Nghiên cứu chuyển gen GmDREB2 vào giống đậu tương đt12

Đậu tương là cây mẫn cảm với điều kiện ngoại cảnh và thuộc nhóm cây chịu hạn kém, khi thiếu nước ở các thời kì khác nhau sẽ làm giảm năng suất và chất lượng cây trồng.. Đặc tính chịu hạn

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

PHẠM MINH HẢO

NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN GmDREB2

VÀO GIỐNG ĐẬU TƯƠNG ĐT12

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

THÁI NGUYÊN - 2017

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

PHẠM MINH HẢO

NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN GmDREB2

VÀO GIỐNG ĐẬU TƯƠNG ĐT12

Chuyên ngành: Di truyền học

Mã số: 60.42.01.21

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: GS.TS Chu Hoàng Mậu

THÁI NGUYÊN - 2017

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan những nội dung trình bày trong luận văn là do tôi thực hiện dưới sự hướng dẫn của GS.TS Chu Hoàng Mậu và sự giúp đỡ, hợp tác của các đồng nghiệp trong nhóm nghiên cứu Các số liệu, kết quả trình bày trong luận văn đã được sự đồng ý của cán bộ hướng dẫn và nhóm nghiên cứu Mọi trích dẫn trong luận văn đều ghi rõ nguồn gốc

Thái Nguyên, tháng 4 năm 2017

Tác giả luận văn

Phạm Minh Hảo

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới GS.TS Chu Hoàng Mậu đã tận tình hướng dẫn và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi hoàn thành bản luận văn này

Tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ của các thầy cô giáo và cán bộ

Bộ môn Sinh học hiện đại & Giáo dục sinh học, Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm-Đại học Thái Nguyên đã tạo điều kiện và giúp đỡ tôi trong quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn

Tôi xin cảm ơn các cán bộ thuộc Phòng ADN ứng dụng, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm khoa học và Công nghệ Việt Nam đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài

Tôi xin được gửi lời cảm ơn chân thành đến gia đình, bạn bè, đồng nghiệp đã luôn động viên, khuyến khích, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện để tôi

có thể hoàn thành luận văn này

Thái Nguyên, tháng 4 năm 2017

Tác giả luận văn

Phạm Minh Hảo

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC NHỮNG TỪ VIẾT TẮT iv

DANH MỤC BẢNG v

DANH MỤC HÌNH vi

MỞ ĐẦU 1

1 Đặt vấn đề 1

2 Mục tiêu nghiên cứu 2

3 Nội dung nghiên cứu 2

4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn 2

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Cây đậu tương và tác động của hạn đến đậu tương 3

1.1.1 Cây đậu tương 3

1.1.2 Tác động của hạn đến cây đậu tương 8

1.1.3 Cơ chế chịu hạn của đậu tương 9

1.2 Nhân tố phiên mã DREB 11

1.2.1 Các nhân tố phiên mã DREB ở đậu tương 11

1.2.2 Nhân tố phiên mã DREB2 12

1.3 Ứng dụng kỹ thuật chuyển gen trong cải thiện khả năng chịu hạn của cây đậu tương 13

1.3.1 Các kỹ thuật chuyển gen ứng dụng ở cây đậu tương 13

1.3.2 Nghiên cứu chuyển gen ở cây đậu tương 15

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 17

2.1 Vật liệu, hóa chất, thiết bị, địa điểm nghiên cứu 17

2.1.1 Đặc điểm của giống đậu tương ĐT12 17

2.1.2 Chủng A tumefaciens tái tổ hợp chứa vector mang gen GmDREB2 18

2.1.3 Hóa chất và thiết bị 19

2.1.4 Địa điểm nghiên cứu 19

2.2 Phương pháp nghiên cứu 20

2.2.1 Phương pháp chuyển gen vào đậu tương 20

2.2.2 Phân tích cây chuyển gen 23

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 27

3.1 Kết quả chuyển gen GmDREB2 và tái sinh cây đậu tương chuyển gen 27

3.1.1 Kết quả khử trùng hạt và tạo nguyên liệu biến nạp 27

3.1.2 Lây nhiễm và tái sinh cây đậu tương chuyển gen 28

3.2 Phân tích sự có mặt của gen chuyển GmDREB2 trong cây đậu tương chuyển gen ở thế hệ T0 33

3.3 Thảo luận 37

3.3.1 Thảo luận về vector pBI121 và promoter 35S 37

3.3.2 Thảo luận về kết quả biến nạp, tái sinh cây chuyển gen và xác định sự có mặt của gen chuyển trong cây chuyển gen 37

3.3.3 Thảo luận về hiệu suất chuyển gen ở đậu tương 39

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 41

1 Kết luận 41

2 Kiến nghị 41

TÀI LIỆU THAM KHẢO 42

DANH MỤC NHỮNG TỪ VIẾT TẮT

ABA : Absisic Acid

Bp : Cặp base DEPC : Diethyl pyrocarbonate DNA : Deoxyribonucleic Acid DREB : Dehydration - Responsive Element Binding dNTP Deoxy

Nucleotide Triphosphate Đtg : Đồng tác giả

E coli : Escherichia coli EDTA : Ethylene diamine tetra- acetic acid

Kb : Kilo base

LB : Luria Bertani

OD : Optical density PCR : Polymerase Chain Reaction - Phản ứng chuỗi RNA

Ribonucleic Acid TAE : Tris - Acetate - EDTA Taq : Thermus aquaticus T0 : Thế hệ cây chuyển gen T0 (cây chuyển gen tái sinh từ chồi

trong ống nghiệm) v/p : vòng / phút

X-gal : 5-bromo-4-chloro-indolyl-β-D-galactopyranoside

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1 Thành phần các loại môi trường tái sinh in vitro ở đậu tương 20

Bảng 2.2 Thành phần đệm tách DNA tổng số 23

Bảng 2.3 Trình tự nucleotide của các că ̣p mồi PCR 24

Bảng 2.4 Thành phần của phản ứng PCR 25

Bảng 2.5 Chu kì nhiệt của phản ứng PCR 25

Bảng 3.1 Kết quả biến nạp gen GmDREB2 vào giống đậu tương ĐT12 32

DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1 Hạt của giống đậu tương ĐT12 17

Hình 2.2 Sơ đồ cấu trúc vector chuyển gen pBI121 mang gen GmDREB2 18

Hình 2.3 Sơ đồ thí nghiệm chuyển gen vào đậu tương qua nách lá mầm 21

Hình 3.1 Giai đoạn chuẩn bị mẫu biến nạp 27

Hình 3.2 Giai đoạn gây tổn thương nách lá mầm và biến nạp 28

Hình 3.3 Giai đoạn tạo đa chồi và kéo dài chồi 30

Hình 3.4 Giai đoạn ra rễ và trồng cây đậu tương chuyển gen ĐT12 trên giá thể 31

Hình 3.5 Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm DNA tổng số ở thế hệ T0. 33

Hình 3.6 Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR xác định sự có mặt của đoạn promoter 35S của cấu trúc mang gen chuyển GmDREB2 trong các cây đậu tương chuyển gen. 34

Hình 3.7 Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR xác định sự có mặt của gen chuyển GmDREB2 bằng cặp mồi GmDREB2-BamHI/GmDREB2- Cmyc-SacI từ hệ gen các cây đậu tương chuyển gen ở thế hệ T0 … 35

MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề

Đậu tương (Glycine max (L.) Merrill) còn gọi là đậu nành là một cây

trồng cạn ngắn ngày có giá trị kinh tế cao Khó có thể có tìm thấy một cây trồng nào có tác dụng nhiều mặt như cây đậu tương [5] Việt Nam là nước nông nghiệp nhiệt đới, trồng đậu tương với ba mục đích là giải quyết vấn đề thiếu protein cho con người và gia súc, xuất khẩu và cải tạo đất Cả nước đã hình thành 6 vùng sản xuất đậu tương, đó là vùng Nam Bộ, miền núi Bắc Bộ, đồng bằng sông Hồng, đồng bằng sông Cửu Long, đồng bằng ven biển miền Trung và Tây Nguyên Tuy nhiên, sản lượng đậu tương của nước ta vẫn thấp, nên vẫn phải nhập khẩu từ các nước để đáp ứng nhu cầu tiêu dùng và làm thức ăn cho gia súc [1]

Trong những năm gần đây, hiện tượng biến đổi khí hậu đã ảnh hưởng nghiêm trọng đến nhiều nước trên thế giới và trong đó có Việt Nam Đặc biệt

là hiện tượng nóng lên của trái đất, dẫn đến tình trạng thiếu nước trầm trọng ở một số nơi Điều này đã ảnh hưởng rất lớn tới ngành nông nghiệp của nước ta, trong đó có cây đậu tương Đậu tương là cây mẫn cảm với điều kiện ngoại cảnh và thuộc nhóm cây chịu hạn kém, khi thiếu nước ở các thời kì khác nhau

sẽ làm giảm năng suất và chất lượng cây trồng Đặc tính chịu hạn ở cây đậu tương là tính trạng đa gen, sản phẩm của các gen này liên quan trực tiếp đến

sự biểu hiện của đặc tính chịu hạn hoặc có chức năng điều hòa nhóm gen chịu hạn Cho đến nay, các nhà khoa học vẫn chưa xác định được gen quyết định đến khả năng chịu hạn của thực vật

Để chống lại điều kiện bất lợi của ngoại cảnh, đặc biệt là hạn hán cơ thể thực vật đã sản xuất ra nhiều loại protein, trong đó có DREB DREB có vai trò kích thích hoạt động phiên mã của nhóm gen chịu hạn, đây là nhân tố phiên mã đóng vai trò quan trọng trong sự biểu hiện gen chịu hạn của cây đậu

tương Để tăng cường sự phiên mã của các gen liên quan đến khả năng chịu hạn, chuyển gen mã hóa nhân tố phiên mã là biện pháp được ứng dụng sẽ mang lại hiệu quả tích cực trong việc tăng cường biểu hiện gen liên quan đến khả năng chịu hạn Xuất phát từ những cơ sở trên chúng tôi đã chọn và tiến hành đề tài:

“Nghiên cứu chuyển gen GmDREB2 vào giống đậu tương ĐT12”

2 Mục tiêu nghiên cứu

Chuyển được cấu trúc mang gen GmDREB2 vào giống đậu tương

ĐT12 phu ̣c vụ ta ̣o dòng cây đậu tương chuyển gen chịu hạn

3 Nội dung nghiên cứu

3.1 Nghiên cứ u biến nạp cấu trúc mang gen GmDREB2 vào giống đậu tương ĐT12 qua nách lá mầm nhờ Agrobacterium tumefaciens (A tumefaciens);

3.2 Nghiên cứ u tái sinh, chọn lọc các dòng cây đậu tương chuyển gen in vitro; 3.3 Phân tích sự có mặt của gen chuyển GmDREB2 trên các dòng cây đậu

tương chuyển gen ở thế hệ T0 bằng kỹ thuật PCR

4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

Về khoa học, kết quả nghiên cứu của đề tài cung cấp dẫn liệu khoa học

về tái sinh cây đậu tương in vitro, ứng dụng kỹ thuật chuyển gen nhằm phục

vụ việc cải thiện tính chịu hạn của giống đậu tương ĐT12

Về thực tiễn, các dòng cây đậu tương chuyển gen là vật liệu phục vụ

phân tích, đánh giá để tạo dòng đậu tương chuyển gen chịu hạn

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 CÂY ĐẬU TƯƠNG VÀ TÁC ĐỘNG CỦA HẠN ĐẾN ĐẬU TƯƠNG 1.1.1 Cây đậu tương

Theo từ điển thực phẩm, cây đậu tương được biết có nguồn gốc xa xưa

từ Trung Quốc và được coi là cây thực phẩm cho đời sống con người từ hơn

4000 năm trước, sau đó được truyền bá sang Nhật Bản vào khoảng thế kỷ thứ

8, vào nhiều thế kỷ sau có mặt ở các nước Á Châu như Thái lan, Malaisia, Korea và Việt Nam Cây đậu tương có mặt ở Âu Châu vào đầu thế kỷ 17 và ở Hoa Kỳ vào thế kỷ 18 Ngày nay Hoa Kỳ là quốc gia đứng đầu sản xuất đậu tương chiếm 50% sản lượng trên toàn thế giới, rồi đến, Trung Quốc, Ấn Ðộ

Ở trung du Việt Nam đậu tương được trồng từ lâu đời, sớm nhất là các tỉnh thuộc khu vực trung du, miền núi phía Bắc và miền đông Nam Bộ [1], [2]

Cây đậu tương hay đậu nành có tên khoa học là Glycine max (L.) Merrill, thuộc chi Glycine, họ đậu (Fabaceae), họ phụ cánh bướm (Papilionoideae), bộ Phaseoleae và có bộ NST 2n = 40 Căn cứ vào đặc điểm hình thái, sự phân bố địa lý và số lượng nhiễm sắc thể thì Hymowit và Newell (1984) cho rằng ngoài chi Glycine còn có chi phụ Soja Chi Glycine được chia thành 7 loài hoang dại lâu năm, chi Soja gồm 2 loài trong đó có loài đậu tương trồng Glycine max L Merrill [1], [2]

Đặc điểm thực vật học

Đậu tương là cây bụi nhỏ, thân thảo, cao trung bình dưới 1m, có lông toàn thân Chùm lông mọc ở nách lá, bông có màu trắng hoặc tím Thân khi còn non thường có màu xanh hoặc màu tím khi về già chuyển sang màu nâu nhạt, chiều cao trung bình từ 0,5 – 1,2 m, thay đổi tùy theo giống, thời vụ, mật

độ cây, đất đai, phân bón… Quả có nhiều lông vàng, dài 3 – 4 cm, rộng 0.8

cm, mỗi quả có từ 3 – 5 hạt Cây đậu nành là cây ngắn ngày, phát triển tốt nhất ở vùng nhiệt đới, ưa sáng, ưa nhiệt

Cây đậu tương có 3 loại lá chính là: lá mầm, cặp lá đơn, lá chét và ngoài ra còn có thêm lá gốc Lá mầm mới mọc có màu vàng hay xanh lục, khi tiếp xúc với ánh sáng thì chuyển sang màu xanh Hạt giống to thì lá mầm chứa nhiều dinh dưỡng nuôi cây mầm, khi hết chất dinh dưỡng lá mầm khô héo đi, cho nên trong kỹ thuật trồng đậu tương nên làm đất tơi nhỏ và chọn hạt to cây sẽ mọc khoẻ, sinh trưởng tốt Lá nguyên xuất hiện sau khi cây mọc

từ 2-3 ngày và mọc phía trên lá mầm Lá đơn mọc đối xứng nhau Lá đơn to màu xanh bóng là biểu hiện cây sinh trưởng tốt Lá đơn to xanh đậm biểu hiện của một giống có khả năng chịu rét Lá đơn nhọn gợn sóng là biểu hiện cây sinh trưởng không bình thường Mỗi lá kép có 3 lá chét, có khi 4-5 lá chét Lá kép mọc so le, lá kép thường có màu xanh tươi khi già biến thành màu vàng nâu Cũng có giống khi quả chín lá vẫn giữ được màu xanh, những giống này thích hợp trồng làm thức ăn gia súc Phần lớn trên lá có nhiều lông tơ Lá có nhiều hình dạng khác nhau tuỳ theo giống, những giống lá nhỏ và dài chịu hạn khoẻ nhưng thường cho năng suất thấp Những giống lá to chống chịu hạn kém nhưng thường cho năng suất cao hơn Nếu 2 lá kép đầu to và dày thường biểu hiện giống có khả năng chống chịu rét Số lượng lá kép nhiều hay

ít, diện tích lá to hay nhỏ chi phối rất lớn đến năng suất và phụ thuộc vào thời

vụ gieo trồng Các lá nằm cạnh chùm hoa nào giữ vai trò chủ chủ yếu cung cấp dinh dưỡng cho chùm hoa ấy Nếu vì điều kiện nào đó làm cho lá bị úa vàng thì quả ở vị trí đó thường bị rụng hoặc lép [1], [2]

Hoa đậu tương nhỏ, không hương vị, thuộc loại cánh bướm Màu sắc của hoa thay đổi tuỳ theo giống và thường có màu tím, tím nhạt hoặc trắng

Đa phần các giống có hoa màu tím và tím nhạt Các giống đậu tương có hoa màu trắng thường có tỷ lệ dầu cao hơn các giống màu tím Hoa phát sinh ở

nách lá, đầu cành và đầu thân Hoa mọc thành từng chùm, mỗi chùm có từ

1-10 hoa và thường có 3-5 hoa Hoa đậu tương ra nhiều nhưng tỷ lệ rụng rất cao khoảng 30% có khi lên tới 80% Hoa đậu tương thuộc loại hoa đồng chu lưỡng tính trong hoa có nhị và nhụy, mỗi hoa gồm 5 lá đài, 5 cánh hoa có 10 nhị và 1 nhụy Hoa đậu tương thường thụ phấn trước khi hoa nở và là cây tự thụ phấn, tỷ lệ giao phấn rất thấp chiếm trung bình 0,5 - 1% [1],[2]

Số quả biến động từ 2 đến 20 quả ở mỗi chùm hoa và có thể đạt tới 400 quả trên một cây Một quả chứa từ 1 tới 5 hạt, nhưng hầu hết các giống quả thường từ 2 đến 3 hạt Quả đậu tương thẳng hoặc hơi cong, có chiều dài từ 2 tới 7 cm hoặc hơn Quả có màu sắc biến động từ vàng trắng tới vàng sẫm, nâu hoặc đen Màu sắc quả phụ thuộc vào sắc tố caroten, xanthophyll, màu sắc của lông, sự có mặt của các sắc tố antocyanin Lúc quả non có màu xanh nhiều lông (có khả năng quang hợp do có diệp lục) khi chín có màu nâu Hoa đậu tương ra nhiều nhưng tỷ lệ đậu quả thấp 20-30% Hạt đậu tương không

có nội nhũ mà chỉ có một lớp vỏ bao quanh một phôi lớn Hạt có hình tròn hoặc bầu dục, tròn dài, tròn dẹt, ovan vỏ hạt thường nhẵn và có màu vàng nhạt, vàng đậm, xanh, nâu, đen đa số là hạt màu vàng Trong hạt, phôi thường chiếm 2%, lá mầm chiếm đến 90% và còn lại là vỏ hạt chiếm 8% tổng khối lượng hạt [1],[2]

Giá trị kinh tế

Đậu tương là cây trồng ngắn ngày có giá trị kinh tế cao về nhiều mặt Sản phẩm của nó được dung làm thức ăn cho con người, thức ăn cho gia súc, làm nguyên liệu cho công nghiệp, có giá trị xuất khẩu và là loại cây có khả năng cải tạo đất trồng rất tốt, ngoài ra đậu tương còn là một vị thuốc trong đông y có tác dụng chữa bệnh

Giá trị dinh dưỡng

Hạt đậu tương có thành phần dinh dưỡng cao, hàm lượng protein trung bình khoảng từ 35,5 - 40% Trong khi đó hàm lượng protein trong gạo chỉ 6,2

- 12%; ngô: 9,8 - 13,2% thịt bò: 21%; thịt gà: 20%; cá: 17 - 20% và trứng: 13

- 14,8%, lipit từ 15- 20%, hydrat các bon từ 15-16% và nhiều loại sinh tố và muối khoáng quan trọng cho sự sống (Nguyễn Thị Hiền và Vũ Thi Thư, 2004) Hàm lượng protein trong hạt đậu tương cao hơn cả hàm lượng prôtein

có trong cá, thịt và cao gấp 2 lần so với các loại đậu đỗ khác Trong hạt đậu tương có khá nhiều loại vitamin, đặc biệt là hàm lượng vitamin B1 và B2 ngoài ra còn có các loại vitamin PP, A, E, K, D, C,v.v [9] Ngoài ra, nó còn chứa sắt, canxi, photpho và các thành phần chất xơ tốt cho tiêu hóa Đậu tương còn là vị thuốc để chữa bệnh, đặc biệt là đậu tương hạt đen, có tác dụng tốt cho tim, gan, thận, dạ dày và ruột Đậu tương là thức ăn tốt cho những người bị bệnh đái đường, thấp khớp, thần kinh suy nhược và suy dinh dưỡng

Giá trị công nghiệp

Hiện nay trên thế giới đậu tương là cây đứng đầu về cung cấp nguyên liệu cho ép dầu, dầu đậu tương chiếm 50% tổng lượng dầu thực vật Ngoài ra đậu tương còn là nguyên liệu của nhiều ngành công nghiệp khác nhau như: chế biến cao su nhân tạo, sơn, mực in, xà phòng, chất dẻo, tơ nhân tạo, chất đốt lỏng…

Giá trị nông học

Đậu tương là nguồn thức ăn tốt cho gia súc, 1 kg hạt đậu tương đương với 1,38 đơn vị thức ăn chăn nuôi Toàn cây đậu tương (thân, lá, quả, hạt) có hàm lượng đạm khá cao cho nên các sản phẩm phụ như thân lá tươi có thể làm thức ăn cho gia súc rất tốt, hoặc nghiền khô làm thức ăn tổng hợp của gia súc Ngoài ra đậu tương còn có vai trò rất tốt trong việc cải tạo đất 1 ha trồng đậu tương nếu sinh trưởng phát triển tốt để lại trong đất từ 30-60 kg N (Phạm Gia Thiều, 2000) Trong hệ thống luân canh, nếu bố trí cây đậu tương vào cơ

cấu cây trồng hợp lý sẽ có tác dụng tốt đối với cây trồng sau, góp phần tăng năng suất cả hệ thống cây trồng mà giảm chi phí cho việc bón N

Tình hình sản xuất đậu tương của Việt Nam và trên thế giới

Đậu tương là cây trồng lấy hạt, cây có dầu quan trọng bậc nhất trên thế giới, đứng hàng thứ 4 sau cây lúa mì, lúa nước và ngô Do khả năng thích ứng rộng nên nó đã được trồng ở khắp năm châu lục, nhưng tập trung nhiều nhất ở châu Mỹ trên 70%, tiếp đến là Châu Á 21,27% và một số nước khác trên thế giới Hiện nay, đậu tương được trồng ở gần 80 quốc gia khác nhau trên thế giới Trong đó, 4 nước có sản lượng đậu tương đứng đầu là Mỹ, Brazil, Argentina và Trung Quốc Hiện nay đậu tương được trồng ở Việt Nam có hai nguồn gốc, đó là các giống địa phương và giống nhập nội Trước cách mạng tháng 8 năm 1945, diện tích gieo trồng đậu tương ở Việt Nam chỉ khoảng 32

ha, năng suất 4,1 tạ/ha, cho đến nay diện tích đó tăng lên đáng kể [2], [9]

Ở Việt Nam, đậu tương được trồng trên cả 7 vùng nông nghiệp, trong

đó vùng núi phía Bắc có diện tích gieo trồng lớn nhất là 46,6%, đồng bằng Sông Hồng 19,3%, vùng Tây Nguyên 11%, miền Đông Nam Bộ 10,2%, đồng bằng Sông Cửu Long 8,9%, khu Bốn 2,3% và vùng Duyên hải miền Trung 1,6%, diện tích gieo trồng đậu tương tính đến tháng 4/2010 là 123,9 nghìn ha Cây đậu tương chiếm một vị trí quan trọng trong nền nông nghiệp của nước ta, đặc biệt là ở những vùng nông thôn nghèo, kinh tế chưa phát triển [1], [2], [5], [9]

Trong những năm gần đây do ảnh hưởng của biến đổi khí hậu toàn cầu cũng như hạn hán đã làm ảnh hưởng tới tình hình phát triển cây đậu tương ở Việt Nam Từ năm 2007 đến nay, diện tích trồng đậu tương có sự biến động

và có xu hướng tăng vào năm 2014, 2015, nhưng năng suất và sản lượng đậu tương gần như không tăng đáng kể

1.1.2 Tác động của hạn đến cây đậu tương

Hạn là một trong nững yếu tố cựu đoan phi sinh học đang được cả thế giới quan tâm Hạn là hiện tương xảy ra trong thiên nhiên và liên qua trực tiếp đến lượng nước có trong thực vật Hạn cũng như các yếu tố ngoại cảnh bất lợi khác khi tác động lên cơ thể thực vật sẽ gây ra những nhản ứng của cơ thể Tùy vào từng loài mà mức độ phản ứng cũng như mức độ thiệt hại do khô hạn gây ra là khác nhau

Trong những nhân tố sinh thái của môi trường thì nước là một nhân tố giới hạn quan trọng của cây trồng, là sản phẩm khởi đầu, trung gian và cuối cùng của các quá trình chuyển hoá sinh hoá diễn ra trong cơ thể thực vật Nước là môi trường để các phản ứng trao đổi chất xảy ra trong tế bào Sự thiếu hụt nước ảnh hưởng xấu đến quá trình sinh trưởng và phát triển của cây, nếu thiếu nước nhẹ sẽ làm giảm tốc độ sinh trưởng, thiếu nước trầm trọng sẽ làm biến đổi hệ keo nguyên sinh chất làm tăng cường quá trình già hóa tế bào khi bị khô kiệt nước, nguyên sinh chất bị đứt vỡ cơ học dẫn đến tế bào,

mô bị tổn thương và chết Thiếu nước trước tiên ảnh hưởng đến sự cân bằng nước của cây, từ đó ảnh hưởng đến các chức năng sinh lý như quang hợp, hô hấp, dinh dưỡng khoáng do đó ảnh hưởng đến sinh trưởng và phát triển của thực vật

Cây đậu tương là cây có nhu cầu về nước cao hơn các loại cây khác và thuộc nhóm cây chịu hạn kém Trong suốt thời gian sinh trưởng, nhu cầu nước của cây không đồng đều qua các giai đoạn Hạn thường làm giảm 40% năng suất đậu tương và tác động đến tất cả các giai đoạn sinh trưởng và phát triển, từ nảy mầm, ra hoa, tạo hạt cũng như chất lượng hạt được tạo thành Nói chung hạn hán ảnh hưởng đến mọi giai đoạn sinh trưởng của cây, đặc biệt với cây đậu tương thì giai đoạn tạo hạt đặc biệt cần nước vì giai đoạn này quá trình tổng hợp protein diễn ra mạnh do đó nước cung cấp cho cây lúc này có ý

nghĩa lớn quyết định năng suất Ở cây đậu tương, để tổng hợp 1kg chất khô cần 500-530 kg nước Trong quá trình nảy mầm thì nhu cầu về nước của đậu tương cũng khá cao 50%, trong khi ở ngô chỉ là 30%, lúa là 26%

Nước vừa là nguyên liệu, vừa là môi trường để các phản ứng trao đổi chất xảy ra Vì vậy, sự vi phạm chế độ nước ảnh hưởng rất lớn đến mọi quá trình sinh trưởng và phát triển của cây

1.1.3 Cơ chế chịu hạn của đậu tương

Để thích nghi với điều kiện khô hạn, đậu tương phản ứng thích nghi với những biến đổi của môi trường như: sự phát triển nhanh của bộ rễ, khả năng chín sớm của quả, khả năng sử dụng nước tiết kiệm trong quá trình sinh trưởng và phát triển của cây…

Khả năng thích nghi của bộ rễ trong điều kiện hạn: Bộ rễ là một trong những

bộ phận quan trọng của cây thực hiện nhiệm vụ lấy nước cung cấp cho các hoạt động sống và phát triển của cơ thể thực vật Ở cây đậu tương sự thích nghi với các điều kiện hạn hán chủ yếu thông qua việc phát triển rễ trụ để có thể tìm kiếm các nguồn nước từ các lớp đất sâu (Taylor và đtg 1978) Bên cạnh đó hệ thống rễ sợi phát triển cũng giúp cho cây có thể vươn tới các lớp đất có độ ẩm cao và tìm kiếm các chất dinh dưỡng

Điều chỉnh áp suất thẩm thấu: Áp suất thẩm thấu có ảnh hưởng rất lớn đến sự

sinh trưởng và phát triển của đậu tương, áp suất thẩm thấu quá cao cây không lấy được nước đây cũng chính là nguyên nhân gây hạn cho cây Khả năng điều chỉnh áp suất thẩm thấu có liên quan trực tiếp đến khả năng cạnh tranh của tế bào rễ cây đối với đất Trong điều kiện áp suất thẩm thấu tăng lên giúp cho tế bào thu nhận được những phân tử nước từ đất Bằng cơ chế như vậy, thực vật có thể vượt qua tình trạng hạn cục bộ Khi tế bào bị mất nước, các chất hòa tan trong cơ thể thực vật sẽ được tích lũy dần trong tế bào nhằm

chống lại việc giảm tiềm năng nước và tăng khả năng giữ nước của nguyên sinh chất Ngay trong quá trình đồng hóa và trao đổi chất thì hầu hết các loại chất hữu cơ hòa tan có tác dụng điều chỉnh áp suất thẩm thấu đã được sinh ra

Hoạt động của các gen chịu hạn: Phản ứng của thực vật trước tác động của hạn

rất đa dạng, phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác nhau, trong đó có kiểu gen, độ dài

và tính khốc liệt của điều kiện ngoại cảnh Biểu hiện của quá trình này là việc sinh tổng hợp của một loạt các chất trong tế bào, một số hoocmon hoặc chất kích thích để giúp cây có khả năng thích ứng Khi đi sâu vào nghiên cứu ở mức độ phân tử của hiện tượng nóng, hạn ở thực vật người ta đã có những bước tiếp cận khác nhau trên nhiều loài cây trồng ở các giai đoạn phát triển

Đặc tính chịu hạn ở cây đậu tương là tính trạng đa gen và sự biểu hiện của các gen cảm ứng với hạn hán liên quan chặt chẽ với quá trình phiên mã

Vì vậy, sự biểu hiện của các gen cảm ứng với hạn hán chịu ảnh hưởng rất nhiều của môi trường trong và ngoài cơ thể, với nhiều mức độ điều hòa Trong một số thập kỷ vừa qua, đã có những tiến bộ đáng kể trong việc cải tiến giố ng cây trồng nhằm tăng cường khả năng chố ng chịu hạn hán củ a thực vâ ̣t thông qua các kỹ thuâ ̣t tác đô ̣ng vào nhân tố phiên mã hoặc yếu tố tín hiệu ở cây trồng chuyển gen Các nhân tố phiên mã (Transcripti on factors - TF) là

bộ máy điều khiển quan trọng của những thay đổi trong biểu hiện gen và phản ứng với các stress môi trường Có thể thấy rõ ở cây trồng các gen mã hóa nhân tố phiên mã chiếm một phần lớn trong hệ gen, ví dụ như ở cây

Arabidopsis có đến 1500 TF trong hệ gen [19] Các protein tham gia điều

khiển hệ gen có thể có chức năng trong việc phản ứng với điều kiện cực đoan như protein kinase và TF TF có các motif có khả năng gắn với DNA như bZIP, MYB, MYC… Các yếu tố cực đoan tác động lên TF, tiếp theo,TF hoạt hóa khả năng phát hiện và gắn với DNA tạo thành đường dẫn truyền tín hiệu phức tạp: từ sự nhận biết, cảm ứng với điều kiện môi trường đến việc tổng

hợp hormon như ABA, sau đó, hoạt hóa các TF Hiện nay, protein DREB (một trong bốn phân họ lớn của họ AP2/ERF) là nhóm TF được nghiên cứu thành công nhất trong điều kiện phi sinh học, bởi vì nó kích hoạt sự biểu hiện của nhiều gen mục tiêu chịu trách nhiệm kiểm soát các yếu tố liên quan [13]

Wang và các cộng sự đã xác định được trong cây Arabidopsis có 474 gen mục

tiêu mà các yếu tố phiên mã DREB tác động [22] Trong số những gen này,

có 160 gen có đáp ứng với stress phi sinh học và 27 gen cảm ứng với tình trạng thiếu nước [21]

1.2 NHÂN TỐ PHIÊN MÃ DREB

1.2.1 Các nhân tố phiên mã DREB ở đậu tương

Đặc tính chịu hạn của đậu tương là tính trạng đa gen, các gen liên quan đến đặc tính chịu hạn của đậu tương được chia thành hai nhóm: Nhóm gen có sản phẩm trực tiếp tham gia vào quá trình hình thành đặc tính chịu hạn của cây và các gen mà sản phẩm tham gia điều hòa của nhóm gen chịu hạn

Các protein điều hoà phiên mã có khả năng hoạt hóa hoặc ức chế biểu hiện của các gen chức năng thông qua việc bám vào trật tự DNA điều khiển trên vùng khởi động gen và tương tác với RNA polymerase tạo thành phức hợp khởi đầu quá trình phiên mã các gen chức năng Nhóm gen mã hóa các nhân tố phiên mã chiếm khoảng 8-10% trong hệ gen mỗi loài và đóng vai trò quan trọng trong mọi hoạt động sống như quá trình sinh trưởng phát triển và chống chịu với bất lợi môi trường Ở đậu tương, hơn 2000 yếu tố phiên mã từ các mô cơ quan chính đã được xác định, khoảng trên 180 yếu tố phiên mã ở rễ liên quan đến tính chịu hạn Các nhà khoa học đã xác định các nhân tố tham gia vào quá trình phiên mã của nhóm gen chịu hạn là DREB, ADREB, NAC, bZIP, ZFHD…

DREB là họ gen tổng hợp protein được tìm thấy nhiều trong tế bào sống khi thực vật gặp các điều kiện bất lợi như hạn hán, mặn và lạnh Nhiều

công trình nghiên cứu của các nhà khoa học trên thế giới cho rằng DREB là nhân tố phiên mã tham gia tích cực vào quá trình này bằng cách kích hoạt nhanh chóng sự hoạt động của các gen tham gia trực tiếp chống lại các điều kiện bất lợi của môi trường như hạn hán, mặn và lạnh Khi nghiên cứu cấu trúc protein họ DREB đã cho thấy rằng chúng có chứa vùng bảo thủ duy nhất

để gắn với trình tự DNA đặc hiệu là AP2/ERF, cho phép chúng tương tác với một loạt các gen phía sau theo hình thức không phụ thuộc ABA Các miền AP2/ERF khá bảo thủ và có khoảng 60 amino acid [10], [11], [12] Shahrokhabadi và đtg (2008) đã xác định được các gen trong họ gen DREB ở đậu tương

Ít nhất có 10 thành viên của phân họ gen DREB được xác định có trong

hệ gen cây đậu tương (GmDREBa, GmDREBb, GmDREBc, GmDREB1, GmDREB2, GmDREB3, GmDREB5, GmDREB6, GmDREB7) [18] Mỗi gen

trong họ DREB có trình tự, độ dài khác nhau nhưng đều được biểu hiện nhiều khi đậu tương gặp các điều kiện về hạn Nhóm DREB1 điều khiển tính chi ̣u

hạn, mă ̣n và la ̣nh, trong khi nhóm DREB2 điều khiển tính chi ̣u ha ̣n

1.2.2 Nhân tố phiên mã DREB2

Sự biểu hiện mạnh của DREB2 sẽ kích hoạt các gen cảm ứng với sự mất nước và cải thiện khả năng chịu hạn

Phân nhóm DREB2 gồm 8 thành viên trong cây Arabidopsis [19] và 5

thành viên trong lúa gạo [15] Phân tích sự phát sinh của các protein DREB2 từ

cây Arabidopsis và lúa gạo, cũng như các protein liên quan, cho thấy phân nhóm

DREB2 liên quan chặt chẽ với phân nhóm A-3, trong đó có ABI4 Phân nhóm DREB2 trong cây Arabidopsis và lúa gạo có thể đều được chia thành ba phân nhóm phụ [15] Điều đáng chú ý là tất cả các DREB2s được phân lập có cảm ứng stress thuộc phân nhóm phụ 1, trong đó bao gồm DREB2A, DREB2B,

DREB2C, DREB2E và DREB2H của cây Arabidopsis, cũng như OsDREB2A

và OsDREB2B của lúa gạo, cho thấy nhóm phụ 1 mà đại diện là các DREB2s có cảm ứng với các stress Phân nhóm phụ 2 bao gồm DREB2D, DREB2G ở cây Arabidopsis và Os DREB2C ở cây lúa gạo, trong khi phân nhóm phụ 3 gồm DREB2F ở cây Arabidopsis và OsDREB2E ở cây lúa gạo Các gen DREB2 ở hai phân nhóm phụ này không có hoặc cảm ứng không đáng kể trước các stress [15], [19] và cũng chưa được phân lập từ thực vật khác, mặc dù tất cả các loài thực vật hạt kín đều có các gen thuộc 2 nhóm này, song vai trò của chúng còn ít được biết đến Các nghiên cứu cho thấy DREB2 có vai trò điều hòa biểu hiện gen dưới sự tác động của hạn hán và stress lên thực vật

Chen và đtg (2007), đã phân lập gen GmDREB2 từ đậu tương và dựa trên sự giống nhau về miền AP2, gen GmDREB2 xếp vào phân họ A-5 trong phân họ DREB Gen GmDREB2 được biểu hiện mạnh trong môi trường có hạn

hán, nồng độ muối cao, nhiệt độ thấp và ABA [21] Sự biểu hiện của

GmDREB2 ở cây thuốc lá chuyển gen thể hiện ở sự tích lũy hàm lượng proline cao [14] Trong Ngân hàng gen quốc tế, trình tự gen GmDREB2 đã được công

bố bởi Wang và đtg (2006) có kích thước 480 bp, mã hóa 159 amino acid, vùng

AP2 có 59 amino acid, từ vị trí amino acid 34 đến 92 [19] Gen GmDREB2 ở

cây đậu tương có chức năng kích hoạt sự phiên mã của nhóm gen chịu hạn Sản phẩm biểu hiện của gen GmDREB2 được tìm thấy khi cây đâ ̣u tương gă ̣p ha ̣n,

lạnh và mă ̣n Như vậy, gen GmDREB2 đã được chứng minh là tích cực tham

gia vào viê ̣c chống ha ̣n ở cây đậu tương [14], [16], [21]

Thông tin về gen GmDREB2 cho thấy trình tự nucleotide của gen GmDREB2 có số lượng nucleotide 480 bp, từ vị trí nucleotide thứ 1 đến 480,

mã hóa cho 159 amino acid, từ vị trí số 1 đến vị trí amino acid thứ 159

1.3 ỨNG DỤNG KỸ THUẬT CHUYỂN GEN TRONG CẢI THIỆN KHẢ NĂNG CHỊU HẠN CỦA CÂY ĐẬU TƯƠNG

1.3.1 Các kỹ thuật chuyển gen ứng dụng ở cây đậu tương

Có nhiều phương pháp chuyển gen vào đậu tương nhưng có thể phân loại thành hai nhóm phương pháp chính: phương pháp chuyển gen gián tiếp

và phương pháp chuyển gen trực tiếp

Các phương pháp chuyển gen trực tiếp được sử dụng phổ biến trong các nghiên cứu chuyển gen đậu tương có thể kể đến là: phương pháp chuyển gen nhờ kỹ thuật xung điện, vi tiêm, chuyển gen trực tiếp qua ống phấn, chuyển gen nhờ súng bắn gen, chuyển gen nhờ kĩ thuật siêu âm, chuyển gen nhờ silicon carbide

Khác với các phương pháp chuyển gen trực tiếp, phương pháp chuyển gen gián tiếp được thông qua vi sinh vật trung gian mang gen chuyển Những

vi khuẩn này tiến hành quá trình chuyển gen vào tế bào thực vật thông qua các cơ chế rất tự nhiên Một trong những phương pháp chuyển gen gián tiếp ở đậu tương được sử dụng, nghiên cứu và ứng dụng khá phổ biến là phương

pháp chuyển gen thông qua loài vi khuẩn đất là Agrobacterium

Chuyển gen gián tiếp ở thực vật được thực hiện gồm các kỹ thuật phân

tử như, xác định gen liên quan đến tính trạng cần quan tâm, phân lập gen, tạo

vector chuyển gen, biến nạp vào mô thực vật thông qua A tumefaciens , chọn

lọc các thể biến nạp trên môi trường chọn lọc, tái sinh cây biến nạp, phân tích xác nhận sự có mặt và dung hợp của gen chuyển bằng PCR, Southern blot và phân tích sự biểu hiện của gen chuyển bằng các kỹ thuật Northern blot, Real time RT-PCR và Western blot

Trong các kỹ thuật chuyển gen gián tiếp thì kỹ thuật chuyển gen thông

qua vi khuẩn A tumefaciens được sử dụng rộng rãi hơn cả bởi vì phương

pháp này dễ sử dụng, ít tốn kém nhưng mang lại hiệu quả cao, vì lượng bản

sao gen chuyển ít, tạo thuận lợi cho việc phân tích cây chuyển gen và không gây tổn thương tế bào

Agrobacterium tumefaciens là loài vi khuẩn sống trong đất gây ra bệnh

khối u hình chóp (crown gall) và bệnh lông rễ (hairy root) ở các vị trí tổn thương của thực vật hai lá mầm Sự sinh trưởng khối u có thể tiếp diễn khi vắng mặt vi khuẩn và khối u có thể được sinh trưởng vô trùng bằng nuôi cấy

mô trong các môi trường thiếu sự bổ sung auxin và cytokinin ngoại sinh mà

bình thường là cần thiết để xúc tiến sự sinh trưởng của mô thực vật invitro Ti-plasmid của Agrobacterium tumefaciens: Ti-plasmid có kích thước khoảng 200-250 kb Chúng được duy trì ổn định trong Agrobacterium ở nhiệt độ dưới

30oC Trong khi hình thành khối u, T-DNA được chuyển vào tế bào thực vật

và hợp nhất với genome nhân T-DNA ổn định trong genome nhân T-DNA được phiên mã trong các tế bào khối u tạo ra nhiều mRNA polyadenyl

1.3.2 Nghiên cứu chuyển gen ở cây đậu tương

Đã có rất nhiều công trình khoa học trên thế giới nghiên cứu về tính chịu hạn của cây đậu tương nhằm góp phần quan trọng trong công tác chọn giống

Năm 2010, Ji và đtg đã phân lập gen glutathione S-transferase (GmGST) từ

mRNA của cây đậu tương dại và chuyển vào cây thuốc lá GST là một họ protein đóng vai trò quan trọng trong việc chống oxy hoá và kích hoạt một số enzyme liên quan đến tính chống chịu ở đậu tương Kết quả phân tích dòng thuốc lá chuyển gen T2 cho thấy, khả năng chống chịu hạn và mặn, sự sinh trưởng kéo dài rễ cũng diễn ra mạnh mẽ hơn hẳn so với cây đối chứng [18]

Ở Việt Nam đã có một số công trình nghiên cứu phân lập và chuyển các gen liên quan đến tính chịu hạn của cây đậu tương Trần Thị Phương Liên

và đtg (2003) phân lập gen chaperonin từ giống đậu tương địa phương chịu

hạn Cúc Vàng có kích thước 1602 bp mã hoá cho 533 axit amin [7] Nguyễn

Thu Hiền và đtg (2005) phân lập gen dehydrin với kích thước 751 bp liên

quan đến khả năng chịu hạn từ hai giống đậu tương vàng Mường Khương và Cao Bằng 4 Lò Thanh Sơn đã nghiên cứu và chuyển gen liên quan đến sự phát triển bộ rễ của cây đậu tương [7] Các nghiên cứu chuyển gen ở đậu tương đã sử dụng các kỹ thuật phân tích cây chuyển gen như, xác định sự có mặt của gen chuyển trong hệ gen cây được chuyển gen bằng PCR phân tích Southern blot để xác định sự dung hợp của gen chuyển vào hệ gen cây chủ (Nguyễn Thị Thuý Hường, 2011; Lò Thị Mai Thu, 2014; Lò Thanh Sơn,

2015) Đánh giá mức độ biểu hiện của gen chuyển GmEXP1 thông qua phiên

mã, Lò Thanh Sơn (2015) đã sử dụng kỹ thuật Real time RT-PCR cho thấy các dòng cây chuyển gen có mức độ phiên mã khác nhau Kiểm tra sự biểu hiện của protein tái tổ hợp trong cây chuyển gen, các nghiên cứu của Nguyễn Thu Hiền (2014), Lò Thanh Sơn (2015) đã sử dụng kỹ thuật lai Western Các nghiên cứu tạo cây chuyển gen đều cho nhận xét, chức năng sinh học của gen chuyển trong cây chuyển gen đã biểu hiện mạnh hơn hẳn cây đối chứng không chuyển gen [4], [7]

Có thể nhận xét rằng, điểm chung các nghiên cứu chuyển gen ở đậu tương của Nguyễn Thị Thuý Hường, Lò Thị Mai Thu, Lò Thanh Sơn là chuyển các gen chức năng riêng lẻ, trong khi tính chịu hạn của cây đậu tương nói riêng và của thực vật nói chung là tính trạng đa gen, do vậy hướng tiếp cận tăng cường biểu hiện gen mã hóa nhân tố phiên mã của nhóm gen chịu hạn được chúng tôi quan tâm nghiên cứu

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1 VẬT LIỆU, HÓA CHẤT, THIẾT BỊ, ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU

2.1.1 Đặc điểm của giống đậu tương ĐT12

Giống đậu tương được sử dụng làm vật liệu nghiên cứu là ĐT12 do Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển đậu đỗ cung cấp Giống đậu tương ĐT12 nhập nội từ Trung Quốc năm 1996, được trung tâm NCTN Đậu đỗ chọn lọc phát triển và hội đồng khoa học Viện Khoa học Kỹ thuật nông nghiệp Việt Nam cho phép khu vực hoá tháng 5 năm 2001 và được công nhân là giống Tiên bộ kỹ thuật năm 2002 theo quyết định sô 5310QĐ /BNN-KHCN ngày 29/11/2002 ĐT12 Có thời gian sinh trưởng cực ngắn từ 71 đến 75 ngày, thuộc loại hình sinh trưởng hữu hạn, cứng cây, hoa trắng, lông phủ màu trắng, quả chín có màu xám Hạt đậu tương ĐT12 có dạng hình cầu, màu vàng nhạt, rốn hạt có màu nâu, kích thước rốn là 3,5 mm (Hình 2.1)

Hình 2.1 Hạt của giống đậu tương ĐT12

Giống đậu tương ĐT12 có chiều cao cây từ 35-50cm, phân cành trung bình, số quả chắc trung bình (18- 30), tỷ lệ quả 3 hạt cao (19- 40%) khối