Hỗ trợ định danh các mẫu nấm ký sinh côn trùng dựa trên phân tích phát sinh chủng loài và cấu trúc bậc hai gene mrLSU (nuclear ribosomal large subunit)

Thông qua việc xây dựng cây phả hệ phân tử, các nhà nghiên cứu có thể dựa vào các chỉ tiêu như địa hình học Topology, giá trị bootstrap, sự phân nhóm để lý giải mối tương quan của các đố

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP.HCM

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Đề tài:

HỖ TRỢ ĐỊNH DANH CÁC MẪU NẤM KÝ SINH CÔN TRÙNG

DỰA TRÊN PHÂN TÍCH PHÁT SINH CHỦNG LOÀI

VÀ CẤU TRÚC BẬC HAI

GENE nrLSU (NUCLEAR RIBOSOMAL LARGE SUBUNIT)

KHOA: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

CHUYÊN NGÀNH: VI SINH – SINH HỌC PHÂN TỬ

GVHD: PGS TS LÊ HUYỀN ÁI THÚY

ThS LAO ĐỨC THUẬN SVTH: TRỊNH HOÀNG LUÂN

MSSV: 1153010446 KHÓA: 2011-2015

Tp Hồ Chí Minh, tháng 05 năm 2015

Trong quá trình làm việc, thời gian tuy ngắn nhưng đã giúp em có được những bài học kinh nghiệm từ thực tế với sự giúp đỡ nhiệt tình của quý thầy cô

Trong quá trình thực hiện khóa luận tốt nghiệp không tránh khỏi những sai sót, em kính mong quý thầy cô cùng góp ý, chỉ dẫn thêm để đề tài được hoàn chỉnh hơn Cuối cùng, em xin kính chúc thầy cô trường Đại Học Mở Thành phố Hồ Chí Minh lời chúc sức khỏe và luôn gặt hái được nhiều thành công trong cuộc sống

Bình Dương, tháng 05 năm 2015

Trịnh Hoàng Luân

Trang ii

DANH MỤC VIẾT TẮT

ATP : Adenosine triphosphate

BLAST : Basic Local Alignment Search Tool

bp : base-pair

nu : nucleotide

DNA : deoxyribonucleotide triphosphate

RNA : ribonucleic acid

LSU : large subunit

rDNA : ribosomal DNA

rRNA : ribosomal RNA

Trang iii

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1 Cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu 15 Bảng 2.2 Các thông số thiết lập cho chu kỳ nhiệt trong phản ứng PCR để khuếch

đại các vùng gene nrLSU 22

Bảng 3.1 Kiểm tra cặp mồi với các thông số vật lý trên IDT 25 Bảng 3.2 Kết quả đo OD mẫu DL0038A và DL0038B được tách chiết theo phương pháp phenol/chlloroform có bổ sung β-mercaptoethanol và CTAB 29 Bảng 3.3 Chiều dài trình tự hai mẫu DL0038A, DL0038B trước và sau khi hiệu chỉnh 38 Bảng 3.4 Hình ảnh cấu trúc bậc hai của mẫu DL0038A, DL0038B và một số mẫu nấm khác 44 Bảng 3.5 Tổng hợp kết quả định danh hai mẫu nấm DL0038A và DL0038B 47

Trang iv

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1.1 Cordyceps sinensis, một loài nấm kí sinh côn trùng 3

Hình 1.2 Sơ đồ vị trí các vùng domain thuộc trình tự nrLSU 9

Hình 2.1 Hình thái giải phẫu mấm nấm DL0038A 18

Hình 2.2 Hình thái giải phẫu mấm nấm DL0038B 19

Hình 3.1 Kiểm tra mồi bằng BLAST trên NCBI 26

Hình 3.2 Vị trí mồi xuôi LR05 được sắp gióng cột với các trình tự dữ liệu 27

Hình 3.3 Vị trí mồi ngược LR5 được sắp gióng cột với các trình tự dữ liệu 27

Hình 3.4 Kiểm tra cặp mồi LR0R/LR5 với Cordyceps Takaomontana 28

Hình 3.5 Hình điện di cho phản ứng PCR mẫu DL0038A, DL0038B 29

Hình 3.6 Hiệu chỉnh cuối mạch R mẫu DL0038A 30

Hình 3.7 Hiệu chỉnh trên mạch R mẫu DL0038A 31

Hình 3.8 Hiệu chỉnh đầu mạch R mẫu DL0038A 32

Hình 3.9 Kết quả hiệu chỉnh mạch R mẫu DL0038A trên NCBI - BLAST 33

Hình 3.10 Hiệu chỉnh cuối mạch R mẫu DL0038B 34

Hình 3.11 Hiệu chỉnh trên mạch R mẫu DL0038B 35

Hình 3.12 Hiệu chỉnh đầu mạch R mẫu DL0038B 36

Hình 3.13 Kết quả hiệu chỉnh mạch R mẫu DL0038B trên NCBI - BLAST 37

Hình 3.14 Cây phả hệ phân tử gen nrLSU được xây dựng bằng phương pháp Maximum Likelihood với bộ cơ sở dữ liệu với bootstrap 1000 lần 40

Hình 3.15 Cây phả hệ phân tử gen nrLSU được xây dựng bằng phương pháp Neighbor-Joining với bộ cơ sở dữ liệu với bootstrap 1000 lần 41

Hình 3.16 Cây phả hệ phân tử gen nrLSU được xây dựng bằng phương pháp Maximum Parsimony với bộ cơ sở dữ liệu với bootstrap 1000 lần 42

Trang v

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

PHẦN 1: TỔNG QUAN 1 CÁC LOÀI NẤM KÝ SINH CÔN TRÙNG 2

1.1 Đặc điểm chung và thành phần loài 2

1.2 Tình hình nghiên cứu trong nước 4

1.3 Tiềm năng ứng dụng 6

2 GENE Nuclear ribosomal large subunits (nrLSU) 8

3 PHẢ HỆ PHÂN TỬ 9

4 CẤU TRÚC THỨ CẤP 11

5 PHƯƠNG PHÁP GIẢI TRÌNH TỰ 13

PHẦN 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1 CẶP MỒI SỬ DỤNG TRONG NGHIÊN CỨU 15

2 DANH MỤC CÁC PHẦN MỀM SỬ DỤNG 15

3 TIẾN TRÌNH NGHIÊN CỨU 17

4 VẬT LIỆU 18

4.1 Dụng cụ và thiết bị 19

4.2 Hóa chất 20

5 QUY TRÌNH TÁCH CHIẾT DNA BỘ GENE 21

6 PHẢN ỨNG PCR 22

6.1 Thành phần phản ứng PCR 22

6.2 Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR 22

6.3 Điện di 22

6.4 Giải trình tự 23

Trang vi

7 HIỆU CHỈNH TRÌNH TỰ 23

8 XÂY DỰNG CÂY PHÁT SINH CHỦNG LOÀI BẰNG PHẦN MỀM MEGA 6.0 23

9 DỰ ĐOÁN VÀ XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC BẬC HAI 24

PHẦN 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 1 PHÂN TÍCH MỒI 15

2 KẾT QUẢ ĐO OD Ở BƯỚC SÓNG 260nm VÀ 280nm 29

3 PCR VÀ ĐIỆN DI GENE nrLSU: 29

4 HIỆU CHỈNH 30

4.1 Hiệu chỉnh mạch R mẫu DL0038A 30

4.2 Hiệu chỉnh mạch R mẫu DL0038B 34

5 CÂY PHÁT SINH LOÀI 39

6 CẤU TRÚC BẬC 2 43

PHẦN 4 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ TÀI LIỆU THAM KHẢO 50

Trang 1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Hiện nay, việc định danh dựa trên công cụ sinh học phân tử là công cụ đắc lực trong việc hỗ trợ định danh hình thái Thông qua việc xây dựng cây phả hệ phân tử, các nhà nghiên cứu có thể dựa vào các chỉ tiêu như địa hình học (Topology), giá trị bootstrap, sự phân nhóm để lý giải mối tương quan của các đối tượng trên cây, kết hợp với các dữ kiện hình thái, giải phẫu học nhằm định danh chính xác các đối

tượng quan tâm Theo Vilgalys và cs, gene nrLSU là một trong những vùng gene

mục tiêu được ứng dụng trong việc phân tích và xây dựng cây phả hệ để hỗ trợ

trong công tác định danh Trình tự nrLSU là vùng gene mã hóa RNA 25S-28S của

ribosome (tiểu phần lớn của ribosome) Vùng gene này chứa nhiều thông tin di truyền có tính bảo tồn cao, được biết rộng rãi trên thế giới và có khả năng thiết kế được cặp mồi phổ quát giúp khuếch đại và giải trình tự của nhiều loài nấm Cặp mồi LR0R/LR5 là cặp mồi phổ quát được sử dụng nhiều trong nhiều nghiên cứu phả hệ phân tử nấm trong những năm gần đây Cặp mồi này được thiết kế để khuếch đại vùng D1-D2 và cho kết quả khuếch đại khoảng 800-1300bp (Sonnenberg và cs,

2007) Vùng D1, D2 là những domain khác nhau nằm trên vùng gene nrLSU có khả

năng giải quyết việc định danh những loài có mối liên quan rất gần gũi với nhau bởi các domain này chứa nhiều thông tin di truyền, có tính biến động Và trong khuôn khổ đề tài, chúng tôi tập trung vào việc định danh hai mẫu nấm ký sinh côn trùng (DL0038A, DL0038B) dựa trên phân tích phát sinh chủng loài và cấu trúc bậc hai

gene nrLSU (sử dụng phần mềm dự đoán cấu trúc Mfold) (Zuker, 2003) với các

thông số thiết yếu như nồng độ Na+= 0,05M; Mg2+ = 0,00M, nhiệt độ mặc định cho quá trình tính toán năng lượng tiêu hao trong quá trình gấp cuộn (tạo cấu trúc bậc 2)

là 25oC

PHẦN 1: TỔNG QUAN

Trang 2

1 CÁC LOÀI NẤM KÝ SINH CÔN TRÙNG

1.1 Đặc điểm chung và thành phần loài

Cordyceps là một chi nấm ký sinh trên côn trùng (Kobayashi, 1982; Spatafora

& Blackwell, 1993) thuộc họ Clavicipitaceae, ngành nấm túi Ascomycota Điểm nổi

bật của nấm ký sinh côn trùng là những giá trị y dược tiềm năng và quý hiếm Điển

hình là Cordyceps sinensis, một loại nấm dược liệu quý hiếm, được ứng dụng nhiều

trong nền tảng y học Trung Quốc trong nhiều thế kỷ Ở mỗi quốc gia khác nhau

Cordyceps sinensis có nhiều tên gọi khác nhau chẳng hạn như DongChongXiaCao

(Trung Quốc), Tockukaso (Nhật Bản) đều có nghĩa là Đông trùng hạ thảo (Choi, 1999) Trong tự nhiên, Cordyceps phân bố chủ yếu ở các vùng núi có độ cao từ

3.500 đến 5.000m so với mặt nước biển, chẳng hạn như cao nguyên Himalaya, Tây

Tạng, Tứ Xuyên, Thanh Hải, Cam Túc, Vân Nam… Do đó Cordyceps luôn luôn là

một dược liệu quý hiếm và có giá trị dược lý cao trong kho tàng dược liệu dân gian (Nguyễn Lân Dũng, 2005)

Cordyceps nội ký sinh trên ấu trùng và cả trên cá thể trưởng thành của nhiều

loài côn trùng khác nhau Quả thể nấm có dạng hình trụ, có thể phân nhánh hay có hình dạng phức tạp Sau khi xâm nhập vào cơ thể côn trùng, bào tử nấm sẽ nảy mầm và phát triển thành hệ sợi nấm Hệ sợi nấm xâm chiếm và thay thế các mô vật chủ và sẽ hình thành quả thể khi gặp điều kiện thích hợp Do vậy, quả thể của

Cordyceps thường được tìm thấy trên xác nhộng hoặc ấu trùng của côn trùng sau

một thời gian nhiễm nấm [18]

Về thành phần loài, hơn 400 loài Cordyceps (Sung và cs, 2007) đã được mô tả

Phần lớn các công bố đến từ các quốc gia thuộc vùng châu Á, trong đó nổi bật hơn

cả là các nước Thái Lan, Trung Quốc, Nhật Bản, Hàn Quốc

Trang 3

Hình 1.1 Cordyceps sinensis, một loài nấm kí sinh côn trùng

(Nguồn: http://www.my-immunity.com/cordyceps.html)

Phân loại khoa học:

Giới (Kingdom): Fungi

Phân giới (Subkingdom): Dikarya

Chi (Genus): Cordyceps

Năm 2007, Sung và cộng sự đã sắp xếp lại hệ thống nhóm nấm Cordyceps và

Clavicipitaceae, kết quả phân loại thành ba họ đơn ngành: Clavicipitaceae s.s

(Clavicipitaceae lớp A), Cordycipitaceae (Clavicipitaceae lớp B) và

Ophiocordycipitaceae (Clavicipitaceae lớp C) (Sung và cs, 2007a, 2007b; Spatafora

Trang 4

và cs, 2007) Việc phân loại phát sinh loài hiện tại của nấm Hypocreleales (Sung và

cs, 2007) như sau:

Clavicipitaceae s.s: Conoideocrella, Hypocrella, Metacordyceps, Moelleriella,

Orbiocrella, Regiocrella, Samuelsia, Shimizuomyces, Villosiclava …

Ophiocordycipitaceae: Cordyceps s.l., Elaphocordyceps, Ophiocordyceps…

Cordycipitaceae: Ascopolyporus, Cordyceps, Hyperdermium, Torrubiella …

Chi Cordyceps Fr (Clavicipitaceae, Hypocreales, Ascomycota) gần đây đã được chia thành 3 họ Clavicipitaceae, Ophiocordycipitaceae, Cordycipitaceae và 4 chi là

Metacordyceps, Elaphocordyceps, Ophiocordyceps và Cordyceps (Sung và cs,

2007)

1.2 Tình hình nghiên cứu trong nước

Ở Việt Nam, các công trình nghiên cứu chủ yếu tập trung liên quan đến việc

thu nhận, khảo sát dược tính của các hợp chất thu nhận các loài Cordyceps, tuy

nhiên các nghiên cứu về thành phần loài vẫn chưa được quan tâm Do vậy, cho đến nay vẫn chưa có một công bố đầy đủ nào về thành phần loài của chi nấm này Sự thiếu thông tin về thành phần loài làm cho khả năng khai thác các loài nấm trong nước ứng dụng trong nghiên cứu, xây dựng quy trình nuôi trồng nấm và sản xuất dược liệu gặp nhiều trở ngại Tại Việt Nam, những nghiên cứu về thành phần loài nấm Đông trùng hạ thảo được công bố vào những năm 1996 và 2001 có 3 loài nấm

thuộc chi Cordyceps, đó là Cordyceps sinensis, Cordyceps militaris và Cordyceps

sabrolifera [10] và 2 loài mới được phát hiện mới cho khu hệ nấm Việt Nam đó là Cordyceps nutans và Cordyceps gunnii [14]

Vào năm 2005, Phạm Thị Vượng (Viện Bảo vệ Thực vật) và Lương Văn Hà (Vườn quốc gia Cúc Phương) cùng với các nhà nấm học trường Đại học Quốc gia Kangwon, Hàn Quốc tiến hành điều tra nhóm nấm ký sinh côn trùng tại vườn quốc gia Cúc Phương Nghiên cứu sử dụng phương pháp so sánh hình thái giải phẫu để

Trang 5

phân loại Kết quả công bố có các loài Cordyceps sp., C nutans, C pruinosa, C

Specocephala, Beauveria bassiana, Beauveria sp., Gibellalus sp., Paecilomyces sp

Năm 2006, nhóm các nhà nghiên cứu nấm ký sinh côn trùng của BIOTEC, Thái Lan đã kết hợp với Viện Sinh học Nhiệt đới khảo sát nhóm nấm này trong vườn quốc gia Cát Tiên Kết quả công bố vào năm 2007 cho biết họ đã thu được tổng cộng 259 mẫu nấm Sơ bộ định danh bằng hình thái dựa trên hệ thống phân loại mới cho thấy có tổng cộng 41 loài được ghi nhận thuộc 17 chi bao gồm

Akanthomyces, Aschersonia, Beauveria, Conoideocrella, Cordyceps, Gibellula, Hirsutella, Hymenostilbe, Hypocrella, Isaria, Metarhizium, Moelleriella, Nomuraea, Ophiocordyceps, Paecilomyces, Torrubiella và Verticillium Tuy nhiên,

trong số này chỉ ghi nhận có 1 loài thuộc chi Cordyceps và 2 loài thuộc chi

Ophiocordyceps (Lê Tấn Hưng và cs, 2010)

Năm 2009, lần đầu tiên ở Việt Nam, Đái Duy Ban cùng các nhà khoa học uy tín đã tìm ra và nhân nuôi thành công Đông Trùng Hạ Thảo với công trình “Nghiên

cứu phát hiện mới loài đông trùng hạ thảo Isaria cerambycidae ở Việt Nam và xác

định một số hoạt chất sinh học trong đông trùng hạ thảo”

Năm 2010, nhóm tác giả Trương Bình Nguyên và cs, đã nghiên cứu phát hiện

các chủng nấm Cordyceps bản địa tại vùng cao nguyên Langbian, Lâm Đồng và

khảo sát được một số hoạt tính sinh học của các loài nấm này

Năm 2012, sau bốn năm nghiên cứu, Trung tâm Nghiên cứu thực nghiệm Nông lâm nghiệp Lâm Đồng đã hoàn thiện quy trình nghiên cứu, sản xuất loại nấm

đông trùng hạ thảo dâu tằm (Paeclomyces tenuipes hay Cordyceps takaomontana)

Đây cũng là lần đầu tiên Việt Nam đã hoàn tất quy trình hoàn chỉnh về sản xuất đông trùng hạ thảo trên con tằm, một loại côn trùng được người dân nuôi từ rất lâu đời và với quy trình này có thể sản xuất đại trà loại dược liệu quý này ngay trên đất Lâm Đồng

Trang 6

Năm 2014, nhóm tác giả Đinh Minh Hiệp và cs, đã định danh một số loài nấm

ký sinh côn trùng bằng việc phân tích phân tử vùng ITS1 -5.8S –ITS2 dựa vào kết quả phát sinh chủng loài và cấu trúc bậc hai Đề tài đặc biệt nhận giải và hỗ trợ kinh phí từ Sở Khoa Học và Công Nghệ Thành phố Hồ Chí Minh

1.3 Tiềm năng ứng dụng

Ở Việt Nam, đông trùng hạ thảo cũng đã được sử dụng làm dược liệu từ rất lâu Đông trùng hạ thảo có một phạm vi ứng dụng rộng, tác dụng hiệu quả trên nhiều bệnh của con người như các bệnh về gan, thận, tim mạch, miễn dịch, thần kinh và các hoạt tính kháng ung thư (Wang & Shiao, 2000) Có thể kể đến một vài nghiên cứu như: khả năng điều hoà đáp ứng miễn dịch [31], ức chế sự phát triển của

tế bào khối u [5] gia tăng chức năng gan [38], thúc đẩy việc tiết ra các hormone tuyến thượng thận [56] giảm huyết áp và sự căng cơ (Chou và cs, 2000) điều hòa đường máu [31]…

Khi các nhà khoa học mở rộng nghiên cứu trên những loài nấm khác trong họ

Clavicipitaceae, các kết quả cho thấy nhiều loài ngoài C sinensis cũng có những

hoạt tính tương tự Tiêu biểu như cordycepin là thành phần chính trong C sinensis - một chất co hoạt tính sinh học trong Cordyceps – phân lập từ C militaris có cấu trúc tương tự như của C.sinensis nhưng với lượng cao hơn (Li và cs, 1995), điều hoà miễn dịch của C cicadae (Weng và cs, 2002) và Paecilomyces japonica (Shin

và cs, 2003), khả năng kháng ung thư của alkali-soluble polysaccharide thu từ C

phioglossoides (Yanada, 1984), hạn chế các yếu tố trung gian gây viêm bằng việc

ngăn cản sự hoạt hoá NF-kB từ C pruinosa (Kim và cs, 2003), hay tác dụng kháng

Ca2+ và chống co thắt cơ tim của loài nấm này (Furuya và cs, 1983), khả năng gây

độc tế bào để chống tế bào ung thư của Paecilomyces tenuipes (Shim và cs, 2000;

Ban và cs, 1998)

Các thành phần có hoạt tính của Cordyceps thường có bản chất là các

nucleoside, polysaccharide, protein, sterol [18] Các chất này thường được phân lập từ hệ sợi hay quả thể

Trang 7

Các nucleoside đã được phân lập từ Cordyseps bao gồm adenin, adenosine,

uracil, uridine, guanidine, guanosine, hypoxanthin, inosine, thymine, thymidine, deoxyuridine, đặc biệt là cordycepin (3’- deoxyadenosine) Cordycepin được nghiên

cứu và phân lập từ C.militaris từ năm 1964 (Kaczka và cs, 1964; Melling và cs,

1972) có tác dụng kháng ung thư (Wang và cs, 2008), ngăn cản quá trình tổng hợp RNA của tế bào HeLa (Siev và cs, 1969), ức chế tổng hợp protein và sự bám dính tế bào (Wong và cs, 2010)

Các polysaccharide hay những hợp chất có nguồn gốc từ đường của

Cordyceps bao gồm d-mannitol (cordycepic acid), beta-glucan, beta-mannan và một

số các polysaccharide phức tạp kết hợp nhiều loại phân tử đường khác nhau Các polysaccharide có khả năng chống ung thư nhưng không tấn công trực tiếp mà gián tiếp bằng việc kích hoạt các hệ thống miễn dịch khác nhau (Wasser, 2002) Bên cạnh đó, chúng còn có khả năng giảm lượng đường trong máu (Kiho và cs, 2000)

Các sterol trong Cordyceps được tìm thấy gồm: ergosterol, delta-3 ergosterol,

ergosterol peroxide, 3-sitosterol, daucosterol, campesterol Ergosterol tìm thấy trong hệ sợi và có ưu thế trong nấm Dạng glycosyl hoá của ergosterol peroxide có tác dụng ức chế sự tăng sinh các dòng tế bào ung thư K562, Jurkat, WM-1341, HL-

60 và RPMI-8226 (Bok và cs, 1998) Các protein, peptide, polyamine, các amino

acid và một số các dipeptide vòng của Cordyceps cũng có hoạt tính chống ung thư

và tiềm năng miễn dịch Đặc biệt, cyclosporine – một loại peptide vòng- phân lập từ

Tolypocladium inflatum (thể vô tính của C subsessilis) đã được sử dụng phổ biến

với vai trò là một chất ức chế miễn dịch hiệu quả cho các trường hợp cấy ghép vật liệu hay cơ quan

Trang 8

2 GENE Nuclear ribosomal large subunits (nrLSU)

Trong nghiên cứu định danh về sinh học phân tử, nhóm nấm ký sinh côn trùng hay ở nhiều loài sinh vật khác thì việc lựa chọn trình tự DNA là vô cùng quan trọng Đòi hỏi trình tự DNA phải có tính bảo tồn cao trong cùng một loài và biến động lớn giữa các loài khác nhau Các gene RNA ribosome khuếch đại bằng mồi phổ quát, có tính bảo tồn cao cho phép phân loại vƣợt mức độ loài [47] Ngoài ra, dựa vào các

vùng bảo tồn của gene rRNA có thể thiết kế các cặp mồi phổ quát (universal primer)

sử dụng khếch đại trình tự của vùng gene rDNA từ nhiều loài trong định danh sinh

học phân tử

rDNA bao gồm nhiều đơn vị lặp lại, mỗi đơn vị lặp lại bao gồm vùng ITS (intergenic transcribed spacer), vùng 18S, 5.8S, 25-28S, 5S RNA và vùng IGS (intergenic spacer) Trong đó vùng 18S-28S là vùng phiên mã chính (Vilgalys, 2004), vùng 18S hình thành tiểu đơn vị nhỏ (SSU), vùng 28S, 5.8S và 5S hình thành tiểu đơn vị lớn (LSU) của ribosome RNA

Từ lâu các vùng gene mã hóa RNA của ribosome (nrSSU, nrLSU) từ lâu đã đƣợc sử dụng làm vùng gene mục tiêu trong nghiên cứu Trình tự nrLSU-rRNA là

vùng gene mã hóa 25S 28S RNA của ribosome (tiểu phần lớn của ribosome) Cấu

trúc của nrLSU-rRNA ngoài những vùng bảo tồn còn có những vùng biến động gọi

là domain D1/D2/D3 (D-divergence region, các số đƣợc đánh thứ tự 1, 2, 3 bắt đầu

từ đầu 5’-3’) [47] Các domain khác nhau của 25-28S rDNA (tiểu phần lớn LSU) chứa nhiều thông tin cho phép so sánh các cấp phân loại từ cao xuống đến cấp độ loài Đặc biệt, vùng DNA D1/D2 mã hóa cho tiểu phần lớn của ribosome gần đây đƣợc xem là rất hữu ích cho việc phân loại phần lớn các loài nấm có giá trị y dƣợc [47]

- Nhánh (clade) là đơn vị phân loại đơn ngành, thường nhóm các sinh vật hoặc các gene bao gồm tổ tiên chung gần nhất

- Taxon – đơn vị phân loài bất cứ nhóm nào mà không cùng một nhánh, taxon đại diện cho các đối tượng đang nghiên cứu, có thể là loài, trình tự gene, trình tự protein…

- Node (nút) là một điểm cho nhánh phân nhánh, đại diện cho tổ tiên chung

Để xây dựng cây phát sinh loài, hiện nay với sự phát triển của khoa học công nghệ kết hợp với thuật giải máy tính, đã có rất nhiều chương trình máy tính thiết kế, xây dựng dựa trên các thuật toán khác nhau để xây dựng cây phát sinh loài (Saitou,

Trang 10

1996; Li, 1997; Swofford và cs, 1996) Một số phần mềm sử dụng hiện nay như: PAUP*, MEGA6, PHYLIP…

Marsimum Parsimony (MP) là cây tiến hóa tốt nhất để mô tả tiến trình tiến

hóa, cây mô tả được các loài ít thay đổi nhất (tức ít đột biến nhất), cây vì thế có điểm thấp nhất (hà tiện) theo một tiêu chuẩn định s n [30] Nguyên lý của phương pháp Maximum Parsimony là tìm kiếm một cây sao cho số lượng thay đổi tiến hóa

là thấp nhất để giải thích những sự khác nhau được nhìn thấy qua các đơn vị phân loại hiện hữu OTUs (operational taxanomic unit) Cây sẽ tính điểm thấp nhất (điểm

hà tiện) nên thông thường phương pháp parsimony sẽ chọn cây có tổng chiều dài nhỏ nhất [33]

Neighbour Joining (NJ) là một trong những phương pháp xây dựng cây tiến

hóa với ít nhánh nhất Nguyên tắc của phương pháp này là tìm ra thứ tự các nhóm hàng xóm (neighbour) hợp lý nhất làm giảm tổng chiều dài của cây tiến hóa Mô hình tiến hóa là một hàm hiện nên một trong số mô hình tiến hóa được chọn để tính toán khoảng cách di truyền giữa từng cặp taxa từ đó cho ra một ma trận khoảng cách giữa tất cả các taxa Do phương pháp Neighbour Joining là một trong những phương pháp nhanh nhất để dò tìm cây tiến hóa nên nó thường được sử dụng để phân tích khối dữ liệu lớn với nhiều taxa Cây Neighbour Joining là cây không có gốc nên chỉ cho biết mối quan hệ giữa các nhánh [33]

Maximum Likelihood (ML) có mô hình tiến hóa là hàm hiện.Nhóm phương

pháp này dựa trên một hàm toán học tính toán xác suất khả năng một cây tiến hóa được tạo thành từ dữ liệu đã quan sát Hàm này cho phép việc tích hợp các quá trình tiến hóa của đặc tính thành mô hình xác suất Phương pháp hợp lý cực đại chọn lựa cây tiến hóa tối đa mà khi quan sát các dữ liệu dưới một mô hình nào đó có xác xuất tối đa [30] Ứng với mỗi mô hình, phương pháp này sẽ tính toán khả năng xác suất dưới dạng lnL mà một cây tiến hóa có thể có từ chuỗi trình tự phân tích Cây tiến hóa có xác suất cao nhất là cây cuối cùng được chọn [33]

Trang 11

Mô hình tiến hóa phức tạp nhất hiện nay là mô hình có khả năng hồi biến tổng quát theo thời gian (General time reverible model) Mô hình này cho rằng có 6 kiểu biến đổi và trong đó mỗi kiểu biến đổi có một tốc độ khác nhau Một vài mô hình tiến hóa ngẫu nhiên phổ biến gồm Jukes-Cantor, Kimura 2-parameter (K2P), Tamura 3-parameter, Hasegawa-Kishino-Yano (HKY), Tamura Nei, General Time Reversible (GTR)…

Hiện nay, một trong các phương pháp đánh giá cây phả hệ phân tử là phân tích chỉ số bootstrap Chỉ số bootstrap là tần số xuất hiện của một nhóm (cluster) trên số lần giản đồ được thiết lập, đơn vị tính là % (phần trăm) Theo Felsenstein năm

1985, bootstrap là một công cụ hỗ trợ cho việc xây dựng cây phát sinh loài [28] Chỉ

số bootstrap nói lên độ tin cậy của sự gần gũi các thành viên của nhóm của cây phả

hệ Phân tính bootstrap là một phương pháp thống kê để có được sự ước tính về các lỗi sai sót khi dựng cây Phân tích bootstrap thường dùng để kiểm tra độ tin cậy một cây, cụ thể là đánh giá độ tin cậy của sự phân nhóm loài trên một cây Phân tích này thường được sử dụng để kiểm tra các taxa được nhóm thành cụm như thế nào dựa vào các trình tự nucleotide hay acid amin làm mẫu phụ [60] Ưu điểm của phương pháp bootstrap là nó có thể áp dụng cho tất cả các phương pháp dựng cây cơ bản Khi giá trị bootstrap ≥75% thì thể hiện tính tương đồng của loài cao, và khi ≥95% thể hiện mức độ tương đồng và độ tin cậy càng cao

4 CẤU TRÚC THỨ CẤP

Cấu trúc thứ cấp của một phân tử acid nucleic đề cập đến sự bắt cặp tương tác của một phân tử và các phân tử, có thể được biểu diễn như là một chuỗi phân tử acid nucleic [9] Cấu trúc thứ cấp của DNA và RNA khác nhau: DNA chủ yếu tồn tại ở dạng bắt cặp hoàn toàn và kết hợp xoắn kép, trong khi RNA thường có dạng bắt cặp phức tạp do tăng khả năng của nó để tạo thành liên kết hydro bắt nguồn từ các hydroxyl nhóm phụ trong đường ribose

Trong chuỗi DNA hoặc RNA, 2 mạch bổ sung đối diện nhau được kết nối thông qua liên kết hydro được gọi là base pair (viết tắt bp) Theo Watson-Crick cơ

tiếp Các axit nucleic xoắn kép là một chuỗi polymer xoắn ốc, có chứa hai mạch bổ

sung nucleotide bắt cặp với nhau [4] Hầu hết các phương pháp dự đoán cấu trúc thứ cấp dựa trên một mô hình năng lượng tương đồng với nhau [39] Đối với nhiều phân tử RNA, cấu trúc thứ cấp rất quan trọng đối với chức năng chính xác của RNA

Cấu trúc thứ cấp thường có thể dự đoán được và phân tích mà không cần sự tương đoán cấu trúc bậc 3 Có ba kỹ thuật dung để dự đoán cấu trúc thứ cấp:

- Đầu tiên là dựa vào các chương trình, phần mềm Tin- Sinh học để phân tích khả năng bắt cặp

- Thứ hai là dựa vào mức năng lượng tự do (∆G) và nguyên lý của nhiệt động học để dự đoán cấu trúc bậc hai

- Xây dựng cây phát sinh chủng loài là yếu tố thứ ba, dựa vào các trình tự có chức năng phân tử tương đồng và liên quan về mặt cấu trúc

Trong quá trình phân tích phả hệ phân tử, sự khác biệt một hay một vài nucleotide giữa các trình tự không cho phép xác định rõ ràng ranh giới về loài, trong khi đó, sự khác biệt một vài nucleotide sẽ ảnh hưởng đến mức năng lượng tạo thành cấu trúc bậc hai (secondary structure) của trình tự đó và từ đó ảnh hưởng đến kiểu cấu trúc bậc hai [58] Ở Việt Nam, Đinh Minh Hiệp và cs đã dựa trên bộ dữ liệu ITS

1990, dự án Bộ gene người được triển khai và hoàn thành 13 năm sau đó, sớm hơn

dự tính 2 năm Dự án này đem lại một lượng dữ liệu lớn cho bộ gene người nhờ phương pháp giải trình tự

Trong lĩnh vực định danh phân tử, nghiên cứu phát sinh loài… thì chỉ cần phân tích xác định trình tự một vùng biến động giữa các loài cần khảo sát mà không cần thiết phải xác định toàn bộ trình tự bộ gene Từ hai phương pháp giải trình tự chính là phương pháp hóa học của Maxam-Gillbert và enzyme học của Sanger (1977), các kỹ thuật giải trình tự dần được cải tiến cho đến ngày nay Mặc dù có nhiều sự khác biệt giữa các phương pháp, nhưng cơ bản vẫn là thực hiện các phản ứng (dùng các tác nhân hóa học hay enzyme xúc tác…) tạo ra tập hợp các đoạn oligonucleotide có chiều dài khác nhau mà nucleotide tận cùng các đoạn này có thể xác định được,sau đó phân tách các đoạn oligonucleotide bằng điện di trên gel polyacrylamide (PAGE) hay điện di mao quản (capillary electrophoresis) và xác định trình tự dựa trên tín hiệu huỳnh quang hay đánh dấu phóng xạ [55]

Phương pháp enzyme học (phương pháp Sanger) tiến hành phản ứng tổng hợp các phân tử DNA với một hàm lượng nhỏ dẫn xuất dideoxy của các nucleotide (dideoxynucleotide triphosphate, ddNTP) Các nucleotide dẫn xuất này bị khử mất thêm một nhóm OH nên phản ứng polymerase không tiếp tục mà kết thúc tại

Trang 14

nucleotide đó Như vậy, tất cả các phân tử được tạo ra trong phản ứng đó đều mang đuôi là A, nếu ddNTP trộn vào là ddATP, tương tự như vậy là T,C hoặc G khi trộn ddTTP, ddCTP hoặc ddGTP

PHẦN 2 VẬT LIỆU

VÀ PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU

Trang 15

Cặp mồi LR0R/LR5 là cặp mồi phổ quát được sử dụng trong nhiều nghiên cứu phả hệ phân tử nấm trong những năm gần đây Cặp mồi này được thiết kế để khuếch đại vùng D1-D2 và cho kết quả khuếch đại khoảng 800-1300 bp [38] Vùng

D1, D2 là những domain khác nhau nằm trên vùng gen nrLSU có khả năng giải

quyết việc định danh những loài có mối liên quan rất gần gũi với nhau bởi các domain này chứa nhiều thông tin di truyền, có tính biến động

Bảng 2.1 Cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu

 Annhyb: phiên bản 4.946 (Olivier Friard, 2012) là phần mềm miễn phí giúp

làm việc và quản lý các trình tự nucleotide dưới nhiều định dạng

 Clustalw2: là một phần mềm miễn phí (giao diện window) dùng cho việc so

sánh sự tương đồng của hai hay nhiều trình tự sinh học

 SeaView: phiên bản 4.2.12 (Manolo Gouy) Sea View là phần mềm miễn phí

có các tính năng hỗ trợ cho các phân tích tương đồng, sắp gióng cột các trình

tự

 Chromas Lite: phiên bản 2.1.1 chương trình miễn phí dùng để hiệu chỉnh

trình tự

Trang 16

 MEGA: phiên bản 6.06 (Kumar, 2013) Phần mềm miễn phí dùng để xây

dựng cây phát sinh loài theo các phương pháp Maximum Parsimony, Maximum Likelihood, Neighbor-Joining

 Mfold: phiên bản 3.1 (Zuker, 2013) Phần mềm trực tuyến dùng để dự đoán cấu trúc bậc hai: http://mfold.rna.albany.edu

Trang 17

3 TIẾN TRÌNH NGHIÊN CỨU

Nhận lấy mẫu nấm ký sinh côn trùng DL0038A và DL0038B

Tách chiết DNA từ các mẫu nấm ký sinh côn trùng theo phương pháp

Phenol/Choroform

Khuếch đại vùng gene nrLSU với cặp mồi LR0R/LR5

Giải trình tự sản phẩm PCR đã khuyếch đại và hiệu chỉnh trình tự

Kiểm tra độ tương đồng bằng BLAST

Xây dựng bộ dữ liệu DNA

Dò tìm mô hình tiến hóa bằng phần mềm MEGA 6.0

Xây dựng cây phát sinh loài (NJ, MP, ML) với các thông số mô hình tiến hóa thích hợp

Định danh sơ bộ dựa trên kỹ thuật phylogeny và so sánh kết quả giữa các cây dựng được và với cây phát sinh loài đã công bố của nghiên cứu trước

Xác định cấu trúc bậc hai của 2 mẫu DL0038A và DL0038B

Kết luận tên loài cho mẫu phân tích

Trang 18

4 VẬT LIỆU

Các mẫu hệ sợi nấm được phân lập và làm thuần từ hai mẫu nấm ký sinh côn trùng DL0038A và DL0038B thu thập từ những chuyến đi thực địa tại vùng núi Langbiang khu vực tỉnh Lâm Đồng do Hội Sinh Học Tp Hồ Chí Minh cung cấp

Về định danh hình thái, hai mẫu DL0038A và DL0038B được định danh sơ bộ

chính là loài Cordyceps Takaomontana

Hình 2.1 Hình thái giải phẫu mấm nấm DL0038A

A Thể bó (quả thể) nấm Cordyceps takaomontana (DL0038A) trong tự nhiên;

B Kí chủ bị bao bọc bởi lớp sợi dày tạo giả hạch màu trắng; C Thể chén nhô cao;

D Hệ sợi phát triển trên môi trường Agar, màu vàng khi già;

E Hệ sợi phân nhánh mạnh; F Thể bình; G Hình thành bào tử đốt; H Bào tử đốt

Trang 19

Hình 2.2 Hình thái giải phẫu mấm nấm DL0038B

A Quả thể Cordyceps takaomontana (DL0038B) còn non, được bao phủ bởi lớp

bụi bào tử màu trắng, thể chén chưa nhô lên khỏi bề mặt quả thể;

B Hệ sợi phát triển trên môi trường PGA; C,D Một số dạng bào tử vô tính;

E Hệ sợi với nhiều cấu trúc thể bình

Máy vortex (Vortex ZX3, Velp )

Máy ly tâm lạnh (Hettich Universal 320R, Đức)

Bộ điện di DNA (BioRad)

Trang 20

Tủ lạnh (LG)

Tủ đông (Sanyo)

Tủ ủ nhiệt (Multitemp III)

Cân kỹ thuật (Satorious, Đức)

Tủ hút khí độc (Ascent Max)

Máy quang phổ kế (Scanning UV VIS, Smart Spec, BioRad)

Máy luân nhiệt (My-Cycler Thermal, BioRad)

Máy chụp ảnh gel (Gel Doc XR System, BioRad)

5 QUY TRÌNH TÁCH CHIẾT DNA BỘ GENE

Tách chiết DNA kế thừa phương pháp phenol chloroform của Chomczynski

và cs năm 1987 đã được biến đổi để tách chiết DNA (Phenol pH=4 thay thế bằng pH=8), bổ sung β-mercaptoethanol

Bước 1: Ly giải tế bào

Dùng que cấy vòng (vô trùng) tiến hành lấy một phần hệ sợi nấm (khoảng 1.5g) hòa tan trong ống eppendorf chứa s n 700µl dung dịch lysis buffer, đảo ống đều Sau đó ủ qua đêm ở nhiệt độ 65o

C

Bước 2: Tách chiết DNA bộ gene phương pháp Choroform/ Phenol

Tiến hành ly tâm 13.000 vòng/phút trong 10 phút và loại bỏ phần cặn, thu dịch nổi, bổ sung 700µl dung dịch PCI (Phenol/ Choroform/ Isoamylalcohol với tỷ lệ 25:24:1), lắc đều ống và ly tâm 13.000 vòng/phút trong 10 phút Sau đó lại thu dịch nổi, bổ sung 1V Choroform, lắc đều và đem ly tâm 13.000 vòng phút

Thu dịch nổi, tiến hành bổ sung 1/10V dung dịch NaOAc 3M, lắc đều Bổ sung 1V isopropanol, lắc đều và ủ ở nhiệt độ 4oC trong vòng 2 giờ

Trang 22

Sau đó ly tâm 13.000 vòng/phút trong 20 phút Loại bỏ dịch nổi, thu tủa và bổ sung 1ml ethanol 70o Tiếp tục ly tâm 13.000 vòng trong 10 phút ở 4oC, loại dịch nổi, loại ethanol và làm khô cặn ở 50oC Cuối cùng bổ sung 50µl TE 1X

Mẫu được tiến hành đo OD260 - OD280 để xác định nồng độ DNA (pha loãng

50 lần) và lưu giữ ở -20oC Mẫu được gọi là tinh sạch khi 1,8 ≤ OD260/OD280 ≤ 2,0

Water free nuclease (hoặc ddH2O) 5,5 µl

6.2 Chu nhiệt cho phản ứng PCR

Bảng 2.2 Các th ng thiết lập cho chu nhiệt trong phản ứng PCR

để huếch đại các v ng gen nrLSU

Kéo dài cu i cùng Nhiệt độ

đó, trình tự cần phải được được đọc theo hai chiều nên một trong hai kết quả cần được đổi lại (reverse-complement) trước khi tiến hành so sánh

So sánh tín hiệu huỳnh quang ngay tại vị trí sai lệch giữa hai kết quả giải trình

tự có thể xác định được đúng loại base nào tương ứng ở vị trí đó Trong một vài trường hợp, các tín hiệu vẫn không thể phân biệt, những vị trí này sẽ được ghi nhận

và xác nhận lại hoặc viết dưới dạng kí hiệu chung theo mẫu IUPAC (IUPAC ambigous nicleotide code) Chẳng hạn, ký tự Y được đại diện cho nucleotide loại C hoặc T Kết quả sau khi hiệu chỉnh được tái kiểm tra thật kỹ bằng mắt và so sánh trên cơ sở dữ liệu nucleotide trên Genbank

8 XÂY DỰNG CÂY PHÁT SINH CHỦNG LOÀI BẰNG PHẦN MỀM MEGA 6.0:

Việc xác định mô hình tiến hóa là một bước quan trọng trong việc xây dựng cây phát sinh chủng loài Trong đề tài này, việc xác định mô hình tiến hóa được xác định bằng phần mềm MEGA 6.0 Mô hình tiến hóa phù hợp nhất là mô hình tiến hóa có giá trị điểm BIC thấp, các thông số của mô hình thích hợp này được khai báo cho việc xây dựng cây phả hệ bằng phương pháp Maxium Likelihood Các cây phát sinh chủng loài được xây dựng bằng các phương pháp: Maximum Likelihood, Neighbour-Joining và cây Maximum Parsimony với giá trị Bootstrap lặp lại 1000 lần

Trang 24

Theo phương pháp Maximim Likelihood: được tạo bằng phần mềm MEGA 6.06 (Kumar, 2013) sử dụng các thông số mô hình tiến hóa từ chức năng Test Models

Theo phương pháp Neighbor Joining: được thực hiện bằng MEGA 6.06 Cây tiến hóa được suy ra với thuật toán Neighbor-Joining

Theo phương pháp Maximum Parsimony: được thực hiện bằng MEGA 6.06 với thiết lập chạy với giá trị bootstrap là 1000 lần

9 DỰ ĐOÁN VÀ XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC BẬC HAI:

Việc dự đoán cấu trúc bậc 2 được thực hiện bằng phần mềm trực tuyến Mfold 3.1 của Zuker (2013) [58] Các thông số thiết yếu được thiết lập cho chương trình

dự đoán cấu trúc bậc hai bao gồm ion Na+=0,05 và nhiệt độ cho quá trình gấp cuộn DNA là 25oC