Phát triển kỹ thuật MSP nhằm phát hiện methyl hóa bất thường gen rassf1a hướng đến hỗ trợ chẩn đoán ung thư vòm họng

BÁO CÁO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Tên đề tài: PHÁT TRIỂN KỸ THUẬT MSP NHẰM PHÁT HIỆN SỰ METHYL HÓA BẤT THƯỜNG GEN SỚM UNG THƯ VÒM HỌNG KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC CHUYÊN NGÀNH: VI SINH- SINH H

BÁO CÁO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Tên đề tài:

PHÁT TRIỂN KỸ THUẬT MSP NHẰM PHÁT HIỆN SỰ METHYL HÓA BẤT THƯỜNG GEN

SỚM UNG THƯ VÒM HỌNG

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

CHUYÊN NGÀNH: VI SINH- SINH HỌC PHÂN TỬ

CBHD: PGS TS LÊ HUYỀN ÁI THÚY ThS LAO ĐỨC THUẬN

SVTH: NGUYỄN THỊ YẾN TUYẾT

MSSV: 1153010962

Khóa: 2011-2015

Tp Hồ Chí Minh, tháng 05 năm 2015

L ỜI CẢM ƠN

Thúy, người luôn đầy nhiệt huyết với khoa học đã truyền cho em ngọn lửa đam mê

Tôi cũng xin cảm ơn các thành viên trong phòng Thí Nghiệm Sinh Học Phân Tử -

Trường ĐH Mở TP.HCM đã hỗ trợ, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài

sóc, động viên và tạo điều kiện tốt nhất cho con

DANH M ỤC HÌNH

Hình 1.1 Cơ chế epigenetics bao gồm hiện tượng methyl hóa DNA, biến đổi

histone và micro-RNA

Hình 1.3 Cơ chế methyl hóa DNA

Hình 1.5 Mô hình methyl hóa DNA

Hình 1.12 Protein RASSF1A điều hòa chu trình chết thông qua Bax

Hình 3.4 Hình A Sơ đồ hình ảnh các vùng đảo CpG trên trình gen khảo sát; Hình

DANH M ỤC BẢNG

DAPK, p16 trên bệnh ung thư vòm họng

ung thư vòm họng phân theo loại mẫu

bào ung thư vòm họng và tế bào bình thường

PCR Polymerase Chain Reaction

RASSF1A RAS association domain family member 1

M ỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ

1.TỔNG QUAN 1

1.1 Tổng quan về ung thư và sinh học phân tử của ung thư 1

1.1.1 Tổng quan về ung thư 1

1.1.2 Sinh học phân tử ung thư 2

1.1.3 Epigenetics 5

1.2 Tổng quan về ung thư vòm họng 10

1.2.1 Tình trạng ung thư vòm họng trên thới giới và tại Việt Nam 10

1.2.2 Khái quát về ung thư vòm họng 11

1.2.3 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước 14

1.2.4 Tìm hiểu về gen RASSF1A và sự methyl hóa gen RASSF1A dẫn đến ung thư vòm họng 15

1.2.5 Phương pháp phát hiện sự methyl hóa 22

1.2.6 Phương pháp cố định mô ảnh hưởng đến hiệu suất thu hồi DNA 24

2.VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 27

2.1 Vật liệu 27

2.1.1 Mẫu mô sinh thiết vòm họng 27

2.1.2 Dung cụ – thiết bị – hóa chất 27

2.1.3 Danh mục các phần mềm sử dụng 28

2.2 Phương pháp tiến hành 29

2.2.1 Khai khác dữ liệu 29

2.2.2 Khảo sát in silico 29

2.2.3 Khảo sát thực nghiệm 31

3.KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 36

3.1 Khai thác dữ liệu 36

3.2 Kết quả khảo sát in silico 41

3.2.1 Khảo sát in silico gen RASSF1A 41

3.2.2 Khảo sát vị trí và cấu trúc đảo CpG thuộc vùng promoter gen RASSF1A 41

3.2.3 Đánh giá mồi 44

3.3 Kết quả thực nghiệm 47

3.3.1 Kết quả tách chiết DNA 47

3.3.2 Kết quả phản ứng MSP trên các mẫu mô ung thư vòm họng 48

4.KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 51

4.1 Kết luận 51

4.2 Đề nghị 51

TÀI LIỆU THAM KHẢO 53

PHU LỤC 59

ĐẶT VẤN ĐỀ

Ung thư là thuật ngữ chỉ một nhóm các dạng bệnh lý khác nhau, đến nay đã có trên

theo ước tính đến 2017 thì tỷ lệ số nhiễm ung thư vòm họng sẽ tăng 161.899 ca trên

Đồng thời, số lượng tử vong cũng khá cao chiếm 3,3% (theo Globocan 2012)

đến sự tăng sinh vượt mức của tế bào và dẫn đến sinh u

methyl liên quan đến ung thư này Gen RASSF1A nằm ở vị trí 3p21.3 của NST, bình

thường đóng vai trò là những gen ức chế ung thư nhưng khi bị methyl hóa một cách

chế khối u RASSF1A có thể ức chế chu trình phát triển của tế bào bằng cách ngăn

đến hình thành u

đã được ứng dụng trong một số công trình nghiên cứu trên thế giới như RT-PCR

được ứng dụng trong nhiều nghiên của các nhóm nghiên cứu trên thới giới như

THU ẬT MSP NHẰM PHÁT HIỆN SỰ METHYL HÓA BẤT THƯỜNG GEN

RASSF1A HƯỚNG ĐẾN HỖ TRỢ CHẨN ĐOÁN SỚM UNG THƯ VÒM

H ỌNG.’ với mong muốn xây dựng cơ sở lý thuyết khoa học nhằm khẳng định sự

đoán sớm bệnh ung thư vòm họng

1 T ỔNG QUAN

1.1 T ổng quan về ung thư và sinh học phân tử của ung thư

1.1.1 T ổng quan về ung thư

1.1.1.1 Định nghĩa

Ung thư là một bệnh lý ác tính của tế bào, khi bị kích thích bởi các tác nhân sinh ung thư, tế bào sẽ tăng sinh vô hạn và không tuân theo các cơ chế kiểm soát về phát triển của cơ thể [2]

1.1.1.2 Đặc tính của ung thư

Đa số bệnh ung thư sẽ hình thành khối u, các khối u lành tính chỉ phát triển tại chỗ, thường rất chậm, có vỏ bọc xung quanh, các khối u ác tính (ung thư) xâm lấn vào

Ung thư không phải là một bệnh duy nhất mà thuật ngữ này phản ảnh một nhóm các

1.1.1.3 Tình hình ung thư trên thế giới

khoảng 70% trên tổng số ca tử vong do ung thư trên toàn thế giới WHO cũng dự

1.1.2 Sinh h ọc phân tử ung thư

[1]

Các nhà ung thư học đã phân loại các nhóm gen chính liên quan đến sự phát sinh

1.1.2.1 Các gen ti ền ung thư (proto-oncogenes)

Gen gây ung thư (oncogene) được định nghĩa như là những gen mã hóa cho một

soát tăng trưởng và thụ thể (receptor) của chúng, các protein truyền tín hiệu, các

lại, hai oncogene phát sinh từ hai cơ chế sau lại sản xuất protein giống hệt protein bình thường, chúng có tác dụng gây ung thư vì được sản xuất ở mức độ cao hơn

ung thư [1]

1.1.2.2 Các gen ức chế khối u (tumor suppressor genes)

Gen Rb

(retinoblastoma) Đột biến ở gen Rb làm phát triển dạng ung thư khác ở người như

đột biến của Rb thường xuất hiện ở tế bào sinh dưỡng hơn là do di truyền từ bố mẹ

Gen p53

Protein p53 khu trú trong

P53

được huy động để làm ngừng sự hư hại DNA và hỗ trợ cho việc sửa chữa DNA

bào [1]

Gen p53 đã được phát hiện gần 20 năm nay và được xem là gen duy nhất giữ vai trò

Gen p73

Đến cuối năm 1977, các nhà nghiên cứu phát hiện ra gen p73, gen này mã hóa một

1.1.2.3 Các gen kiểm soát chu trình tế bào

[1]

S: là giai đoạn tổng hợp DNA Cuối giai đoạn này lượng DNA tăng lên gấp

M (mitosis): là giai đoạn nguyên phân của tế bào Cuối phase M, có hai tế

trưởng (growth factor) Sự thiếu đi nhân tố này sẽ làm cho tế bào mất khả năng phân chia và đi vào phase G0, tuy nhiên nếu lại nhận được tín hiệu của nhân tố tăng trưởng tế bào sẽ lại được hoạt hóa trở lại chu trình Tế bào có thể đi ra khỏi chu trình bình thường để trải qua quá trình biệt hóa hoặc đi vào chương trình chết (apoptosis) [1]

1.1.2.4 Các gen sửa chữa DNA

1.1.3 Epigenetics

không làm thay đổi trình tự DNA và được di truyền một cách ổn định từ thế hệ này

Hình 1.1 Cơ chế epigenetics bao gồm hiện tượng methyl hóa DNA, biến đổi

histone và micro-RNA [33]

tượng epigenetics là một trong những cơ chế chính liên quan đến quá trình hình

thành tế bào ung thư Một ví dụ về hiện tượng methyl hóa của epigenetics [4, 15] ở hình 1.2 :

Hình 1.2 Cơ chế biến đổi epgenetics gây im lặng gen

1.1.3.1 Methyl hóa DNA

dinucleotide CpG (cystosine-phosphate-guanine ) hình thành 5-methylcytosine (5mC) [4, 15, 19, 36]

Khi nói đến methyl hóa DNA thì vùng đảo CpG luôn được đề cập, thực tế đảo CpG

là vùng giàu dinucleotide CpG (cystosine phosphate guanine) có kích thước khoảng

thường kéo dài từ vùng đầu 5’ đến exon 1 thuộc vùng promoter của gen, ở các tế bào bình thường phần lớn các đảo CpG không bị methyl hóa, chỉ những phân nhóm

hóa [26, 38, 43]

Hình 1.3 Cơ chế methyl hóa DNA [19]

Chú thích: dưới xúc tác của enzym DNMT và co-factor S-adenosyl-L-methionine

được thực hiện bởi các enzyme DNA methyltranfarase (DNMTs) bằng cách hình

Trong đó DNMT1 thuộc nhóm methyl transferase duy trì, DNMT3a và DNMT3b

[15, 19, 36]

DNMT3a và DNMT3b thuộc nhóm enzyme de novo methyltransferase có khả năng

methyltranferase duy trì DNA (maintenance DNA methyltransferase) trong đó

ổn định sự methyl hóa của các tế bào soma khác nhau DNMT1 có khả năng tăng cường quá trình sinh tổng hợp DNA vì DNMT1 tương tác nhân tố DNA polymerase

cường hỗ trợ hoạt động nhóm enzyme de novo transferase

1.1.3.2 Methyl hóa trong t ế bào bình thường

thường chẳng hạn như: Methyl hóa DNA là một hiện tượng bình thường xảy ra

theo độ tuổi Bên cạnh đó nếu sự methyl hóa bất thường này tăng theo thời gian có

1.1.3.3 Methyl hóa DNA trong t ế bào ung thư

Methyl hóa ở mức thấp (hypomethylation) là nguyên nhân dẫn đầu làm giảm biểu

kìm hãm như 5 -glycosylate vào các yếu tố phiên mã làm bất hoạt quá trình phiên

dinucleotide CpG, điều này dẫn đến sự gia tăng kích thích xây dựng NST tiền sắp

Hình 1.4 S ự methyl hóa DNA trong ung thư [19]

Methyl hóa vượt mức tại một số vị trí đặc biệt trên bộ gen cụ thể là các đảo CpG

vượt mức do sự hoạt động quá mức của enzyme DNMTs gồm DNMT1 và DNMT3,

Hình 1.5 Mô hình methyl hóa DNA

1.2 T ổng quan về ung thư vòm họng

1.2.1 Tình tr ạng ung thư vòm họng trên thới giới và tại Việt Nam

tính đến 2.017 thì tỷ lệ số nhiễm ung thư vòm họng sẽ tăng 161.899 ca trên toàn thế

giới [52]

Hình 1.6 T ỷ lệ mắc bệnh và tử vong của các loại ung thư tại Việt Nam [49]

1.2.2 Khái quát v ề ung thư vòm họng

1.2.2.1 Gi ải phẫu vùng vòm họng

Hình 1.7 Gi ải phẫu vùng hầu họng-cổ

1.2.2.2 Khái ni ệm và triệu chứng ung thư vòm họng

Ung thư vòm họng (UTVH) là một khối u biểu mô ác tính xuất phát từ niêm mạc

trong giai đoạn sớm UTVH thường không có triệu chứng hoặc có những triệu

được phân bố như sau loại I 2%, loại II 3% và loại III là 95%, từ đó cho thấy UTVH

1.2.2.3 Tác nhân gây b ệnh ung thư vòm họng

Epstein-barr virus [3, 19, 21, 33]

ung thư, cần phải có ít nhất 6 hoặc 7 đột biến xảy ra và được tich lũy độc lập qua

p15 và p14 ARFI) và 3p21.3 (RASSF1A, BLU/ZMYND10 và CACNA2D2) [19, 21, 33]

[19, 21, 33]

đến hình thành UTVH thông qua việc phá vỡ cơ chế điều hòa chu trình tế bào như

Đồng thời yếu tố di truyền và môi truyền cũng liên quan đến trong việc hình thành

phổ biến ở thành phố Guangdong phía nam Trung Quốc, người Et-xki-mô ở Alaska

Epstein-barr virus xuất hiện hơn 90% ở những người trưởng thành trên thế giới, phân bố khắp cơ thể thường không gây hại vì có sự cân bằng giữa ký chủ và virus, tuy nhiên, khi gặp điều kiện cần và đủ, EBV cũng giống như một số loại virus tàng nhiễm khác, sẽ gây

sự kết hợp cùng các yếu tố như cơ địa người bệnh, môi trường, chế độ ăn uống và

Tuy nhiên, trong nghiên cứu này tôi tập trung chủ yếu nguyên nhân chính gây UTVH do yếu tố di truyền cụ thể là hiện tượng methyl hóa bất thường dẫn đến việc

tạo u, và gen methyl hóa mà tôi quan tâm ở đây là gen RASSF1A

1.2.3 Tình hình nghiên c ứu trong và ngoài nước

đồng thời, trên thế giới đã có một số công trình nghiên tiêu biểu về hiện tượng

RASSF1A trên b ệnh ung thư vòm họng và thu được kết quả là 66,7% gen RASSF1A

RASSF1A và TSLC1 cùng sự hiện diện của Epstein-barr virus trong ung thư vòm

vòm họng methyl hóa RASSF1A chiếm 82%, vị trí xung quanh cách khối u 0,5 cm

đối với 49 mẩu phết hầu họng Đồng thời còn các công trình khác trên thế giới của

Ở Việt Nam, tôi chưa tìm thấy công trình tiêu biểu nào liên quan đến việc nghiên

1.2.4 Tìm hi ểu về gen RASSF1A và sự methyl hóa gen RASSF1A dẫn đến ung thư

vòm h ọng

1.2.4.1 V ị trí, tên gọi và cấu trúc gen RASS1A trên NST

RASSF1A (Ras association domain family 1 isoform A ) là một gen ức chế khối u

Hình 1.8 V ị trí của gen RASSF1A trên nhiễm sắc thể số 3

RASSF1 dài khoảng 11000 bp, bao gồm 8 exon tạo thành 8 vùng phiên mã khá c

2αβ, 3, 4, 5, 6 mã hóa cho một chuỗi polypeptide ngắn với 340 amino acid có trọng

lượng phân tử gần 39 kD, hai promoter riêng biệt và các đảo CpG trên vùng

Hình 1.9 B ản đồ của gen RASSF1A (A) và protein RASSF1A (B ) [17]

hóa tương đồng; RA: Ras association domain; SARAH, Sav/RASSF/Hpo

1.2.4.2 Vai trò và ch ức năng của RASSF1A

RASSF1A thúc đẩy tế bào chết theo chu trình, và giảm tình trạng tạo u ở các dòng

như điều hòa chu trình chết, sự ngưng chu trình tế bào và ổn định hệ thống vi ống (hình 1.10)

Hình 1.10 Tóm t ắt vai trò sinh học của protein RASSF1A [16]

kì quá độ từ G1 sang S Chu kỳ tế bào bị trì hoãn tại phase G1 cho đến khi nó đủ

tích lũy của Cyclin D1-gen điều khiển hiện tượng phosphoryl hóa Rb (thông qua

tế bào của RASSF1A cũng có thể mất đi do sự biểu hiện lệch lạc của các Cyclin [16,

42, 49]

, Rb, p53 Bên cạnh đó , p120E4F điều khiển quá trình phiên mã

49]

Hình 1.11 APC-Cdc20 b ị ức chế suốt quá trình nguyên phân [43]

Protein RASSF1A điều hòa chu trình chết (apoptosis)

đường chết theo chu trình của Ras-protein, hoạt động này liên quan đến tăng cường,

tương tác với MST1 tạo phức hợp RASSF1A-MST1 sẽ kích hoạt cho con đường

năng làm tế bào chu chết theo chu trình và nó cần thiết cho sự tương tác giữa

Ngoài ra, RASSF1A cũng có thể điều chỉnh chu trình chết thông qua con đường

các tương tác nội phân tử nhưng khi tạo phức hợp RASSF1A thì sự ức chế trên sẽ

Hình 1.12 Protein RASSF1A điều hòa chu trình chết thông qua Bax [43]

1.2.4.3 S ự methyl hóa bất thường gen RASSF1A dẫn đến bệnh ung thư

tượng methyl hóa vượt mức làm thay đổi cấu trúc gen không có khả năng ức chế tăng sinh tế bào Tuy nhiên, hiện tượng đột biến gen thường không phổ biến như

ung thư vòm họng…[28] Trong đó, sự methyl quá mức vùng CpG của promoter ở

ở các tế bào ung thư, gen RASSF1A bị methyl hóa vượt mức vùng promoter của gen

1.2.4.4 S ử dụng sự methyl hóa gen RASSF1A như một dấu chứng sinh học

đây là một phạm vi rất rộng cho các loại ung thư, tuy nhiên, ở những tế bào mô bình thường thì sự methyl hóa này rất hiếm được tìm thấy Như vậy sự methyl hóa gen

RASSF1A đang được xem xét để sử dụng trong bệnh viện như một dấu ấn để chẩn đoán, phát hiện sớm ung thư đồng thời còn tiên lượng cho những bệnh nhân đã

methyl hóa vượt mức như một cơ chế khử hoạt tính ức chế khối u phổ biến ở tế bào

được nghiên cứu rất kỹ trên nhiều loại ung thư Chẳng hạn như, sự methyl hóa

RASSF1A trong ung thư vú chiếm 94% trong các mô ung thư [49] Tương tự như vậy,

đã được phát hiện với tần số methyl 67% (20/30) của mẫu khối u, tuy nhiên trong nước súc miệng chỉ có 37% , 33% số mẫu phết mũi họng và 3% ở mẫu huyết tương

methyl hóa DNA vượt mức được sử dụng như một dấu ấn chẩn đoán, việc chẩn đoán sẽ tốt hơn nếu kết hợp với các phương pháp chẩn đoán thông thường như tế

1.2.5 P hương pháp phát hiện sự methyl hóa

1.2.5.1 Phương pháp biến đổi bisulfite

Hình 1.13 X ử lý sodium bisulfite và sự chuyển đổi cytosine thành uracil

đổi sodium bisulfite DNA bộ gen Phản ứng xử lý sodium bisulfite được sử dụng để

Dưới tác dụng của sodium bisulfite tất cả các cystosine không bị methyl hóa sẽ được chuyển hóa thành uracil trong khi đó các cystosine methyl hóa không bị tác

1.2.5.2 Phương pháp Methylation - Specific PCR (MSP)

hiện tượng methyl hóa RASSF1A còn dự đoán được nguy cơ phát triển ung thư từ tế

Trong đó phương pháp MSP do Herman và cộng sự phát minh vào năm 1996, được

methyl hóa

và không methyl được thiết kế để phân biệt giữa các alen bị methyl hóa và không bị methyl hóa, cũng như để phân biệt giữa DNA đã biến đổi sodium bisulfite với DNA chưa bị biến đổi bằng hai phản ứng độc lập Để đạt được các mục tiêu này thì các

Hình 1.14 Nguyên t ắc của kỹ thuật MSP [18]

1.2.6 Phương pháp cố định mô ảnh hưởng đến hiệu suất thu hồi DNA

1.2.6.1 Mô c ố định bằng formallin

thư [5, 6]

chú ý là DNA thường được cố định mẫu mô bằng parrafin và formallin được ứng

dụng rộng rãi tại các bệnh viện trên toàn thới giới hiện nay, việc cố định này góp

Fomallin được biết là một tiêu chuẩn vàng trong việc lưu trữ các mô bệnh học vì

phân cắt tạo thành các đoạn nhỏ và đặc bi ệt sự tạo liên kết giữa DNA với protein

gian dài cùng với các yếu tố như nhiệt độ , pH, nồng độ acid sẽ dẫn đến hiện tượng DNA tự phân rã , kết quả này gây trở ngại cho việc phân tích di truyền cũng như

định tế bào mà không ảnh hưởng đến hoạt động hoặc làm giảm hoạt động của

1.2.6.2 Mô tươi

Mô tươi thường được lấy để sản xuất các dòng tế bào hoặc được đồng nhất để tách

ứng khác của tế bào, cũng như không ảnh hưởng đến hoạt động của enzym trong