Khảo sát tính chất đột biến điểm trên gen LDLR và apob của bệnh cao cholesterol trong máu có tính chất gia đình (familial hypercholesterolemia, FH) bằng phương pháp PCR kết hợp giải trình tự

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Đề tài: KHẢO SÁT TÍNH CHẤT ĐỘT BIẾN ĐIỂM TRÊN GEN LDLR VÀ ApoB CỦA BỆNH CAO CHOLESTEROL TRONG MÁU CÓ TÍNH CHẤT GIA ĐÌNH FAMILIAL HYPERCHOLESTEROLEMIA, FH BẰNG PH

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Đề tài:

KHẢO SÁT TÍNH CHẤT ĐỘT BIẾN ĐIỂM TRÊN

GEN LDLR VÀ ApoB CỦA BỆNH CAO

CHOLESTEROL TRONG MÁU CÓ TÍNH CHẤT

GIA ĐÌNH (FAMILIAL HYPERCHOLESTEROLEMIA, FH) BẰNG PHƯƠNG PHÁP PCR KẾT HỢP GIẢI TRÌNH TỰ

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

CHUYÊN NGÀNH: VI SINH – SINH HỌC PHÂN TỬ

CBHD: PGS TS Lê Huyền Ái Thúy SVTH: Nguyễn Thanh Duy

MSSV: 1153010123 Khóa: 2011

Tp Hồ Chí Minh, tháng 5 năm 2015

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP HCM

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Đề tài:

KHẢO SÁT TÍNH CHẤT ĐỘT BIẾN ĐIỂM TRÊN

GEN LDLR VÀ ApoB CỦA BỆNH CAO

CHOLESTEROL TRONG MÁU CÓ TÍNH CHẤT

GIA ĐÌNH (FAMILIAL HYPERCHOLESTEROLEMIA, FH) BẰNG PHƯƠNG PHÁP PCR KẾT HỢP GIẢI TRÌNH TỰ

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

CHUYÊN NGÀNH: VI SINH – SINH HỌC PHÂN TỬ

CBHD: PGS TS Lê Huyền Ái Thúy SVTH: Nguyễn Thanh Duy

MSSV: 1153010123 Khóa: 2011

GVHD ký xác nhận:

………

Tp Hồ Chí Minh, tháng 5 năm 2015

LỜI CẢM ƠN

!

Em xin chân thành cảm ơn Quý Thầy Cô Khoa Công nghệ Sinh Học trường Đại học

Mở TP.HCM đã tận tình dạy bảo em trong những năm vừa qua Đồng thời, Quý Thầy Cô cũng chính là những người đã truyền đạt những kiến thức quý báu để làm hành trang cho em bước vào đời

Đặc biệt nhân dịp này, em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành nhất của mình tới PGS TS Lê Huyền Ái Thuý và ThS Trương Kim Phượng là những người đã tận tình chỉ ra hướng nghiên cứu, hướng dẫn, quan tâm, động viên và giúp đỡ từng bước đi của em trong quá trình thực hiện chuyên đề Khoá Luận Tốt Nghiệp

Em cũng xin chân thành cảm ơn ThS Lao Đức Thuận đã tạo điều kiện cho em được thực hiện chuyên đề Khóa Luận Tốt Nghiệp tại phòng thí nghiệm Sinh Học Phân

Tử, trường Đại học Mở TP.HCM

Đồng thời em cũng xin gửi lời cảm ơn đến tập thể cán bộ Khoa Xét Nghiệm cũng như một số khoa khác tại Bệnh Viện Đa Khoa Xuyên Á Các bác, các anh và các chị là những người đã hết lòng hỗ trợ em trong quá trình thu thập mẫu bệnh phẩm tại bệnh viện

Cũng trong dịp này, em xin gửi lời cảm ơn của mình đến các bạn và các em trong phòng thí nghiệm Sinh Học Phân Tử đã hết lòng giúp đỡ em thực hiện chuyên đề Khoá Luận Tốt Nghiệp này

Cuối cùng, em xin gửi lời biết ơn sâu sắc nhất của mình đến gia đình và người thân đặc biệt là bố mẹ em Mọi người đã dõi theo, ủng hộ, quan tâm và động viên em rất nhiều trong quá trình thực hiện chuyên đề Khoá Luận Tốt Nghiệp

Sinh viên Nguyễn Thanh Duy

kDa kilodalton

DANH MỤC BẢNG

!

Bảng II.1 Thành phần phản ứng PCR với cặp mồi LDLR 20

Bảng II.2 Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR với cặp mồi LDLR 21

Bảng II.3 Thành phần phản ứng PCR với bộ mồi ApoB 21

Bảng II.4 Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR với bộ mồi ApoB 21

Bảng III.1 Số lượng các bài báo khoa học thu thập được 25

Bảng III.2 Số dạng đột biến/loại đột biến của gen LDLR 26

Bảng III.3 Số lượng các đột biến điểm thuộc gen LDLR trên các Châu Lục 27

Bảng III.4 Số lượng các đột biến trên từng exon thuộc gen LDLR 29

Bảng III.5 Các phương pháp phát hiện đột biến điểm trên gen LDLR 31

Bảng III.6 Số lượng công trình nghiên cứu trên từng dạng đột biến gen ApoB 32

Bảng III.7 Số lượng các dạng đột biến thuộc gen ApoB trên các Châu Lục 33

Bảng III.8 Số lượng các đột biến trên từng exon của gen ApoB 34

Bảng III.9 Các phương pháp phát hiện đột biến trên gen ApoB 36

Bảng III.10 Thông tin về cặp mồi LDLR 37

Bảng III.11 Thông tin về các thông số vật lý của cặp mồi LDLR_F và LDLR_R 42

Bảng III.12 Thông tin về hệ mồi ApoB 44

Bảng III.13 Thông tin về các thông số vật lý của mồi ApoB_F, ApoB_R1 và ApoB_R2 52

Bảng III.14 Chỉ số đo OD của các mẫu huyết tương sau tách chiết 53

Bảng III.15 Kết quả các đột biến được phát hiện trên exon 4 của gen LDLR ở một số mẫu bệnh phẩm 55

Bảng III.16 Kết quả phân tích đột biến R3500Q trên gen ApoB ở một số mẫu bệnh phẩm 59

Bảng III.17 Chỉ số sinh hóa của một số mẫu bệnh phẩm xuất hiện đột biến trên gen LDLR và ApoB 59!

!

DANH MỤC HÌNH

!

Hình I.1 Cấu trúc hoá học của cholesterol [75] 2

Hình I.2 Cấu trúc của lipoprotein [30] 3

Hình I.3 Một số apolipoprotein trên bề mặt lipoprotein [72] 4

Hình I.4 Vị trí gen LDLR trên nhiễm sắc thể số 19 [74] 6

Hình I.5 Các vùng chức năng của thụ thể LDLR [5] 8

Hình I.6 Vị trí gen ApoB trên nhiễm sắc thể số 2 [73] 10

Hình I.7 Tỷ lệ phân bố số lượng đột biến theo từng exon trên gen LDLR [76] 11

Hình III.1 Số dạng đột biến/loại đột biến của gen LDLR 27

Hình III.2 Số lượng các đột biến điểm thuộc gen LDLR trên các Châu Lục 28

Hình III.3 Số lượng các đột biến trên từng exon thuộc gen LDLR 30

Hình III.4 Các phương pháp phát hiện đột biến điểm trên gen LDLR 31

Hình III.5 Số lượng công trình nghiên cứu trên từng đột biến gen ApoB 33

Hình III.6 Số lượng các dạng đột biến trên gen ApoB ở từng Châu Lục 34

Hình III.7 Số lượng các đột biến trên từng exon của gen ApoB 35

Hình III.8 Các phương pháp phát hiện đột biến điểm trên gen ApoB 36

Hình III.9 Kết quả khảo sát mồi LDLR_F bằng công cụ BLAST trên NCBI 38

Hình III.10 Kết quả khảo sát mồi LDLR_R bằng công cụ BLAST trên NCBI 39

Hình III.11 Kết quả khảo sát mồi LDLR_F bằng chương trình Annhyb 40

Hình III.12 Kết quả khảo sát mồi LDLR_R bằng chương trình Annhyb 41

Hình III.13 Vị trí bắt cặp của LDLR_F và LDLR_R trên gen NG_009060.1 41

Hình III.14 Kích thước sản phẩm của cặp mồi LDLR_F và LDLR_R 42

Hình III.15 Kết quả khảo sát mồi ApoB_F bằng công cụ BLAST trên NCBI 45

Hình III.16 Kết quả khảo sát mồi ApoB_R1 bằng công cụ BLAST trên NCBI 46

Hình III.17 Kết quả khảo sát mồi ApoB_R2 bằng công cụ BLAST trên NCBI 47

Hình III.18 Kết quả khảo sát mồi ApoB_F bằng chương trình Annhyb 48

Hình III.19 Kết quả khảo sát mồi ApoB_R1 bằng chương trình Annhyb 49

Hình III.20 Vị trí bắt cặp của ApoB_F và ApoB_R1 trên gen FJ525873.1 49

Hình III.21 Kích thước sản phẩm của cặp mồi ApoB_F và ApoB_R1 50

Hình III.22 Kết quả khảo sát mồi ApoB_R2 bằng chương trình Annhyb 50

Hình III.23 Vị trí bắt cặp của ApoB_F và ApoB_R2 trên gen FJ525873.1 51

Hình III.24 Kích thước sản phẩm của cặp mồi ApoB_F và ApoB_R2 51

Hình III.25 Kết quả điện di sản phẩm PCR trên gen LDLR 54

Hình III.26 Kết quả điện di sản phẩm PCR với cặp mồi khuếch đại allele hoang dại ở một số mẫu bệnh phẩm 57

Hình III.27 Kết quả điện di sản phẩm PCR với cặp mồi khuếch đại allele đột biến ở một số mẫu bệnh phẩm 58

!

!

MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN II DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT III DANH MỤC BẢNG V DANH MỤC HÌNH VI MỤC LỤC VII ĐẶT VẤN ĐỀ IX

I TỔNG QUAN 1

I.1 TỔNGQUANVỀCHOLESTEROL 2

I.1.1 Định nghĩa 2

I.1.2 Vai trò của cholesterol trong cơ thể 2

I.1.3 Điều hoà cholesterol trong cơ thể 2

I.1.4 Phân tử vận chuyển cholesterol trong máu (Lipoprotein) 3

I.2 TỔNGQUANVỀBỆNHCAOCHOLESTEROLTRONGMÁUCÓ TÍNHGIAĐÌNH(FAMILIALHYPERCHOLESTEROLEMIA,FH) 5

I.2.1 Bệnh cao cholesterol trong máu có tính gia đình 5

I.2.2 Nguyên nhân 6

I.3 TỔNGQUANVỀGENLDLRVÀPROTEINLDLR 6

I.3.1 Vị trí của gen 6

I.3.2 Chức năng của protein LDLR 7

I.3.3 Rối loạn chức năng của protein LDLR 8

I.4 TỔNGQUANVỀGENAPOBVÀPROTEINAPOB 9

I.4.1 Vị trí của gen 9

I.4.2 Chức năng của protein ApoB 10

I.4.3 Rối loạn chức năng của protein ApoB 10

I.5 CÁCDẠNGĐỘTBIẾNTRÊNGENLDLRVÀA PO B 11

I.5.1 Đột biến trên gen LDLR 11

I.5.2 Đột biến trên gen ApoB 12

I.6 MỘTSỐKỸTHUẬTPHÁTHIỆNĐỘTBIẾNTRÊNGENLDLR VÀ APOB 12

I.6.1 Phương pháp giải trình tự (Sequencing) 12

I.6.2 Phương pháp phân biệt tính đa hình trong cấu hình sợi đơn DNA (Single Strand Conformation Polymorphism, SSCP) 12

I.6.3 Phương pháp điện di trên gel biến tính (Denaturing Gradient Gel Eletrophoresis, DGGE) 13

I.6.4 Phương pháp Multiplex Ligation – Dependent Probe Amplifications (MPLA) 13

I.6.5 Phương pháp phân biệt tính đa hình dựa vào chiều dài giới hạn của các đoạn DNA tương đồng (Restriction Fragment Length Polymorphisms, RFLP) 13

I.6.6 Phương pháp Southern Blot 13

I.7 MỘTSỐCÔNGTRÌNHNGHIÊNCỨUNỔIBẬTVỀĐẶCĐIỂM

PHÂNTỬCỦABỆNHCAOCHOLESTEROLTRONGMÁUCÓ

TÍNHGIAĐÌNH 14

II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16

II.1 VẬTLIỆU 17

II.2 PHƯƠNGPHÁPNGHIÊNCỨU 17

II.2.1 Khai thác dữ liệu 17

II.2.2 Khảo sát in silico 17

II.2.3 Khảo sát thực nghiệm 17

III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 24

III.1 KHAITHÁCDỮLIỆU 25

III.1.1 Gen LDLR 26

III.1.2 Gen ApoB 32

III.2 KHẢOSÁTIN SILICO 37

III.2.1 Gen LDLR 37

III.2.2 Gen ApoB 43

III.3 KHẢOSÁTTHỰCNGHIỆM 53

III.3.1 Tách chiết DNA bộ gen người 53

III.3.2 Phản ứng PCR giải trình tự exon 4 của gen LDLR 53

III.3.3 Phân tích đột biến điểm trên gen LDLR 54

III.3.4 Phản ứng AS – PCR kết hợp giải trình tự phát hiện đột biến R3500Q trên gen ApoB 57

III.3.5 Phân tích kết quả đột biến R3500Q trên gen ApoB 58

IV KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 61

IV.1 KẾTLUẬN 62

IV.2 ĐỀNGHỊ 63

V TÀI LIỆU THAM KHẢO 64

VI PHỤ LỤC 75

PHỤLỤC1–THÔNGTINMỘTSỐMẪUBỆNHPHẨM 76

PHỤLỤC2–MỘTSỐDẠNGĐỘTBIẾNTRÊNGENLDLR 77

PHỤLỤC3–MỘTSỐDẠNGĐỘTBIẾNTRÊNGENAPOB 85

PHỤLỤC4–KẾTQUẢGIẢITRÌNHTỰEXON4TRÊNGENLDLRỞ MỘTSỐMẪUBỆNHPHẨM 86

PHỤLỤC5–KẾTQUẢGIẢITRÌNHTỰALLELEĐỘTBIẾNR3500Q TRÊNGENA PO BTRÊNMỘTSỐMẪUBỆNHPHẨM 90!

!

và cộng sự, 2010; Sun và cộng sự, 2005)

Theo báo cáo của tổ chức Y Tế Thế Giới (WHO, 2008) về tình hình cao cholesterol,

tỷ lệ người trưởng thành có chỉ số hàm lượng cholesterol cao trên thế giới là 39% Tại Đông Nam Á, tỉ lệ cao cholesterol ở nam và nữ là 29% (WHO, 2008)

Nguyên nhân dẫn đến bệnh FH là do thay đổi tính chất di truyền (đột biến điểm) ở

các gen có chức năng trong quá trình điều hòa lượng cholesterol trong máu (LDLR,

ApoB, PCSK9, LDLRAP1), chế độ dinh dưỡng (chế độ ăn chứa nhiều lipid)…

(Soufi và cộng sự, 2004; Martra và cộng sự, 2012) Nguyên nhân chủ yếu là do đột

biến điểm ở các gen điển hình: LDLR và ApoB (Marduel và cộng sự, 2010)

Hiện nay, trên thế giới có nhiều công trình điển hình theo hướng nghiên cứu xác

định các đột biến điểm trên gen LDLR và ApoB dựa vào các kỹ thuật PCR giải trình

tự, AS - PCR (Brown và cộng sự, 1986; Innerarity và cộng sự, 1987; Abifadel và cộng sự, 2003)… Tuy nhiên, tại Việt Nam có rất ít công trình nghiên cứu về tính

chất đột biến của các gen LDLR và ApoB

Nhằm mục đích tìm hiểu thông tin và xác định rõ nét tính chất đột biến điểm trên

các gen LDLR và ApoB ở các bệnh nhân mắc bệnh cao cholesterol trong máu có

tính gia đình ở Việt Nam, cụ thể là ở khu vực Thành phố Hồ Chí Minh Chúng tôi

thực hiện chuyên đề Khoá Luận Tốt Nghiệp “Khảo sát tính chất đột biến điểm

trên gen LDLR và ApoB của bệnh cao cholesterol trong máu có tính chất gia

đình (Familial Hypercholesterolemia, FH) bằng phương pháp PCR kết hợp giải trình tự”

Nội dung nghiên cứu

I.1 TỔNG QUAN VỀ CHOLESTEROL

I.1.1 Định nghĩa

Cholesterol (Cholest-5-en-3β-ol) là phân tử thuộc nhóm steroid, cấu tạo phân tử gồm có 27 nguyên tử Carbon (C) và nhóm – OH [30] Trong cơ thể con người, cholesterol được cơ thể hấp thu từ nguồn thực phẩm hoặc tự tổng hợp trong gan [54]

Hình I.1 Cấu trúc hoá học của cholesterol [75]

Dựa vào công bố khoa học của Russell và cộng sự (1992), hằng ngày, cơ thể con người tổng hợp khoảng 700 – 900 mg cholesterol và hấp thu khoảng 300 – 500 mg cholestrol thông qua hệ tiêu hoá Mỗi ngày, cholesterol được chuyển hóa theo nhiều

cơ chế: (i) khoảng 600 mg được chuyển hoá và bài tiết qua bộ máy tiêu hoá, (ii) 100

mg chuyển hoá thành acid mật, (iii) 85 mg được bài tiết qua da (ở dạng chất nhờn), (iv) 50 mg tham gia vào quá trình tổng hợp thành các hormone steroid [54]

I.1.2 Vai trò của cholesterol trong cơ thể

Cholesterol là thành phần phổ biến trong tế bào động vật, có vai trò quan trọng trong quá trình chuyển hoá lipid, là tiền chất tham gia sản xuất vitamin D và các hormone steroids (glucocorticoids, oestrogens, progesterones, androgens, aldosterone) [46], là thành phần của màng tế bào và tổng hợp thành acid mật [30]

I.1.3 Điều hoà cholesterol trong cơ thể

Sự điều hòa cholesterol trong cơ thể được thực hiện bởi 3 cơ chế điều hòa (feed - back) liên quan đến nhau: (i) điều hòa quá trình sản xuất thụ thể LDL, (ii) hoạt hóa

và điều hòa hoạt động của enzyme HMC - CoA reductase cũng như các enzyme khác trong quá trình tổng hợp, (iii) sự điều hòa của enzyme cholesterol 7-α-hydroxylase trong quá trình tổng hợp acid mật [54]

I.1.4 Phân tử vận chuyển cholesterol trong máu (Lipoprotein)

Do phân tử cholesterol có tính kỵ nước nên chúng không thể tự lưu thông trong máu

mà chúng được “đóng gói” dưới dạng các phân tử lipoprotein [30]

I.1.4.1 Cấu trúc lipoprotein

Lipoprotein là phức hợp cao phân tử, có cấu trúc lớp vỏ và cấu trúc lõi Lớp vỏ được cấu tạo bởi lớp màng có tính ưa nước (hydrophilic) gồm có: apolipoprotein, phospholipid và cholesterol Vùng lõi được cấu tạo bởi cholesteryl ester, triglyceride, acid béo và vitamin tan trong chất béo (Vitamin E) [30]

Hình I.2 Cấu trúc của lipoprotein [30]

I.1.4.2 Apolipoprotein

Apolipoprotein là các tiểu phần protein liên kết với các phân tử lipoprotein [30] Apolipoprotein có bốn vai trò: (i) tham gia vào quá trình lắp ghép thành lipoprotein, (ii) bảo đảm cấu trúc của lipoprotein (apo B, apob E, apo A – I, apo A – II), (iii) là yếu tố đồng hoạt hóa của các enzyme (apo A – I, apo C – II, apo C – III), (iv) gắn vào các thụ thể chuyên biệt của tế bào (apo A – I, apo B - 100, apo E) [30]

Hình I.3 Một số apolipoprotein trên bề mặt lipoprotein [72]

I.1.4.3 Phân loại lipoprotein

Lipoprotein được phân loại dựa trên tỷ trọng, kích thước, thành phần lipid và loại apolipoprotein [30] Lipoprotein bao gồm các loại: Chylomicrons, Lipoprotein tỉ trọng rất thấp (Very Low Density Lipoprotein, VLDL), Lipoprotein tỉ trọng thấp (Low Density Lipoprotein, LDL), Lipoprotein tỉ trọng trung bình (Intermediate Density Liporotein, IDL) và Lipoprotein tỉ trọng cao (High Density Lipoprotein, HDL) [30]:

• Chylomicron (đường kính > 100 nm, tỉ trọng 0,95 g/ml) được tổng hợp từ ruột non, có chức năng vận chuyển triglyceride và cholesterol từ ruột đến các

mô khác trong cơ thể

• Lipoprotein tỉ trọng rất thấp (Very Low Density Lipoprotein, VLDL) (đường kính 40 – 50 nm, tỉ trọng < 1,006 g/ml) vận chuyển triglyceride và cholesterol từ gan đến các vùng mô khác

• Lipoprotein tỉ trọng thấp (Low Density Lipoprotein, LDL) (đường kính 20 -

25 nm, tỉ trọng 1,019 – 1,063 g/ml) là sản phẩm cuối của quá trình chuyển hóa VLDL có chức năng vận chuyển cholesterol trong huyết tương

• Lipoprotein tỉ trọng trung bình (Intermediate Density Liporotein, IDL) (đường kính 25 - 30 nm, tỉ trọng 1,006 – 1,019 g/ml) là sản phẩm biến đổi của VLDL và là tiền chất của LDL

• Lipoprotein tỉ trọng cao (High Density Lipoprotein, HDL) (đường kính 6 -

10 nm, tỉ trọng 1,063 – 1,21 g/ml) được tạo ra ở gan và ruột, tham gia vào quá trình vận chuyển cholesterol ngược từ mô ngoại vi về gan theo cách trực tiếp hay gián tiếp để thải trừ

TRONG MÁU CÓ TÍNH GIA ĐÌNH (FAMILIAL HYPERCHOLESTEROLEMIA, FH)

I.2.1 Bệnh cao cholesterol trong máu có tính gia đình

Cao cholesterol trong máu có tính gia đình (Familia Hypercholesterolemia, FH) là

một rối loạn di truyền trội nằm trên nhiễm sắc thể thường: NST số 1 (gen PCSK9), NST số 2 (gen ApoB) và NST số 19 (gen LDLR) [6, 50] Bệnh FH có biểu hiện đặc

trưng là tăng cao chỉ số cholesterol trong máu Đây là yếu tố dẫn đến tăng nguy cơ mắc các bệnh về tim mạch, phổ biến nhất là bệnh tim mạch vành (Coronary Heart Disease – CHD) Những bệnh nhân mắc bệnh FH thường có nguy cơ cao mắc bệnh tim mạch vành sớm (trước tuổi 30) so với người bình thường [57]

Bệnh FH gồm thể dị hợp tử và thể đồng hợp tử Mức cholesterol trong huyết tương

ở bệnh nhân FH thể dị hợp tử và thể đồng hợp tử lần lượt cao gấp hai lần và bốn lần

so với người bình thường [4] Tần suất mắc bệnh FH ở thể dị hợp tử và thể đồng hợp tử lần lượt khoảng 1/500 và 1/1 000 000 người Nguy cơ mắc bệnh CHD đối với bệnh nhân FH ở nam giới và nữ giới trước 50 tuổi lần lượt là 50% và 30% [6] Các bệnh nhân FH ở kiểu hình thể dị hợp tử thường có biểu hiện như chỉ số LDL -

C trong huyết tương khoảng từ 5 đến 12 mmol/L [4, 32] Cholesterol xuất hiện bất thường ở những vị trí: giác mạc, gân, hình thành các bướu vàng [13]

Kiểu hình đồng hợp tử thường có biểu hiện như chỉ số LDL - C trong huyết tương

> 12 mmol/L [4, 13] Cholesterol tích tụ gây ra các bướu vàng nghiêm trọng trên da

và gân [13]

I.2.2 Nguyên nhân

Bệnh cao cholesterol do nhiều nguyên nhân: do rối loạn tính chất di truyền (đột biến điểm) ở các gen có chức năng trong quá trình điều hòa lượng cholesterol trong máu

(LDLR, ApoB, PCSK9, LDLRAP1), do chế độ dinh dưỡng (chế độ ăn chứa nhiều

lipid), ít vận động … [27, 56] Đối với di truyền phân tử, nguyên nhân chủ yếu của

bệnh FH thường do đột biến gen trên các gen LDLR (Low Density Lipoprotein Receptor), ApoB (Apoliprotein B) và PCSK 9 (Proprotein Convertase Subtilin/

Kexin 9) [8]

I.3.1 Vị trí của gen

Gen LDLR (Low Density Lipoprotein Receptor) có kích thước 45 kbp, gồm 18 exon

và 17 intron, nằm trên cánh ngắn của nhiễm sắc thể số 19 (19p13.2), sản phẩm

phiên mã của gen LDLR có kích thước 5,3 kb, mã hóa cho chuỗi peptide dài 860

amino acid [18, 24, 32]

Hình I.4 Vị trí gen LDLR trên nhiễm sắc thể số 19 [74]

!

I.3.2 Chức năng của protein LDLR

Gen LDLR mã hóa cho thụ thể trung gian hấp thụ LDL (LDLR) bằng quá trình nhập

nội bào, giúp cho LDL - C trong huyết tương được hấp thụ vào gan [20] Protein LDLR trưởng thành có 839 amino acid bao gồm các vùng domain chức năng tương

ứng với các exon trên gen LDLR [18, 41]:

– Vùng tín hiệu: exon 1

– Vùng ligand (gắn với phối tử): exon 2 – 6

– Vùng chứa tiền chất tăng trưởng biểu bì (EGFP): exon 7 - 14

– Vùng đường hóa: exon 15

– Vùng xuyên màng: exon 16 và 41 bp của exon 17

– Vùng nằm trong tế bào chất: phần còn lại của exon 17 và exon 18

Thụ thể LDL (LDLR) là một glycoprotein trên bề mặt tế bào gan Ở trạng thái bình thường LDLR có vai trò gắn kết với ApoB - 100 của phối tử LDL - C hình thành

“thể clathrin” chuyển LDL - C vào nội bào thông qua tương tác với LDLR Adaptor Protein 1 (LDLRAP1) Sau đó, phức hợp thụ thể - phối tử bị phân tách, thụ thể LDLR được chuyển/phục hồi trên màng tế bào, cholesterol (LDL - C) được tế bào

sử dụng [4]

Sự điều hòa tổng hợp LDLR dựa theo hai con đường: (i) con đường điều hòa kích

hoạt sự hoạt động phiên mã gen LDLR thông qua hoạt động của Steroid Response

Element Binding Protein (SREBP) gắn kết với Steroid Response Element (SRE) trên trình tự DNA mã hóa LDLR, có vai trò làm giảm lượng cholesterol trong máu, (ii) con đường điều hòa sự thoái biến LDLR thông qua hoạt động của yếu tố LXR (Liver X Receptor) tạo ra IDOL (Inducible Degrader of the LDLR), có vai trò duy trì lượng LDL - C thích hợp trong máu [4]

Hình I.5 Các vùng chức năng của thụ thể LDLR [5]

I.3.3 Rối loạn chức năng của protein LDLR

Sự đột biến trên gen LDLR dẫn đến các rối loạn chức năng của LDLR, gồm có [18]:

Nhóm 1: Những đột biến trên gen LDLR dẫn đến không tổng hợp hoặc tổng hợp rất

ít được thụ thể LDL trong lưới nội sinh chất Những bệnh nhân dị hợp tử FH chỉ sản xuất được một nửa số thụ thể LDL Đây là nhóm đột biến rất phổ biến, xấp xỉ ½ các

dạng đột biến trên gen LDLR đã được công bố [18, 36]

Nhóm 2: Những đột biến trên gen LDLR dẫn đến tổng hợp thụ thể LDLR bất

thường (khiếm khuyết) ở dạng không xuất hiện trên bề mặt tế bào, không thể rời khỏi lưới nội sinh chất cho đến khi bị thoái biến hoàn toàn Đa số các phân tử

LDLR khiếm khuyết có trọng lượng phân tử khác nhau từ 100.000 đến 135.000 kDa [12, 18, 36]

Nhóm 3: Những đột biến gen LDLR dẫn đến tổng hợp thụ thể LDL bất thường

(khiếm khuyết), có thể di chuyển tới bề mặt tế bào, nhưng không tương tác được với các LDL – C [18, 36]

Nhóm 4: Những đột biến gen LDLR dẫn đến tổng hợp thụ thể LDL bất thường

(khiếm khuyết) gắn được với phối tử nhưng không tới được các vùng lõm trên bề mặt tế bào để chuyển LDL – C vào bên trong tế bào [18, 36]

Nhóm 5: Những đột biến dẫn tới tổng hợp những thụ thể LDL bất thường (khiếm

khuyết), có thể tạo phức hợp với phối tử nhưng khi chuyển vào bên trong tế bào, không tách rời khỏi LDL – C Do đó, những thụ thể này không thể quay trở lại màng tế bào và bị thoái biến nội bào [18, 36]

Những đột biến gây rối loạn thuộc nhóm 1 được gọi là đột biến “receptor – negative”, ngược lại những đột biến gây sai hỏng thuộc nhóm 2 -5 được gọi là các đột biến “receptor – defective” [6, 18]

I.4.1 Vị trí của gen

Gen ApoB (Apolipoprotein B) có kích thước khoảng 43 kbp, gồm 29 exon và 28

intron, nằm trên cánh ngắn của nhiễm sắc thể số 2 (2p24 – p23) [4, 9] Sản phẩm

phiên mã của gen ApoB gồm có 2 dạng: dạng ngắn là apolipoprotein B – 48 (gồm

2152 acid amin, chiếm 48% tổng số acid amin của protein ApoB) và dạng dài hơn

là apolipoprotein B – 100 (gồm 4536 acid amin, chiếm 100% tổng số acid amin của protein ApoB) [68]

Hình I.6 Vị trí gen ApoB trên nhiễm sắc thể số 2 [73]

I.4.2 Chức năng của protein ApoB

Apolipoprotein B là một loại protein lưỡng cực, có vai trò chính trong quá trình chuyển hóa lipoprotein trong cơ thể, tồn tại dưới hai dạng: ApoB - 100 và ApoB –

48 [68]

ApoB - 48 gồm 2152 acid amin được tổng hợp trong ruột và có vai trò trong sự hình thành Chylomicron [48], góp phần vận chuyển chất béo trong thức ăn cũng như các vitamin tan trong chất béo (A, D, E,K) từ ruột vào máu [49]

ApoB - 100 là một glycoprotein rất lớn, bao gồm 4536 acid amin, có khối lượng phân tử là 550 kDa [67] ApoB - 100 được tổng hợp ở gan và có vai trò trong việc đóng gói các hạt lipoprotein mật độ rất thấp (VLDL) vào bên trong tế bào, từ đó VLDL bị phân giải, cholesterol được tế bào sử dụng, lưu trữ hoặc loại thải khỏi cơ thể [48] ApoB – 100 là thành phần của một vài loại lipoprotein khác nhau như: VLDL, IDL và LDL đây là những chất có liên quan đến sự vận chuyển cholesterol cũng như lipid trong máu [49]

I.4.3 Rối loạn chức năng của protein ApoB

Đột biến trên gen ApoB là nguyên nhân gây ra tình trạng tăng cholesterol có tính gia

đình, chủ yếu là dạng apolipoprotein B – 100 khiếm khuyết có tính chất gia đình (Familial defective apolipoprotein B-100, FDB) Dạng đột biến này dẫn đến sự thay đổi cấu trúc vùng chức năng của Apolipoprotein B – 100, dẫn đến cản trở sự tương tác các LDL – C với các thụ thể LDLR trên bề mặt tế bào Hệ quả là rất ít lipoprotein được chuyển khỏi hệ máu và hàm lượng cholesterol trong máu cao hơn

mức bình thường (≥ 5,0 mmol/L) theo WHO (2008) [68]

I.5.1 Đột biến trên gen LDLR

Các dạng đột biến trên gen LDLR được tìm thấy với tỷ lệ 85 - 90% trên tổng số

trường hợp được chẩn đoán mắc bệnh FH trên thế giới [36, 57] Đột biến trên gen

LDLR rất đa dạng, trải rộng từ exon 1 đến exon 18 Số lượng các dạng đột biến

phân bố trong từng vùng exon của gen LDLR cũng rất biến thiên, chủ yếu tập trung

vào exon 4 với gần 400 đột biến (chiếm tỷ lệ 19,5%) [4, 76]

Hình I.7 Tỷ lệ phân bố số lượng đột biến theo từng exon trên gen LDLR [76]

Đến nay, số lượng các dạng đột biến trên gen LDLR ở những bệnh nhân FH tăng

cao so với thập niên 1980 [4] Các đột biến này gây nên những rối loạn về chức năng trên protein thụ thể LDL (protein LDLR) Theo công bố khoa học của trường Đại học London (University College of London) (2011), có hơn 1700 đột biến khác

nhau (đa số là đột biến điểm) được tìm thấy trên gen LDLR [76] Đa số là các dạng

đột biến thay thế (substitutions) với tỷ lệ 73,5% trên tổng số lượng đột biến được ghi nhận Một số dạng đột biến khác: đột biến gắn chèn (insertions) chiếm tỷ lệ 4,3%, đột biến mất nucleotide (deletions) chiếm tỉ lệ 19,4%, đột biến đột biến lặp đoạn (duplications) có tỷ lệ 3,7%, đột biến đảo ngược (inversion) tỷ lệ là 0,1% và đột biến gắn chèn/mất nucleotide (insertions/deletions) chiếm tỷ lệ 0,9% [4, 76]

I.5.2 Đột biến trên gen ApoB

Không giống như trên gen LDLR, chỉ có một số lượng nhỏ đột biến được tìm thấy trên gen ApoB, chủ yếu là đột biến điểm [6] Các đột biến này được tìm thấy trong

vùng trình tự mã hóa vùng amino acid của phân tử LDL - C của protein ApoB, thuộc vùng trình tự exon 26 và exon 27 [6] Loại đột biến phổ biến nhất là R3500Q, thay đổi acid amin Arginine bằng Glutamine tại vị trí codon thứ 3500 thuộc exon 26

của gen ApoB Đột biến R3500Q có tỷ lệ xuất hiện là 1/500 trên cá thể người Châu

Âu [13] Một loại đột biến điểm khác cùng một vị trí với R3500Q là R3500W là đột biến thay thế acid amin Arginine bằng Tryptophan tại codon 3500 thuộc exon 26 Đột biến R3500W, được tìm thấy trên bệnh nhân Châu Á, ở các quốc gia: Trung Quốc hay Malaysia [13] Ngoài ra còn một số loại đột biến điểm khác trên gen

I.6.1 Phương pháp giải trình tự (Sequencing)

Giải trình tự gen là phương pháp chính xác để phát hiện các đột biến điểm Phương pháp này không chỉ xác định chính xác các đột biến mà còn chỉ ra được bản chất của các đột biến này Hiện nay phương pháp này được sử dụng nhiều trong việc

phát hiện các đột biến gen gây bệnh FH, đặc biệt là trên gen LDLR [38]

I.6.2 Phương pháp phân biệt tính đa hình trong cấu hình sợi đơn DNA (Single Strand Conformation Polymorphism, SSCP)

SSCP là phương pháp phát hiện các dạng biến thể đột biến ở những gen khác nhau Phương pháp này khá phổ biến và xuất hiện trong nhiều công trình nghiên cứu [11,

22, 39, 40]… Độ nhạy của phương pháp phụ thuộc vào chiều dài đoạn khuếch đại, điều kiện điện di, độ rộng của các lỗ trong gel polyacrylamide, có hoặc không có

glycerol Phương pháp này có độ nhạy khá cao (tương đương độ nhạy của phương pháp giải trình tự) trong xác định các đột biến điểm nên được sử dụng nhiều trong

việc xác định các đột biến trên gen LDLR gây bệnh FH [38]

I.6.3 Phương pháp điện di trên gel biến tính (Denaturing Gradient Gel Eletrophoresis, DGGE)

DGGE là một kỹ thuật phát hiện đột biến dựa vào khả năng phân biệt thành phần nucleotide trong các đoạn DNA cùng độ dài bằng phương pháp điện di trên gel biến tính [10]

I.6.4 Phương pháp Multiplex Ligation – Dependent Probe Amplifications (MPLA)

MLPA là phương pháp dùng để phát hiện đột biến tái sắp xếp lớn trong vùng mã

hóa trình tự của gen LDLR Hiện nay, MLPA được sử dụng nhiều vì phát hiện được

nhiều đột biến, thời gian thực hiện giảm 30 – 50%, tiết kiệm công sức nhưng phương pháp này đắt tiền hơn các phương pháp phát hiện đột biến tái sắp xếp lớn khác [35]

I.6.5 Phương pháp phân biệt tính đa hình dựa vào chiều dài giới hạn của các đoạn DNA tương đồng (Restriction Fragment Length Polymorphisms, RFLP)

RFLP là phương pháp phát hiện nhanh chóng các đột biến gen Phương pháp này

có độ nhạy tương đương 88% so với phương pháp giải trình tự Phương pháp này sử dụng các enzyme cắt giới hạn giúp phân biệt allele hoang dại /allele đột biến tại các

vị trí đột biến trên trình tự DNA đích [65]

I.6.6 Phương pháp Southern Blot

Southern Blot cũng là phương pháp phổ biến dùng để phát hiện đột biến tái sắp xếp những đoạn nucleotide lớn (mất/lặp đoạn) trong những thập niên 90 Đây cũng là

phương pháp phát hiện được đột biến đầu tiên của gen LDLR Tuy nhiên phương

pháp này có nhược điểm là khó làm, tốn nhiều thời gian và đòi hỏi cần một lượng lớn DNA bản mẫu Vì vậy hiện nay phương pháp này có rất ít nhà khoa học sử dụng trong phát hiện các đột biến gây bệnh FH cũng như một số đột biến khác [10]

I.6.7 Phương pháp Allele – Specific PCR (AS – PCR)

AS – PCR là phương pháp dùng để phát hiện một đột biến điểm đã biết trước bằng cách phân tích sản phẩm sau khuếch đại qua điện di trên gel agarose hay gel polyacrylamide Phương pháp này hoạt động bởi một đoạn mồi được thiết kế đặc biệt tạo ra mismatch ở đầu 3’ của mồi với DNA mạch khuôn [64] Enzyme DNA polymerase chỉ khuếch đại đoạn trình tự DNA mạch khuôn khi nucleotide ở đầu 3’ của mồi bắt cặp bổ sung tại vị trí đột biến đặc hiệu của đoạn trình tự mục tiêu [17]

Phương pháp này được sử dụng để phát hiện đột biến trên gen ApoB đặc biệt là đột

biến R3500Q [37, 63]

ĐẶC ĐIỂM PHÂN TỬ CỦA BỆNH CAO CHOLESTEROL TRONG MÁU CÓ TÍNH GIA ĐÌNH

Jensen HK và cộng sự (1996) đã sử dụng phương pháp PCR – SSCP kết hợp

phương pháp giải trình tự phát hiện 22 đột biến trên gen LDLR ở các bệnh nhân FH

Đan Mạch [38]

Fard-Esfahani P và cộng sự (2005) đã sử dụng phương pháp AS – PCR phát hiện

đột biến R3500Q trên gen ApoB ở các bệnh nhân cao cholesterol trong máu có tính

Ở Việt Nam có rất ít công trình nghiên cứu về sự đột biến điểm trên các vùng exon

của các gen LDLR và ApoB trên mẫu bệnh phẩm của bệnh nhân cao cholesterol tại

Việt Nam Một số công bố khoa học tại Việt Nam nghiên cứu về bệnh này như:

Nguyễn Trà My và nhóm nghiên cứu (2013): “Khảo sát in silico – thiết kế mồi phản ứng dò đột biến của gene LDLR và ApoB gây tăng cholesterol máu có tính gia

đình”; Nguyễn Trọng Nghĩa làm trưởng nhóm (2014) “Ứng dụng kỹ thuật sinh học

phân tử xác định tần suất đột biến trên gene LDLR, ApoB và PCSK9 trên bệnh nhân

tăng cholesterol trong máu có tính gia đình”

!

!

!

II.1 VẬT LIỆU

Bộ mẫu bệnh phẩm (mẫu huyết tương) do Bệnh Viện Đa Khoa Xuyên Á cung cấp, với chỉ số cholesterol toàn phần và LDL – C cao hơn mức bình thường (theo kết quả xét nghiệm sinh hoá)

II.2.1 Khai thác dữ liệu

Chúng tôi tiến hành thu thập dữ liệu cùng các bài báo khoa học trên NIH (National Institutes of Health), NCBI (National Center for Biotechnology Information), PubMed và Google về khái niệm, cơ sở phân tử, thông tin về bệnh FH và sự đột

biến trên gen LDLR và ApoB gây nên bệnh cao cholesterol trong máu có tính gia

đình

II.2.2 Khảo sát in silico

Chúng tôi tiến hành thu thập trình tự nucleotide của gen LDLR và ApoB từ

khảo sát độ đặc hiệu của các cặp mồi và phát hiện đột biến

Để đánh giá các thông số vật lý của các cặp mồi như: chiều dài, nhiệt độ nóng chảy,

%GC, năng lượng hình thành các cấu trúc thứ cấp (cấu trúc kẹp tóc, primer dimer….) chúng tôi sử dụng phần mềm trực tuyến IDT Analyzer (http://sg.idtdna.com/analyzer/applications/oligoanalyzer/) của hãng IDT

Độ đặc hiệu của mồi được kiểm tra bằng chương trình BLAST trên NCBI (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) và phần mềm Annhyb

II.2.3 Khảo sát thực nghiệm

II.2.3.1 Tách chiết DNA bộ gen người

Chúng tôi sử dụng phương pháp phenol: chloroform để tách chiết DNA bộ gen người Trong đó, màng tế bào và màng nhân được biến tính bằng chất tẩy mạnh (SDS) và proteinase K Sau đó, protein sẽ được biến tính bằng phenol: chloroform

và được loại bỏ DNA bộ gen người sẽ được tủa với ethanol lạnh và bảo quản trong nước cất hai lần hoặc dung dịch TE 1X

Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) 1M (pH = 8)

Ammonium acetate (NH4OAc) 5M

Ethanol 100%

Ethanol 70%

Proteinase K (18,5 mg/ml)

! Quy trình thực hiện:

Hút 50 µl mẫu huyết tương cho vào ống eppendorf loại 1,5 ml

Thêm 1 ml H2O, vortex nhẹ, ly tâm 13000 vòng /phút trong 3 phút, thu tủa Thêm 700 ml dung dịch lysis buffer gồm:

NaCl 0,45M 14 µl Tris HCl 10mM (pH = 8,2) 14 µl EDTA 1M (pH = 8) 14 µl SDS 10% 33 µl H2O 625 µl Trộn đều các thành phần trong eppendorf bằng cách vortex cho tan khối tủa trước khi dung dịch lysic buffer tiếp xúc với mẫu

Thêm 5 µl proteinase K (18,5 mg/ml), trộn đều Ủ ở nhiệt độ 56oC trong 1 giờ

Đưa eppendorf về nhiệt độ phòng, thêm 700 µl dung dịch phenol: chloroform (tỉ lệ 1:1) trộn đều

Ly tâm ở nhiệt độ phòng, 13000 vòng/phút trong 3 phút Thu dịch nổi

Lặp lại 3 lần Sau đó bổ sung Chloroform cùng thể tích với dịch nổi thu được

Ly tâm và thu dịch nổi

Thêm 0,25 lần thể tích NH4OAc 5M và 2,5 lần thể tích Ethanol 100%, đảo

Rửa lại tủa thu được bằng Ethanol 70%, ly tâm 13000 vòng/phút trong 10

Loại bỏ dịch nổi và để khô tự nhiên

II.2.3.2 Đo mật độ quang huyền dịch DNA

Chúng tôi xác định nồng độ và độ tinh sạch DNA bộ gen người sau khi tách chiết bằng phương pháp đo mật độ quang (Optical Density, OD) ở bước sóng 260 nm và

280 nm

A260: độ hấp thu cực đại của DNA ở bước sóng 260 nm

A280: độ hấp thu cực đại của protein ở bước sóng 280 nm

C: nồng độ DNA (C = A260 x 50 x d), d: hệ số pha loãng

! Cách tiến hành:!

Chúng tôi tiến hành pha loãng huyền dịch DNA (d: độ pha loãng 80 lần)

Sau đó, sử dụng micropipette phù hợp thu huyền dịch chuyển vào cuvette thạch anh Tiến hành đo OD ở ở bước sóng 260 nm và 280 nm, ghi nhận nồng độ DNA và chỉ số A260/A280

II.2.3.3 Phản ứng PCR

Chúng tôi tiến hành thực hiện phản ứng PCR:

– Phản ứng PCR với cặp mồi khuếch đại vùng gen LDLR, sản phẩm PCR được

gửi giải trình tự

– Phản ứng AS - PCR với bộ mồi khuếch đại vùng gen ApoB (phản ứng

khuếch đại allele hoang dại, phản ứng khuếch đại allele đột biến) sản phẩm PCR được gửi giải trình tự

Chúng tôi kế thừa các cặp mồi này từ công trình nghiên cứu của Nguyễn Trà My và

các cộng sự “Khảo sát in silico – thiết kế mồi phản ứng dò đột biến của gene LDLR

và ApoB gây tăng cholesterol máu có tính gia đình”

! Thiết bị:

Máy PCR

Tủ thao tác PCR

! Thành phần phản ứng:

Phản ứng PCR được tiến hành trong thể tích 50 µl với mồi PCR giải trình tự gen

LDLR, thành phần và chu kỳ nhiệt của phản ứng PCR như bảng II.1 và bảng II.2

Bảng II.1 Thành phần phản ứng PCR với cặp mồi LDLR

Bảng II.2 Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR với cặp mồi LDLR

Bước Nhiệt độ ( 0 C) Thời gian Số chu kỳ

Phản ứng PCR được tiến hành trong thể tích 50 µl với mồi AS – PCR cho gen

ApoB, thành phần và chu kỳ nhiệt của phản ứng PCR như bảng II.3 và bảng II.4

Bảng II.3 Thành phần phản ứng PCR với bộ mồi ApoB

Bảng II.4 Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR với bộ mồi ApoB

Bước Nhiệt độ ( 0 C) Thời gian Số chu kỳ

II.2.3.4 Phương pháp điện di

Các acid nucleic (DNA) là các đại phân tử tích điện âm, trong điện trường các phân

tử DNA sẽ di chuyển về phía cực dương của điện trường Vận tốc di chuyển của các phân tử DNA phụ thuộc vào khối lượng và cấu trúc của chúng Kỹ thuật điện di được tiến hành trên gel agarose Các phân tử DNA di chuyển trong gel và được phát hiện bởi Ethidium bromide (EtBr), dựa vào đặc tính EtBr gắn vào phân tử acid nucleotide mạch đôi và phát huỳnh quang dưới tác động của tia UV Kích thước của DNA được xác định thông qua thang chuẩn

Cho 1,95 g (1,5%) agarose vào 130 ml dung dịch TAE 1X

Tiến hành đun trong lò vi sóng trong 7 phút, tránh để gel trào ra ngoài

Lặp lại đến khi agarose tan hết

vào, lắc đều

Rót gel vào khuôn điện di đã được cài lược vào

Chờ đến khi gel rắn hoàn toàn thì cẩn thận tháo lược ra khỏi gel

Hòa trộn 5 µl sản phẩm PCR hoặc lượng DNA bộ gen sau tách chiết + 1 µl dung dịch nạp mẫu Thực hiện điện di ở hiệu điện thế 70V trong 30 phút

III.1 KHAI THÁC DỮ LIỆU

Chúng tôi sử dụng các từ khóa: LDLR mutations, ApoB mutations, LDLR,

ApoB - 100, cholesterol, hypercholesterolemia, familial hypercholesterolemia,

familial defective apolipoprotein B-100, FDB, FH … để tiến hành khai thác trên ngân hàng dữ liệu NCBI, NIH và Google Chúng tôi thu được tổng cộng hơn 70 tài liệu tham khảo (tính đến thời điểm hết tháng 4/2015) nghiên cứu về cơ chế phân tử

của bệnh FH và cũng như các loại đột biến trên hai gen LDLR và ApoB Các nguồn tài liệu này cho thấy nghiên cứu về đột biến trên gen LDLR và ApoB gây nên bệnh

FH rất phổ biến trên thế giới, đặc biệt là các nước Châu Âu có số lượng công trình

nghiên cứu nhiều nhất Các đột biến trên hai gen này rất đa dạng đặc biệt là trên gen

LDLR, các công trình nghiên cứu đã sử dụng nhiều kỹ thuật sinh học phân tử để xác

định các đột biến trên hai gen LDLR và ApoB

Chúng tôi tiến hành phân loại các bài báo nghiên cứu khoa học đã thu thập được theo từng chủ đề như sau: tổng quan về cholesterol (định nghĩa, chức năng, điều hòa

và phân tử vận chuyển cholesterol trong máu), tổng quan về bệnh FH, tổng quan về

gen LDLR, tổng quan về gen ApoB, các phương pháp phát hiện đột biến trên gen

LDLR và ApoB và các công trình nghiên cứu thực nghiệm gen LDLR và ApoB trên

thế giới Thông tin phân loại các bài báo được chúng tôi trình bày dưới bảng sau (Bảng III.1)

Bảng III.1 Số lượng các bài báo khoa học thu thập được

Nội Dung Phân Loại Số Lượng Bài báo Tài Liệu Tham Khảo

59, 61, 62, 63, 66, 71]

III.1.1 Gen LDLR

biến khác nhau trên gen LDLR, đã được công bố trên một số công trình nghiên cứu,

bài báo khoa học [4, 76] Các đột biến ở gen này trải rộng trên toàn bộ 18 exon và

17 intron, trong đó exon 4 là exon có số lượng đột biến xuất hiện nhiều nhất (gần

400 đột biến) [76]

Đồng thời chúng tôi tiến hành khảo sát dữ liệu của 17 bài báo khoa học có tiến hành

thực nghiệm trên gen LDLR được thu thập từ các nguồn NCBI, NIH và Google

trong khoảng thời gian từ 1995 đến hết tháng 4/2015 Dữ liệu thu thập được chúng tôi xử lý, phân tích bằng phần mềm MedCalc (13.0.6.0)

Đầu tiên, chúng tôi tìm hiểu về số dạng đột biến/loại đột biến xuất hiện trên gen

LDLR, kết quả được trình bày ở bảng III.2

Bảng III.2 Số dạng đột biến/loại đột biến của gen LDLR

Loại Đột Biến Số Dạng Đột Biến (n (%))

Hình III.1 Số dạng đột biến/loại đột biến của gen LDLR

Chúng tôi ghi nhận có tổng cộng 286 dạng đột biến trên gen LDLR Trong đó loại

đột biến sai nghĩa (Missense) chiếm số sượng nhiều nhất (66,1%), kết quả này phù hợp với nguồn dữ liệu của trường Đại Học London (University College London) về

số lượng của từng loại đột biến được tìm thấy trên gen LDLR [76] Bên cạnh đó

chúng tôi cũng nhận thấy loại đột biến ở vị trí cắt (Splice Site) chiếm số lượng ít

nhất (2,1%) Tính chất số dạng đột biến/loại đột biến của gen LDLR có ý nghĩa

Châu Á – Châu Mỹ 3 (1,2%) [1, 44]

Châu Âu – Châu Mỹ -

Hình III.2 Số lượng các đột biến điểm thuộc gen LDLR trên các Châu Lục

Theo kết quả trên, chúng tôi nhận thấy Châu Âu là châu lục có số lượng đột biến xuất hiện nhiều nhất (77%) và thấp nhất là Châu Phi (1,2%) Chúng tôi chưa thu

thập được công trình nghiên cứu nào về sự đột biến trên gen LDLR ở Châu Úc Bên

cạnh đó, chúng tôi còn ghi nhận được có một số đột biến xuất hện đồng thời ở cả hai và ba Châu Lục như: Châu Âu – Châu Mỹ - Châu Á (0,4%) với đột biến G457R; Châu Á – Châu Âu (1,6%) có các đột biến là: C337Y, E207K, P664L và

Q233P… Tính chất về số lượng các dạng đột biến trên gen LDLR theo từng châu

lục có ý nghĩa thống kê (p < 0,0001)

Kế đến, chúng tôi xác định số lượng đột biến trên từng exon nhằm tìm ra vùng exon

nổi trội trên gen LDLR (Bảng III.4)

Bảng III.4 Số lượng các đột biến trên từng exon thuộc gen LDLR