Khảo sát mức độ methyl tạo đảo cpg thuộc vùng promoter củab các gen DAPK và APC trên nhóm bệnh nhân có nguy cơ ung thư cổ tử cung

Tần suất methyl hóa trên vùng promoter của gen DAPK trong các giai đoạn ung thư cổ tử cung khác nhau và các phương pháp xác định tính chất methyl hóa khác nhau ..... Tuy nhiên, ở Việt N

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Tên đề tài:

KHẢO SÁT MỨC ĐỘ METHYL HÓA TẠI ĐẢO CpG

THUỘC VÙNG PROMOTER CỦA CÁC GEN DAPK VÀ APC

TRÊN NHÓM BỆNH NHÂN CÓ NGUY CƠ UNG THƯ CỔ

TP Hồ Chí Minh, tháng 5 năm 2015

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Tên đề tài:

KHẢO SÁT MỨC ĐỘ METHYL HÓA TẠI ĐẢO CpG

THUỘC VÙNG PROMOTER CỦA CÁC GEN DAPK VÀ APC

TRÊN NHÓM BỆNH NHÂN CÓ NGUY CƠ UNG THƢ CỔ

TP Hồ Chí Minh, tháng 5 năm 2015

và truyền đạt những kiến thức kinh nghiệm quý báu, tạo mọi điều kiện thuận lợi để

em hoàn thành tốt trong suốt thời gian thực hiện đề tài

Bên cạnh đó, tôi xin cảm ơn các bạn của tôi, các bạn sinh viên phòng thí nghiệm sinh học phân tử đã quan tâm, giúp đỡ tận tình tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài

Cuối cùng con xin cảm ơn Ba, Mẹ, cảm ơn gia đình đã luôn bên con, ủng hộ

cho con, tạo mọi điều kiện tốt nhất để con hoàn thành việc học của mình

Em xin gửi lời chúc sức khỏe đến tất cả người Thầy, người Cô đáng kính khoa Công nghệ sinh học, Trường Đại Học Mở TP Hồ Chí Minh, xin chúc Thầy Cô ngày càng gặt hái được nhiều thành công

Tôi xin chúc các bạn của tôi sẽ hoàn thành tốt công việc học tập của mình tại trường và thành công trong cuộc sống

Xin chân thành cảm ơn

Sinh viên thực hiện Nguyễn Tấn Liêm

iii

I.1 Tổng quan ung thư 1

I.1.1 Khái niệm ung thư 1

I.1.2 Phân loại ung thư 1

I.1.3 Ung thư cổ tử cung 2

I.1.4 Các nguyên nhân dẫn đến ung thư cổ tử cung 2

I.1.4.1 Thuốc lá 2

I.1.4.2 Thuốc 3

I.1.4.3 Virus HPV (Human Papiloma virus) 3

I.1.4.4 Độ tuổi 5

I.1.4.5 Yếu tố di truyền và chủng tộc 5

I.2 Tình hình mắc bệnh ung thư cổ tử cung trên thế giới và Việt Nam 5

I.2.1 Tình hình ung thư cổ tử cung trên thế giới 5

I.2.2 Tình hình ung thư cổ tử cung ở Việt Nam 6

I.3 Tổng quan về Epigenetics và sự methyl hóa 6

I.3.1 Epigenetics 6

I.3.2 Sự methyl hóa DNA 7

I.3.3 Đảo CpG 8

I.3.4 Sự biến đổi Histone 10

I.3.5 microRNA 10

I.4 Gen DAPK (Death-associated protein kinase) 11

I.4.1 Định nghĩa 11

iv

I.5 Gen APC (Adenomatous polyposis coli) 15

I.5.1 Định nghĩa 15

I.5.2 Cơ chế hoạt động và chức năng của protein APC 15

I.5.3 Tình hình nghiên cứu sự methyl hóa của gen APC 17

I.5.4 Phương pháp nghiên cứu sự methyl hóa 19

I.5.4.1 Phương pháp MSP (Methylation Specific PCR) 19

I.5.4.2 Phương pháp Nested MSP 20

Phần II Vật liệu và phương pháp 21

II.1 Vật liệu 21

II.2 Phương pháp 21

II.2.1 Khai thác dữ liệu 21

II.2.2 Khảo sát in silico 21

II.2.2.1 Thu thập trình tự gen mục tiêu, xác định vị trí vùng cần tìm 21

II.2.2.2 Phương pháp đánh giá, thiết kế mồi 21

II.2.3 Khảo sát in vitro 22

II.2.3.1 Tách chiết DNA từ mẫu bệnh phẩm Pap’smear 22

II.2.3.2 Xác định nồng độ và độ tinh sạch của DNA sau tách chiết 24

II.2.3.3 Biến đổi DNA bằng sodium bisulfite với bộ kit Zymo Research 24

II.2.3.4 Thực hiện phản ứng MSP 25

II.2.3.5 Điện di trên gel agarose 27

II.2.3.6 Giải trình tự 28

Phần III Kết Quả Và Thảo Luận 29

v

III.1.2 Bộ dữ liệu về tần suất methyl hóa trên vùng promoter của gen APC ở các

loại ung thư và ung thư cổ tử cung 38

III.2 Khảo sát in sillico 45

III.2.1 Thu thập trình tự gen DAPK, gen APC 45

III.2.1.1 Thu thập trình tự gen DAPK 45

III.2.1.2 Thu thập trình tự gen APC 46

III.2.2 Khảo sát vùng promoter gen DAPK (Death associated protein kinase), APC (Human adenomatous polysis coli) 47

III.2.2.1 Khảo sát vùng promoter gen DAPK 47

III.2.2.2 Khảo sát vùng promoter gen APC 48

III.2.3 Thu thập hệ mồi cho phản ứng MSP 49

III.2.3.1 Thu thập hệ mồi cho phản ứng MSP trên gen DAPK 49

III.2.3.2 Thu thập hệ mồi cho phản ứng MSP trên gen APC 51

III.2.4 Tìm hiểu thông số vật lý của mồi tham khảo 51

III.2.4.1 Thông số vật lý của cặp mồi gen DAPK 53

III.2.4.2 Thông số vật lý của cặp mồi gen APC 55

III.3 Khảo sát in vitro 57

III.3.1 Tách chiết DNA và kiểm tra DNA bộ gen sau khi tách chiết 57

III.3.2 Kết quả phản ứng MSP các mẫu bệnh phẩm với cặp mồi đặc hiệu của gen DAPK, APC 58

III.3.2.1 Kết quả phản ứng MSP các mẫu bệnh phẩm với cặp mồi đặc hiệu của gen DAPK 58

vi

Phần IV Kết Luận và Đề Nghị 65

IV.1 Kết luận 65

IV.2 Đề Nghị 65

Phần V Tài Liệu Tham Khảo 66

Phần VI Phụ lục 89

vii

Hình I 2 Số bệnh nhân nhiễm và tử vong do ung thư cổ tử cung gây ra trên Thế

giới 5

Hình I 3 Các quá trình biến đổi Epigenetics 7

Hình I 4 Quá trình methyl hóa DNA 7

Hình I 5 Quá trình methyl hóa 8

Hình I 6 Methyl hóa DNA trong tế bào bình thường và tế bào ung thư 9

Hình I 7 Định vị của gen DAPK trên nhiễm sắc thể số 9 11

Hình I 8 Con đường chu trình chết của tế bào 13

Hình I 9 Định vị của gen APC trên nhiễm sắc thể số 5 15

Hình I 10 Con đường điều hòa tín hiệu Wnt trong màng nguyên sinh chất và các phức hợp trong tế bào chất 17

Hình I 11 Nguyên tắc của phản ứng MSP 19

Hình II 1 Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR với cặp mồi DAPK-MR, DAPK-MF, DAPK-UR, APC-MR, APC-MF, APC-UR, APC-UF 27

Hình III 1 Tần suất methyl hóa của gen DAPK trong các loại ung thư 35

Hình III 2 Phương pháp sử dụng nghiên cứu sự methyl hóa DNA của gen DAPK trong các loại ung thư 36

Hình III 3 Mẫu sử dụng nghiên cứu sự methyl hóa DNA của gen DAPK trong các loại ung thư 36

Hình III 4 Tần suất methyl hóa của gen APC trong các loại ung thư 42

Hình III 5 Phương pháp sử dụng nghiên cứu sự methyl hóa của gen APC trong các loại ung thư 42

viii

Hình III 8 Định vị của đảo CpG trên vùng promoter của gen DAPK 48

Hình III 9 Định vị gen APC trên nhiễm sắc thể số 5 48

Hình III 10 Định vị của đảo CpG trên vùng promoter gen APC 49

Hình III 11 Cấu trúc vùng promoter của gen DAPK 54

Hình III 12 Vị trí CpG và trình tự nhận biết của các nhân tố phiên mã trên vùng promoter của gen DAPK 55

Hình III 13 Cấu trúc vùng promoter gen APC 56

Hình III 14 Vị trí CpG và trình tự nhận biết của các nhân tố phiên mã trên vùng promoter của gen APC 57

Hình III 15 Kết quả điện di sản phẩm MSP ở các mẫu CD 58

Hình III 16 Kết quả điện di sản phẩm MSP ở các mẫu CA 61

Hình III 17 Kết quả giải trình tự mẫu CD1-A với cặp mồi DAPK-MF, DAPK-MR 63

Bảng II 1 Thành phần phản ứng PCR cho cặp mồi DAPK-MF, DAPK-MR, APC-MF, APC-MR 26

Bảng II 2 Thành phần phản ứng PCR cho cặp mồi DAPK-UF, DAPK-UR, APC-UF, APC-UR 26

Bảng III 1 Các công trình nghiên cứu khoa học được thu thập trên NCBI 29

Bảng III 2 Tần suất methyl hóa trên vùng promoter của gen DAPK ở các loại ung thư 31

Bảng III 3 Tần suất methyl hóa trên vùng promoter của gen DAPK trong các giai đoạn ung thư cổ tử cung khác nhau và các phương pháp xác định tính chất methyl hóa khác nhau 37

ix

thư 40

Bảng III 6 Tần suất methyl hóa trên vùng promoter của gen APC trong các giai

đoạn ung thư cổ tử cung khác nhau và các phương pháp xác định tính chất methyl hóa khác nhau 44

Bảng III 7 Tần số methyl hóa trung bình có trọng số của các gen APC trong ung

thư cổ tử cung và trong tế bào bình thường 45

Bảng III 8 Trình tự gen DAPK thu thập trên ngân hàng gen 45 Bảng III 9 Trình tự gen APC thu thập trên ngân hàng gen 46

Bảng III 10 Thông tin cặp mồi DAPK-MF, DAPK-MR, DAPK-UF và DAPK-UR cho phản ứng MSP 50 Bảng III 11 Thông tin cặp mồi APC-MF, APC-MR, APC-UF, APC-UR cho phản ứng MSP 51 Bảng III 12 Khảo sát các thông số vật lý của mồi DAPK-MF, DAPK-MR, DAPK-

UF, DAPK-UR 53 Bảng III 13 Khảo sát các thông số vật lý của mồi APC-MF, APC-MR, APC-UF, APC-UR 55

Bảng III 14 Tính chất methyl hóa đảo CpG trên vùng promoter gen DAPK ở các

mẫu CD 59

Bảng III 15 Tính chất methyl hóa đảo CpG trên vùng promoter gen APC ở các

mẫu CA 61

x

APC Adenomatous Polyposis Coli

ARF Alternate reading frame

BER Breast cancer

BSP Bisulfite specific PCR

CER Cervical cancer

CK1α Casein kinase

COL Colorectal cancer

CpG Cystonine phosphodiester Guanine

E1A Adenovirus early region 1A

E2F-1 E2F Transcription Factor 1

EB1 End-binding protein 1

ERK Extracellular Signal-Regulated Kinase

GAIP G Alpha Interacting Protein

GAS Gastric cancer

GDP Guanosine-5’-diphosphate

GSK3β Glycogen synthase kinase 3

GTP Guanosine-5’-triphosphate

HPV Human Papiloma virus

IARC Interntional Agency for Research on Cancer

ID4 Inhibitor of DNA binding 4

xi

LIV Liver cancer

LRP Lipoprotein receptor-related protein

LUN Lung cancer

Mdm2 Mouse double minute 2 homolog

MR Methyl reverse

mTOR Mechanistic Target of Rapamycin

MyC Myc Avian Myelocytomatosis viral oncogene homolog

NAS Nasopharylgeal carcinoma

Ocs Oral contraceptives

PCR Polymerase chain reaction

QMSP Qualitative Methylation specific PCR

Raf Rapidly Accelerated Fibrosarcoma

SAM S-adenyl methione

SAM Sterile Anpha motif

WHO World Health Organization

Wnt Wingless –type mouse mammary tumor virus integration site

ZIPK Zipper-Interacting Protein kinase

β-TrCP Beta-Transducin Repeat Containing E3 Ubiquitin protein Ligase

CIN Cervical Intraepithelial Neoplasia

xii

HMT Histone Methyl Transferase

HDM Histone Demethyl

OD Optical Density

DNA trên vùng promoter gen DAPK, APC là dấu chứng sinh học tiềm năng trong

việc tiên lượng và chẩn đoán sớm ung thư nói chung và ung thư cổ tử cung nói riêng [36, 73, 143]

Gen DAPK (Death-associated protein kinase) là gen ức chế quá trình tạo u và

sự di căn, nằm trên nhiễm sắc thể số 9 (9q21.33), có kích thước là 211.407 bp, gồm

29 exon (Genecard) Gen APC (Adenomatous polyposis coli) là một gen ức chế khối

u đa chức năng, nằm trên nhiễm sắc thể số 5 (5q22.2), có kích thước là 138.742 bp, gồm 15 exon (Genecard)

Trên thế giới, nhiều công trình nghiên cứu về sự methyl hóa DNA trên vùng

promoter gen DAPK, APC ở nhiều loại ung thư khác nhau như: ung thư phổi, ung

thư cổ tử cung, ung thư gan,…[14, 36, 39, 151] Tuy nhiên, ở Việt Nam có rất ít

công trình nghiên cứu về sự methyl hóa DNA trên vùng promoter của gen DAPK,

APC ở các loại ung thư, đặc biệt là ung thư cổ tử cung, căn bệnh đứng thứ 2 của phụ

Mục tiêu: Xác định tính chất methyl hóa DNA trên vùng promoter gen

DAPK, APC liên quan đến bệnh ung thư cổ tử cung ở Việt Nam, dựa trên bộ mẫu có

xiv

- Thu thập bộ dữ liệu về tính chất methyl hóa của vùng promoter trên gen DAPK,

APC với các bệnh ung thư, đặc biệt là ung thư cổ tử cung

- Thu thập và khảo sát bộ mồi đặc hiệu cho phản ứng MSP khuếch đại vùng gen mục tiêu

- Xác định tính chất methyl hóa DNA trên vùng promoter gen DAPK, APC trên

bộ mẫu có tính chất nhiễm HPV type nguy cơ cao/nguy cơ thấp hoặc không nhiễm HPV type nguy cơ cao/nguy cơ thấp bằng phương pháp MSP.

SVTH: Nguyễn Tấn Liêm Trang 1

Phần I Tổng quan I.1 Tổng quan ung thƣ

I.1.1 Khái niệm ung thƣ

“Ung thư” là một dạng bệnh lý dùng mô tả trên 200 loại bệnh riêng lẻ, được phân loại dựa vào đặc điểm mô học và vị trí khởi phát ung thư [1, 156, 161] Ung thư khởi phát từ sự phân chia, phát triển không kiểm soát của các tế bào bất thường

ở bất kỳ vùng mô trên cơ thể con người [1, 7] Sự diễn tiến của ung thư là sự xâm lấn của các tế bào bất thường xảy ra ở các vùng mô lân cận, di căn đến các mô ở xa

và các bộ phận khác nhau của cơ thể thông qua hệ thống bạch huyết và máu [1, 7]

Hình I 1 Quá trình khởi phát và diễn tiến của ung thƣ [20]

Chú thích: (a): Tế bào bình thường (b): Tế bào bất thường (c): Mạch máu (d):

mạch bạch huyết

I.1.2 Phân loại ung thƣ

Ung thư được chia thành các dạng chính [156, 161]:

- Ung thư biểu mô (Carcinoma)

- Ung thư mô liên kết (Sarcoma)

- Ung thư tủy (Myeloma cancer)

- Ung thư bạch cầu (Leukemia)

- Ung thư lympho (Lymphoma)

SVTH: Nguyễn Tấn Liêm Trang 2

- Ung thư hỗn hợp (Mixed Types Cancer)

I.1.3 Ung thƣ cổ tử cung

Ung thư cổ tử cung là loại ung thư ác tính, bắt đầu bằng sự tăng sinh bất thường của các tế bào xung quanh tử cung hoặc các vùng cấu trúc của tử cung [53] Các dạng ung thư cổ tử cung: ung thư trong biểu mô tế bào hình vảy (xuất phát ở vùng chuyển tiếp, nơi tiếp nối của tế bào mô vảy cổ tử cung với biểu mô trụ của nội mạc tử cung) và ung thư tuyến cổ tử cung [53] Ung thư biểu mô hình vảy chiếm 80%, ung thư cổ tử cung tuyến chiếm 10-20% trong tổng số trường hợp mắc bệnh ung thư cổ tử cung [135]

Sự khởi phát và diễn tiến ung thư cổ tử cung bao gồm quá trình tạo u trong biểu mô tử cung (cervical intraepithelial neoplasia), sự tổn thương trong biểu mô của các tế bào hình vảy (squamous intraepithelial lesion) và sự loạn sản (dysplasia) [53] Theo hệ thống phân loại của tổ chức y tế Thế Giới, mức độ loạn sản và tạo u ở tầng biểu mô cổ tử cung (Cervical Intraepithelial Neoplasia) được chia thành các cấp độ [160]:

- CIN1: sự loạn sản ở mức độ nhẹ

- CIN2: sự loạn mức độ vừa

- CIN3: sự loạn sản mức độ nghiêm trọng

Trong hệ thống phân loại của Bethesda, mức độ tổn thương biểu mô và diễn tiến hình thành ung thư cổ tử cung được chia thành các cấp độ:

- LSIL (Low-grade Squamous Intraepithelial Lesion): sự tổn thương bên trong biểu mô hình vảy cấp độ thấp, tương ứng với CIN1 [162]

- HSIL (High-grade Squamous Intraepithelial Lesion): sự tổn thương bên trong biểu mô hình vảy cấp độ cao, tương ứng với CIN2, CIN3 [162]

I.1.4 Các nguyên nhân dẫn đến ung thƣ cổ tử cung

I.1.4.1 Thuốc lá

IARC (International Agency for Research on Cancer) ghi nhận thuốc lá là nguyên nhân gây ung thư cổ tử cung và các loại ung thư khác [165] Ước tính có khoảng 7% bệnh nhân ung thư cổ tử cung tại Anh có liên quan đến thuốc lá [106]

SVTH: Nguyễn Tấn Liêm Trang 3

Những người hút thuốc có nguy cơ ung thư cổ tử cung hình vảy cao gấp 1,5 lần so với những người không hút thuốc [9]

I.1.4.2 Thuốc

 Thuốc tránh thai (Oral contraceptives: Ocs)

Việc dùng thuốc tránh thai có chứa ostrogen-progestogen (thường gọi là Ocs)

là nguyên nhân dẫn đến ung thư cổ tử cung [165] Ước tính có khoảng 10% bệnh nhân ung thư cổ tử cung tại Anh có liên quan đến việc dùng Ocs [21, 165] Những người dùng Ocs suốt 5 năm có nguy cơ ung thư cổ tử cung gấp đôi so với những người không dùng thuốc Nguy cơ mắc ung thư cổ tử cung càng tăng khi thời gian dùng thuốc càng lâu [10, 131]

 Thuốc Diethylstilbestrol

Những phụ nữ mang thai thường dùng thuốc diethylstilbestrol (DES) để ngăn chặn sự sẩy thai trong thời kỳ thai nghén, làm tăng nhanh sự phát triển các loại ung thư hiếm có ở tử cung và âm đạo [164] Phụ nữ dùng thuốc DES có nguy cơ mắc bệnh ung thư cổ tử cung và ung thư biểu mô cấp độ cao gấp 2,3 lần so với những phụ nữ không sử dụng thuốc [59]

I.1.4.3 Virus HPV (Human Papiloma virus)

a Virus HPV

Virus HPV là loài virus tạo thành các khối u, lan truyền phổ biến trên thế giới

thông qua con đường tình dục và có phạm vi hoạt động mạnh [34] Ước tính có

khoảng 5,2% các loại ung thư gây nên bởi sự xâm nhiễm của virus HPV [34]

HPV tác động chủ yếu vào biểu mô lát tầng không sừng hóa của cổ tử cung tại

nơi tiếp giáp giữa cổ trong và cổ ngoài [2] Biểu mô lát tầng không sừng hóa có khả năng bảo vệ và được phát triển lên hướng bề mặt, sau đó sẽ bong ra Khi nhiễm virus, những tổn thương ban đầu có thể xảy ra ở biểu mô lát, do không tiếp xúc với mạch máu nên không gây ra hiện tượng viêm, không hoạt hóa miễn dịch và hầu như

miễn nhiễm sau khi đã nhiễm tự nhiên HPV [1, 2] Khi virus HPV tấn công được

vào lớp tế bào đáy, lớp tế bào này vốn có khả năng sinh sản cao và gây nên hiện tượng phát triển mạnh hơn bình thường thành một rồi đến nhiều lớp tế bào sau đó Khi các tế bào phát triển bất thường này chiếm toàn bộ các lớp tế bào của biểu mô

SVTH: Nguyễn Tấn Liêm Trang 4

lát, gây hiện tượng dị sản hay ung thư tại chỗ Sau đó có khả năng lấn sâu xuống màng đáy và hình thành ung thư cổ tử cung giai đoạn xâm lấn [1, 2]

b Phân loại HPV

Có khoảng 100 loài virus HPV khác nhau được chia thành nhóm: type có nguy

cơ cao (16, 18, 31, 33, 35, 39,…) và type có nguy cơ thấp (6, 11, 40, 42, 43, 44, ) [34] Nhóm HPV type nguy cơ cao: 16, 18, 31 được xác định chiếm 99,7% trong

ung thư biểu mô cổ tử cung và 94-100% ung thư tuyến cổ tử cung [153]

c Cơ chế gây bệnh ung thư

Cơ chế gây bệnh của các virus type nguy cơ cao đã được chứng minh bằng sự hợp nhất của DNA virus với hệ gen di truyền trong tế bào (sự khuyết đoạn, sự sắp xếp lại trình tự DNA) và Epigenetics (sự biến đổi tình trạng methyl hóa và sự biểu

hiện bất thường của các miRNA) [135] E6 và E7 là hai protein oncogenic của HPV

đóng vai trò quan trọng trong quá trình sinh ung thư cổ tử cung, là đích của 2 gen ức

chế khối u đóng vai trò quan trọng, p53 và gen Rb [50]

E6 tương tác với các protein có chức năng cơ bản trong tế bào, làm suy thoái

sự biểu hiện điều hòa của p53 thông qua con đường ubiquitin hoá Trong tế bào bình thường không có sự xâm nhiễm, protein mdm-2 chịu trách nhiệm trong duy trì

cấp độ biểu hiện của p53 Khi có sự xâm nhiễm của virus HPV nguy cơ cao, protein

mdm2 điều khiển p53 sẽ được thay thế bằng phức hợp protein E6 liên kết với protein (E6-associate protein) kết quả dẫn đến sự phân hủy và suy thoái p53 nhanhchống p53 đóng vai trò quan trọng trong việc sữa chữa sai hỏng DNA, chu trình chết của tế bào và làm ngừng chu trình của tế bào.Sự biểu hiện của E6 trong tế bào duy trì chức năng của p53 ở cấp độ thấp, dẫn đến sự giảm điều hòa chu trình tế bào

và chương trình chết theo tế bào, kết quả là sự tích tụ các đột biến và sự tăng sinh của các tế bào đột biến [50]

E7 làm giảm sự điều hòa của gen Rb, gen ức chế khối u đóng vai trò quan

trọng trong quá trình điều hòa chu trình tế bào, làm giải phóng yếu tố phiên mã E2F, hoạt động trong quá trình tổng hợp DNA bên trong tế bào, kết quả làm tế bào tăng sinh một cách liên tục và tiến triển thành ung thư mà không có một cơ chế kiểm soát nào ngăn cản được [50]

SVTH: Nguyễn Tấn Liêm Trang 5

I.1.4.4 Độ tuổi

Ung thư cổ tử cung đang có khuynh hướng trẻ hóa độ tuổi mắc bệnh, trong khoảng 20 đến 35 tuổi [164, 165]

I.1.4.5 Yếu tố di truyền và chủng tộc

Ung thư cổ tử cung biểu mô hình vảy có nguy cơ xảy ra 74-80%, ung thư tuyến 39-69% ở những phụ nữ là con đầu lòng của người bệnh (mẹ, chị và con gái) [61] Bên cạnh đó, còn có nhiều yếu tố được coi là nguyên nhân gây ung thư cổ tử

cung: thai sản, suy giảm miễn dịch và HIV,…

I.2 Tình hình mắc bệnh ung thƣ cổ tử cung trên thế giới và Việt Nam

I.2.1 Tình hình ung thƣ cổ tử cung trên thế giới

Hình I 2 Số bệnh nhân nhiễm và tử vong do ung thƣ cổ tử cung gây ra trên

Thế giới (WHO, 2012)

Ung thư cổ tử cung là nguyên nhân thứ 2 trong các bệnh ung thư ở phụ nữ gây

tử vong trên thế giới và có 500.000 người bệnh mới được chẩn đoán trên thế giới [62] Ở Mỹ, có khoảng 128.000 người bệnh ung thư mới phát hiện mỗi năm và 4.600 người phụ nữ chết trong năm 2000 Theo Iida M và cộng sự (2014) cho thấy rằng ở Nhật Bản, các giai đoạn ung thư cổ tử cung sớm gia tăng ở các độ tuổi của người phụ nữ (20-40 tuổi), chẩn đoán và điều trị ở các bệnh nhân này thì rất quan trọng [62]

SVTH: Nguyễn Tấn Liêm Trang 6

Theo WHO 2002, ung thư cổ tử cung là loại ung thư tử vong đứng thứ hai trên thế giới ước tính khoảng 493.243 phụ nữ được chẩn đoán mắc bệnh ung thư cổ tử cung và 273.505 người chết vì ung thư cổ tử cung mỗi năm (WHO, 2002)

Ước tính có khoảng 1,4.106 người phụ nữ trên thế giới đang sống với ung thư

cổ tử cung và ở Ấn Độ có khoảng một phần tư trong tổng số được báo cáo gần đây

có 132.000 người nhiễm bệnh (ACCP, 2004)

Theo WHO 2012, thế giới có 528.000 bệnh nhân mới phát hiện bị ung thư cổ

tử cung, 266.000 người tử vong trên thế giới, chiếm 12% trong các bệnh ung thư ở phụ nữ trên thế giới Ung thư cổ tử cung là một loại bệnh phổ biến nhất ở phụ nữ miền Đông và miền Trung của Châu phi, chiếm tần số gây bệnh cao trên Thế Giới

độ tuổi từ 15 đến 44 tuổi (WHO, 2012)

I.2.2 Tình hình ung thƣ cổ tử cung ở Việt Nam

Tại Việt Nam, ước tính cứ 100.000 phụ nữ thì có khoảng 20 trường hợp mắc bệnh và 11 trường hợp tử vong Trong năm 2010, có 5.664 phụ nữ mắc ung thư cổ

tử cung, tỷ lệ mắc là 13,6/100.000 phụ nữ Một trong những lý do dẫn đến tình trạng này là phụ nữ chưa được sàng lọc định kỳ và có hệ thống để phát hiện sớm ung thư qua các xét nghiệm thích hợp, dễ tiếp cận [155, 157] Theo WHO 2012, Việt Nam có 5.146 người mới phát hiện bệnh ung thư cổ tử cung và 2.423 người tử vong (WHO, 2012)

I.3 Tổng quan về Epigenetics và sự methyl hóa

I.3.1 Epigenetics

Thuật ngữ Epigenetics được Waddington C H định nghĩa vào năm 1940, là quá trình thay đổi cơ chế di truyền trong sự biểu hiện của gen mà không có sự thay đổi trình tự nucleotide [132] Epigenetics gồm có sự methyl hóa DNA, sự biến đổi các histone và các microRNA [19] Sự biến đổi Epigenetics liên quan đến sự biểu hiện gen thông qua những cơ chế riêng biệt ảnh hưởng đến sự ổn định, gấp cuộn, định vị và tổ chức của DNA [66]

SVTH: Nguyễn Tấn Liêm Trang 7

Hình I 3 Các quá trình biến đổi Epigenetics [157]

I.3.2 Sự methyl hóa DNA

Sự methyl hóa DNA có tính chất di truyền phân tử, là quá trình gắn nhóm CH3 vào vị trí cytosine liên kết phosphodiester với guanine [92] Sự methyl hóa

DNA được xúc tác bởi nhóm enzyme DNA methyltransferase (DNMT), chuyển

nhóm methyl từ S-adenyl methione (SAM) vào đầu cacbon số 5 của cytosine để hình 5mC [68, 99, 133] Họ DNA methyltransferase (DNMT) gồm có DNMT3a, DNMT3b và DNMT1 [99, 133] Ở các loài động vật có vú, sự methyl hóa DNA xảy

ra tại các vị trí CpG [92]

Hình I 4 Quá trình methyl hóa DNA [99]

SVTH: Nguyễn Tấn Liêm Trang 8

Hình I 5 Quá trình methyl hóa [99]

Chú thích: DNA methyltransferase: DNMT 3a, DNMT3b và DNMT1

I.3.3 Đảo CpG

CpG là cặp dinucleotide gồm có cytosine liên kết phosphodiester với guanine (CpG, trong đó "p" chỉ ra sự liên kết posphodiester giữa nucleotide cytosine và

guanine), tập trung trong các đảo CpG [92, 99]

Đảo CpG là các chuỗi DNA có chiều dài 0,5 kilobase đến một vài kilobase,

%GC chiếm hơn 50% thành phần nucleotide [15, 92] Các đảo CpG thường được tìm thấy ở vùng 5’-promoter kéo dài đến exon đầu tiên của nhiều gen giữ nhà (house-keeping gene) và gen đặc trưng cho mô (tissue-specific genes) [92] Có khoảng 70% các promoter thuộc gen của sinh vật Eukaryote có sự hiện diện của các đảo CpG [99, 120] Đặc biệt là các đảo CpG liên kết với các vùng promoter của gen người và chuột có trình tự bảo tồn cao Các đảo CpG được bảo tồn trong suốt quá trình tiến hóa nhằm giúp vùng promoter của gen biểu hiện cơ chế điều hòa cấu trúc nhiễm sắc thể và các yếu tố liên kết phiên mã [66, 99]

Sự methyl hóa của các đảo CpG giúp điều hòa sự biểu hiện gen trong suốt các quá trình phát triển và biệt hóa [49, 93, 98, 122, 134] Ở tế bào lành, sự methyl hóa DNA bình thường diễn ra tại các đảo CpG thuộc vùng promoter của các gen đè nén khối u, gen điều hòa chu trình tế bào và chương trình chết tế bào [133] Tuy nhiên khi có sự methyl hóa bất thường, bao gồm methyl hóa vượt mức (hypermethylation)

SVTH: Nguyễn Tấn Liêm Trang 9

xảy ra trên nhóm gen đè nén khối u, làm chức năng các gen có lợi này bị bất hoạt hay giải methyl hóa vượt mức (hypomethylation) xảy ra trên nhóm oncogene, kích hoạt chức năng các gen bất lợi, là các cơ chế chính gây ung thư đã được ghi nhận [133, 140]

Sự methyl hóa DNA vượt mức trên các đảo CpG của các vùng promoter gen

ức chế khối u đều dẫn đến sự biến đổi DNA trong suốt quá trình phát triển của tế bào ung thư [68]

Hypermethylation: tính chất methyl hóa DNA vượt mức của các đảo CpG trong vùng promoter và hypomethylation tính chất giải methyl hóa DNA vượt mức trên cả bộ gen người thông qua quá trình giảm số lượng các cặp dinucleotide CpG

bị methyl hóa trong các vùng trình tự lặp lại và các vùng trình tự chèn, được chia thành ba dạng khác nhau: dạng A, B, C (Hình I 6) [75]

Hình I 6 Methyl hóa DNA trong tế bào bình thường và tế bào ung thư [75]

SVTH: Nguyễn Tấn Liêm Trang 10

- Dạng C: DNA bộ gen người có tính chất methyl hóa DNA vượt mức tại các vùng promoter và tính chất giải methyl hóa DNA trên cả bộ gen

Sự methyl hóa DNA của các gen gây ung thư có tiềm năng như một dấu chứng sinh học trong việc ứng dụng chẩn đoán lâm sàng như nguy cơ rủi ro, chẩn đoán, phân loại và sự tiến triển của ung thư [89, 96]

Tính chất methyl hóa vượt mức trên vùng promoter của các oncogen MGMT,

RARβ2, RASSF1A, p16INK4A, CCNA, FHIT, p73, HIC-1, CADM1, Htert, DcR1, DcR2, DAPK1, APC, SYK dẫn đến ung thư cổ tử cung [68]

I.3.4 Sự biến đổi Histone

Nucleosome là đơn vị cơ sở cấu tạo nên cấu trúc nhiễm sắc thể, bao gồm các chuỗi DNA được cuộn xung quanh 8 phân tử protein lõi: histone 2H2A, 2H2B, 2H3, 2H4 và 1 phân tử histone nối (H1) [114]

Histone có vai trò đảm bảo ổn định cấu trúc nhiễm sắc thể thông qua các tương tác tĩnh điện và điều hòa sự sao chép, phiên mã Sự biến đổi Histone dẫn đến thay đổi cấu trúc nhiễm sắc thể (giải nén), tác động đến sự biểu hiện gen [149]

Cơ chế biến đổi histone bao gồm sự methyl hóa, acetyl hóa, ubiquitin hóa và

sự phosphoryl hóa histone Các dạng biến đổi này ảnh hưởng đến sự gấp cuộn của các chuỗi DNA cũng như ảnh hưởng đến hoạt động phiên mã [99]

Những sự biến đổi này được thực hiện bởi các enzyme điều hòa histone acetyltransferase (HATs) và deacetylases (HDACs): di chuyển nhóm acetyl, histone methylstranferase (HMTs) và demethyl (HDMs): di chuyển nhóm methyl [114]

Trong suốt quá trình sinh ung, các tế bào có thể chịu sự biến đổi histone làm thay đổi khả năng nhận biết trình tự mạch khuôn của các yếu tố phiên mã, chính vì thế dẫn đến sự biểu hiện hoặc im lặng bất thường của gen [149]

SVTH: Nguyễn Tấn Liêm Trang 11

microRNA tương tác với trình tự mRNA (RNA thông tin), mRNA thường ở vùng 3’ không dịch mã (Untranslation), làm ngăn cản quá trình dịch mã, có thể làm thoái hóa, dẫn đến sự im lặng bất thường của gen [29, 66]

I.4 Gen DAPK (Death-associated protein kinase)

I.4.1 Định nghĩa

Gen DAPK nằm trên nhiễm sắc thể số 9 (9q21.33), có kích thước là 211.407

bp (Gencard)

Hình I 7 Định vị của gen DAPK trên nhiễm sắc thể số 9

Gen DAPK mã hóa protein ức chế quá trình tạo u và sự di căn, được điều hòa

bởi Ca2+/calmodulin, có chức năng tín hiệu trung gian trong kiểm soát sự chết theo chương trình (apoptosis) của tế bào [70]

Sự methyl hóa vượt mức ở các đảo CpG trên gen DAPK dẫn đến ức chế biểu

hiện của protein DAPK là nguyên nhân dẫn đến sự hình thành và diễn tiến của quá

trình sinh ung và di căn [70] Sự bất hoạt của gen DAPK dẫn đến sự bất hoạt của protein DAPK làm giảm đi sự cảm ứng của p19ARF/p53, kết quả dẫn đến sự bất hoạt chương trình chết của tế bào phụ thuộc p53 [128]

I.4.2 Cơ chế hoạt động và chức năng của protein DAPK

DAPK (120 kDa) là protein lớn nhất trong họ protein DAPK, được điều hòa bởi Ca2+/Calmodulin [52] Protein DAPK gồm nhiều cấu trúc domain có chức năng khác nhau: kinase, miền chết (death domain) và vùng lặp lại ankyrin gián tiếp tương tác với các protein khác [52]

Protein DAPK là protein thực hiện nhiều chức năng bên trong tế bào: sự chết theo chương trình (Apotosis), sự tự tiêu của tế bào (Autophagy), sự di cư của tế bào, hình thành các bóng màng (membrane blebbing),…[52, 154] Cơ chế chết theo chương trình tế bào và sự tự tiêu của tế bào đóng vai trò quan trọng trong việc ức chế sự hình thành và di căn khối u [52] Protein DAPK có vai trò kích thích sự khởi

SVTH: Nguyễn Tấn Liêm Trang 12

đầu của một số cytokines (INFγ, TNFα, Fas, ), sự bong tróc của các chất nền bên trong tế bào, các oncogen [33]

Trong tế bào bình thường, sự phosphoryl hóa protein ERK2 dẫn đến sự tăng hoạt động của protein DAPK và làm tăng hoạt tính thúc đẩy chương trình chết của

tế bào [52] Protein DAPK thúc đẩy sự giữ protein ERK1/2 trong tế bào chất, gây trở ngại hoạt động của protein ERK trong nhân, là nhóm Elk-1 Protein có mối quan

hệ trong sự thúc đẩy sự tồn tại và tăng sinh của tế bào [52] Khi protein ERK1/2 tồn tại trong tế bào chất, kích thích sự khởi đầu các tín hiệu chết của tế bào bằng con đường làm tăng nhanh các protein DAPK dẫn đến sự loại trừ các tế bào Các protein ERK2 bị phosphoryl hóa sẽ hoạt động tại bộ máy Golgi, tương tác của protein GAIP với Gα dẫn đến sự tự tiêu của tế bào Các con đường Ras/Raf/ERK thể hiện

sự điều hòa tự tiêu (autophagy) của tế bào thông qua sự điều hòa phosphoryl hóa GAIP Nói tóm lại, sự tồn tại các protein ERK1/2 trong tế bào chất bởi protein DAPK, gây nên sự tự tiêu của tế bào và thúc đẩy hoạt động ức chế khối u của protein DAPK [52]

Bên cạnh đó, protein DAPK sẽ kích thích quá trình phiên mã của các gen p53 trong con đường phụ thuộc vào protein p19ARF ARF làm ổn định các protein p53 bởi sự bất hoạt cơ chế điều hòa âm tính protein Mdm2 [52] Các protein p53 ổn định sẽ kích thích sự chết theo chương trình tế bào (Apotosis) hoặc gây ra sự tự tiêu

(Autophagy) thông qua sự ức chế các hoạt động của protein mTor trong con đường phụ thuộc phức hợp AMPK và TSC1/2 [52]

Các oncogen như Ras, Myc hoặc E2F-1 có mối quan hệ chặt chẽ với các con

đường chết/suy yếu của tế bào, hình thành nên các điểm kiểm tra (Checkpoint) sự chết hoặc suy yếu của tế bào, phụ thuộc vào các cấp độ điều hòa chống lại sự tăng sinh không kiểm soát của tế bào [52] Protein DAPK đồng biểu biện với các

oncogen như MyC và Ras hoặc E1A và Ras, ức chế hoạt động của các oncogen

trong cơ chế sinh u

SVTH: Nguyễn Tấn Liêm Trang 13

Hình I 8 Con đường chu trình chết của tế bào [52]

I.4.3 Tình hình nghiên cứu sự methyl hóa của gen DAPK trong ung thư

Cohen O và cộng sự (2001) chứng minh rằng sự methyl hóa DNA của gen

DAPK như một tín hiệu liên quan đến cơ chế sinh u và sự phát triển của khối u ác

tính ở người [33]

Narayan G và cộng sự (2003) khảo sát tần suất methyl hóa DNA của vùng

promoter gen DAPK bằng phương pháp MSP của 90 mẫu mô ung thư thân tử cung

của các bệnh nhân ở Colombia, Đức, Tây Ban Nha Kết quả nghiên cứu, xác định được 51,1% (46/90) mẫu ung thư thân cổ tử cung bị methyl hóa DNA trên gen

DAPK [101]

Một công trình nghiên cứu của Dulaimi E và cộng sự (2004) khảo sát tần suất

methyl hóa DNA của vùng promoter gen DAPK bằng phương pháp MSP của 34

mẫu mô ung thư vú thu nhận từ trung tâm ngân hàng khối u ung thư Fox Chase (Fox chase Cancer Center Tumor Bank) Nhóm tác giả xác định được 50% (17/34)

mẫu mô vú bị methyl hóa DNA tại vùng promoter gen DAPK, với tính chất đặc

trưng cho từng loại tế bào khối u, hiện diện trong tất cả các giại đoạn và các cấp độ của ung thư vú [39]

Tiếp theo, công trình nghiên cứu của Li J và cộng sự (2005) khảo sát tần suất

methyl hóa DNA trên vùng promoter gen DAPK bằng phương pháp MSP của 60

SVTH: Nguyễn Tấn Liêm Trang 14

mẫu mô ung thư vòm họng thu nhận từ Đại Học Y Dược Thượng Hải Kết quả nghiên cứu ghi nhận tỉ lệ methyl hóa DNA là 27% (16/60) mẫu mô Từ đó cho thấy

sự methyl hóa DNA trên vùng promoter của gen DAPK xuất hiện phổ biến trong

ung thư vòm họng và ảnh hưởng đến sự tiến triển của ung thư vòm họng [84]

Gozuacik D và cộng sự (2006) chứng minh rằng sự methyl hóa DNA trên

vùng promoter của gen DAPK được tìm thấy nhiều hơn trong 20 loại ung thư: ung

thư bạch huyết, bạch cầu, phổi, vú, ruột kết, tử cung, dạ dày và khối u não,… Kết

quả nghiên cứu cho thấy sự mất đi biểu hiện của gen DAPK trong ung thư được đặc

trưng bởi tính chất methyl hóa DNA bất thường ở các tế bào ung thư, chức năng của

gen DAPK trong cơ chế đè nén u [52]

Liu Y và cộng sự (2007) khảo sát tần suất methyl hóa của vùng promoter gen

DAPK bằng phương pháp MSP của 122 bệnh nhân ung thư phổi ở phía tây của

Pennsyvania Kết quả nghiên cứu ghi nhận được 32,8% (40/122) mẫu mô phổi bị methyl hóa DNA Nhóm tác giả nhận định tỉ lệ mắc bệnh do sự biến đổi của gen

DAPK không có liên quan đến tình trạng hút thuốc của bệnh nhân hay các đột biến

diễn ra ở các gen K-ras, gen p53 và gen EGFR [87]

Zhao X và cộng sự (2008) khảo sát sự methyl hóa bất thường của vùng

promoter gen DAPK bằng phương pháp MSP của 52 mẫu mô ung thư biểu mô cổ tử

cung và 60 mẫu mô có sự tạo u trong biểu mô cổ tử cung của các bệnh nhân ở Đại Học Zhenzhou Nhóm tác giả xác định 65,4% (34/52) mẫu bị methyl hóa DNA trong ung thư biểu mô cổ tử cung, 18,3% (11/60) mẫu bị methyl hóa DNA trong biểu mô cổ tử cung có sự tạo u [152] Sự methyl hóa bất thường của vùng promoter

gen DAPK ở mẫu mô ung thư cổ tử cung cao hơn nhiều so với các mẫu mô có sự

tạo u bên trong biểu mô cổ tử cung Sự methyl hóa DNA trên vùng promoter của

gen DAPK có mối quan hệ nghịch với sự biểu hiện của protein DAPK Sự methyl hóa DNA trên vùng promoter là nguyên nhân dẫn đến sự bất hoạt của gen DAPK,

có mối quan hệ với sự tạo u của ung thư cổ tử cung [152]

Fendri A và cộng sự (2009) khảo sát tần suất methyl hóa DNA trên vùng

promoter của gen DAPK bằng phương pháp MSP của 68 mẫu mô ung thư vòm

họng tại bệnh viện Đại Học Sfax, phía nam của Tunisia Kết quả nghiên cứu xác

SVTH: Nguyễn Tấn Liêm Trang 15

định được 91% (62/68) mẫu mô methyl hóa DNA Đây là kết quả nghiên cứu phản

ánh tính chất methyl hóa DNA vượt mức của vùng promoter trên gen DAPK là chìa

khóa quan trọng dẫn đến cơ chế sinh u, có thể là dấu chứng sinh học trong chẩn đoán bệnh ung thư [46]

Đồng thời vào năm 2010, Wu L và cộng sự đã tiến hành khảo sát tần suất

methyl hóa của vùng promoter gen DAPK bằng phương pháp MSP của 65 mẫu mô

ung thư gan ở các bệnh nhân Hàn Quốc Công trình nghiên cứu xác định được 52% (34/65) mẫu mô bị methyl hóa DNA và nhóm tác giả ghi nhận sự methyl hóa bất

thường tại vùng promter của gen DAPK có thể coi như một dấu chứng sinh học

(biomarker) để chẩn đoán, dự báo trước nguy cơ mắc bệnh ung thư gan [142]

Năm 2014, Xiong J và cộng sự đã chứng minh rằng sự methyl hóa DNA của

vùng promoter gen DAPK có mối quan hệ chặt chẽ với ung thư cổ tử cung Sự methyl hóa vùng promoter của gen DAPK1 được coi như một dấu chứng sinh học

(Biomarker) trong ung thư biểu mô cổ tử cung để chẩn đoán sớm ung thư cổ tử cung [143]

I.5 Gen APC (Adenomatous polyposis coli)

I.5.1 Định nghĩa

Gen APC nằm trên nhiễm sắc thể số 5 (5q21.22), có kích thước là 138.742 bp

(Gencard)

Hình I 9 Định vị của gen APC trên nhiễm sắc thể số 5

Gen APC thuộc họ gen đè nén khối u, mã hóa cho protein APC có nhiều chức

năng tác động đến con đường tín hiệu Wnt/β catein [24, 36, 43 ]

I.5.2 Cơ chế hoạt động và chức năng của protein APC

Protein APC có kích thước 2.843 acid amin, trọng lượng 310 kDa, chứa nhiều vùng domain liên kết với các protein khác giúp protein APC thực hiện nhiều chức năng bên trong tế bào [43] Protein APC còn có các chức năng như hình thành

SVTH: Nguyễn Tấn Liêm Trang 16

khung xương tế bào, di cư tế bào và bám dính thông qua sự tương tác với các protein bộ khung tế bào như tubulin, actin, EB1,…[43]

Protein APC có đặc điểm nổi trội nhất là liên kết với β catein, làm thoái biến các phân tử β catein, có vai trò trong cơ chế điều hòa âm β-catein và con đường tín hiệu Wnt [36, 43] Do protein APC liên kết với β catein và đồng kích hoạt GSK3 (glyocogen synthase kinase 3) nên protein APC được coi là “giàn khuôn” cho sự phosphoryl hóa của β catein [112]

Trong các tế bào bình thường, β catein nội sinh được tìm thấy trong sự kết dính với biểu mô của tế bào, nơi mà nó tương tác với E-cadherin và α catein để giúp

đỡ sự bám dính bên trong tế bào [75]

β-catein mới tổng hợp trong tế bào chất là đích cho sự phân giải bởi: Axin,

protein APC ức chế khối u, protein phosphat 2A, protein kinase GSK3b (Glycogen

synthase Kinase 3) và CK1α (Casein Kinase 1α) [75] Tiếp đó là sự phosphory hóa

β catein với phức hợp, đầu tiên là Ser 45 của CK1α và sau đó là Ser 33, Ser 37 và Thr-41 bởi đích GSK3β, quá trình ubiquintin hóa tại vùng lặp lại chuyển đổi β trong protein ligase ubiquitin E3 (β-TrCP) và sự khử protein bởi proteosome [75]

Các ligand của Wnt tương tác với các phức hợp thụ thể Fzd nằm trên màng gồm 7 đoạn và protein LRP5/6 làm rối loạn cấu trúc phức hợp APC/Axin/GSK3β [75] Phức hợp thụ thể ligand của Wnt có vai trò phosphory hóa domain LRP5/6 bên trong tế bào thông qua sự liên kết hoạt động của CK1α và GSK3β Sự phosphoryl hóa vượt mức của vùng domain LRP5/6 liên kết với Axin dẫn đến phá hủy phức hợp này Hệ quả này là Axin tự do di chuyển tới màng tham gia vào sự thoái biến β catein nhanh chống dừng lại [75] Các LRP ở trạng thái bị bất hoạt (không liên kết với Axin) sau đó sẽ bị giải phosphoryl hóa và bị thoái biến bởi một

cơ chế chưa được biết Vì thế, sự ổn định của β catein bằng con đường tín hiệu Wnt

được thực hiện thông qua sự phân tách phức hợp protein APC/Axin/GSK3β, hay

chính là sự ức chế hoạt động của GSK3β [75]

Con đường tín hiệu Wnt còn phụ thuộc vào các protein Dishevelled (Dsh) trong tế bào chất, tương tự như Axin, được bổ sung tới các thụ thể con đường tín

SVTH: Nguyễn Tấn Liêm Trang 17

hiệu Wnt Hoạt động của Dsh liên kết với Axin, CK1, Par-1 và CK2, cho phép phân tách các thành phần của phức hợp APC/Axin/GSK3β [75]

Đáng chú ý khi xảy ra sự mất chức năng của gen APC kết quả dẫn đến sự tích

lũy β catein, nguyên nhân dẫn đến hoạt động phiên mã vượt mức của các gen đích Wnt thông qua phức hợp β catein/ yếu tố tế bào T (T cell factor) là nguyên nhân

khởi phát quá trình tạo u [36] Mối quan hệ giữa sự bất hoạt gen APC với con

đường tín hiệu Wnt được thể hiện bằng quá trình tích lũy β catein, là một trong những nguyên nhân hình thành ung thư Sự methyl hóa DNA vượt mức được ghi

nhận là sự khởi đầu của quá trình tạo u khi gen APC bất hoạt hoàn toàn [55]

Hình I 10 Con đường điều hòa tín hiệu Wnt trong màng nguyên sinh chất và

các phức hợp trong tế bào chất [75]

I.5.3 Tình hình nghiên cứu sự methyl hóa của gen APC

Esteller M và cộng sự (2000) chứng minh sự methyl hóa DNA vượt mức trên

vùng promoter ở gen APC là cơ chế quan trọng làm suy yếu đi chức năng của gen

APC, đóng vai trò quan trọng trong quá trình sinh ung thư [45] Đồng thời vào năm

2000, Kawakami K và cộng sự đã ghi nhận vùng promoter của gen APC bị methyl

hóa DNA vượt mức là yếu tố chính gây nên ung thư tuyến thực quản, các cấp độ

methyl hóa DNA của gen APC trong huyết tương có tiềm năng như một dấu chứng

sinh học cho quá trình xâm lấn và chẩn đoán ung thư thực quản [73]

Dong S và cộng sự (2001) khảo sát tần xuất methyl hóa DNA trên vùng

promoter ở gen APC bằng phương pháp MSP 53 mẫu mô thân ung thư cổ tử cung

SVTH: Nguyễn Tấn Liêm Trang 18

tại bệnh viện Samsung Cheil Kết quả nghiên cứu xác định 32% (17/53) mẫu mô ung thư thân cổ tử cung bị methyl hóa DNA [38]

Toyooka S và cộng sự (2004) khảo sát tần suất methyl hóa DNA của vùng

promoter ở gen APC bằng phương pháp MSP 351 mẫu mô ung thư phổi ở Nhật

Nhóm tác giả xác định 37% (131/351) mẫu mô ung thư phổi bị methyl hóa DNA [127]

Một công trình nghiên cứu của Nomoto S và cộng sự (2007) khảo sát tần suất

methyl hóa DNA trên vùng promoter ở gen APC bằng phương pháp MSP của 52

mẫu mô ung thư gan của Đại Học Y Dược Nagoya Kết quả nghiên cứu xác định 78,6% (33/42) mẫu mô gan bị methyl hóa DNA [104]

Tiếp theo, công trình nghiên cứu của Yaqinuddin A và cộng sự (2013) khảo

sát tần suất methyl hóa DNA trên vùng promoter ở gen APC bằng phương pháp

MSP của 27 mẫu mô ung thư tuyến tiền liệt ở Pakistani Kết quả nghiên cứu ghi nhận 88,2% (15/27) mẫu mô methyl hóa, sự methyl hóa DNA vượt mức của vùng

promoter gen APC có tần suất methyl hóa cao ở người dân Pakistani, có tiềm năng

như một dấu chứng sinh học (Biomarker) cho việc xác định ung thư tuyến tiền liệt [148] Đồng thời vào năm 2013, Dimberg J và cộng sự (2013) khảo sát tần suất

methyl hóa của vùng promoter gen APC ở 52 mẫu mô ung thư ruột kết ở Thụy

Điển, 59 mẫu mô ung thư ruột kết của bệnh nhân ở Việt Nam Kết quả nghiên cứu xác định 53,8% (28/52) mẫu mô ung thư ruột kết ở Thụy Điển bị methyl hóa DNA, 44,9% (22/49) mẫu mô ung thư ruột kết ở Việt Nam bị methyl hóa DNA Sự methyl

hóa của vùng promoter gen APC được coi như là một công cụ trong chẩn đoán ung

thư ruột kết [36]

Samaei N M và cộng sự (2014) khảo sát tần suất methyl hóa DNA trên vùng

promoter ở gen APC bằng phương pháp MSP của 125 mẫu mô ung thư ruột kết tại

Đại Học Y Dược Golestan Kết quả nghiên cứu ghi nhận 35,2% (44/125) mẫu methyl hóa Tỉ lệ methyl hóa DNA trên vùng promoter của các gen tham gia điều hòa con đường Wnt chiếm tỉ lệ cao trong ung thư ruột kết Sự methyl hóa DNA vượt mức có mối quan hệ với sự tăng biểu hiện của enzyme DNMT1 [116] Đồng thời vào năm 2014, công trình nghiên cứu của Bilgrami S M và cộng sự (2014)

SVTH: Nguyễn Tấn Liêm Trang 19

khảo sát tần suất methyl hóa DNA vượt mức trên vùng promoter ở gen APC bằng

phương pháp MSP ở 76 mẫu mô ung thư bàng quang ở Đại Học Aga Khan Kết quả nghiên cứu xác định 51% (22/43) mẫu mô bàng quang bị methyl hóa DNA cấp độ thấp, 97% (32/33) mẫu mô bàng quang bị methyl hóa ở cấp độ cao Sự methyl hóa

DNA trên vùng promoter ở gen APC có tiềm năng là công cụ đánh giá sự xâm

nhiễm của ung thư bàng quang [14]

I.5.4 Phương pháp nghiên cứu sự methyl hóa

I.5.4.1 Phương pháp MSP (Methylation Specific PCR)

Phân tích chính xác bản đồ về sự methyl hóa DNA ở các đảo CpG là một điều cần thiết để hiểu sâu hơn về các cơ chế sinh học như: các gen dấu vết điều hòa, sự bất hoạt của nhiễm sắc thể X và sự im lặng của các gen ức chế khối u trong các bệnh nhân bị ung thư Herman J và cộng sự (1996) mô tả một phương pháp mới: MSP (Methyltion Specific PCR) đánh giá tình trạng methyl hóa ở các vị trí CpG thuộc đảo CpG [58]

Herman J và cộng sự (1996) đã chứng minh rằng phương pháp MSP có thể dùng để xác định sự thay đổi methyl hóa vượt mức của vùng promoter có mối quan

hệ với sự bất hoạt các gen ức chế khối u trong các loại ung thư ở người [58]

Hình I 11 Nguyên tắc của phản ứng MSP [166]

Chú thích: M: DNA bị methyl hóa, U: DNA không bị methyl hóa

Phương pháp MSP dựa vào sự biến đổi Bisulfite (Bisulfite modification) để làm khác biệt giữa allele bị methyl hóa và allele không có sự methyl hóa tại các đảo CpG và phản ứng PCR (Polymerase chain reaction) khuếch đại đoạn gen mục tiêu

SVTH: Nguyễn Tấn Liêm Trang 20

với các cặp mồi đặc trưng cho allele có sự methyl hóa DNA (Methylated DNA) và allele không bị methyl hóa DNA (Unmethylated DNA) [37]

MSP được sử dụng rộng rãi để nghiên cứu sự methyl hóa DNA tại các đảo CpG Phương pháp MSP có thể thực hiện được ở số lượng DNA nhỏ, có độ nhạy xác định được 1 allele bị methyl hóa trên 1.000 allele không có sự methyl hóa Phương pháp MSP phù hợp với các mẫu DNA thu nhận từ các mẫu mô đúc parafin [37, 58]

I.5.4.2 Phương pháp Nested MSP

Palmisano và cộng sự (2000) đã phát triển kĩ thuật Nested MSP làm tăng tính nhạy của phương pháp MSP khoảng 50 lần Giai đoạn đầu tiên, phản ứng PCR diễn

ra với cặp mồi đặc hiệu cho các trình tự gen đích nhận diện các khuôn DNA sau khi biến đổi bisulfite nhưng không phân biệt sự khác nhau giữa allele có sự methyl hóa

và không có sự methyl hóa Trong giai đoạn tiếp theo, hai phản PCR diễn ra riêng biệt với từng cặp mồi đặc hiệu cho allele bị methyl hóa DNA (Methylated DNA) hoặc allele không bị methyl hóa (Unmethylated DNA) Kết quả phản ứng Nested MSP được phân tích dựa vào kĩ thuật điện di trên gel agarose [37]

Nested MSP được Divine K K và cộng sự (2006) sử dụng rộng rãi trong việc xác định sự methyl hóa của các gen thu nhận từ các mẫu đờm của các bệnh nhân đã được chẩn đoán lâm sàng bị ung thư phổi [37]

SVTH: Nguyễn Tấn Liêm Trang 21

Phần II Vật liệu và phương pháp II.1 Vật liệu

Chúng tôi thu thập và sử dụng bộ mẫu bệnh phẩm Pap’smear (kèm theo các

chỉ tiêu lâm sàng) có tính chất nhiễm virus HVP type nguy cơ cao/ type nguy cơ

thấp được cung cấp bởi phòng khám Âu Lạc (Công Ty Cổ Phần Công nghệ Việt Á)

và Công Ty Cổ Phần Dịch Vụ Phân Tích Di Truyền

II.2 Phương pháp

II.2.1 Khai thác dữ liệu

Chúng tôi tiến hành khai thác dữ liệu trên NCBI sử dụng một số từ khóa như

Epgenetics, DNA methylation, DAPK gene, APC gene, Cervical cancer, cancer,

CpG Island…để tìm hiểu thông tin về sự methyl hóa trên vùng promoter của gen

DAPK, APC và mối tương quan của hiện tượng này với ung thư nói chung, ung thư

cổ tử cung nói riêng trên thế giới

II.2.2 Khảo sát in silico

II.2.2.1 Thu thập trình tự gen mục tiêu, xác định vị trí vùng cần tìm

Chúng tôi thu thập trình tự nucleotide của gen DAPK, APC từ ngân hàng gen

NCBI (National Center Biotechnology International), Genecard

Chúng tôi sử dụng phần mềm trực tuyến Methprimer để xác định vị trí của các

đảo CpG trong vùng promoter của gen DAPK, APC vì đây là vùng cần quan tâm

nhất, trên trang web http://www.urogene.org/methprimer

II.2.2.2 Phương pháp đánh giá, thiết kế mồi

Chúng tôi sử dụng một số công cụ tin sinh học:

Chương trình trực tuyến TFSEARCH www cbrc jb/research/db /TFSEARCH html để xác định vị trí nhận biết của các yếu tố phiên mã trên vùng

promoter gen DAPK, APC

Phần mềm Annhyb phiên bản 4.496: khảo sát khả năng bắt cặp bổ sung, vị trí

bắt cặp và kích thước sản phẩm tạo thành của các mồi trên gen DAPK, APC

SVTH: Nguyễn Tấn Liêm Trang 22

Phần mềm trực tuyến IDT analyzer (www.idtdna.com): phân tích các thông số vật lý của mồi, gồm có: Tm (nhiệt độ nóng chảy), chiều dài, tỷ lệ %GC, khả năng tạo thành cấu trúc thứ cấp của mồi

II.2.3 Khảo sát in vitro

Nội dung nghiên cứu:

Với mục tiêu đánh giá mức độ methyl hóa của đảo CpG trong vùng promoter

của gen DAPK, APC bằng phương pháp MSP, chúng tôi tiến hành nghiên cứu theo

quy trình thực nghiệm sau:

- Tách chiết mẫu DNA từ mẫu bệnh phẩm: mẫu Pap’smear của bệnh nhân ung

thư cổ tử cung được xác định nhiễm virus HPV kiểu type nguy cơ cao/type nguy cơ thấp do công ty cổ phần Công nghệ Việt Á) và Công Ty Cổ Phần

Dịch Vụ Phân Tích Di Truyền

- Biến đổi sodium bisulfite bằng Zymo Research Kit

- Thực hiện quy trình MSP nhằm phát hiện sự methyl hóa trên đảo CpG thuộc

vùng promoter của gen DAPK, APC

- Gửi sản phẩm đại diện của phản ứng MSP để giải trình tự

II.2.3.1 Tách chiết DNA từ mẫu bệnh phẩm Pap’smear

Nguyên tắc:

Chúng tôi sử dụng phương pháp phenol/chloroform để tách chiết DNA Trong

đó, màng tế bào và màng nhân được biến tính bằng chất tẩy mạnh (SDS) kết hợp sử dụng enzyme proteinase Sau đó protein sẽ được biến tính, loại bỏ bằng phenol/chloroform, DNA bộ gen sẽ được tủa với ethanol tuyệt đối trữ lạnh

Thiết bị và hóa chất

- Máy ly tâm lạnh (Hettich)

- Bể ổn nhiệt (Thermo Final Tes

- Phenol

- Chloroform

- NaCl 5M

- Tris HCl 1M (pH=8)

SVTH: Nguyễn Tấn Liêm Trang 23

- Cho mẫu bệnh phẩm vào ống Eppendorf loại 1,5 ml

- Bổ sung một thể tích hỗn hợp dung dịch ly giải (NaCl 5M, Tris HCl 1M (pH=8), dung dịch đệm EDTA 0,5M (pH=8), SDS 10% và nước cất hai lần)

Bổ sung 10 µl protein K (nồng độ 20 mg/ml)

- Trộn đều hỗn hợp ủ 48oC trong 2 giờ, thỉnh thoảng lắc nhẹ

- Bổ sung một thể tích phenol:chloroform (tỷ lệ 1:1) Trộn đều Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 3 phút

- Chuyển phần dịch nổi phía trên sang Eppendorf sạch Lặp lại bước phenol:chloroform, sau đó đem ly tâm như trên thêm một lần, thu phần dịch nổi cho vào một Eppendorf sạch mới

- Thêm một lượng dịch chloroform bằng thể tích dịch nổi thu được Trộn nhẹ

Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 1 phút Chuyển phần dịch nổi phía trên sang ống Eppendorf sạch

- Bổ sung một lượng Amonium acetate NH4OAc 5M và một lượng Ethanol tuyệt đối theo tỷ lệ 0,2:2,5 thể tích dịch nổi

- Trộn đều Để kết tủa DNA -20oC trong 30 phút Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 10 phút, ở 4oC Thu lấy kết tủa, loại bỏ phần dịch nổi

- Bổ sung một thể tích Ethanol 70% trữ lạnh để rửa sạch kết tủa Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 5 phút, ở 4oC

- Thu tủa, lọai bỏ dịch nổi (dung dịch Ethanol)

- Hoà tan kết tủa DNA trong 30-50 µl nước cất hai lần vô trùng Bảo quản DNA

4oC đến -20oC

SVTH: Nguyễn Tấn Liêm Trang 24

II.2.3.2 Xác định nồng độ và độ tinh sạch của DNA sau tách chiết

 Nguyên tắc:

Nồng độ DNA sau tách chiết được kiểm tra bằng máy quang phổ ở bước sóng

260 nm Giá trị mật độ quang OD 260 nm (Optical Density 260 nm) của các mẫu DNA cho phép xác định nồng độ DNA trong dung dịch (với A260nm= 1OD = 50 µg/ml DNA sợi đôi) Độ tinh sạch của DNA được xác định thông qua tỉ số A260nm/A280nm Nếu tỉ số A260nm/A280nm nằm trong khoảng 1,8-2,0 là DNA tinh sạch

II.2.3.3 Biến đổi DNA bằng sodium bisulfite với bộ kit Zymo Research

 Nguyên tắc

Mẫu DNA sau khi được xử lý với hỗn hợp biến đổi sodium bisulfite để chuyển cytosine thành uracil (trừ 5mC) sẽ được cố định trên màng của cột, sau đó muối được rửa sạch và DNA được thu hồi lại

 Thiết bị và hóa chất

- CT conversion reagenet (EZ1)

- M-Dilution buffer (EZ2)

- M-Dissolving buffer (EZ3)

- M-Binding buffer (EZ4)

- M-Wash buffer (EZ5)

- M-Desunlphonation buffer (EZ6)

- M-Elution buffer (EZ7)

 Các bước tiến hành:

SVTH: Nguyễn Tấn Liêm Trang 25

- Chuẩn bị chất biến đổi EZ1: cho 900 μl nước cất 2 lần, 300 μl EZ2, 50 μl EZ3 vào ống CT Conversion Reagent, votex 10 phút

- Lấy 130 μl dung dịch CT Conversion Reagent (EZ1) trên và 20 μl DNA vào eppendorf 250 μl, trộn đều

- Xử lý dung dịch DNA theo chu trình nhiệt: 98OC trong 10 phút, 64OC trong 2,5 giờ, giữ ở nhiệt độ 4OC

- Hút 600 μl EZ4 và dung dịch DNA được xử lý nhiệt vào cột Zymo-spinTMIC (C1), đóng nắp, đảo đều

- Ly tâm 13000 vòng/phút trong 30 giây ở nhiệt độ phòng

- Thêm 100 μl EZ5 vào cột C1, ly tâm 13000 vòng/phút trong 30 giây ở nhiệt