Nghiên cứu khả năng ức chế hoạt tính của enzyme α amylase từ cao chiết lá cóc đỏ (lumnitzera littorea)

Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất lên hoạt động của enzyme α-amylase .... Hiện nay chưa có thuốc chữa khỏi bệnh đái tháo đường, tuy nhiên trường hợp mắc phải đái tháo đường tuýp II có thể ph

Khóa: 2011-2015

Tp Hồ Chí Minh, ngày 05, tháng 05, năm 2015

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên xin giành lời biết ơn đến gia đình tôi đã tạo điều kiện cho tôi được

học tập trong suốt thời gian qua

Để hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này, tôi xin gửi đến Ban giám hiệu trường

Đại học Mở Tp Hồ Chí Minh, lãnh đạo phòng Giáo Dục và Đào tạo Đại học và

Ban Chủ nhiệm Khoa Công nghệ Sinh học lời cảm ơn và lòng tự hào được học tập

tại trường trong những năm qua

Lời cảm ơn sâu sắc nhất xin được gửi đến cô Th.S Nguyễn Thị Lệ Thủy- giảng

viên hướng dẫn và Th.S Nguyễn Thị Phương Khanh- giảng viên phụ trách phòng thí

nghiệm Sinh Hóa đã tận tình giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuẫn lợi nhất cho tôi

thực hiện khóa luận này

Xin chân thành cảm ơn các thầy cô trong Khoa Công nghệ Sinh học đã giảng

dạy, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian vừa qua

Xin cảm ơn tất cả bạn bè đã giúp đỡ và độngg viên tôi những lúc khó khăn trong

quá trình học tập tại trường

Bình Dương, ngày 06, tháng 05, năm 2015

Người thực hiện Trần Lê Trúc Thanh

MỤC LỤC

DANH MỤC BẢNG i

DANH MỤC HÌNH ii

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT iii

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

PHẦN I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

TỒNG QUAN VỀ CHI LUMNITZERA 3

Phân loại thực vật 3

Đặc điểm nhận dạng 3

Đặc điểm sinh học 4

Giá trị kinh tế của chi Lumnitzera 4

Thực trạng và một số nghiên cứu về chi Lumnitzera 4

1.2 TỔNG QUAN VỀ BỆNH TIỂU ĐƯỜNG 5

Khái quát về bệnh tiểu đường 5

Tình hình bệnh tiểu đường hiện nay 6

Những biến chứng của bệnh tiểu đường 8

Tìm hiểu một số loại thuốc trị bệnh tiểu đường 9

1.3 TỔNG QUAN VỀ HỆ ENZYME AMYLASE 11

Giới thiệu chung 11

Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động của enzyme α-amylase 12

PHẦN II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15

Địa điểm nghiên cứu 15

2.2 Vật liệu nghiên cứu 15

2.3 Thiết bị, dụng cụ và hóa chất 16

Thiết bị và dụng cụ 16

Hóa chất 16

2.4 Nội dung nghiên cứu 16

Nghiên cứu động học của phản ứng enzyme -amylase 18

2.4.1.1 Nghiên cứu sự ảnh hưởng của thời gian ủ enzyme lên quá trình thủy phân cơ chất 18

2.4.1.2 Nghiên cứu sự ảnh hưởng của nồng độ cơ chất lên hoạt động của enzyme α-amylase 19

2.4.1.3 Nghiên cứu sự ảnh hưởng của pH lên hoạt động của enzyme α-amylase 21

Nghiên cứu khả năng ức chế hoạt tính enzyme -amylase của cao chiết lá Cóc đỏ (Lumnitzera littorea) 22

So sánh khả năng ức chế hoạt tính enzyme -amylase của cao Cóc đỏ và Cóc trắng 25

PHẦN III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28

Kết quả nghiên cứu động học của phản ứng enzyme -amylase 28

3.2 Kết quả nghiên cứu khả năng ức chế hoạt tính của enzyme -amylase của cao chiết lá Cóc đỏ (Lumnitzera littorea) 32

3.3 Kết quả so sánh khả năng ức chế hoạt tính enzyme -amylase của cao Cóc đỏ và Cóc trắng 35

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 37

TÀI LIỆU THAM KHẢO iv PHỤ LỤC

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2 1 Ảnh hưởng của thời gian ủ lên phản ứng thủy phân cơ chất 18

Bảng 2 2 Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất lên hoạt động của enzyme α-amylase 20

Bảng 2 3 Ảnh hưởng của pH lên hoạt động của enzyme α-amylase 21

Bảng 2 4 Bố trí thí nghiệm của cao chiết lá Cóc đỏ 23

Bảng 2 5 Thí nghiệm so sánh khả năng ức chế hoạt tính enzyme của 2 loại cao chiết 26

Bảng 3 1 Ảnh hưởng của thời gian ủ enzyme lên phản ứng thủy phân cơ chất 28

Bảng 3 2 Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất 30

Bảng 3 3 Ảnh hưởng của pH 31

Bảng 3 4 Khả năng ức chế hoạt tính enzyme α-amylase bởi cao chiết lá Cóc đỏ 32

Bảng 3 5 Kết quả IC50 chủa các loại cao chiết từ lá Cóc đỏ (Lumnitzera littorea) 34

Bảng 3 6 Giá trị IC50 của Cóc đỏ và Cóc trắng 35

DANH MỤC HÌNH

Hình 1 1 Cóc đỏ (Lumnitzera littorea) và Cóc trắng (Lumintzera racemosa) 3

Hình 1 2 Sự phân bố người bệnh tiểu đưởng trên thế giới (2010) 7

Hình 1 3 Các loại enzyme exoamylase và endoamylase 11

Hình 1 4 Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất lên vận tốc phản ứng 13

Hình 2 1 Nguyên liệu lá Cóc đỏ (Lumnitzera littorea) trước và sau khi phơi 15

Hình 2 2 Quy trình điều chế cao phân đoạn lá Cóc đỏ (Lumnitzera littorea) 17

Hình 2 3 Quy trình nghiên cứu khả năng ức chế hoạt tính enzyme amylase 24

Hình 3 1 Ảnh hưởng của thời gian ủ enzyme lên phản ứng thủy phân cơ chất 29

Hình 3 2 Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất 31

Hình 3 3 Khả năng ức chế hoạt động của enzyme α-amylase bởi các loại cao chiết 33

Hình 3 4 Đồ thị IC50 của các loại cao chiết từ lá Cóc đỏ (Lumnitzera littorea) 34

Hình 3 5 Giá trị IC50 của cao Cóc đỏ và Cóc trắng 36

Hình 3 6 Quy trình ức chế hoạt tính enzyme α-amylase 38

ĐẶT VẤN ĐỀ

Ngày nay, bệnh đái tháo đường gia tăng một cách nhanh chóng trên thế giới cũng như ở Việt Nam Nước ta không phải là quốc gia có tỉ lệ đái tháo đường lớn nhất thế giới nhưng bệnh đái tháo đường ở nước ta phát triển nhanh nhất thế giới

Ai cũng có khả năng mắc phải căn bệnh này, vì bên cạnh các yếu tố khách quan

do di truyền, sắc tộc, môi trường địa lý, nó là hệ quả trực tiếp mang lại do các thói quen sống chưa lành mạnh như: ăn uống không điều độ, ít vận động, lối sống công nghiệp với thực phẩm ăn nhanh, ít dinh dưỡng và quá thừa năng lượng, kèm theo áp lực công việc và cuộc sống, tình trạng căng thẳng (stress) kéo dài, đều là những nhân tố tác động đến khả năng mắc bệnh tiểu đường Bệnh tiểu đường là một trong những nguyên nhân chính của nhiều bệnh hiểm nghèo, điển hình là bện tim mạch vành, tai biến mạch máu não, mù mắt, suy thận,…v.v

Một báo cáo vể tình hình bệnh đái tháo đường loại II hiện nay ở châu Á được phổ biến trên tạp chí JAMA số 20 ngày 27/05/2009 đã cho thấy đái tháo đường đang có khuynh hướng tăng cao Vì vậy, việc nghiên cứu các phương pháp điều trị bệnh tiểu đường đang được các nhà khoa học quan tâm, đặt biệt là phương pháp điều trị bệnh có nguồn gốc sinh học

Hiện nay chưa có thuốc chữa khỏi bệnh đái tháo đường, tuy nhiên trường hợp mắc phải đái tháo đường tuýp II có thể phòng tránh được bằng cách ức chế hay hạn chế sự hoạt động của enzyme α-glucosidase hay α-amylase bởi các loại thuốc có sẵn trên thị trường như: các loại insulin, nhóm thuốc sulphonylurea, thuốc ức chế men α-glucosidase, metformin, nhóm thiazolidinedione (TZD),… Tuy nhiên tác dụng phụ của các loại thuốc này là gây tăng cân, đầy hơi, buồn nôn, hay hạ đường huyết quá thấp,… Do đó, mong muốn tìm ra loại thuốc mới an toàn, hiệu quả, giảm các tác dụng phụ và có nguồn gốc từ sinh học, tự nhiên đối với những trường hợp mắc phải bệnh đái tháo đường là hết sức cần thiết

Các công trình nghiên cứu hoạt tính của thực vật ở rừng ngập mặn cho thấy một

số loài cây có giá trị trong nghiên cứu khoa học và là nguồn dược liệu có hoạt tính

sinh học như: Mắm biển (Avicennia marima), Bần chua (Sonneratia caseolaris), Ngọc nữ biển (Clerodendrum inerme), Ô rô (Acanthus ilicifolius), Cóc trắng

(Lumnitzera racemosa),… Trong đó có loài cây Cóc đỏ (Lumnitzera littorea) là một

trong những loài cây quý, có giá trị cao trong kinh tế như làm gỗ, chất đốt, hoa kiểng, cây cảnh, mà còn có vai trò trong y học dân gian như chữa trị một số bệnh nấm vòm họng, viêm loét miệng,… Chính vì giá trị kinh tế cao mà hiện nay loài cây Cóc đỏ này đã có mặt trong sách đỏ Việt Nam (2006), do nạn chặt phá rừng thường xuyên xảy ra ở các khu vực rừng ngập mặn

Trên cơ sở đó, đề tài “Nghiên cứu và xây dựng quy trình ức chế hoạt tính

của enzyme α-amylase từ cao chiết lá Cóc đỏ (Lumnitzera littorea)” được thực

hiện với mục đích tìm kiếm nguồn nguyên liệu tự nhiên có khả năng ức chế enzyme α-amylase, đồng thời nâng cao giá trị khoa học cũng như giá trị y học cho loài cây

Cóc đỏ (Lumnitzera littorea)

PHẦN I TỔNG QUAN TÀI LIỆU

TỒNG QUAN VỀ CHI LUMNITZERA

Chi Lumnitzera là chi sống ở rừng ngập mặn, theo Phạm Hoàng Hộ[1] ở Việt

Nam chi này có 2 loài là: Cóc đỏ (Lumnitzera littorea) và Cóc trắng (Lumnitzera

racemosa)

Tên Việt Nam: cây Cóc đỏ và Cóc trắng

Tên Khoa học: Lumnitzera littorea (Jack) Voigh; Lumintzera racemosa Willd

Đặc điểm nhận dạng

Về cơ bản cây Cóc đỏ (Lumnitzera littorea) và cây Cóc trắng (Lumnitzera

racemosa) không có gì khác nhau, ngoại trừ màu sắc hoa Cây gỗ vừa hay nhỏ, cao

tới 15 m, cành khúc khuỷu, vuông, có rất nhiều mắt là do những vết sẹo của lá rụng

để lại trên cây Lá đơn, mọc cách, phiến lá dày, hình trứng ngược hay bầu dục Hoa

Hình 1 1 Cóc đỏ (Lumnitzera littorea) và Cóc trắng (Lumintzera racemosa)

màu đỏ, hợp thành bông ở đầu cành, đài hoa dài 1,5-2 cm, hoa có 5 cánh, chỉ nhị dài khoảng 5 lần cách hoa Quả mập, hình xoan, dài 3-4 cm, 1 hạt

Giá trị kinh tế của chi Lumnitzera

Gỗ được dùng làm đồ dùng thông dụng, dùng trong xây dựng, làm chất đốt, quần

xã còn được trồng để chắn gió, bảo vệ đê điều, các vùng đất ven sông, ven biển

Thực trạng và một số nghiên cứu về chi Lumnitzera

Loài cây này thường xuyên bị tàn phá và khai thác làm chất đốt, hiện chúng đang

có trong sách đỏ Việt Nam và ở phân hạng sắp nguy cấp (VU), có nguy cơ tuyệt chủng trong tự nhiên

1.1.5.1 Cây Cóc đỏ (Lumnitzera littorea)

Trong nước

Hiện chưa tìm thấy công trình nghiên cứu nào về loài cây Cóc đỏ (Lumnitzera

littorea)

Ngoài nước

Năm 2011, Shahbudin S và cộng sự[11] đã nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn của

cây ngập mặn (Cóc littorea) và được đăng trên Tạp chí Y học Nhiệt đới Châu Á

Thái Bình Dương, chỉ ra rằng hoạt động kháng khuẩn của cao chiết Cóc đỏ

(Lumnitzera littorea) tăng theo nồng độ Vi khuẩn Gram dương (S aureus và B

cereus) và chỉ vi khuẩn Gram âm (E coli) bị ức chế bởi các cao chiết Định lượng

phân tích dựa trên những đặc tính kháng khuẩn thu được thông qua việc xác định

tính kháng khuẩn và nồng độ diệt khuẩn của Lumnitzera littorea

1.1.5.2 Cây Cóc trắng (Lumnitzera racemosa)

Trong nước

Năm 2013, Trần Mỹ Linh[3] và cộng sự đã chứng minh hoạt tính ức chế nấm và

vi khuẩn gây bệnh của ba loài thực vật ngập mặn Aegiceras corniculatum,

Avicennia marina và Lumnitzera racemosa

Ngoài nước

Năm 2010, Lisette D và cộng sự[5] đã chứng minh cao thô ethanol và cao

n-butanol từ cây Cóc Trắng (Lumnitzera racemosa Willd.) có khả năng diệt khuẩn

Năm 2011, Sundaram R và Murugesan G[12] đã chứng minh cao chiết ethanol của

lá cây Lumnitzera racemosa có khả năng bảo vệ chức năng gan in vitro khi thử

nghiệm trên chuột và có khả năng đánh bắt một số gốc tự do DPPH•

1.2 TỔNG QUAN VỀ BỆNH TIỂU ĐƯỜNG

Bệnh tiểu đường là một bệnh mãn tính xảy ra khi tuyến tụy không sản xuất đủ insulin hoặc khi cơ thể không thể sử dụng hiệu quả insulin mà nó sản xuất Insulin

là một hormone điều chỉnh lượng đường trong máu Tăng lượng đường huyết trong máu là một hiệu ứng phổ biến của bệnh tiểu đường không được kiểm soát và theo thời gian dẫn đến thiệt hại nghiêm trọng cho nhiều hệ thống của cơ thể, đặc biệt là các dây thần kinh và mạch máu

 Bệnh tiểu đường được chia thành các loại sau:

Bệnh tiểu đường loại I

Bệnh tiểu đường loại I (trước đây được gọi là phụ thuộc insulin, khởi phát ở vị thành niên hoặc trẻ nhỏ) được đặc trưng bởi sự sản xuất thiếu insulin và nhu cầu insulin hàng ngày Các nguyên nhân gây ra bệnh tiểu đường loại I thường là không biết và khó có thể ngăn chặn được

Các triệu chứng bao gồm bài tiết quá nhiều nước tiểu (polyuria), khát nước (polydipsia), đói liên tục, giảm cân, thay đổi thị lực và mệt mỏi Những triệu chứng này có thể xảy ra đột ngột

Bệnh tiểu đường loại II

Bệnh tiểu đường loại II (trước đây được gọi là không phụ thuộc insulin hay khởi phát người lớn) kết quả là từ việc sử dụng không hiệu quả insulin của cơ thể Bệnh tiểu đường loại II bao gồm 90 % những người bị bệnh tiểu đường trên thế giới và phần lớn là kết quả của trọng lượng cơ thể dư thừa và thiếu hoạt động thể chất

Các triệu chứng có thể tương tự như những người mắc bệnh tiểu đường loại I, nhưng rất ít khi được phát hiện Kết quả là, bệnh có thể được chẩn đoán một vài năm sau khi bắt đầu, một khi đã phát sinh biến chứng

Cho đến gần đây, loại hình này của bệnh tiểu đường đã được nhìn thấy không chỉ

có ở người lớn mà hiện nay nó cũng xảy ra ở trẻ em

Tiểu đường thai nghén

Tiểu đường thai nghén là sự tăng đường huyết với các giá trị glucose trong máu cao hơn bình thường nhưng dưới ngưỡng để chẩn đoán là bệnh tiểu đường, xảy ra trong quá trình mang thai Phụ nữ bị tiểu đường thai nghén có nguy cơ cao mắc biến chứng khi mang thai và khi sinh Họ cũng có nguy cơ cao mắc bệnh tiểu đường loại

II trong tương lai Tiểu đường thai nghén được chẩn đoán thông qua sàng lọc trước sinh

Tình hình bệnh tiểu đường hiện nay

1.2.2.1 Trên thế giới

Bệnh tiểu đường có tính hủy diệt cao hơn các bệnh nguy hiểm khác trên thế giới cộng lại ở châu Á Nó đang âm ỉ hình thành một làn sóng đe dọa toàn cầu (WHO, 2005)

Đây chính là cơn sóng thần toàn cầu, một tai họa sớm gây khủng hoảng y tế thế giới trong thế kỉ 21 và sẽ làm giàm tuổi thọ của người dân trong vòng 200 năm trở

lại đây Châu Á được đáng giá là tâm chấn của cuộc khủng hoảng này vì quá trình này diễn ra trong nền văn hóa, trong chế độ dinh dưỡng truyền thống từ lúa gạo đang dần được thay thế bởi các món ăn Phương Tây giàu chất béo và đường, dẫn đến sự gia tăng tỉ lệ mắc bệnh tiểu đường ở thanh thiếu niên (Zimmet, 2005)

Trong năm 2012, bệnh tiểu đường chính là nguyên nhân trực tiếp của 1,5 triệu ngưởi tử vong[18]

Năm 2014, 9 % người trưởng thành trên 18 tuổi có bệnh tiểu đường[15] Hơn 80

% các ca tử vong do bệnh tiểu đường ở những người dân có thu nhập thấp và trung bình[18]

Hình 1 2 Sự phân bố người bệnh tiểu đưởng trên thế giới (2010)

WHO dự đoán rằng bệnh tiểu đường sẽ là 1 trong 7 nguyên nhân hàng đầu gây tử vong trong năm 2030[7]

Chế độ ăn uống lành mạnh, hoạt đông thể chất thường xuyên, duy trì trọng lượng

cơ thể bình thường và tránh sử dụng thuốc lá có thể ngăn ngừa hoặc làm chậm khởi phát của bệnh tiểu đường loại II[14]

1.2.2.2 Tại Việt Nam

Việt Nam là nước đang phát triển và cũng là quốc gia có tỉ lệ người dân mắc bệnh tiểu đường cao Theo nghiên cứu của Bệnh viện Nội tiết Trung ương năm

2002 cả nước chỉ có khoảng 2,7 % dân số mắc bệnh đái tháo đường nhưng đến năm

2012 điều tra tại 6 vùng trên cả nước tỷ lệ này đã tăng lên gần 5,7 %; đối với tỷ lệ tiền đái tháo đường cũng có sự gia tăng từ 7,7 % (năm 2002) lên tới 12,8 % (năm 2012) Cuộc điều tra đã chỉ ra một thực trạng đáng quan tâm là tỷ lệ người bệnh đái tháo đường trong cộng đồng không được phát hiện là 63,6 % trong khi tỷ lệ này chung trên thế giới là 50 % Thống kê cũng cho thấy nhóm tuổi từ 45-64 tuổi được xem là nhóm đối tượng có tỷ lệ mắc đái tháo đường cao nhất, nhóm tuổi mắc đái tháo đường đang có xu hướng trẻ hoá theo thời gian, hiện bệnh tăng nhanh không chỉ ở thành phố và các khu công nghiệp mà còn cả ở khu vực trung du, miền núi[19]

Một số nguyên nhân phổ biến khiến bệnh tiểu đường phát triển nhanh ở Việt Nam là do lối sống và chế độ ăn uống của người dân Tại các thành phố, số trẻ em

bị béo phì chiếm 8-21 % Trong khi đó, có tới hơn 50 % nam giới hút thuốc lá và uống rượu bia Những yếu tố này đã góp phần khiến nhiểu người mắc bệnh tiểu đường (WHO, 2010)[20]

Những biến chứng của bệnh tiểu đường

Theo thời gian, bệnh tiểu đường có thể gây hại cho tim, mạch máu, mắt, thận và thần kinh

Tiểu đường làm tăng nguy cơ bệnh tim và đột quỵ Trong một nghiên cứu đa quốc gia, 50 % những người bị đái tháo đường tử vong vì bệnh tim mạch (chủ yếu

Các nguy cơ dẫn đến tử vong ở người mắc bệnh tiểu đường thường gấp đôi so với những người không mắc bệnh tiểu đường[8]

Tìm hiểu một số loại thuốc trị bệnh tiểu đường

1.2.4.1 Metformin

Metformin có mặt hầu hết trên thế giới Tác dụng của metformin là giảm lượng đường trong gan và kiểm soát đường huyết Thông thường, metformin đơn trị liệu

sẽ làm giảm HbAlc khoảng 1,5 % (Bailey and Turner, 1996; DeFronzo et al, 1995)

Metformin thường được dung nạp tốt, tuy nhiên có tác dụng phụ là gây rối loạn hệ tiêu hóa Ngoài ta, metformin còn có khả năng gây tử vong do nhiễm toan acid lactic tuy nhiên tỉ lệ này rất thấp (<1 trường hợp trên 100.000 bệnh nhân điều trị)

(Salperter et al., 2006) Metformin là thuốc đơn trị liệu thường không kèm theo hạ đường huyết, ở bệnh nhân tiền tiểu đường không gây tăng đường huyết (Engl et

al,2002) Không tăng đường huyết là ưu điểm chính của metformin hoặc làm ổn

định hay giảm (ít) trọng lượng, trái ngược với nhiều loại thuốc khác là gây hạ đường huyết

1.2.4.2 Sulfonylureas

Sulfonylureas làm giảm đường huyết bằng cách tăng cường tiết insulin Sulfonylureas còn có tác dụng tương tự như metformin là làm giảm HbAlc tương đương 1,5 % (Groop, 1992) Các tác dụng phụ của sulfonylureas là hạ đường huyết, gây hôn mê đặc biệt là ở người cao tuổi Một số sulfonylureas mới hơn có nguy

cơ hạ đường huyết tương đối thấp hơn (Tessier et al., 1994; Holstein et al., 2001)

Ngoài ra, tăng cân khoảng 2 kg là phổ biến khi bắt đầu điều trị bằng sulfonylurea Điều này có thể có tác động xấu đến nguy cơ bệnh tim mạch Điều trị bằng sulfonylurea là một trong những nguyên nhân làm tăng nguy cơ tử vong do tim

mạch (Klimt et al., 2003)

1.2.4.3 Glinides

Cũng giống như sulfonylureas, các glinides kích thích tiết insulin, khác với sulfonylurea, glinide liên kết với một chuỗi hệ thống khác nhau trong các thụ thể sulfonylurea (Malaisse, 2003) Glinide có thời gian tồn tại ngắn hơn và chỉ bằng

một nửa so với sulfonylureas Trong 2 loại glinides hiện đang có ở Mỹ, thì repaglinide là gần như có hiệu quả như metformin hoặc sulfonylureas, nghĩa là giảm HbAlc khoảng 1,5 % Nateglinide kém hiệu quả trong việc giảm HbAlc so với

repaglinide khi được sử dụng như là đơn trị liệu hoặc kết hợp trị liệu (Rosenstock et

al., 2004; Gerich et al., 2005) Các glinides có nguy cơ tăng cân tương tự

sulfonylureas, nhưng hạ đường huyết ít hơn so với một số sulfonylureas (Gerich et

al., 2005; Kristensen et al., 2000)

1.2.4.4 Insulin

Insulin là thuốc trị tiểu đường lâu đời nhất trong các loạỉ thuốc hiện có và có cơ chế điều trị lâm sàng được hiểu rõ nhất Insulin ban đầu được phát triển để điều trị các bệnh nhân tiểu đường loại I thiếu insuỉin Insulin cũng đã được sử dụng sớm để điều trị các dạng kháng insulin (Himsworth and Kerr, 1939) Insulin là thuốc hiệu quả nhất đối với bệnh tiểu đường trong việc làm giảm đường huyết Khi được sử dụng với liều lượng thích hợp nó có thể giảm bất kỳ mức độ cao HbAlc nào, hoặc

hạ thấp gần với mục tiêu điều trị Insulin được sử dụng với liều tương đối lớn (> 1 đơn vị/kg), đối với điều trị bệnh tiểu đường loại I Liều sử dụng insulin có thể cao hơn đối với kháng insulin của bệnh tiểu đường loại II và khi muốn hạ thấp HbAlc đến mục tiêu điều trị Insulin ổn định mức độ chất béo trung tính và cholesterol HDL (Nathan, 1988), nhưng kềm theo là tăng cân từ 2-4 kg, sự tăng cân này có thể

tỉ lệ thuận với việc giảm đường huyết Sự tăng cân có thể có ảnh hưởng xấu đến nguy cơ tim mạch

1.2.4.5 Các loại thuốc tổng hợp

Có nhiều bệnh nhân không đáp ứng với các loại thuốc đơn trị liệu nên thường phải kết hợp hai loại thuốc với nhau, hoặc dùng một thuốc uống và insulin Theo khuyến cáo của FDA chỉ nên sử dụng một trong 3 loại thuốc gồm metformin, glimepiride, và pioglitazone kết hợp với insulin Cho đến nay, đã có khá nhiều các thuốc tổng hợp hai loại thuốc lại cùng một viên, chỉ trừ có loại sulfonylureas và repaglinide (prandin) là không tổng hợp với nhau vì chúng hoạt động tương tự nhau Các phương pháp chữa trị bệnh tiểu đường chỉ được phép kết hợp sử dụng hai

loại thuốc với nhau, không nên dùng ba hay nhiều loại thuốc uống cùng lúc sẽ gây

ra suy đường huyết trầm trọng, có thể dẫn đến tử vong

1.3 TỔNG QUAN VỀ HỆ ENZYME AMYLASE

Giới thiệu chung

Hiện nay, có 6 loại enzyme amylase được xếp vào 2 nhóm: endoamylase (enzyme nội bào) và exoamylase (enzyme ngoại bào)

1.3.1.1 Endoamylase

Gồm có α-emylase (EC 3.2.1.1) và nhóm enzyme khử nhánh Nhóm enzyme khử nhánh này được chia thành 2 loại: khử trực tiếp là pullulanase (hay α-dextrin 6-glucanohydrolasa) (EC 3.2.1.41); khử gián tiếp là transglucosidase (hay oligo-1,6- glucosidase) (EC 3.2.1.20) và amylo-l,6-glucosidase (EC 3.2.1.10) Các enzyme này thủy phân các liên kết bên trong của chuỗi polysaccharide

1.3.1.2 Exoamylase

Đây là những enzyme thủy phân tinh bột từ đầu không khử của chuỗi polysaccharide Nhóm này gồm có:

+ ß-amylase (EC 3.2.1.2)

+ amyloglucosidase (glucoamylase hay γ-amylase) (EC 3.2.1.3)

Hình 1 3 Các loại enzyme exoamylase và endoamylase

1.3.1.3 Sự khác biệt giữa các loại enzyme amylase

Các loại enzyme amylase không chỉ khác nhau ở đặc tính mà còn khác nhau ở

pH hoạt động và tính ổn định với nhiệt

Tốc độ phản ứng của amylase phụ thuộc vào pH, nhiệt độ, mức độ polyme hóa của cơ chất Các enzyme amylase có nguồn gốc khác nhau sẽ có tính chất, cơ chế tác dụng và sản phẩm cuối cùng của quá trình thủy phân khác nhau

Amylase có nguồn gốc khác nhau sẽ có thành phần, tính chất, nhiệt độ hoạt động,

pH tối ưu và các đặc điểm thủy phân khác nhau

Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động của enzyme α-amylase

1.3.2.1 Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất

 Phản ứng của enzyme xảy ra theo 3 giai đoạn

Giai đoạn 1: enzyme sẽ tương tác với cơ chất tạo thành phức hợp enzyme- cơ

chất (ES) Ở giai đoạn này, nếu nồng độ cơ chất thấp thì tốc độ phản ứng V phụ thuộc tuyến tính với nồng độ cơ chất

Giai đoạn 2: phức hợp ES sẽ được tách ra, tốc độ phản ứng cực đại và nó hoàn

toàn không phụ thuộc vào nồng độ cơ chất

Giai đoạn 3: enzyme sẽ được giải phóng và hoạt động tự do Hiện tượng này

được xem xét dựa trên cơ sở phản ứng chỉ có một cơ chất Cuối cùng, nếu nồng độ

cơ chất vượt qua ngưỡng cực đại thì tốc độ phản ứng không có khả năng tăng thêm

Ở giai đoạn này các enzyme đã bão hòa với cơ chất Do đó, nó không thể có tốc độ phản ứng cao hơn nữa

Hình 1 4 Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất lên vận tốc phản ứng

Điều kiện hoạt động của α-amylase từ các nguồn khác nhau thường không giống nhau pH tối thích cho hoạt động của α-amylase từ nấm sợi là pH từ 4,0 - 4,8 (có thể hoạt động tốt trong vùng pH từ 4,5 - 5,8) Theo số liệu của Liphis, pH tối thích cho

hoạt động dextrin hóa và đường hóa của chế phẩm amylase từ Asp.orysee trong

vùng pH từ 5,6 - 6,2 Còn theo số liệu của Fenixova thì pH tối thích cho hoạt động dextrin hóa của nó là pH từ 6,0 - 7,0

1.3.2.3 Ảnh hưởng của chất kìm hãm

Chất kìm hãm là chất có khả năng làm yếu hoặc làm chấm dứt hoàn toàn tác dụng của enzyme Các chất kìm hãm có thể là ion kim loại, các anion, các hợp chất hữu cơ có phân tử nhỏ hoặc protein Các chất kìm hãm có khả năng kìm hãm thuận nghịch và không thuận nghịch Trong chất kìm hãm thuận nghịch, ta có thể phân biệt hai dạng kìm hãm cạnh tranh và không cạnh tranh

Kìm hãm cạnh tranh: xảy ra khi enzyme thiếu tính đặc hiệu tuyệt đối, trong trường hợp này chất kìm hãm có cấu tạo tương tự như cơ chất, nó kết hợp vào trung tâm hoạt động của enzyme làm giảm hiệu lực xúc tác của enzyme

Kìm hãm không cạnh tranh: là chất kìm hãm kết hợp với enzyme ở vị trí khác với trung tâm hoạt động, làm thay đổi cấu trúc không gian của phân tử enzyme làm giảm hoạt động xúc tác của nó, dẫn đến giảm tốc độ phản ứng

PHẦN II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Địa điểm nghiên cứu

Thí nghiệm được tiến hành nghiên cứu tại phòng thí nghiệm Sinh hóa và phòng thí nghiệm Thực phẩm của trường Đại Học Mở thành phố Hồ Chí Minh

Địa chỉ: 68 Lê Thị Trung, phường Phú Lợi, thành phố Thủ Dầu Một, tỉnh Bình Dương

2.2 Vật liệu nghiên cứu

Nguồn nguyên liệu chính: sử dụng lá cây Cóc đỏ (Lumnitzera littorea) trưởng

thành, lá mọc cách, phiến lá hình trứng ngược, dài 3 - 8 cm, rộng 1 - 2,5 cm, ít

gân, cuống dài 0,5 - 1 cm, lá có màu xanh đậm

Nguồn gốc: thu hái từ rừng ngập mặn Cần Giờ vào tháng 08/2014

Hình 2 1 Nguyên liệu lá Cóc đỏ (Lumnitzera littorea) trước và sau khi phơi

Ethanol (Việt Nam)

n-hexan (Việt Nam)

Ethyl acetate (Việt Nam)

Iodine (Trung Quốc)

Tinh bột (Trung Quốc)

HCl 10 % (Trung Quốc)

Enzyme α-amylase (Novozyme)

Đệm phosphate (KHPO4, Na2HPO4) (Trung Quốc)

 Cao phân đoạn từ lá Cóc đỏ (Lumnitzera littorea)

Các mẫu cao phân đoạn từ lá Cóc đỏ sử dụng cho các thí nghiệm nghiên cứu sau này được thừa hưởng từ nghiên cứu trước và đã được điều chế như sau: mẫu lá cây

Cóc đỏ (Lumnitzare littorea) sau khi thu hái sẽ được rửa sạch, phơi khô và xay

nhuyễn Tiếp đến, tiến hành trích ly vớ dung môi ethanol 960C để thu các hợp chất trong lá Cóc đỏ với tỷ lệ nguyên liệu và dung môi là 1:12 (g/ml) Quá trình trích ly được thực hiện với thời gian 15 ngày, thay dung môi trích ly sau 24 giờ Cuối cùng được đem đi lọc lần 1, lọc lần 2, dịch sau khi lọc đem cô quay chân không thu được cao tổng Cao tổng này được sử dụng để tiến hành điều chế cao phân đoạn

Hình 2 2 Quy trình điều chế cao phân đoạn lá Cóc đỏ (Lumnitzera littorea)

57,44 g cao ethyl acetate

Dịch

11,12 g cao EA : E (8:2)

66,43 g cao ethanol

Lọc 2

Cô quay

Cô quay

Cô quay EA: E (8:2)

Dịch

Dịch Cao còn lại lần 1

Cao còn lại lần 2

2.4 Nội dung nghiên cứu

2.4.1.1 Nghiên cứu sự ảnh hưởng của thời gian ủ enzyme lên quá trình thủy phân cơ chất

Mục đích

Mỗi loại enzyme khác nhau đều có thời gian ủ khác nhau Do đó, nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian ủ enzyme lên phản ứng thủy phân nhằm biết được thời gian ủ tối đa để enzyme α-amylase thủy phân cơ chất là tốt nhất, cũng như tại thời gian đó enzyme đạt vận tốc phản ứng cao nhất

Thí nghiệm được lặp lại 3 lần và được bố trí theo bảng 2.1

Bảng 2 1 Ảnh hưởng của thời gian ủ lên phản ứng thủy phân cơ chất

Thời gian (phút) Nghiệm thức Thời gian (phút) Nghiệm thức

sẽ thay đổi từ 0 phút đến 20 phút như đã được bố trí theo bảng 2.1, tiếp đến cho 1

ml dung dịch acid HCl 10 % vào hỗn hợp nói trên lắc đều nhằm ức chế enzyme amylase và ngưng quá trình thủy phân tinh bột của enzyme, cuối cùng hỗn hợp sẽ được thêm vào 5 ml dung dịch iodine 0,125 % nhằm phát hiện lượng tinh bột còn sót lại sau quá trình thủy phân của enzyme α-amylase và sẽ được đo độ hấp thụ quang ở bước sóng 660 nm

Thời gian phản ứng (phút) là thông số tối ưu ở thí nghiệm 2.4.1.1

Dung dịch đệm phosphate: pH= 6,5

Acid HCl 10 %

Dung dịch iod 0,125 %

Thí nghiệm được lặp lại 3 lần và được bố trí theo bảng 2.2

Bảng 2 2 Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất lên hoạt động của enzyme α-amylase

và sẽ được đo độ hấp thụ quang ở bước sóng 660 nm

Chỉ tiêu đánh giá

Dựa vào lượng tinh bột còn sót lại, thí nghiệm được đem đi đo độ hấp thụ ở bước sóng 660 nm và được ghi nhận lại, sau đó dựa vào kết quả OD có được sẽ tiến hành

xử lý số liệu bằng phần mềm Statgraphic 3,0 nhằm biết được nồng độ cơ chất thích

hợp cho các thí nghiệm tiếp theo

2.4.1.3 Nghiên cứu sự ảnh hưởng của pH lên hoạt động của enzyme α-amylase Mục đích

Các loại enzyme đều rất nhạy cảm với pH của môi trường phản ứng, pH môi trường không thích hợp có thể ảnh hưởng đến khả năng thủy phân cơ chất Do đó, nghiên cứu ảnh hưởng của pH lên hoạt động của enzyme α-amylase nhằm tìm được

pH môi trường thích hợp mà tại pH đó khả năng hoạt động thủy phân của enzyme là tốt nhất

Bố trí thí nghiệm

Enzyme α-amylase có nồng độ là 1 μg/ml

Thời gian phản ứng (phút) là thông số tối ưu ở thí nghiệm 2.4.1.1

Nồng độ cơ chất là thông số tối ưu ở thí nghiệm 2.4.1.2

Acid HCl 10 %

Dung dịch iodine 0,125 %

Thí nghiệm được lặp lại 3 lần và được bố trí theo bảng 2.3

Bảng 2 3 Ảnh hưởng của pH lên hoạt động của enzyme α-amylase