích hợp nhiều cảm biến sinh học trên cùng một chíp kích cỡ khoảng 1cm2 đang được các nhà khoa học quan tâm nghiên cứu [92]

Tra cứu trên trang thông tin “ISI Web of Science’’ [56], có khoảng 399 công trình công bố liên quan đến cảm biến sinh học để phát hiện virus gây bệnh, tính đến tháng 3/2011 Trong đó có 323 công trình được công bố từ năm 2000 đến 3/2011 Hoa Kỳ là nước công bố nhiều nhất với 158 công trình (chiếm 40%), Trung Quốc:

53 công trình (13%), Đức: 24 công trình (6%), Anh: 22 công trình, Pháp: 21 công trình, Nhật Bản: 18, Israel: 17 công trình, Việt Nam: 4 công trình, số công trình còn

lại đến từ các quốc gia khác Trong đó, đối tượng được quan tâm nhiều nhất sử dụng cảm biến sinh học để phát hiện là HIV với 81 công trình, virus viêm gan: 34 công trình (chủ yếu phát hiện virus viêm gan B), virus cúm: 28 công trình, virus Dengue: 17 công trình, HPV: 7 công trình, còn lại là những nghiên cứu trên các đối tượng virus gây bệnh khác

Bảng 1.2 tóm tắt một số công trình nghiên cứu tiêu biểu về cảm biến miễn dịch

để phát hiện các đối tượng virus gây bệnh khác nhau sử dụng các kỹ thuật đo khác nhau Đáng lưu ý, có những bộ cảm biến có khả năng phát hiện kháng nguyên virus với giới hạn phát hiện thấp cỡ ng/ml đến μg/ml và thời gian phát hiện chỉ vài giây đến vài phút [155,192]

Việt Nam mới tiếp cận công nghệ cảm biến sinh học trong khoảng 10 năm trở lại đây nhưng đã đạt được những tiến bộ đáng ghi nhận: nhóm nghiên cứu cảm biến sinh học của Trường Đại học Bách khoa Hà Nội với những bộ cảm biến để phát hiện dư lượng thuốc trừ sâu và kim loại nặng trong môi trường [166,167], sau đó nhóm này đã phối hợp với Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương nghiên cứu phát triển một số chip sinh học để phát hiện vật liệu di truyền của virus H5N1 [120], virus Herpes [119,165] Một số nhóm nghiên cứu khác cũng quan tâm nghiên cứu về cảm biến sinh học như ở phòng thí nghiệm Công nghệ nano thuộc Đại học Quốc gia

Tp Hồ Chí Minh với cảm biến sinh học để phát hiện nồng độ glucozơ và axit uric trong máu [50], nhóm nghiên cứu nano y sinh của Viện khoa học vật liệu thuộc Viện khoa học Việt Nam [72] Về nghiên cứu phát triển bộ cảm biến miễn dịch để phát hiện virus gây bệnh, vẫn chưa có nghiên cứu nào được công bố tính tới thời điểm tác giả đề xuất đề cương nghiên cứu năm 2008

14

Bảng 1.2 Một số nghiên cứu về cảm biến miễn dịch để phát hiện virus gây bệnh

Loại cảm biến Đối tượng

Thông số dò tìm

Tham khảo Giới hạn phát

hiện

Thời gian phát hiện

Cảm biến miễn

dịch đo dòng Virus Hanta

Độ nhạy lớn hơn 10 lần so với phương pháp ELISA, thời gian phân tích khoảng 25 phút

–1 Không đưa ra [40] Cảm biến miễn

dịch đo tổng trở

Virus cúm A/H7N1

5µg/ml Không đưa ra [28]

Cảm biến miễn

dịch sợi quang hóa

Kháng thể IgM kháng virus Dengue

thấp hơn 100 lần so với phương

1.3 Phân loại cảm biến miễn dịch

Phát triển thành công bộ cảm biến miễn dịch phụ thuộc rất lớn vào các yếu tố như: thiết kế bộ chuyển đổi, quá trình cố định phần tử dò, thiết bị để đo tín hiệu ra, đặc biệt là cơ sở vật chất cũng như điều kiện nghiên cứu Với mục tiêu phát triển bộ cảm biến miễn dịch để phát hiện chính xác virus gây bệnh thì quá trình lựa chọn phần tử dò và phương pháp đo tín hiệu phù hợp với điều kiện nghiên cứu là một

trong những chìa khóa quan trọng để giải quyết vấn đề Hình 1.5 mô tả chiến lược tổng thể quá trình phát triển các kỹ thuật chẩn đoán để dò tìm virus gây bệnh [14]

Hình 1.5 Chiến lược phát hiện virus gây bệnh

Cảm biến miễn dịch được phân loại dựa trên các kỹ thuật dò tìm, gồm có 4 kỹ thuật chủ yếu: đo điện hóa (đo thế, đo dòng, đo tổng trở hoặc đo độ dẫn); đo quang

16

(đếm photon, cộng hưởng bề mặt); đo sự thay đổi vi khối lượng (dịch tần, áp điện),

và đo nhiệt (đo thay đổi nhiệt) (hình 1.6)

Hình 1.6 Nguyên lý hoạt động của cảm biến miễn dịch [83]

1.3.1 Cảm biến miễn dịch điện hóa (electrochemical immunosensors)

Cảm biến miễn dịch điện hóa là loại cảm biến sinh học mà khi tương tác kháng nguyên - kháng thể xảy ra tạo sự thay đổi điện hóa trong dung dịch phân tích hay trên bề mặt điện cực của cảm biến Hình 1.7 mô tả một số kiểu điện cực sử dụng để phát triển cảm biến miễn dịch điện hóa

Hình 1.7 Một số kiểu điện cực sử dụng cho cảm biến miễn dịch điện hóa

Bảng 1.3 mô tả sự phân loại cảm biến miễn dịch đo tín hiệu điện hóa dựa trên kiểu đo, bộ chuyển đổi và đối tượng phân tích

Bảng 1.3 Cảm biến miễn dịch điện hóa dựa trên loại hình chuyển đổi tín hiệu và đối tượng

phân tích [83,159,190,196,200,201]

1 Điện thế

Điện cực lựa chọn ion (ISE);

Tranzito hiệu ứng trường lựa chọn ion (ISFET); enzym FET

(ENFET); điện cực thủy tinh Điện cực kim loại

K+, Cl-, Ca+, H+, Na+, phần tử oxy hoá khử

2 Dòng điện Điện cực kim loại hoặc cacbon O2, phần tử miễn dịch gắn

enzym oxy hóa khử…

1.3.1.1 Cảm biến miễn dịch đo điện thế (potentiometric immunosensors)

Bộ chuyển đổi của cảm biến đo điện thế được thiết kế khi cấp vào dòng điện không đổi và hoạt động dựa trên nguyên lý cơ bản của phương trình Nernst Theo phương trình Nernst, sự thay đổi điện thế tỷ lệ logarit với hoạt tính ion đặc hiệu trên

bề mặt cảm biến [124] Điện thế tạo ra trong một pin điện hóa (electrochemical cell)

là kết quả của sự thay đổi năng lượng tự do khi có hiện tượng hóa học xảy ra cho tới khi điều kiện cân bằng được thỏa mãn Với các pin điện hóa có một anot và một catot, sự chênh lệch điện thế giữa thế điện cực catot và thế điện cực anot là điện thế của pin điện hóa Nếu phản ứng xảy ra dưới điều kiện cân bằng chuẩn thì phương trình này cho phép tính toán điện thế của một pin chuẩn Khi điều kiện phản ứng không ở trạng thái chuẩn, phải sử dụng phương trình Nernst để xác định điện thế của pin Hiện tượng vật lý không liên quan đến các phản ứng oxy hóa khử, nhưng các điều kiện ban đầu của chúng có năng lượng tự do khác không cũng sẽ tạo ra một điện thế Thiết bị này có thể được sử dụng để đo định lượng chất cần phân tích + Thế dịch chuyển màng: Nguyên lý của phép đo này dựa trên điện thế tập trung dịch chuyển qua một lớp màng chọn lọc ion Điện cực chọn lọc ion (Ion Selective Electrode-ISE) sử dụng màng chọn lọc ion để tạo ra sự khác biệt về quá trình tích điện giữa mẫu và bề mặt cảm biến [19] Khi kháng nguyên hoặc kháng thể

cố định trên màng chọn lọc ion tương tác với chất cần tìm (gắn đặc hiệu) trong dung dịch sẽ dẫn đến sự thay đổi thế dịch chyển màng ISE phổ biến nhất là điện cực pH,

18

có chứa một lớp màng thủy tinh nhạy với nồng độ ion hyđro trong dung dịch Sự chênh lệch điện thế qua màng chọn lọc ion được tính theo phương trình:

E = K - (2.303RT/nF)log (a) (1.1) Trong đó, K là hằng số tính toán, R là hằng số khí, T là nhiệt độ, n là số lượng điện tử dịch chuyển qua màng, F là hằng số Faraday và a là hoạt tính ion chất cần

+ Tranzito hiệu ứng trường (Field Effect Transitor -FET): FET là thiết bị bán dẫn sử dụng để kiểm soát sự tích điện trên bề mặt của một điện cực (điện cực cửa) được đặt giữa cực nguồn và cực máng Thế bề mặt này thay đổi theo nồng độ chất phân tích Khi tích hợp ISE và FET sẽ tạo thành một tranzito hiệu ứng trường nhạy ion (ISFET) Đây là thiết bị có triển vọng để tạo ra bộ cảm biến miễn dịch có độ nhạy siêu cao hướng tới ứng dụng trong chẩn đoán bệnh [124]

Ưu điểm của cảm biến đo điện thế là hoạt động đơn giản, tự động và có kích thước nhỏ gọn Tuy nhiên, các cảm biến sử dụng phương pháp đo thế vẫn còn những tồn tại liên quan đến độ nhạy (kém hơn so với cảm biến đo dòng điện) và ảnh hưởng bất lợi của những gắn kết không đặc hiệu dẫn đến tạo ra tín hiệu giả (do ảnh hưởng của các ion khác có trong mẫu) Đặc biệt, tỷ lệ tín hiệu/nhiễu ảnh hưởng lớn đến độ tin cậy của phép đo

1.3.1.2 Cảm biến miễn dịch đo dòng (amperometric immunosensors)

Cảm biến được thiết kế để đo dòng tạo ra bởi một phản ứng điện hóa khi cung cấp thế đầu vào không thay đổi Quá trình đo dòng phụ thuộc vào sự chuyển điện tử

từ các phản ứng oxy hóa khử của các phần tử sinh học tới bề mặt điện cực Không

có nhiều ứng dụng để phát hiện trực tiếp mẫu phân tích vì hầu hết chất phân tích (protein) không có khả năng hoạt động như một thành phần của chuỗi oxy hóa khử trong phản ứng điện hóa, do đó loại cảm biến này cần chất đánh dấu có hoạt tính điện hóa trong quá trình phân tích và được thực hiện trên bề mặt của một điện cực

nhạy như điện cực oxy hay H2O2 [7] Điện cực oxy được mô tả lần đầu tiên năm

1956 bởi GS Clark [20], điện cực này bao gồm một tế bào có chứa chất điện phân, một điện cực Pt nhạy sử dụng làm catot có thế phân cực tại -0,7V và một điện cực chuẩn Ag/AgCl Tế bào này có khả năng thẩm thấu khí, lớp màng bao phủ có khả năng thấm oxy Phản ứng hóa học xảy ra tại catot như sau:

O2 + 2H2O +2e- → H2O2 + 2OH- (1.2)

H2O2 + 2e- → 2OH- (1.3) Phản ứng tại anot:

4Ag + 4Cl- → 4AgCl + 4e- (1.4) phản ứng này tạo ra dòng điện Đó là một chuỗi các enzym với tốc độ phản ứng xúc tác cao (>103 s-1) tạo ra các phép biến đổi trong hệ thống đo dòng

Ngoài oxy sinh ra bởi quá trình xúc tác H2O2, thì những thành phần khác cũng tạo ra sự thay đổi về dòng điện như ferrocence, In2+ hay các enzym như: HRP (horseradish peroxidase), glucozơ oxidaza, gluco-6-phosphate dehydrogenaza…[83]

Cảm biến miễn dịch đo dòng có độ nhạy cao cho phép phân tích mẫu ở nồng độ rất thấp Tuy nhiên, nhược điểm chính của loại cảm biến này là phải sử dụng kèm theo một hoạt chất có khả năng tạo ra phản ứng oxy hoá khử nên quá trình dò tìm chất phân tích thường được thực hiện một cách gián tiếp [11]

1.3.1.3 Cảm biến miễn dịch đo tổng trở (impedimetric immunosensors)

Cảm biến miễn dịch đo tổng trở để dò tìm trực tiếp mẫu sinh học thông qua phản ứng kháng nguyên – kháng thể mà không cần chất đánh dấu (label free) và cung cấp một dòng điện xoay chiều có biên độ và tần số (dải tần số) thích hợp [124] Đây là loại cảm biến có tiềm năng phát triển và ứng dụng rộng rãi để dò tìm mầm bệnh vì có khả năng phát hiện mẫu trực tiếp, quá trình đo đạc đơn giản Đo tổng trở được thực hiện dựa vào nguyên lý của tụ điện điện phân, độ lớn dung kháng phụ thuộc vào độ dày và bản chất của chất điện phân trên bề mặt của điện cực kim loại Nhìn chung, có hai phương pháp đo tổng trở: không faraday (non-Faradaic) [31,128] và faraday (Faradaic) [190]

20

Đo tổng trở không faraday được thực hiện khi không có sự hiện diện của bất kỳ phần tử oxy- hóa khử nào trong quá trình phân tích Sự thay đổi tổng trở của cảm biến nhận được từ sự thay đổi về số lượng, độ dày của phức hợp tạo thành do sự gắn kết với kháng nguyên (kháng thể) trên bề mặt điện cực trong quá trình tương tác với mẫu

Đo tổng trở faraday được thực hiện với sự tham gia của một phần tử oxy-hóa khử trong quá trình phân tích như [Fe(CN)6]4-/3- Trong quá trình phát hiện chất phân tích, phản ứng kháng nguyên – kháng thể xảy ra trên bề mặt điện cực hình thành phức hợp các phần tử sinh học cản trở sự chuyển điện tử từ điện cực này sang điện cực kia thông qua dung môi phân tích đồng thời thay đổi các thuộc tính bề mặt của điện cực (điện dung, điện trở, chuyển điện tử) do đó phổ tổng trở của cảm biến cũng thay đổi ở một dải tần số nhất định [126]

1.3.1.4 Cảm biến miễn dịch đo độ dẫn (conductimetric immunosensors)

Cảm biến miễn dịch đo độ dẫn là thiết bị dò tìm sự thay đổi độ dẫn điện xảy ra

do phản ứng của các phần tử miễn dịch trên bề mặt cảm biến giữa hai điện cực khi cung cấp một thế vào không đổi Độ dẫn của cảm biến phụ thuộc vào sự linh động

và nồng độ ion trong dung dịch [83] Cảm biến miễn dịch đo độ dẫn thường sử dụng kết hợp với một số enzym để điều khiển quá trình thay đổi về sự hình thành ion Một số khó khăn thường gặp phải trong quá trình đo độ dẫn đến từ ảnh hưởng của yếu tố nền hay sự thay đổi ion trong các mẫu bệnh phẩm Ngoài ra, thay đổi độ dẫn trên bề mặt cảm biến cũng tương đối nhỏ trong một dung dịch có độ ion hóa cao như mẫu bệnh phẩm Hơn nữa, cảm biến đo độ dẫn cần phải sử dụng một điện cực trống “blank” để so sánh, nên sự thay đổi độ trôi giữa điện cực làm việc và điện cực

so sánh cũng ảnh hưởng đến tín hiệu đo Hiện nay, các nhà khoa học đã áp dụng một số loại polime dẫn như polyanilin (PANi), polypyrrol (PPy) để tăng cường độ dẫn của cảm biến [86]

1.3.2 Cảm biến miễn dịch quang (optical immunosensors)

Khi ánh sáng đi qua mẫu, một số hiện tượng có thể xảy ra như: bị phản xạ ngược lại hoặc truyền qua mẫu Quá trình này xảy ra phụ thuộc vào bước sóng ánh sáng, góc của chùm tia tới và thành phần của mẫu, độ dày của mẫu Hiện nay, cảm biến miễn dịch quang được ứng dụng phổ biến nhất trong các phân tích phần tử sinh học do có khả năng phát và đọc tín hiệu nhanh Sự thay đổi về hấp thụ, huỳnh

quang, quang hóa, tán xạ hay chỉ số khúc xạ khi ánh sáng bị phản xạ tại bề mặt nhạy của cảm biến Thông thường, các đầu dò để tìm sự thay đổi các tín hiệu vật lý này là các diode quang hay các bộ nhân quang Một số bộ cảm biến miễn dịch quang học được nghiên cứu phát triển ứng dụng để phát hiện các tác nhân truyền nhiễm như:

đo cộng hưởng plasmon bề mặt (SPR), đo sự phát huỳnh quang hoặc đo chỉ số khúc

xạ thông qua ống dẫn sóng (optical dielectric waveguides) [83,115]

1.3.3 Cảm biến miễn dịch áp điện (piezoelectric immunosensors)

Quá trình dò tìm áp điện được thực hiện trên nguyên lý của sự biến thiên tần số của một tinh thể thạch anh dao động tương ứng với sự thay đổi vi khối lượng do quá trình hình thành phức hợp kháng nguyên – kháng thể trên bề mặt cảm biến Có hai loại cảm biến đo áp điện thường được quan tâm nghiên cứu là vi cân tinh thể thạch anh (Quartz Crystal Microbalance - QCM) và sóng âm bề mặt (Surface Acoustic Wave - SAW) QCM là một trong những phương pháp đã được áp dụng để phát hiện nhanh một số tác nhân gây bệnh truyền nhiễm như virus Dengue, SARS-CoV, cúm A , có độ nhạy và độ tin cậy tương đương với kỹ thuật ELISA [115] Mặc dù cảm biến miễn dịch áp điện là thiết bị phân tích có tiềm năng, nhưng một số hạn chế vẫn cần phải khắc phục liên quan đến sự ổn định của bề mặt cảm biến với pha lỏng

do sự gắn không đặc hiệu của các protein, mất mát vật liệu phủ trên bề mặt sau các bước rửa [108]

1.3.4 Cảm biến miễn dịch nhiệt (thermometric immunosensors)

Một số phản ứng kháng nguyên - kháng thể có khả năng tạo ra sự thay đổi về nhiệt nên người ta thiết kế ra những bộ chuyển đổi có khả năng nhận biết được sự thay đổi này Tuy nhiên, chuyển đổi nhiệt đòi hỏi thiết lập hệ thống rất phức tạp, có khả năng cách nhiệt tốt, không xảy ra sự trao đổi nhiệt và chịu sự ảnh hưởng của sự thay đổi nhiệt ở môi trường ngoài [14,83]

1.4 Chuyển điện tử trong cảm biến miễn dịch

Cảm biến miễn dịch cho phép dò tìm sự tương tác giữa kháng nguyên và kháng thể, trong đó kháng thể thường được lựa chọn để gắn lên bề mặt điện cực của cảm biến để phát hiện kháng nguyên Muốn tạo ra sự thay đổi điện hóa từ phản ứng này trong cảm biến miễn dịch, các nhà nghiên cứu thường kết hợp sử dụng một protein trung gian có hoạt tính oxy hóa khử gắn với kháng thể hoặc kháng nguyên trong quá trình phân tích nhằm tạo ra sự chuyển điện tử giữa tâm oxy hóa khử của protein và

22

bề mặt điện cực của cảm biến, tăng cường tín hiệu và khả năng nhận biết mẫu [156,185] Tuy nhiên, sự hình thành gắn kết kháng nguyên – kháng thể có khả năng làm một phần điện cực bị che phủ và dẫn đến giảm tốc độ chuyển điện tử tại bề mặt điện cực Do đó, việc tìm hiểu cơ chế chuyển điện tử cũng như động học tương tác giữa các phân tử sinh học của phản ứng kháng nguyên - kháng thể đóng vai trò rất quan trọng trong quá trình nghiên cứu chế tạo cảm biến miễn dịch

Chuyển điện tử là quá trình một điện tử di chuyển từ nguyên tử hay phân tử này (phần tử cho – D) tới một nguyên tử hay phân tử khác (phần tử nhận – A) (phương trình 1.5) [177]

D + A → D+

+ A- (1.5) Thuyết Marcus mô tả tốc độ truyền của một điện tử bằng cách di chuyển hoặc nhảy từ chất cho (D-Donor) sang chất nhận (A-Aceptor), tốc độ này phụ thuộc vào hai thông số chính: năng lượng tái tạo () và cường độ bắt cặp điện tử (HAB)

Hình 1.8 Sự dịch chuyển điện tử trong protein

Trong hình 1.8, trục tung là năng lượng tự do còn trục hoành đặc trưng cho sự chuyển động của các hạt nhân nguyên tử Parabol phía trái đặc trưng cho thế năng

bề mặt của sự dịch chuyển hạt nhân của chất phản ứng ở trạng thái ban đầu (điện tử còn ở chất cho) và parabol phía phải đặc trưng cho thế năng bề mặt của sự dịch chuyển hạt nhân chất tạo thành ở trạng thái cuối (sau khi điện tử dịch chuyển từ chất cho sang chất nhận) Do vận tốc của điện tử rất cao so với hạt nhân, nên hạt nhân được coi như duy trì trạng thái cố định trong cả quá trình dịch chuyển điện tử thực

tế từ các chất tham gia phản ứng đến khi sản phẩm tạo thành Trạng thái chuyển dịch của phản ứng này phải xảy ra tại một điểm nào đó trong khoảng cấu hình hạt nhân nơi mà các trạng thái của các chất phản ứng và sản phẩm bị suy giảm Như vậy, thông qua sự dao động của các phân tử tham gia phản ứng và vùng ngoại biên

của chúng có thể đạt được cấu hình trạng thái chuyển dịch và một điện tử có thể dịch chuyển [41]

Tốc độ chuyển điện tử được tính theo thuyết bán cổ điển (phương trình 1.6):

]4

/2)0(exp[

22

/2

B k G

AB H T B k h ET

Phương trình trên bao gồm hai phần: liên quan đến hạt nhân (hàm mũ) và điện

tử (phía trước hàm mũ), tốc độ chuyển điện tử đạt tới giá trị cực đại ( 0

ET

k ) khi yếu tố hạt nhân tối ưu (-∆G0=); khi ấy giá trị 0

Hình 1.9 Chuyển điện tử trực tiếp (xuyên hầm) từ tâm hoạt động của enzym tới điện cực

Quá trình xuyên hầm của điện tử trong protein xảy ra ở các phản ứng mà tương tác điện tử giữa các vị trí tâm oxy hóa khử tương đối yếu Ở điều kiện đó, trạng thái chuyển dịch cho phản ứng chuyển điện tử phải được hình thành nhiều lần trước khi các chất tham gia phản ứng chuyển đổi hoàn toàn thành sản phẩm phản ứng, đây là quá trình không đoản nhiệt điện tử [184]

24

Cấu hình điện cực cảm biến được thiết kế để có khả năng nhận biết được sự chuyển điện tử trực tiếp từ các tâm oxy hóa khử của protein tới điện cực [185] hoặc gián tiếp thông qua các protein hay các phần tử trung gian khác như hạt nano kim loại hay polime dẫn… [156]

Cảm biến miễn dịch trên cơ sở chế chuyển điện tử trực tiếp hay gián tiếp qua yếu tố trung gian thường sử dụng một loại protein oxy hóa khử là enzym peroxidaza

củ cải ngựa (Horseradish peroxidase-HRP), đây là một loại glycoprotein chứa heme, có trọng lượng phân tử khoảng 42.000 Da Hiệu quả của sự chuyển điện tử giữa HRP và điện cực đã được công bố từ nhiều năm trước đây [134] Trong đó sự

di chuyển điện tử trực tiếp được chứng minh bằng phép đo dòng và có sự tham gia của H2O2 hoặc những peroxit khác Một số nhà khoa học cũng đã sử dụng hạt nano kim loại lai ghép với các phần tử sinh học tạo thành một hệ thống liên hợp làm tăng tốc độ chuyển điện tử và khả năng giao tiếp về điện giữa các enzym oxy hóa khử và điện cực [183]

1.5 Động học tương tác kháng nguyên – kháng thể

Để đảm bảo thành công trong quá trình nghiên cứu phát triển cảm biến miễn dịch, bên cạnh những hiểu biết về sự chuyển điện tử giữa protein và điện cực, những kiến thức về động học tương tác của các phần tử sinh học, đặc biệt là tương tác giữa kháng nguyên trong dung dịch và kháng thể cố định trên bề mặt cảm biến cũng rất quan trọng Sadana và cộng sự [136,137] đã công bố những nghiên cứu mang tính lý thuyết về động học gắn kết kháng nguyên - kháng thể trên bề mặt cảm biến miễn dịch

- Kháng thể đơn trị, kháng nguyên đơn trị (hình 1.10):

Hình 1.10 Gắn kết bước đơn của kháng nguyên đơn trị trong dung dịch và kháng thể đơn

trị gắn trên bề mặt cảm biến [136]

Trong mô hình này, mỗi kháng thể trên bề mặt cảm biến chỉ có một vị trí gắn kháng nguyên duy nhất và ngược lại mỗi kháng nguyên trong dung dịch cũng chỉ có một vị trí gắn với kháng thể

Tốc độ quá trình gắn kết một kháng nguyên đơn trị bằng một kháng thể được tính theo:

1 1 1 0 1 1

) (     







k c

k dt

d

s (1.7)

Ở đây, Г 0 là nồng độ tổng của kháng thể trên bề mặt cảm biến, Г 1 là nồng độ kháng thể trên bề mặt được gắn với các kháng nguyên tại một thời điểm nào đó, c s

là nồng độ kháng nguyên tiếp cận sát bề mặt cảm biến, k 1 là hằng số tốc độ phản

ứng theo chiều thuận và k -1 là hằng số tốc độ phản ứng theo chiều nghịch

Sơ đồ phản ứng quá trình gắn kết được đơn giản hóa bằng phương trình 1.8

1 1

d c

k dt

d

f Ag

s (1.9)

Trong đó, Г Ag là tổng kháng nguyên gắn với kháng thể trên bề mặt cảm biến, k f = k 1 Phương trình 1.9 là phương trình tốc độ phản ứng giữa kháng nguyên đơn trị trong dung dịch và kháng thể đơn trị gắn trên bề mặt cảm biến (gắn kết bước đơn, động học cấp một)

- Kháng thể 2 trị, kháng nguyên đơn trị (hình 1.11)