Khảo sát mức độ methyl hóa tại đảo cpg thuộc vùng promoter các GEN ABC và p16IN4α trên nhóm bệnh nhân có nguy cơ ung thư cổ tử cung

Các công bố khoa học ghi nhận tính chất methyl hóa tại các đảo CpG thuộc vùng promoter các gen đè nén u là dấu chứng sinh học tiềm năng trong việc tiên lượng, chẩn đoán các ệnh ung thư,

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Đề tài:

KHẢO SÁT MỨC ĐỘ METHYL HÓA TẠI ĐẢO CpG

TRÊN NHÓM BỆNH NHÂN CÓ NGUY CƠ

UNG THƯ CỔ TỬ CUNG

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

CHUYÊN NGÀNH: VI SINH – SHPT

GVHD: PGS.TS LÊ HUYỀN ÁI THÚY

ThS TRƯƠNG KIM PHƯỢNG SVTH: Nguyễn Thị Anh Đào

MSSV: 1153010160 Khóa: 2011 – 2015

Tp Hồ Chí Minh, tháng 5 năm 2015

GVHD ký xác nhận

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Đề tài:

KHẢO SÁT MỨC ĐỘ METHYL HÓA TẠI ĐẢO CpG

TRÊN NHÓM BỆNH NHÂN CÓ NGUY CƠ

UNG THƯ CỔ TỬ CUNG

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

CHUYÊN NGÀNH: VI SINH – SHPT

GVHD: PGS.TS LÊ HUYỀN ÁI THÚY

ThS TRƯƠNG KIM PHƯỢNG SVTH: Nguyễn Thị Anh Đào

MSSV: 1153010160 Khóa: 2011 – 2015

Tp Hồ Chí Minh, tháng 5 năm 2015

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành đề tài này, em xin gửi lời cảm ơn đến các quý thầy, cô khoa Công Nghệ Sinh Học, trường Đại Học Mở thành phố Hồ Chí Minh đã giảng dạy và truyền đạt kiến thức cơ bản để giúp em làm cơ sở cho chuyên đề khóa luận tốt nghiệp này

Em xin gửi lòng biết ơn chân thành và sâu sắc đến Cô Lê Huyền Ái Thúy và Cô

Trương Kim Phượng đã tận tình hướng dẫn, truyền đạt những kiến thức và kinh

nghiệm quý báu, tạo mọi điều kiện thuận lợi để em hoàn thành tốt đề tài này

Bên cạnh đó, tôi xin cảm ơn các bạn của tôi, các bạn sinh viên phòng thí nghiệm sinh học phân tử đã quan tâm giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài

Cuối cùng con xin cảm ơn Ba, Mẹ, cảm ơn gia đình đã luôn bên con, tạo mọi điều kiện

tốt nhất để con hoàn thành việc học của mình

Em xin gửi lời chúc sức khỏe đến tất cả người thầy, người cô đáng kính khoa Công nghệ sinh học, Trường Đại Học Mở Tp Hồ Chí Minh, xin chúc thầy cô ngày càng gặt hái được nhiều thành công trong công việc

Tôi xin chúc các bạn của tôi sẽ hoàn thành tốt chuyên đề khóa luận tốt nghiệp của mình và thành công trong cuộc sống

Xin chân thành cảm ơn

Sinh viên thực hiện Nguyễn Thị Anh Đào Tháng 5/2015

MỤC LỤC

DANH MỤC BẢNG vii

DANH MỤC HÌNH viii

PHẦN I TỔNG QUAN 3

I.1 Tổng quan về ung thư 3

I.1.1 Khái niệm ung thư 3

I.1.2 Các yếu tố nguy cơ 3

I.1.3 Phân loại ung thư 4

I.1.4 Ung thư cổ tử cung 4

I.1.5 Tình hình ung thư cổ tử cung trên thế giới 6

I.1.6 Tình hình ung thư cổ tử cung ở Việt Nam 6

I.1.7 Yếu tố nguy cơ dẫn đến ung thư cổ tử cung 7

I.2 Epigenetics 10

I.2.1 Methyl hóa DNA 10

I.3 Tổng quan về gen APC 12

I.3.1 Vị trí, cấu trúc và chức năng của gen APC 12

I.3.2 Các công trình nghiên cứu khoa học về tính chất methyl hóa gen APC 14

I.4 Tổng quan về gen p16 INK4a 15

I.4.1 Vị trí, cấu trúc và chức năng của gen p16 INK4a 15

I.4.2 Tình hình nghiên cứu về gen p16 INK4a 16

I.5 Các phương pháp phân tích sự methyl hóa DNA 17

I.5.1 Phương pháp MSP 17

I.5.2 Phương pháp Nested MSP 19

PHẦN II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20

II.1 Vật liệu 20

II.2 Phương pháp nghiên cứu 20

II.2.1 Khai thác dữ liệu 20

II.2.2 Khảo sát in silico 20

II.2.3 Khảo sát thực nghiệm 21

PHẦN III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 28

III.1 KHAI THÁC DỮ LIỆU VÀ KHẢO SÁT IN SILICO GEN APC 28

III.1.1 Kết quả khai thác dữ liệu 28

III.1.2 Kết quả khảo sát in silico gen APC 34

III.1.2.1 Thu thập trình tự gen 34

III.1.2.2 Thu thập bộ mồi cho phản ứng MSP 35

III.1.3 Đánh giá các thông số vật lý của mồi 36

III.2 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU GEN p16 INK4a 42

III.2.1 Kết quả khai thác dữ liệu 42

III.2.2 Kết quả khảo sát in silico gen p16 INK4a 47

III.2.2.1 Thu thập trình tự gen 47

III.2.2.2 Thu thập bộ mồi cho phản ứng MSP 48

III.2.2.3 Đánh giá các thông số vật lý của mồi 49

III.3 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU THỰC NGHIỆM 54

III.3.1 Thực hiện phản ứng MSP trên gen APC và p16 INK4a 54

III.3.2 Giải trình tự mẫu đại diện: 60

PHẦN IV KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 62

IV.1 KẾT LUẬN 62

IV.2 ĐỀ NGHỊ 63

TÀI LIỆU THAM KHẢO 64

PHỤ LỤC 79

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

APC Adenomatous polyposis Coli

SAM S-denosylmethionine

SIL squamous intraepithelial lesion

DANH MỤC BẢNG

Bảng II 1 Thành phần phản ứng PCR 25

Bảng III 1.Tần số methyl hóa gen APC trong các loại ung thư 28

Bảng III 2 Tần suất methyl hóa gen APC ở các giai đoạn khác nhau trong UTCTC và phương pháp xác định 33

Bảng III 3 Bộ mồi cho phản ứng MSP đối với gen APC 36

Bảng III 4 Kết quả khảo sát mồi MSP đối với gen APC 37

Bảng III 5 Tần xuất methyl hóa gen p16 INK4a trong các loại ung thư 43

Bảng III 6.Tần suất methyl hóa gen p16 INK4a ở các giai đoạn khác nhau trong UTCTC và phương pháp xác định 46

Bảng III 7 Bộ mồi cho phản ứng MSP đối với gen p16 INK4a 48

Bảng III 8 Kết quả khảo sát mồi MSP đối với gen p16 INK4a 50

Bảng III 9 Kết quả khảo sát sự methyl hóa đảo CpG trên vùng promoter gen APC 56

Bảng III 10 Kết quả khảo sát sự methyl hóa đảo CpG trên vùng promoter gen p16 INK4a 58

Bảng III 11 Tính chất methyl hóa trên gen p16 INK4a trong trên bộ mẫu bệnh phẩm nhiễm/không nhiễm HPV 59

DANH MỤC HÌNH

Hình I 1 Diễn tiến của quá trình sinh ung 3

Hình I 2 Các giai đoạn phát triển của UTCTC 5

Hình I 3 Tỷ lệ mắc bệnh ung thư cổ tử cung ở nữ giới trên thế giới 6

Hình I 4 Tỷ lệ mắc bệnh ung thư cổ tử cung ở nữ giới tại Việt Nam 7

Hình I 5 Cơ chế hoạt động của oncoprotein E6 và E7 9

Hình I 6 Các cơ chế epigenetic 10

Hình I 7 Các con đường methyl hóa DNA 11

Hình I 9 Vị trí gen APC (GeneCard) 12

Hình I 8 Sự methyl hóa trong tế ào ình thường và tế ào ung thư 12

Hình I 10 Con đường tín hiệu Wnt 13

Hình I 11 Vị trí gen p16 INK4a(GeneCard) 15

Hình I 12 Vai trò của protein p16 INK4a trong chu kỳ tế bào 16

Hình I 13 Cơ chế chuyển đổi nucleotide từ cytosine thành uracil nhờ vào xử lý với sodium bisulfite 18

Hình I 14 Minh họa phương pháp MSP 18

Hình I 15 Minh họa phương pháp Nested MSP 19

Hình II 1 Chu kỳ nhiệt biến đổi bisufite 24

Hình II 2 Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR 26

Hình III 1 Đồ thị mô tả tỉ lệ methyl hóa có trọng số trên vùng promoter gen APC trong các loại ung thư 30

Hình III 2 Đồ thị mô tả các loại mẫu được sử dụng để khảo sát mức độ methyl hóa trên trên vùng promoter gen APC 31

Hình III 3 Đồ thị mô tả các phương pháp sinh học phân tử được sử dụng để khảo sát mức độ methyl hóa trên vùng promoter gen APC 32

Hình III 4 Định vị gen APC trên NST số 9 (NCBI) 35

Hình III 5 Định vị đảo CpG trên vùng promoter của gen APC (Methprimer) 35

Hình III 6 Kết quả Annhyb cặp mồi APC_MF – APC_MR trên vùng promoter của

gen APC 39 Hình III 7 Kết quả Annhyb cặp mồi UR-UF trên vùng promoter của gen APC 40 Hình III 8 Cấu trúc vùng promoter gen APC 41 Hình III 9 Vị trí nhận biết của một số nhân tố phiên mã trên đảo CpG của gen APC 41

trong các loại ung thư 44 Hình III 11 Đồ thị mô tả các phương pháp sinh học phân tử được sử dụng để khảo sát

mức độ methyl hóa trên vùng promoter gen p16 INK4a 44 Hình III 12 Đồ thị mô tả các loại mẫu được sử dụng để khảo sát mức độ methyl hóa

trên vùng promoter gen p16 INK4 45

Hình III 13 Định vị gen p16 INK4a trên NST số 9 (NCBI) 47

Hình III 17 Cấu trúc vùng promoter gen p16 INK4a 53 Hình III 18 Vị trí nhận biết của một số nhân tố phiên mã trên đảo CpG3 của gen

ĐẶT VẤN ĐỀ

Theo báo cáo của tổ chức Y Tế Thế giới (WHO, World Health Organization) ung thư cổ tử cung là loại ung thư phổ biến thứ hai gây tử vong ở phụ nữ trên toàn thế giới (WHO, 2006) Năm 2012, có khoảng 530.000 ca mắc ung thư cổ tử cung và có khoảng 260.000 ca tử vong do ung thư cổ tử cung (WHO, 2012) Ở Việt Nam, giai đoạn 2007-2008, tần suất mắc bệnh ung thư cổ tử cung ở miền Bắc và miền Nam là 7,7/100.000 người và 26,8/100.000 người [103]

Các công bố khoa học ghi nhận tính chất methyl hóa tại các đảo CpG thuộc vùng promoter các gen đè nén u là dấu chứng sinh học tiềm năng trong việc tiên lượng, chẩn

đoán các ệnh ung thư, điển hình là bệnh ung thư cổ tử cung (Guo et al., 2012)

Gen APC (Adenomatous Polyposis Coli) thuộc nhóm gen đè nén u, mã hóa cho

protein APC có vai trò ức chế đường truyền tín hiệu Wnt thông qua phosphoryl hóa

β-catein, kiểm soát sự phát triển và phân chia của tế bào (Dimberg et al., 2013) Sự methyl hóa vượt mức trên vùng đảo CpG thuộc promoter gen APC đến bất hoạt chức

năng đè nén u của protein APC, hệ quả là khởi phát và diễn tiến quá trình sinh u

(Hammoud et al., 2013) Công trình nghiên cứu của Reesink-Peters và cộng sự (2004) ghi nhận tính chất methyl hóa bất thường trên gen APC trong các mẫu vệt cạo cổ tử

cung của các bệnh nhân ung thư cổ tử cung là 54%

Gen p16 INK4a (cyclin-dependent kinase inhibitor 4a) thuộc nhóm gen đè nén u,

nằm trên nhiễm sắc thể số 9 (9p21.3), có kích thước là 26.739bp (GenBank) Sự methyl

quả là tế bào tăng sinh không kiểm soát được và hình thành khối u (Szalmás et al.,

2009) Công trình nghiên cứu của Attalebvà cộng sự (2009) ghi nhận tính chất methyl

59,1%

Ở Việt Nam, cho đến thời điểm này có rất ít công trình nghiên cứu về mức độ

methyl hóa trên vùng promoter của gen APC, p16 INK4 trong ung thư cổ tử cung Do

vậy, chúng tôi thực hiện chuyên đề khóa luận tốt nghiệp “Khảo sát mức độ methyl

hóa tại đảo CpG thuộc vùng promoter các gen APC, p16 INK4a trên nhóm bệnh nhân có nguy cơ ung thư cổ tử cung”

Mục tiêu: Xác định tính chất methyl hóa DNA trên vùng promoter gen APC,

p16 INK4 liên quan đến bệnh ung thư cổ tử cung ở Việt Nam, dựa trên bộ mẫu có tính

chất nhiễm HPV type nguy cơ cao/nguy cơ thấp hoặc không nhiễm HPV

Nội dung nghiên cứu bao gồm:

mối tương quan với các loại ung thư, đặc biệt là ung thư cổ tử cung

- Thu thập bộ mồi cho phản ứng Methylation- specific PCR nhằm khảo sát mức

mô, mẫu máu…) của bệnh nhân ung thư cổ tử cung trong thực nghiệm, để hướng đến mục tiêu tìm ra dấu chứng sinh học tiềm năng cho chẩn đoán, tiên lượng bệnh ung thư

cổ tử cung

- Thực hiện quy trình MSP, Nested MSP xác định tính chất methyl hóa ở gen

APC, p16 INK4a trên bộ mẫu bệnh phẩm nhiễm hoặc không nhiễm HPV ở Việt Nam

PHẦN I TỔNG QUAN I.1 Tổng quan về ung thư

I.1.1 Khái niệm ung thư

Ung thư là một thuật ngữ chung mô tả các dạng bệnh lý phản ánh những sự thay đổi về sinh sản, tăng trưởng và chức năng của tế bào, có thể ảnh hưởng đến bất kì phần nào của cơ thể, (WHO, World Health Organization) Ung thư khởi phát từ một tế bào ình thường bị biến đổi qua nhiều giai đoạn, điển hình là sự tổn thương tiền ung thư và hình thành, diễn tiến tạo các khối u Các tế bào phân chia và phát triển không kiểm soát được, hình thành các khối u ác tính, có thể di chuyển và xâm lấn các mô ở gần (xâm lấn cục bộ) hay ở xa (di căn) qua hệ thống bạch huyết hay mạch máu Đối với các bệnh ung thư, sự di căn là nguyên nhân dẫn đến tử vong [115]

Hình I 1 Diễn tiến của quá trình sinh ung [83]

I.1.2 Các yếu tố nguy cơ [115]

Các biến đổi trong ung thư là kết quả của sự tương tác giữa các yếu tố di truyền của một người và các tác nhân bên ngoài, bao gồm:

 Tác nhân hóa học: amiăng, các thành phần của khói thuốc lá, aflatoxin (chất gây nhiễm ẩn thực phẩm) và thạch tín (chất gây nhiễm ẩn nước uống)

I.1.3 Phân loại ung thư [116]

hay phủ các cơ quan bên trong

 Ung thư mô liên kết (sarcoma): ung thư khởi phát trong xương, sụn, mỡ, cơ, mạch máu hay các mô liên kết khác

máu như tủy xương và sản xuất ra một số lượng lớn các tế bào máu ất thường tiến vào dòng máu

của hệ thống miễn dịch

sống

I.1.4 Ung thư cổ tử cung [109]

Ung thư cổ tử cung là ung thư ác tính, hình thành trong các mô cổ tử cung (cơ quan kết nối tử cung và âm đạo) Tiến trình hình thành và diễn tiến ung thư cổ tử cung trải qua một khoảng thời gian dài, các tế bào biểu mô cổ tử cung bị biến đổi, chuyển từ trạng thái tiền sinh ung trở thành ung thư Các dạng biến đổi gồm có: tân sinh trong biểu mô cổ tử cung (cervical intraepithelial neoplasia, CIN), tổn thương iểu mô vảy (squamous intraepithelial lesion, SIL) [114]

Các loại ung thư cổ tử cung: ung thư tế bào biểu mô vảy (Squamous cell carcinoma) và ung thư mô tuyến (Adeno carcinoma) [111] Ung thư iểu mô tế bào vảy phổ biến nhất, chiếm khoảng 80- 85% trong tất cả các loại ung thư cổ tử cung [109]

 Các giai đoạn phát triển của ung thư cổ tử cung

- Giai đoạn 0 (tiền ung thư):

Trong giai đoạn này, sự biến đổi sinh học bất thường diễn ra (loạn sản) ở các lớp

tế bào lót cổ tử cung, giai đoạn này được gọi là CIN Dựa vào phương pháp quan sát dưới kính hiển vi, CIN được chia thành các cấp độ:

- Giai đoạn 3: các tế ào ung thư di chuyển, xâm nhập vào phần dưới của âm đạo và/hoặc các mô dọc theo xương chậu

- Giai đoạn 4: các tế ào ung thư đã di căn đến các cơ quan khác, di chuyển và xâm nhập vào hệ ruột, bàng quang hoặc các cơ quan khác (phổi, gan)

Hình I 2 Các giai đoạn phát triển của UTCTC [106]

I.1.5 Tình hình ung thư cổ tử cung trên thế giới

Theo số liệu thống kê của Globocan 2012, ung thư cổ tử cung là loại ung thư phổ biến thứ tư ở phụ nữ trên toàn thế giới, ước tính có khoảng 528.000 trường hợp mới mắc bệnh và 266.000 trường hợp tử vong do ung thư cổ tử cung, chiếm 7,5% số ca tử vong do ung thư ở phụ nữ Trong đó, khoảng 87% trường hợp tử vong do ung thư cổ tử cung xảy ra ở các khu vực chưa phát triển [105]

I.1.6 Tình hình ung thư cổ tử cung ở Việt Nam

Theo Globocan 2012, ở Việt Nam ung thư cổ tử cung là một trong năm loại ung

thư phổ iến ở phụ nữ: vú, phổi, gan, cổ tử cung, dạ dày Ước tính có khoảng 5.146 trường hợp mắc ung thư cổ tử cung, chiếm khoảng 9,4% trong tất cả các loại ung thư ở

phụ nữ [113]

Hình I 3 Tỷ lệ mắc bệnh ung thư cổ tử cung ở nữ giới trên thế giới

(Globocan, 2012) [105]

Ở miền Bắc Việt nam, tỷ lệ mắc ung thư cổ tử cung là 7,7/100.000 người, đứng hàng thứ ba và chiếm 6% trong các loại ung thư ở nữ giới sau ung thư vú và dạ dày Ở miền Nam, tỷ lệ này lên tới 26,8/100.000 người, đứng đầu và chiếm hơn 20% các ung thư ở nữ [103]

I.1.7 Yếu tố nguy cơ dẫn đến ung thư cổ tử cung

I.2.4.1 Hút thuốc lá

Hút thuốc gắn liền với sự phát triển các tổn thương tiền ung thư cũng như UTCTC Những chất có hại trong khói thuốc lá được hấp thu qua phổi và theo máu đi

khắp cơ thể (Szarewski et al., 1998)

Phụ nữ hút thuốc lá có nguy cơ ị ung thư cổ tử cung gấp ít nhất 2 lần so với phụ

nữ không hút thuốc (Szarewski et al., 1998) Các sản phẩm phụ của thuốc lá đã được

tìm thấy trong dịch chất nhày cổ tử cung của các phụ nữ hút thuốc Các nhà nghiên cứu ghi nhận rằng các thành phần trong khói thuốc lá làm suy giảm hệ miễn dịch, gây tổn hại đến DNA bộ gen và góp phần vào sự phát triển của ung thư cổ tử cung [112]

I.2.4.2 Mang thai nhiều lần và sử dụng thuốc tránh thai

Phụ nữ đã a, ốn lần sinh con lần lượt có nguy cơ mắc ung thư cổ tử cung cao

gấp 2,6 lần, 3,8 lần so với các phụ nữ chưa sinh con (Muñoz et al., 2002)

Hình I 4 Tỷ lệ mắc bệnh ung thư cổ tử cung ở nữ giới tại Việt Nam

(Globocan, 2012) [105]

Hơn nữa, việc sử dụng lâu dài thuốc tránh thai cũng là yếu tố làm tăng nguy cơ UTCTC ở phụ nữ, có thể tăng gấp ốn lần so với phụ nữ không sử dụng thuốc tránh

thai (Moreno et al., 2002)

I.2.4.3 Virus HPV

HPV là virus gây u nhú ở người, lan truyền chủ yếu thông qua đường tình dục và

có phạm vi hoạt động rộng (Colón-Lópezet al., 2010) Sự xâm nhiễm mãn tính của

HPV là yếu tố chính gây ra ung thư cổ tử cung (Castellsague, 2008) Có hơn 100 type HPV khác nhau, trong đó, khoảng 40 type HPV xâm nhiễm, tác động đến cơ quan sinh

dục Các type HPV được phân loại thành 2 nhóm dựa trên mức độ nguy cơ gây ung

thư: (1) nhóm nguy cơ cao (có khả năng tích hợp DNA vào bộ gen của tế ào người,

làm rối loạn sinh sản ác tính, tạo ra ung thư) là HPV 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52,

56, 58, 59, 68, 82, (2) nhóm nguy cơ thấp (bộ gen tồn tại độc lập với tế bào chủ,

thường chỉ gây ra các u lành biểu mô: u nhú gai, mụn cóc ) là HPV 6, 11, 40, 42, 43,

44, 54, 61, 72, 73, 81 (Trung et al., 2008) Nhiễm HPV type 16, HPV type 18 gây ra khoảng 70% trong tất cả các trường hợp ung thư cổ tử cung (Munoz et al., 2003) HPV type 16 thường được tìm thấy trong ung thư iểu mô tế bào vảy và HPV type 18 thường được tìm thấy trong ung thư tuyến (Altekruse et al., 2003)

 Cơ chế gây ung thư của HPV

Sau khi xâm nhập vào tế bào, các oncogen E6, E7 của virus HPV thuộc type nguy

cơ cao (đặc biệt là HPV 16, 18) gắn chèn vào bộ gen tế bào chủ và biểu hiện dựa vào

bộ máy phiên mã, dịch mã của tế bào chủ Oncoprotein E6, E7 ức chế hoạt động đè nén

u và kiểm soát sự phân bào của protein p53 (tumor suppressor protein) và Rb

(retinoblastoma) dẫn đến hình thành khối u (Wong et al., 2005) Đây là sự tương tác

giữa các oncogen và gen ức chế khối u dẫn đến rối loạn chức năng sinh lý của các tế

bào: loạn sản, sinh u (Wong et al., 2005)

Protein E6 kiềm hãm hoạt động của protein ức chế khối u p53 theo con đường hình thành phức hợp E6-p53 và enzyme ubiquitin hóa tế bào E6-AP (E6-associate

protein) (Crook et al., 1991) làm suy thoái và phân hủy p53, p53 mất chức năng kiểm

soát chu trình tế bào (tham gia điều khiển điểm dừng “Check point” tại pha G1), sự chết theo chương trình (apoptosis) cũng như cơ chế sửa chữa DNA.Vì vậy, các tế bào

tăng sinh một cách bất thường và hình thành khối u (Wong et al., 2005)

Protein E7 liên kết với protein Rb dẫn đến phá vỡ liên kết giữa protein Rb với yếu

tố phiên mã E2F Khi đó E2F ở trạng thái tự do, tham gia vào cơ chế hoạt hóa quá trình phiên mã các gen điều hòa hoặc có chức năng cho chu trình tế bào chuyển từ pha G1

sang pha S, kích hoạt sự sao chép và phân chia của tế bào (Chellappan et al., 1992)

Hình I 5 Cơ chế hoạt động của oncoprotein E6 và E7 [93]

I.2.1 Methyl hóa DNA

vào car on 5’ của cytosine đứng trước guanines (CpG) tạo thành 5-methylcytosine

(Moore et al., 2012) Methyl hóa DNA được thực hiện bởi họ enzyme DNA

methyltransferases (DNMTs): DNMT1, DNMT3a, DNMT3 Trong đó, DNMT1 là enzyme có trong động vật hữu nhũ có vai trò duy trì sự methyl hóa DNA còn

DNMT3a, DNMT3b có vai trò tạo ra các gốc methyl mới hay de novo methylation (Baylin, 2005; Delpu et al., 2013)

Hình I 6 Các cơ chế epigenetics [59]

Trong DNA của động vật có vú, 5-methylcytosine được tìm thấy trong khoảng 4% DNA của bộ gen, chủ yếu tập trung tại các đảo CpGs (Baylin, 2005)

Trong tế ào ình thường, sự methyl hóa DNA có vai trò điều hòa sự biểu hiện

gen, bất hoạt nhiễm sắc thể X (Herman et al., 2003) Bên cạnh đó, sự methyl hóa DNA giúp im lặng sự biểu hiện các gen của các tác nhân gây bệnh (Jaenisch et al., 2003)

Sự biến đổi chức năng của các enzym DNMTs dẫn đến sự methyl hóa DNA bất thường: sự methyl hóa vượt mức (hypermethylation) hoặc giải methyl hóa (hypomethylation) DNA (Laird, 2005) Giải methyl hóa là cơ chế biến đổi epigenetics

được tìm thấy đầu tiên trong mô ung thư ở người (Feinberg et al., 1983) Giải methyl

hóa có thể dẫn đến sự rối loạn biểu hiện gen, kích hoạt các yếu tố chuyển vị hoặc mất

đi sự in dấu gen (Esteller, 2008) Methyl hóa vượt mức trong vùng promoter có thể

“khóa” trực tiếp các vị trí liên kết của các yếu tố phiên mã, dẫn đến im lặng sự biểu

hiện gen (Robert et al., 2002; Nosho et al., 2009)

Hình I 7 Các con đường methyl hóa DNA [62]

 Đảo CpG

Đảo CpG là các đoạn DNA giàu CpG, có kích thước khoảng 200-1000 nucleotide

(Bird et al, 1985) CpG là cặp dinucleotide được hình thành bởi cytosine tạo liên kết

phosphodiester với guanine (Millis, 2011).Trong bộ gen người, khoảng 60% vùng promoter có chứa đảo CpG, tập trung tại các vị trí nhận biết của các yếu tố phiên mã

(Guo et al., 2012)

I.3 Tổng quan về gen APC

I.3.1 Vị trí, cấu trúc và chức năng của gen APC

Gen APC (Adenomatous polyposis coli) nằm trên nhiễm sắc thể số 5 (5q21.22), định vị ở nucleotide 112.707.505 đến 112.846.239 Gen APC có kích thước là 138.734

bp (GenBank)

Hình I 9 Vị trí gen APC (GeneCard)

Hình I 8 ự methyl hóa trong tế ào lành và tế ào ung thư [ 8 ]

Gen APC là gen ức chế khối u được Kinzler và cộng sự, Nishisho và cộng sự phát hiện năm 1991 Gen APC có mối liên quan đến bệnh u tuyến polyp mang tính chất di

truyền FAP (familial adenomatous polyposis), là một dạng rối loạn di truyền đặc trưng

cho ung thư đại trực tràng Gen APC mã hóa protein APC (300 kDa), là chất đối kháng của đường truyền tín hiệu Wnt/β-catein (Chen et al., 2005)

Con đường tín hiệu Wnt/β-catein đóng vai trò trong cơ chế kích hoạt sự tăng sinh

và phát triển của tế bào, thông qua hoạt động của β-catein kích thích quá trình phiên

mã của gen (Clevers et al., 2012) Khi có tín hiệu Wnt, β-catein sẽ di chuyển vào trong

nhân, kết hợp với nhân tố phiên mã TCF (T cell factor) để kích hoạt sự phiên mã các gen có vai trò trong chu trình tế bào (Clevers H., 2006) Con đường truyền tín hiệu Wnt diễn ra liên tục sẽ dẫn đến tế ào tăng sinh không kiểm soát, gây ra nhiều loại loại ung

thư ở người như: đại trực tràng, gan, cổ tử cung, buồng trứng (Behrenset al., 1996)

Protein APC có vai trò “gác cổng” cho tế bào, ức chế hoạt động của β-catein

trong chu trình tế bào, kiểm soát sự tăng sinh của tế bào (Kim et al., 2007) Protein

APC hoạt động thông qua sự tương tác với các protein Axin, GSK3b (Glycogen synthase Kinase 3 ), CK1γ (casein kinase I-γ) tạo phức hợp gây phosphryl hóa β-catein, dẫn đến sự thoái biến β-catein trong proteasome Khi vắng mặt β-catein, các Groucho sẽ gắn kết với nhân tố phiên mã TCF, ức chế sự phiên mã của các gen mục tiêu của tín hiệu Wnt (Clevers H., 2006)

Hình I 10 Con đường tín hiệu Wnt [20]

I.3.2 Các công trình nghiên cứu khoa học về tính chất methyl hóa gen

APC

Các công bố điển hình của Esteller và cộng sự (2000), Clément và cộng sự

(2004) ghi nhận rằng sự methyl hóa vượt mức trên vùng promoter của gen APC có liên

quan đến nhiều loại ung thư phổ biến ở người như: đại trực tràng, dạ dày , gan ,tuyến tụy Công trình nghiên cứu của Kawakami và cộng sự (2000) ghi nhận tính chất methyl

hóa trên gen APC xảy ra trong quá trình hình thành và phát triển của ung thư vòm

họng

Năm 2001, Virmani và cộng sự xác định mức độ methyl hóa trên vùng promoter

của gen APC là 44% đối với các mẫu mô trữ lạnh của bệnh nhân ung thư vú, 53% đối

với các mẫu mô trữ lạnh của bệnh nhân ung thư phổi Nhóm tác giả ghi nhận rằng

methyl hóa bất thường trên vùng promoter của gen APC có liên quan đến một vài loại

ung thư ở người (đại trực tràng, dạ dày)

Công trình nghiên cứu của Henrique và cộng sự (2007) xác định sự methyl hóa

trên vùng promoter của gen APC là dấu chứng sinh học tiềm năng để chẩn đoán ung

thư đại trực tràng

Công trình nghiên cứu của Lof-Ohlin và cộng sự (2011) chứng minh tính chất

methyl hóa bất thường trên vùng promoter của gen APC là dấu chứng sinh học cho

việc tiên lượng nguy cơ mắc bệnh ung thư cổ tử cung

Một nghiên cứu của Eissa và cộng sự (2011) xác định methyl hóa trên gen APC là

dấu chứng sinh học để chẩn đoán và phát hiện sớm ung thư àng quang

I.4 Tổng quan về gen p16INK4a

I.4.1 Vị trí, cấu trúc và chức năng của gen p16 INK4a

là 26.739bp (GenBank)

Hình I 11 Vị trí gen p16 INK4a(GeneCard)

chu trình tế bào bằng cách ức chế phức hợp Cyclin D-CDK4/6 (cyclin dependent

kinase), chuyển tế bào vào trạng thái dừng ở pha G1(Kim et al., 2005)

Phức hợp cyclin D-CDK4/6 có chức năng phosphoryl hóa vượt mức protein pRb, kết quả là pRb bị bất hoạt chức năng và giải phóng yếu tố phiên mã E2F Khi đó, E2F kích hoạt sự phiên mã các gen tham gia trong quá trình phân bào, thúc đẩy chu trình

tế bào vượt qua điểm kiểm soát G1/S, ước vào pha S, diễn ra sự tăng sinh và phân ào

(Ortega et al., 2002)

Hệ quả là quá trình phosphoryl hóa pRb không diễn ra, pRb tương tác với yếu tố E2F làm dừng chu trình tế bào tại pha G1, do vậy tế bào bị kìm hãm sự tăng sinh (Serrano

et al., 1997; Canepa et al., 2007)

Hình I 12 Vai trò của protein p16 INK4a trong chu kỳ tế bào [74]

I.4.2 Tình hình nghiên cứu về gen p16 INK4a

các giai đoạn khác nhau của ung thư cổ tử cung Cụ thể, tần suất methyl hóa là 0% ở giai đoạn 0, 25% ở giai đoạn 1, 19% ở giai đoạn 2, 67% ở giai đoạn 3 và 100% ở giai đoạn 4

Tiếp theo, công trình nghiên cứu của Wong và cộng sự (1999) ghi nhận mức độ

của bệnh nhân ung thư cổ tử cung

Năm 2005 Kim và cộng sự ứng dụng phương pháp MSP ghi nhận mức độ methyl

là 61% (25/41) trong các mẫu mô đúc paraffin của các bệnh nhân ung thư cổ tử cung và 0% (0/11) ở các mẫu cổ tử cung ình thường

Công trình nghiên cứu của Kanyama và cộng sự năm 2002 ghi nhận methyl hóa

gan, đầu cổ, cổ tử cung và ung thư phổi không tế bào nhỏ…

Công trình nghiên cứu của Ivanova và cộng sự năm 2007 đã ghi nhận sự methyl

là dấu chứng sinh học trong chẩn đoán ung thư cổ tử cung và xác định mức độ methyl hóa là vượt mức là 23% bằng phương pháp MSP

Một nghiên cứu khác của Attaleb và cộng sự năm 2009 đã chứng minh rằng

tiên lượng và chẩn đoán ung thư cổ tử cung

Năm 2012 Jha và cộng sự ghi nhận mức độ methyl hóa vượt mức trên vùng

lá và sử dụng thuốc tránh thai của các bệnh nhân UTCTC Methyl hóa trên gen

p16 INK4a là dấu chứng sinh học đáng tin cậy trong tiên lượng ung thư cổ tử cung ở dân

cư miền Bắc Ấn Độ

Công trình nghiên cứu của Bhatia và cộng sự năm 2014 xác định mức độ methyl

70% trong các mẫu máu của bệnh nhân tương ứng, trong khi ở các mô ình thường thì mức độ methyl hóa ghi nhận được là 13% và 0% ở các mẫu máu

I.5 Các phương pháp phân tích sự methyl hóa DNA

I.5.1 Phương pháp M P

Phương pháp methylation-specific PCR (MSP) là phương pháp xác định tình trạng methyl hóa trên các đảo CpG của nhiễm sắc thể Phương pháp MSP được mô tả lần đầu tiên bởi Herman và công sự năm 1996 Để tiến hành phản ứng MSP, DNA

được tinh sạch và trải qua biến đổi bằng sodium bisulfite, chuyển tất cả cytosine không

bị methyl hóa thành uracil (Herman et al., 1996)

Các sản phẩm DNA biến đổi này được sử dụng làm bản mẫu cho hai phản ứng PCR riêng biệt, với cặp mồi đặc hiệu cho DNA bị methyl hóa và cặp mồi đặc hiệu cho

DNA không bị methyl hóa (Herman et al., 1996)

Hình I 13 Cơ chế chuyển đổi cytosine thành uracil nhờ vào xử lý với sodium

bisulfite [54]

Hình I 14 Minh họa phương pháp M P [54]

Đối với phương pháp MSP, để phân biệt DNA bị methyl hóa hoặc không bị methyl hóa, trong trình tự mỗi mồi phải có nhiều hơn hai vị trí CpG Kết quả phản ứng

PCR được ghi nhận như sau (Ku et al., 2011):

(1): Phản ứng PCR với cặp mồi methyl hóa âm tính; phản ứng PCR với cặp mồi unmethyl hóa dương tính: ghi nhận DNA không bị methyl hóa

(2): Phản ứng PCR với cặp mồi methyl hóa dương tính; phản ứng PCR với cặp mồi unmethyl hóa dương tính: ghi nhận DNA bị methyl hóa không hoàn toàn

(3): Phản ứng PCR với cặp mồi methyl hóa dương tính; phản ứng PCR với cặp mồi unmethyl hóa âm tính: ghi nhận DNA bị methyl hóa hoàn toàn

I.5.2 Phương pháp Nested MSP

Phương pháp Nested MSP được mô tả lần đầu tiên bởi Palmisano và cộng sự vào năm 2000 Nested MSP là phương pháp có độ nhạy cao được sử dụng để phát hiện tình trạng methyl hóa của các mẫu bệnh phẩm có lượng DNA thấp Nested MSP trải qua hai lần PCR: phản ứng PCR lần một được tiến hành sử dụng cặp mồi khuếch đại DNA

đã iến đổi isulfite nhưng không để phân biệt tình trạng methyl hóa của DNA, phản ứng PCR đầu tiên sử dụng một bộ mồi nằm ngoài được thiết kế trên vùng không chứa CpG (bởi vì cả DNA methyl và không methyl được khuếch đại với chúng) và sản phẩm PCR này được sử dụng làm khuôn cho phản ứng MSP Phản ứng PCR lần 2 được thực

hiện với hai cặp mồi như trong phản ứng MSP thông thường (Palmisano et al., 2000)

Hình I 15 Minh họa phương pháp Nested M P [54]

PHẦN II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

II.1 Vật liệu

Chúng tôi thu thập bộ mẫu bệnh phẩm (Pap’smear) (kèm theo các chỉ tiêu lâm

sàng) có tính chất nhiễm HPV type nguy cơ cao/nguy cơ thấp hoặc không nhiễm HPV

được cung cấp bởi phòng khám Âu Lạc (công ty cổ phần Công nghệ Việt Á) và Công

ty cổ phần dịch vụ Phân Tích Di Truyền

II.2 Phương pháp nghiên cứu

II.2.1 Khai thác dữ liệu

các công trình nghiên cứu về mức độ methyl hóa ở các đảo CpG trên vùng promoter

của gen APC, p16 INK4a đối với ung thư cổ tử cung bằng một số từ khóa như: “APC

II.2.2 Khảo sát in silico

II.2.2.1.Thu thập trình tự gen

II.2.2.2 Thiết kế và đánh giá mồi

Một số công cụ tin sinh học được sử dụng:

MSP, xác định vị trí các đảo CpG trên vùng promoter của gen

nhận biết của các nhân tố phiên mã trên vùng promoter của gen

- IDT analyzer (https://sg.idtdna.com/calc/analyzer): xác định các thông số của mồi như: chiều dài, %GC, nhiệt độ nóng chảy, cấu trúc thứ cấp self dimer, hetero dimer, hairpin-loop

- Annhyb (4.964): kiểm tra vị trí bắt cặp của mồi và kích thước sản phẩm

II.2.3 Khảo sát thực nghiệm

II.2.3.1 Tách chiết DNA

 Nguyên tắc:

Chúng tôi sử dụng phương pháp phenol/chloroform để tách chiết DNA bộ gen người từ các mẫu bệnh phẩm (Pap’smear) Trong đó, màng tế ào và màng nhân được biến tính bằng chất tẩy mạnh (SDS) kết hợp sử dụng enzym proteinase K Sau đó, protein sẽ được biến tính và bị loại bỏ bằng phenol/chloroform DNA bộ gen sẽ được tủa với ethanol tuyệt đối trữ lạnh

− Máy ly tâm lạnh (Hettich)

− Bể ổn nhiệt (Thermo Final Test)

 Các bước tiến hành tách chiết DNA từ các mẫu Pap’smear

− Cho mẫu bệnh phẩm vào ống Eppendorf loại 1,5ml

− Bổ sung một thể tích phù hợp hỗn hợp dung dịch ly giải (NaCl 5M,

cất hai lần) Bổ sung 10µl proteinase K (nồng độ 20 ng/ml)

− Bổ sung một thể tích l phù hợp của dung dịch phenol: chloroform (tỷ lệ 1:1), trộn đều Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 3 phút Chuyển phần dịch

nổi phía trên sang ống eppendorf sạch Lặp lại ước này thêm một lần

− Thêm một lượng dung dịch chloroform bằng thể tích dịch nổi thu được, trộn nhẹ Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 1 phút Chuyển phần dịch nổi

phía trên sang ống eppendorf sạch

Ethanol tuyệt đối theo tỷ lệ 0,2: 2,5 thể tích so với thể tích dịch nổi dịch

nổi

C trong 30 phút Ly tâm 13.000

− Bổ sung một thể tích Ethanol 70% trữ lạnh để rửa sạch kết tủa Ly tâm

− Thu tủa, loại bỏ dịch nổi (dung dịch ethanol) Để khô trong 30 phút

− Hòa tan kết tủa DNA trong 30-50 µl nước cất hai lần vô trùng Bảo quản

II.2.3.2 Kiểm tra chất lượng DNA thu nhận bằng phương pháp đo mật

độ quang

Hàm lƣợng DNA có thể xác định đƣợc nhờ sự hấp thu mạnh ánh sáng ở ƣớc

 Hóa chất:

− CT conversion reagenet ( EZ1)

− M-Dilution buffer (EZ2)

− M-Dissolving buffer (EZ3)

− M-Binding buffer (EZ4)

− M-Wash buffer (EZ5)

− M-Desulphonation buffer (EZ6)

− M-Elution buffer (EZ7)

− Xử lý dung dịch DNA theo chu trình nhiệt:

Hình II 1 Chu kỳ nhiệt biến đổi bisufite

− Sau đó, ổ sung 600 µl EZ4 và dung dịch DNA đƣợc xử lý nhiệt vào cột spinTMIC (C1), đảo ống eppendort thật đều Sau đó, ly tâm 13000 vòng/phút trong 30 giây, ở nhiệt độ phòng

Zymo-− Bổ sung 100 µl EZ5vào cột C1, ly tâm 13000vòng/phút trong 3giây, ở nhiệt độ phòng

− Bổ sung 200 µl EZ6 vào cột C1, để nhiệt độ phòng 15-20 phút, ly tâm 13000 vòng/ phút trong 30 giây

− Bổ sung 200 µl EZ5vào cột C1, ly tâm 13000 vòng/phút trong 30 giây ở nhiệt độ phòng (thực hiện 2 lần)

− Đặt cột vào eppendorf 1,5 ml, thêm 10 µl EZ7, ly tâm 13000 vòng/phút trong 30

II.2.3.4 Phản ứng MSP:

Sau khi thực hiện tách chiết và biến đổi bằng sodium bisulfite các mẫu DNA bộ gen người từ các mẫu bệnh phẩm, chúng tôi tiến hành thực hiện phản ứng MSP xác

trên bộ mẫu có tính chất nhiễm/hoặc

không nhiễm HPV

 Hóa chất:

− Dung dịch Master mix 2X (Hãng My tab pol)

− Nước cất hai lần

 Thiết bị:

− Máy luân nhiệt (Thermo cycler, hãng BioRad)

Bảng II 1 Thành phần phản ứng PCR Thành phần Thể tích (l)

Hình II 2 Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR II.2.3.5 Phương pháp điện di:

 Nguyên tắc:

Các acid nucleic là các đại phân tử tích điện âm, trong điện trường các phân tử DNA sẽ di chuyển về phía cực dương của điện trường Tốc độ di chuyển phụ thuộc vào khối lượng và cấu trúc của phân tử DNA Các acid nucleic trong gel agarose sẽ được hiện hình dưới tia tử ngoại (UV) nhờ ethidium bromide Chất này có khả năng gắn xen vào giữa các azơ của acid nucleic và phát quang dưới tác dụng của tia tử ngoại (λ=300 nm) Kích thước của các acid nucleic sẽ được xác định khi so sánh với kích thước đã

biết trước của thang chuẩn

 Thiết bị, hóa chất

- Buồng điện di

- Máy đọc gel Bio Rad

- Gel agarose Bio Rad

- 50X TAE Buffer Bio Rad

- Ethidium bromide Bio Rad

- Thang chuẩn 50bp……….Bioline

 Các ƣớc tiến hành

DNA đã pha loãng sau khi đo OD xong đƣợc chúng tôi sử dụng tiếp cho quá

đƣợc chạy điện di với gel agarose 1,5% ở hiệu điện thế 70V trong 30 phút

PHẦN III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

III.1 KHAI THÁC DỮ LIỆU VÀ KHẢO SÁT IN SILICO GEN APC

III.1.1 Kết quả khai thác dữ liệu

III.1.1.1 Bộ dữ liệu về tính chất methyl hóa gen APC trong các loại ung

thƣ

Nhằm mục đích tìm hiểu tính chất methyl hóa trên đảo CpG thuộc gen APC liên

quan đến các bệnh ung thƣ, tập trung ở bệnh UTCTC, chúng tôi khai thác dữ liệu trên

NCBI bằng các từ khóa : “APC gene”, “methylation”, “cervical cancer”… Chúng tôi thu thập đƣợc tổng số 47 bài báo khoa học bằng tiếng Anh có liên quan đến gen APC Trong đó, 14 bài báo mô tả đặc điểm, chức năng gen APC, 28 bài báo khảo sát tần suất methyl hóa ở đảo CpG trên vùng promoter của gen APC trong các loại ung thƣ

và 5 bài báo nghiên cứu về tần suất methyl hóa gen APC ở các giai đoạn khác nhau

trong UTCTC (số liệu cập nhật đến năm 2015)

III.1.1.2 Bộ dữ liệu về tần số methyl hóa trong UTCTC và các ung thƣ khác

Dựa trên các công trình nghiên cứu từ năm 1991 đến năm 2014, chúng tôi ghi

nhận tính chất methyl hóa của gen APC trong UTCTC và các loại ung thƣ khác (ung

thƣ vú, ung thƣ đại trực tràng, ung thƣ tuyến tiền liệt, ung thƣ àng quang, ung thƣ phổi, ung thƣ thực quản, ung thƣ gan) Kết quả trình bày ở bảng III.1 và hình III.1

Bảng III 1.Tần số methyl hóa gen APC trong các loại ung thƣ

% (n)

Tần suất methyl hóa trung bình có trọng số

Tài liệu tham khảo

(199)

28%

(118) 44,9%

(49)

53,8%

(52) 25%

(120)

27%

(111) 41,7%

(216)

37,5%

(24) 64,1%

(170)

38,5%

(243) Ung thƣ àng