Nghiên cứu và xây dựng quy trình ức chế hoạt tính của enzyme α glucosidase từ lá cóc đỏ (lumnitzera litterea)

 Loài: Lumnitzera littorea và Lumnitzera racemosa nh 1.1 : Lumnitzera littorea Jack Voigt nh 1.2: Lumnitzera racemosa Willd... 1.4 TỔNG QUAN VỀ ENZYME α-GLUCOSIDASE 1.4.1 Enzyme α-gl

- -

BÁO CÁO

Tên đề tài: Ê Ứ

Ứ

 -GLUCOSIDASE Ừ

(LUMNITZERA LITTOREA)

S

UY : T

GVHD:

SVTH:

MSSV: 1153010176 -2015

Tp ồ hí Minh, ngày 05 tháng 05 năm 2015

Trong su t th i gi n h t p t i kho ng gh Sinh – Tr ng i h

i

Ẽ ii

Ầ Ổ 3

Ổ Ề LUMNITZERA 3

1.1.1 Phân lo i 3

1.1.2 i m h nh thái 5

1.1.3 h n 5

1.1.4 iá tr kinh t 6

1.1.5 T nh h nh nghi n u trong n ớ v ngo i n ớ 6

Ổ Ề 8

1.2.1 guy n t tá h hi t 8

1.2.2 ỹ thu t hi t lỏng - lỏng 8

1.2.3 ỹ thu t hi t r n - lỏng 9

1.2.4 ỹ thu t hi t ph r n 11

1.2.5 á y u t nh h ng n quá tr nh tá h hi t nguy n li u 12

1.3 15

1.3.1 hái ni m 15

1.3.2 h n lo i 15

1.3.3 h ng pháp i u tr 16

1.4 Ổ Ề α-GLUCOSIDASE 17

1.4.1 Enzyme α-glucosidase 17

Ầ Ê Ứ 23

2.1 V t li u 23

2.1.1 i t ng nghi n u 23

2.1.2 i m nghi n u 23

2.1.3 h t v thi t 24

2.2 Quy tr nh i u h o tổng 25

2.3 Quy tr nh i u h o ph n o n 26

2.4 ghi n u s nh h ng th i gi n n v n t ph n ng ủ enzyme -glucosidase 29

2.5 ghi n u s nh h ng ủ nồng h t n v n t ph n ng ủ enzyme -glucosidase 31

2.6 ghi n u kh năng h ho t tính ủ nzym -glu osi s t o hi t lá ỏ 33

2.7 So sánh kh năng h nzym -glu osi s t o hi t lá y ỏ v y Tr ng 36

2.8 Xá nh ki u h ho t tính nzym -glu osi s ủ o hi t 38

Ầ 40

3.1 t qu i u h o tổng t lá y ỏ 40

3.2 t qu i u h o ph n o n t o tổng 40

3.3 t qu nghi n u s nh h ng ủ th i gi n n v n t ph n ng enzyme -glucosidase 40

3.4 t qu nghi n u s nh h ng ủ nồng h t n v n t ph n ng

3.6 So sánh kh năng h nzym -glu osi s ủ á o hi t

y ỏ với y Tr ng 49

3.7 Xá nh ki u h ho t tính nzym -glu osi s o hi t n-hexane 52

3.8 Xá nh ki u h ho t tính nzym -glu osi s ủ o hi t thyl t t 55

Ầ Ề 59

4.1 t lu n 59

4.2 i n ngh 64

65

iii

B ng 3.2: t qu nghi n u s nh h ng của p-nitrophenyl-α-D-glucosidase 43

B ng 3.3: t qu kh năng c ch enzyme -glucosidase củ o hi t 45

B ng 3.4: iá tr IC50 th hi n kh năng c ch enzyme -glucosidase của

DANH M C HÌNH VẼ

nh 1.1 : Lumnitzera littorea (Jack) Voigt 3

nh 1.2: Lumnitzera racemosa Willd 3

nh 1.3: o ủ L littorea 4

nh 1.4: o ủ L racemosa 4

nh 1.5: o ủ h i lo i 4

nh 1.6: t ủ h i lo i 4

nh 1.7: ồ th h nh tr nh 19

nh 1.8: ồ th h phi nh tr nh 19

nh 1.9: ồ th h kh ng nh tr nh 20

nh 1.10: ồ th h h n h p 21

nh 2.1: á y ỏ (Lumnitzera littorea) tr ớ v s u khi ph i 23

nh 2.2: Quy tr nh i u h o tổng lá y ỏ 25

nh 2.3: Quy tr nh i u h o ph n o n lá y ỏ 27

nh 2.4: S ồ nghiên c u s nh h ng th i gi n n v n t c ph n ng của enzyme -glucosidase 30

nh 2.5: S ồ nghi n u kh năng h nzym α-glu osi s t o hi t 34

nh 2.6: S huy n h h t n n khi nzym α-glu osi s h 35

nh 3.1: ồ th th hi n s nh h ng của th i gi n n v n t c ph n ng của enzyme -glucosidase 42

nh 3.2: ồ th th hi n kh năng c ch enzyme -glucosidase của cao chi t t lá y ỏ 46

nh 3.3: ồ th th hi n giá tr IC50 của cao chi t t lá y ỏ và

cây Cóc Tr ng so với acarbose c ch enzyme -glucosidase 51

nh 3.4: ồ th i u i n 1 V th o 1 S với á nồng khá nh u ủ

o hi t n-hexane 55

nh 3.5: ồ th i u i n 1 V th o 1 S với á nồng khá nh u ủ

o hi t thyl t t 58

Ặ Ấ Ề

nh ái tháo ng l m t ăn nh nguy hi m v ng gi tăng nh nh với

á i n h ng nh nh tim m h t i i n m h máu n o m l suy th n o n

hi … tr th nh nguy n nh n g y t vong th t á n ớ ng phát tri n

Tr n th giới 10 gi y ồng hồ l i m t ng i h t v nh ng i n h ng ủ

nh ái tháo ng V v y vi nghi n u á ph ng pháp i u tr nh ái tháo ng ng á nh kho h qu n t m

Trong á h ớng i u tr nh ái tháo ng lo i 2 h ớng i u tr ằng á h

h ho t tính enzyme α-glucosidas hi n ng á nh kho h h n

v h ho t ng n gi n v n to n ho ng i s ụng h ng lo i thu

h nzym α-glucosidas ng s ụng hi n n y v n nhi u tá ụng phụ

nh thu igu ni s tá ụng phụ uồn n n ti u h y v giá kim lo i; thu Sulphonylur s tá ụng phụ g y r i lo n ti u h y v ng phát

n ỏ ;… N n nhằm mụ í h h n h á tá ụng phụ n to n ho ng i s ụng v th m nhi u l h n ho vi i u tr nh ái tháo ng ph i nghi n

u á h t h ho t tính enzyme α-glucosidas mới t nhi u nguồn khá nh u

á nh kho h tr n th giới nhi u ng tr nh nghi n u v h

ho t tính enzyme α-glucosidas ng nh l p á h p h t t nhi n ho t tính

sinh h t á nguy n li u khá nh u Trong Vi t m nằm trong v ng khí h u nhi t ới gi m n n nguồn th v t ồi o v phong ph T th i x x ng h

t i t t m ki m v s ụng y ỏ trong t nhi n l m th ăn v thu h

nh h ng hi u i t v y ỏ l i h y h i truy n mi ng v ghi hép k t th nh kinh nghi m qu nhi u th h n i ti p nh u ho n ng y h m

n y khi m y h v ng nghi p phát tri n nh ng nghi n u v t trong

l nh v i u tr nh h y nh ng kỹ thu t hi n i nguồn th phẩm ồi

o th y ỏ t nhi n v n m t v th nh t nh ủ n

R ng ng p m n l m t h sinh thái huy n ti p gi m i tr ng i n v t

li n tr ng v ng s ng v n i n nhi t ới v n nhi t ới nhi u

nh kho h qu n t m i t go i r r ng ng p m n n l n i t p h p s

ng phong ph ủ nhi u hủng th v t qu hi m trong nhi u lo i l

nguồn li u ho t tính sinh h nh m i n (Avicennia marina) n hu (Sonneratia caseolaris) g n i n (Clerodendrum inerme), Ô rô (Acanthus

ilicifolius), tr ng (Lumnitzera racemosa), v.v Trong y ỏ (Lumnitzera littorea) l m t lo i th v t th n g thu hi Lumnitzera h ng

(Combretaceae) ph n trong h sinh thái ủ r ng ng p m n t n trong sá h ỏ

Vi t m năm 1996

Tr n s t i “Nghiên cứu và ng qu tr nh ức ch ho t t nh của enzyme -glucosidase t Cóc Đỏ (Lumnitzera ittorea)” xu t Tiêu

hí t r l ng tá nghi n u kh ng l m nh h ng tới h sinh thái th v t ủ

r ng ng p m n o i t ng nghi n u ho t i h n l nh ng lá

tr ng th nh ụ í h ủ t i g p ph n l m tăng giá tr v m t kho h ng

nh kinh t cho loài cây này, t o ti n ho vi nghi n u l p á h p h t t nhi n ho t tính sinh h o t y ỏ g p ph n l m ng h nguồn nguy n li u trong l nh v li u v th phẩm

PHẦN I: TỔNG QUAN

1.1 TỔNG QUAN VỀ CHI LUMNITZERA

1.1.1 Phân loại [13]

Chi Lumnitzera là m t chi s ng trong r ng ng p m n Theo tác gi Ph m

Hoàng H [16], Vi t Nam chi Lumnitzera gồm h i lo i l ỏ (Lumnitzera

littorea) và Cóc Tr ng (Lumnitzera racemosa)

 Loài: Lumnitzera littorea và Lumnitzera racemosa

nh 1.1 : Lumnitzera littorea (Jack) Voigt nh 1.2: Lumnitzera racemosa Willd

nh 1.3: o ủ L littorea nh 1.4: o ủ L racemosa

nh 1.5: o ủ h i lo i nh 1.6: t ủ h i lo i

ặc điểm hình thái [3,4,5]

V n th h i y ỏ (Lumnitzera littorea) và y Tr ng (Lumnitzera racemosa) i m gi ng nh u h khá m u ủ cánh hoa

Cây thân g , cao 10-20 m, vỏ màu nâu th m, có v t n t, m t trong vỏ màu nâu

ỏ, ph n giác màu vàng, lõi màu nâu th m, cành nhánh hình khúc khuỷu, vuông, khi non m u ỏ nh t, có nhi u m t do nh ng v t s o của lá rụng l i

Lá m c cách, t p trung u cành, phi n lá hình tr ng ng c, m t trên lá bóng, dài 2-8 cm, r ng 1-2.5 m nh tròn có khía tai bèo, g c hình nêm, ít gân,

cu ng i 0.5-1 cm, lá tích nhi u mu i

R có kh năng m s u v o lớp mùn dày R khí th ng không phát tri n thành h r trên m t t nh á cây khác Tuy nhi n trong m i tr ng ẩm th p, r khí có th phát tri n thành h r vòng trên m t t d ng m u r nhỏ

Cụm hoa hình chum u cành, dài 1.5-3 cm Hoa có cu ng ng n i 1.5-2

mm i h nh ng t o th nh h a m t Tràng 5 thùy, hình b u dục thuôn, dài 5-6

mm ng m u ỏ, rụng M t c p bao hoa d ng v y ính v o ng i h 5-10, dài

g p i ánh ho nhụy h i nh r khi ho n , vòi nhụy v i n B u lô 5 lá noãn

h p, noãn nhỏ 3-5 ính no n tr o o thụ ph n nh him c bi t là chim hút m t

và nh ng lo i ăn m t Ong m t và ong vò vẽ ng th m gi v o s thụ ph n của hoa

Qu h ch, 1 h t, hình tr ng dài 3-4 cm, với nhi u s i ng m ủa vỏ qu nằm r i rác, vỏ qu trong c ng Qu non m u n u ỏ, qu chín rụng, mùa ra hoa vào tháng 6 n tháng 8, mùa qu hín v o tháng 8 n tháng 10

1.1.3 Phân bố [9,25]

y ỏ (Lumnitzera littorea) và y Tr ng (Lumnitzera racemosa) là

lo i y ng p m n ph n h u v h u Ú thu v ng nhi t ới Ở Vi t

m h i lo i y n y ph n á r ng ng p m n s ng v n i n n i h ng p

tri u o ho ít ng p n ớ m n nh n i u h Qu vv

Tr ớ năm 2001 ỏ ng i n kh i thá r t nhi u V th n cây Cóc

ỏ khi gi th ng r ng ho m i ăn n n tr ớ khi h t y ng i t th ng ụ

l trên thân cây ki m tr hi u y Cóc ỏ gi nh ng kh ng h t nh ng

ng h t o á v t ụ quá s u S u khi V n Qu i h Qu th nh

l p năm 2011 ng tá o v r ng th hi n khá t t ph n n o ngăn h n

vi kh i thá y ỏ t i h Qu i n n y t i h Qu ng ti n h nh m t

s án m v trồng ỏ nh n gi ng phát tri n lo i y n y i u ki n thi n nhi n ủ h Qu l m i tr ng r t ph h p với ỏ

V nh ng tá ng ủ á y u t t nhi n v on ng i m á qu n th ủ

á lo i n y th y ổi hi t v hủy i t ng y ng o Ở Trung Qu

loài Lumnitzera littorea l m t lo i ng v h ng trồng l i với

m t v ng nhỏ o in n Ở Vi t m Lumnitzera littorea là loài có tên trong

sá h ỏ với p áo ng V i n n y cây Cóc ỏ hính th phát hi n

n u lo i y n y c m v o h m than sẽ cho nhi t cao và ch ít l h n n n

kh ng l m h máy m Trong hi n tranh th giới th 2, than của loài cây này

c s dụng ch y máy tàu và xe H u i ng th y ho xăng

và vi khuẩn gây b nh của ba loài th c v t ng p m n Aegiceras corniculatum,

Avicennia marina và Lumnitzera racemosa t i v n qu c gia Xuân Thủy với nồng

d ch chi t t 10 - 100 mg/ml

 go i n ớc

ăm 1980 jum r v tr [18] t lá và vỏ cây của Lumnitzera racemosa

nh n bi t c m t s h p ch t nh tri ont nol (1), taraxerol (2), -amyrin (3), betulin (4), -sitosterol (5) và friedelin (6)

n-trong myri tin ho t ng m nh nh t so với flavonoid và quercetin (MIC – 1.5

μg ml) kh năng kháng Pseudomonas aeruginosa (MIC - 6 μg ml)

ăm 2011 Sun r m R và Murugesan G. [21] h ng minh cao chi t ethanol

của lá cây Lumnitzera racemosa có kh năng o v ch năng g n in vitro khi th

nghi m trên chu t và có kh năng ánh t m t s g c t o nh , HRSA,

NO, FRAP, LPO, SOD

1.2 TỔNG QUAN VỀ T

1.2.1 Nguyên tắc tách chiết [15]

hi ho nguy n li u v ung m i ti p x với nh u n u ung m i sẽ th m

v o nguy n li u s u nh ng h t trong t o nguy n li u y sẽ h t n v o ung

m i rồi khu h tán r ngo i t o Trong quá tr nh tá h hi t sẽ x y r m t s quá

tr nh s u: khu h tán thẩm th u thẩm tí h Trong th nghi m vi hi t r n - lỏng

áp ụng nhi u h n gồm ng m ki t ng m m hi t với máy hi t Soxhl t …

1.2.2 Kỹ thuật chiết lỏng - lỏng [15]

Kỹ thu t chi t lỏng - lỏng c áp dụng ph n hi o th n u ho c dung d h n u thành nh ng ph n o n có tính phân c c khác nhau

Nguyên t c của s chi t lỏng - lỏng là s phân b của m t ch t tan vào hai pha lỏng và hai pha này không hòa tan vào nhau Hằng s phân b của m t ch t tan cho

bi t kh năng h t n ủa ch t n y i với hai pha lỏng t i th i i m cân bằng Mục

í h hính ủa s chi t bằng ung m i l tinh ch h s m t h p ch t nào n l u ý rằng s chi t lỏng - lỏng c th c hi n nhi t phòng, n u gia tăng nhi t cho dung môi thì kh năng h t n ủa dung môi sẽ tăng l n v nguyên t c trên sẽ có nhi u s th y ổi

Kỹ thu t chi t lỏng - lỏng nh i m là do ph i l c bình lóng nhi u l n, nên nh ng l n chi t sau, dung môi trong bình lóng t o nh t ng g y kh khăn trong vi c tách pha thành hai lớp

1.2.3 Kỹ thuật chiết rắn - lỏng [15]

1.2.3.1 Kỹ thuật chiết ngấm kiệt

So với ph ng pháp ng m m th ph ng pháp n y i hỏi thi t b ph c t p

h n m t h t nh ng hi u qu l i o h n v ít m t ng h n v y l quá tr nh chi t liên tục, dung môi trong bình ng m ki t o h m u ch t sẽ c liên tục thay th bằng dung môi tinh khi t

1.2.3.2 Kỹ thuật chiết ngâm dầm

ỹ thu t hi t ng m d m ng t ng t nh kỹ thu t hi t ng m ki t nh ng

kh ng i hỏi thi t ph t p v th th ng th o tá với m t l ng lớn

m u y g m t y trong m t nh h ằng thủy tinh ho thép kh ng r

nh n p y Tránh s ụng nh ằng nh v ung m i h u th h t n

m t ít nh g y nh m l n với á h p h t th h trong y

th gi tăng hi u qu hi t ằng á h th nh tho ng o tr n x u lớp

t y ho th g n nh v o máy l l nh ( h n p nh ung r l m dung h hi t tr o r ngo i)

i l n ng m ung m i h n ng m 24 gi l ủ v với m t l ng ung

m i nh trong nh m u h t h h t n v o ung m i t n m o hòa,

kh ng th h t n thêm nhi u h n ng m l u h n h m t th i gi n h

l i quy t hi t l hi t nhi u l n m i l n m t ít l ng ung m i

ung m i s u khi thu hồi l m kh n n ớ ằng á h t kh n v

ti p tụ s ụng hi t á l n s u

1.2.3.3 Kỹ thuật chiết bằng máy chiết Soxhle

y l ph ng pháp hi t xu t r n - lỏng, s dụng m t pha lỏng lôi kéo

h p ch t h u r khỏi mô th c v t (pha r n) bằng cách hòa tan nó

H th ng ho t ng d a trên nguyên lý: dung môi h u trong trụ chi t luôn

lu n ổi mới hòa tan t i h p ch t trong mô th c v t ung m i c

un n ng sẽ y h i l n th o nhánh th ng n trái khi g p ng sinh hàn, dung môi

ng ng tụ v r i xu ng trụ chi t trung tâm T i y h p ch t c n chi t c hòa tan, lôi kéo ra ngoài Khi trụ y, ng siphon sẽ hoàn tr dung môi v bình c u Chu trình l p l i ho n khi ch t c n chi t hòa tan h t

1.2.3.4 Kỹ thuật chiết bằng lôi cuốn eo nước

y l ph ng pháp ổ i n nh t nh ng ng y nay v n r t nhi u lo i tinh

u hi t xu t ằng ph ng pháp n y v n t ng i n to n v tính kinh

t o

Trong quá tr nh hi t li u ng p trong n ớ un s i lớp n ớ n y

v i tr nh h ng r o o v tinh u kh ng nh h ng i quá tr nh un nóng

hu h tán l h u ti n v i tr qu n tr ng trong quá tr nh hi t xu t tinh u hu h tán l quá tr nh huy n ng ng u nhi n ủ á ph n t h t t n

t n i nồng o n n i nồng th p trong ung m i lỏng

Thẩm th u l h th h i trong quá tr nh hi t xu t tinh u Thẩm th u

ng v i tr trong vi m ng á ph n t tinh u l n m t t i ti t Trong thẩm

huy n ng ph n t á t o ẩy á ph n t tinh u th o h ớng t nồng

th p n o n y n trong t o n ít ph n t tinh u ồng n ớ n ngo i t o lớn o n ớ n y khuynh h ớng i huy n v o t o Quá trình

n y sẽ ti p tụ ho n khi t n ằng h i n m ng hi nồng h t t n h i

m t ủ m ng t o n ằng nh u á ph n t n ớ sẽ i huy n r khỏi m ng t

o á ph n t n ớ n y sẽ m ng th o á ph n t tinh u r khỏi t o

Th l quá tr nh un n ng n ớ hi ung p nhi t ho n ớ nhi t ủ

n ớ tăng l n n khi áp su t h i ủ n ớ ằng với áp su t kh ng khí T i th i

i m n y nhi t tăng th m nh ng quá tr nh t n ng v n i n r n n ti p tụ ung

p nhi t l ng i n ổi n ớ t th lỏng s ng th h i

h th t l s h h i hi n ớ v tinh u un n ng n áp su t khí quy n h ng sẽ y h i m t nhi t xá nh v t o th nh m t h n h p ng phí

ph n tán trong á ph n t n ớ thẩm th u trong á t i ti t á ph n t tinh

u ng m v o n ớ nh quá tr nh khu ch tán thông qua màng, hai h n y x y r

ng l Quá tr nh ti p tụ ho n khi t t á ph n t tinh u khu h tán

á h t h p thu gi ng nh lo i s ụng trong s k t gồm h t h p thu ph

th ng, ph o v pha trao ổi ion

– phân chia cao th n u (có ch a t t c các lo i h p ch t t không phân

c n phân c ) th nh á ph n o n có tính phân c c khác nhau

– cô l p m t m u h p ch t thiên nhiên c n kh o sát ra khỏi o th n u

ho c gi i o n cu i mu n tinh ch m u h p ch t

1.2.5 Các yếu tố ản ưởng đến quá trình tách chiết nguyên liệu [15]

1.2.5.1 Lựa chọn dung mô để tách chiết

Do c u t o hóa h c của cây cỏ ho c sinh kh i th ng là nh ng ch t li u i phân t (polymer, cellulose, n m m c, thành t bào vi sinh v t,…) t ng i tr không hòa tan trong dung môi h u v th vi c kh o sát h p ch t t nhi n ngh

c các lo i h p ch t bằng cách s dụng dung môi v n năng m th nol ( th chi t

h u h t các h p ch t t nhiên trong m u cây)

Nguyên t c của s chi t là dung môi không phân c c (ví dụ: eter d u hỏa, hexan, heptan, benzen, toluene,…) sẽ hòa tan t t các h p ch t có tính không phân

c c (ví dụ: các alcol béo, ester béo,…) ung m i ph n c trung bình (ví dụ: dietyl eter, chloroform,…) h t n t t các h p ch t có tính phân c c trung bình (các h p

ch t có ch a nhóm ch c eter -O- , aldehyde -CH=O, cetone -CO-, ester -COO-…)

và dung môi phân c c m nh (ví dụ: metanol, ethanol,…) h t n t t các h p ch t có tính phân c c m nh (các h p ch t có ch a nhóm ch c -OH, - …)

Mu n chi t h p ch t ra khỏi cây cỏ c n ch n dung môi phù h p, s dụng kỹ thu t chi t tách phù h p bằng cách ngâm d m, bằng máy chi t Soxhl t … Sau khi chi t, ph n bã cây còn l i l c bỏ, dung môi qua l c thu hồi bằng máy cô quay chân không nhi t th p 30 – 40 0C vì th c hi n nhi t cao có th l m h h i m t vài h p ch t kém b n nhi t

Ch n dung môi ph i tính trung tính kh ng c, không quá d cháy, hòa tan

c các h p ch t c n kh o sát Sau khi chi t tá h xong ung m i th c

lo i bỏ d dàng C n tránh á ung m i nh nz n ho c d cháy do có nhi t sôi th p nh i tyl t r on t tr lorur …

1.2.5.2 Nhiệ độ tách chiết

Khi nhi t tăng th nhớt của dung môi gi m, t o i u ki n thu n l i cho quá trình tách chi t Tuy nhiên, khi nhi t tăng sẽ gây b t l i cho quá trình tách chi t trong á tr ng h p sau:

– i với nh ng h p ch t kém b n nhi t khi nhi t tăng o sẽ gây bi n ổi

ho c làm m t tính ch t hóa h c của chúng Ví dụ nh : vit min gly osi alkaloid,…

– i với t p ch t: khi nhi t tăng kh ng h tan của ho t ch t tăng m tan của t p ch t ng tăng th o l m ho ch chi t thu c sẽ l n nhi u t p nh gôm, ch t nh y…ngo i r khi nhi t t tăng sẽ làm cho m t s ch t trong nguyên

li u b tr ng n , tinh b t b hồ h nhớt của d ch chi t tăng g y kh khăn ho quá trình tách chi t

– i với dung môi d y h i nhi t sôi th p khi tăng nhi t thì dung môi d b hao hụt, có th gây cháy nổ trong quá trình chi t nên thi t b chi t ph i kín và có b ph n hồi l u ung m i

1.2.5.3 Thời gian tách chiết

Khi b t u chi t, các ch t có phân t l ng nhỏ (th ng là ho t ch t) sẽ

c hòa tan và khu h tán v o ung m i tr ớ s u n các phân t lớn h n (

th ng là t p nh nh a, keo,…) o n u th i gian chi t ng n sẽ không chi t h t

ho t ch t trong nguyên li u y nh ng n u th i gian chi t dài quá thì d ch chi t sẽ

l n nhi u t p gây b t l i cho quá trình tinh ch và b o qu n

1.2.5.4 Độ mịn của nguyên liệu

hi kí h th ớc của nguyên li u cây thô quá dung môi sẽ khó th m ớt nguyên li u, ho t ch t khó chi t vào dung môi nên th i gian chi t sẽ l u h n hi nguyên li u cây m n quá thì b m t ti p xúc gi a nguyên li u v ung m i tăng l n

l ng ch t khu h tán v o ung m i tăng o th i gian chi t sẽ ng n h n

Tuy nhiên n u nguyên li u quá m n, khi ng m vào dung môi b t nguyên li u

b dính vào nhau nhi u t bào th c v t b phá hủy, d ch chi t l n nhi u t p

ng glu os n y t á lo i th ăn g i l r ohy r t ph n hủy

v i v o máu á th ăn r ohy r t gồm ánh m m kho i t y trái y

s Tuy n tụy m t ph n nằm phí s u y ti t r hoo -m n g i l insulin

v o ng máu nsulin ho phép glu os i huy n t máu v o á t o nh t nh

ủ th huy n h th nh năng l ng h ng t s ụng năng l ng n y i

l i n i huy n suy ngh v th hi n nhi u ho t ng khá

nh ti u ng x y r khi kh ng insulin ho kh ng ủ insulin h y insulin t o r kh ng ho t ng ng h năng huy n glu os r khỏi máu

ủ tuy n tụy l m ho tuy n tụy kh ng s n xu t insulin hi kh ng insulin t

o sẽ kh ng huy n h glu os l m ho l ng glu os trong máu tăng o

– nh ái tháo ng lo i 2: th ng x y r ng i tr n 50 tuổi hi m kho ng

g n 90 % trong tổng s tr ng h p ái tháo ng i với nh ng ng i ái tháo ng lo i 2 m th v n s n xu t insulin nh ng á t o kh ng

ho kém nh y m với s ó m t ủ insulin ng ng trong máu o kh ng huy n h th nh năng l ng n n gi m o hi th ph n ng ằng á h tăng s n xu t insulin l n v g y quá t i trong tuy n tụy Th o th i gi n

l ng insulin ti t r n n gi m nh ái tháo ng lo i 2 n nguy n

nh n ti m ẩn trong u t o g n i u n y l m ho nh phát tri n nh nh h n u

nh ng ng i m ng g n ti m ẩn phát hi n sớm v i n pháp ph ng ng ằng á h ăn u ng h p lí th nh th kh ng xu t hi n ho phát tri n h m

nh ng nh v n gi ng ti m ẩn Trong tr ng h p ng l i nh sẽ phát tri n

r t nh nh

1.3.3 ương p áp điều trị [2.23]

 Phương ph p điều trị đ i th o đường lo i 1:

Với nh ng ng i m nh ái tháo ng lo i 1 h sẽ ph i tiêm insulin

th ng xuy n trong u i v th h kh ng kh năng t o r hormon n y nsulin nhi u lo i nh ng nằm trong h i ng hính t y th o tá ụng nh nh h y

h m: ng tá ụng nh nh ng ng y tr ớ ăn tăng l ng insulin trong

th ph h p với l ng r ohy r t s p nh p v o ng tá ụng h m ng v o uổi t i gi l ng ng trong máu kh ng tăng v t trong nhi u gi v o h m sau

i n nay, vi u ng insulin ng viên là kh ng th vì insulin trong môi

tr ng y sẽ phân hủy o các nhà khoa h ng nghiên c u insulin trong m t vỏ nang thích h p thu có th qua dày, gi i phóng ra trong

ru t non và ng m vào máu Th i gian g n y ta th y xu t hi n insulin ới ng

t nó vào máu ằng ng phổi Qua nhi u năm nghiên u ng i ta phát hi n ng thu t này c hi u qu r t cao

 Phương pháp điều trị đ i tháo đường lo i 2:

Phụ thu vào tình tr ng ủ nh nhân, ph ng pháp ch tr g n li n với

vi ăn u ng thích h p tăng ng ho t ng h nh nhân ái tháo ng lo i

2 mới dùng thu u ng k t h p với nh ng h t hi u nhằm làm gi m l ng

ng huy t nh nhân có th dùng riêng thu viên ho k t h p với ph ng pháp tiêm insulin

Thu s ụng i u tr b nh ái tháo ng lo i 2 chủ y u chia 3 nhóm: – Nhóm thu c thúc tụy t ng ti t th m insulin nh nh m sulfonylur : gly uri (Micronase, DiaBeta, Glynase), glipizide (Glucotrol, Glucotrol XL), glimepiride (Amaryl); và nhóm meglitinide: repaglinide (Pradin)

– Nhóm thu c giúp insulin ho t ng h u hi u h n nh nh m igu ni : metformin (Glucophage, Glucophage XR, Metformin XR, nhóm thiazolidinedione: glitazone, rosiglitazone (Avandia), pioglitazone (Actos)

– h m ngăn ru t bớt h p thu ch t ng khi ăn ằng ch t c ch enzyme

α-glucosidase: acarbose (Precose, Glucobay), miglitol (Glyset)

h ng pháp h nzym α-glu osi s trong i u tr ái tháo ng lo i

2 u ti n s ụng v h n gi n n to n h x y r trong ph n ti u

h h kh ng th m gi v o quá tr nh huy n h ng h y i thi n h năng

ủ insulin ng nh kí h thí h s s n sinh insulin… nh á ph ng pháp khá

1.4 TỔNG QUAN VỀ ENZYME α-GLUCOSIDASE

1.4.1 Enzyme α-glucosidase[14]

Enzyme α-glucosidase với nh ng tên khác nh maltase, glucoinvertase, glucosidoinvertase, glucosidosucrase, maltase-glucoamylase, nitrophenyl α-D- glucosidase, transglucosidase, α-glucopyranosidase, glucosidoinvertase, α-D- glucosidase, α-glucosidase hydrolase, α-1,4-glucosidase, thu nhóm hydrolase

(nhóm enzym xúc tác á ph n ng thủy ph n).

1.4.2 ất ức c ế enzyme [14,17]

h t h enzyme là nh ng h t làm gi m t ph n ng do enzyme xúc tác o t ng ủ m t enzyme có th gi t ch t m t m m nh ho i u

ch nh l i s không cân ằng trong huy n hóa Có nhi u lo i thu h enzyme, chúng ng s ụng nh là h t i t ỏ và thu c tr sâu Không

ph i t t các phân t liên k t với enzyme u là h t h enzyme, nh ng

h t ho t hóa liên k t với á nzym và làm tăng ho t tính enzyme mà chúng liên

k t

S liên k t ủ m t h t h có th ngăn h n m t h t i vào tâm

ho t ng ủ enzyme và gây tr ng i cho các ph n ng xúc tác ủ enzyme

h t h có th liên k t với enzyme thu n ngh ch ho không thu n ngh h

h t h không thu n ngh h th ng ph n ng với enzyme và thay ổi nó v

m t hóa h h ng ch t h làm thay ổi l ng các acid amin quan tr ng

c n thi t cho ho t ng củ enzyme Ng l i h t h thu n ngh ch liên k t không ồng h tr và theo nh ng ki u khác nhau tùy thu vào liên k t h t

h - enzyme, ph nzyme - h t ho h i

h t h thu n ngh h li n k t với enzyme bằng các t ng tác không ồng hóa tr h ng h n nh liên k t hydrogen, t ng tác k n ớ và liên k t ion Nhi u liên k t y u gi các h t h và tâm ho t tính m nh mẽ và i t

Ng l i i với các h t và h t h không thu n ngh h các h t

h thu n ngh h th ng không tr i qua ph n ng hóa h khi liên k t với enzym

và c th ng lo i ỏ ằng cách pha loãng ho thẩm tách

Có 4 ki u ủ h enzyme thu n ngh h chúng phân chia d theo tác ng ủ s thay ổi nồng h t ủ enzym trên h t h :

1.4.2.1 Ứ ế ạn tranh (competitive inhibition)

C ch t và h t h không liên k t với enzyme cùng m t lúc i u này

có th là do h t h có ái l với tâm ho t ng ủ m t lo i enzyme nên

x y ra s nh tranh gi a h t và h t h nh tranh vào tâm ho t ng

ủ enzyme y là lo i h có th kh phụ ằng nồng ủ cao ủ

h t i vì nh ng h t h nh tranh th ng có u trúc t ng t nh u trúc

ủ h t n n th t

nh 1.7: ồ th h nh tr nh

1.5.2.2 Ứ ế phi ạn tranh (uncompetitive inhibition)

h t h h k t h p với ph enzyme - h t mà không k t h p với enzyme t do y là m t d ng h mà các liên k t ủ ch t h với enzyme làm gi m ho t tính ủ nó nh ng không nh h ng n liên k t ủ enzyme -

h t t qu là m ủ s ch h phụ thu vào nồng ủ h t h

nh 1.8: ồ th h phi nh tr nh

1.5.2.3 Ứ ế không ạn tranh (noncompetitive inhibition)

h t h h p với enzyme v trí khác với v trí k t h p ủ h t t o thành ph c enzyme - ch t - h t h không huy n hóa ti p h v y enzyme có th ồng th i k t h p h t h và h t h t và h t

ch không nh tranh với nhau k t h p với enzyme và ng không th lo i tr tác ụng kìm hãm ằng cách tăng nồng h t n n

nh 1.9: ồ th h kh ng nh tr nh

1.5.2.4 Ứ ế ỗn p (mixed inhibition)

h t h không nh ng liên k t với enzym t do mà còn liên k t với

ph h p enzyme - h t t o thành ph h p enzyme - h t h - h t nên không t o s n phẩm i n t ng h h phụ thu vào nồng h t

h T h i o c khi không h t h l o h n khi có m t

h t h

nh 1.10: ồ th h h n h p

1.5.3 ìn ìn ng iên cứu về k ả năng ức c ế enzyme α-glucosidase

ăm 1908, Kuble cô l p h p h t conduritol A t vỏ ủ qu nho

Marsdenia condurango, m t h p h t có kh năng h enzym α-glucosidase

p h t này ng tìm th y trong cây Glymnena sylvestre, m t loài cây bụi

dùng làm thu tr b nh ái tháo ng m t s n ớ châu Á và Ấn

ăm 1953 Ug l St n loni loir v á ng s l p h t

oji ios t h hi t x k kh năng h ho t tính ủ nzym nzym

α-glucosidase

ăm 2006, Nilubon Jong-Anurakkun và ng s l p 2 h p h t )-lyoniresinol 3a-O-β-D-glucopyranosid và quercetin 3-O-β-D- xylopyr nosyl(1”,2’’)-β-D-galactopyranosid t lá cây Alstonia scholaris có ho t tính h enzym α-glucosidase

ăm 2011 riy r ni [19] v ng s k t lu n rằng hi t xu t thyl t t

t ng (Zingiber officinale Ros o ) kh năng h ho t ng ủ nzym

glu osi s khi tính ằng giá tr 50 là 180.13 (mg/ml)

ăm 2012 niyu [5] v ng s h ng minh o hi t th nol t lá t i

y ồng (Struchium sparganophora) kh năng h nzym glucosidase

7-O-(β-D-glucosidase

i S u khi hái v nguy n li u r s h lo i ỏ t p h t ph i kh v x y t o

th nh t y huẩn ho quá tr nh nghi n u

nh 2.1: á y ỏ (Lumnitzera littorea) tr ớ v s u khi ph i

2.1.2 ịa điểm nghiên cứu

Thí nghi m c ti n hành t i phòng thí nghi m Sinh Hóa, Khoa Công Ngh Sinh H Tr ng i H c M Thành ph Hồ Chí Minh trong th i gian t tháng 09/2014 n tháng 02/2015

2.1.3 Hóa chất và thiết bị

Hóa chất:

– Ethanol (Vi t Nam)

– n–hexane (Vi t Nam)

– Ethyl acetate (Vi t Nam)

– 4- Nitrophenyl α–D –Glucopyranosde (Sigma)

– Enzyme α–Glucosidase (Sigma)

– Cân kỹ thu t (Sartorius TE 412)

– Máy cô quay (Buchi Rotavapor R – 200)

– èn UV hi n huỳnh quang Vilber Lourmat VL – 6.LC

– áy o qu ng phổ UV– vis

2.2 uy trìn điều chế cao tổng

2.2.1 Qu tr nh điều ch cao tổng t c Cóc đỏ (Lumnitzera littorea):

á y ỏ s dụng trong nghiên c u c thu hái t r ng ng p m n C n

Gi v o tháng 9 năm 2014 s u h ng t i th c hi n quá tr nh i u ch cao tổng

2.2.2 Thuy t minh quy trình

u lá y t i ỏ (Lumnitzare littorea) thu hái lá tr ng th nh t i

r ng ng p m n n i , s u lo i ỏ nh ng lá h hỏng s u nh r s h lo i

t át ph i kh v x y nhuy n S u , chúng tôi s ụng ung môi ethanol 96 0

C trí h ly á h p h t trong lá y ằng ph ng pháp ng m m với tỷ l nguy n

li u và dung môi là 1:12 g/ml Quá tr nh trí h ly th hi n với th i gi n ngâm

là 15 ngày, trong quá trình ngâm dung môi th y s u m i 24 gi Sau h n

h p s u khi trí h ly l th rồi l tinh lo i ỏ h s u khi l

lo i ung m i ằng ph ng pháp cô quay chân không Cao tổng n y s ụng

ti n h nh i u h o ph n o n á thí nghi m ti p th o

2.3 uy trìn điều chế cao p ân đoạn

2.3.1 Qu tr nh điều ch cao ph n đo n

C o ph n o n ti n h nh i u h t o tổng ằng á h s ụng á

ung m i ph n khá nh u nh n-hexane, ethyl acetate, ethyl acetate :

ethanol (8:2) v th nol h ng pháp hi t lỏng - lỏng s ụng i u h

o ph n o n Quy tr nh i u h o ph n o n tr nh y trong h nh 2.3

Cao ethyl acetate

Cao

n-hexane

Cao ethanol

Thuy t minh quy trình

Cao tổng t lá y ỏ thu theo s ồ hình 2.2 ti n hành quá trình

i u ch o ph n o n th o s ồ hình 2.3 o ph n o n i u ch theo th

t tăng n củ phân c c t ng ng với các dung môi nh : n-hexane, ethyl

acetate và h dung môi ethyl acetate : ethanol (8:2)

u tiên, dung môi n-hexane c thêm vào cao tổng, ti n hành khu y u cho các h p ch t thu ph n o n n-hexane h t n v o ung m i l ng s u

l c qua gi y l thu c d ch chi t n-hexane và ph n cao còn l i, quá trình này

c l p l i n khi các ch t trong cao tổng không tan vào dung môi n-hexane n a thì d ng l i D ch chi t n-hexane qu y uổi dung môi thu c cao chi t n-

hexane

Sau khi cao chi t n-hexane i u ch xong, ph n cao còn l i ti n hành cho

ung m i thyl t t v o i u ch cao chi t thu ph n o n ethyl acetate

Thao tác ti n hành thí nghi m ng gi ng nh hi t cao n-hexane Thu c d ch

chi t ethyl acetate và ph n cao không tan trong ethyl acetate, d ch chi t n y m i

qu y h n kh ng thu c cao chi t ethyl acetate

Ph n cao không tan trong dung môi ethyl acetate, h dung môi ethyl acetate : ethanol với tỷ l 8:2 ph tr ớc c cho v o i u ch o ph n o n ethyl acetate : ethanol (8:2) Khu y u h n h p, các h p ch t có kh năng t n trong ung môi ethyl acetate : ethanol (8:2) phân c c này sẽ h t n v o ung m i

l ng, l c qua gi y l thu c d ch chi t ethyl acetate : ethanol (8:2) và ph n cao không tan trong dung môi ethyl acetate : ethanol (8:2) D ch chi t n y m i

qu y h n kh ng thu c cao chi t ethyl acetate : ethanol (8:2)

Ph n cao không tan trong dung môi ethyl acetate : ethanol (8:2) sẽ m i quay lo i bỏ ung m i thu c cao chi t ethanol

á o hi t n y sẽ s ụng trong á thí nghi m ti p th o

2.4 Nghiên cứu sự ản ưởng thời gian đến vận tốc phản ứng của enzyme

Ho t ng c ch enzyme α-glu osi s xá nh d a theo ph ng pháp

của Apostolidis [1] và c ng s (2007)

Thí nghi m c ti n hành nh s u: Cho 2 ml dung d ch enzyme

α-glucosidase 0.5 mg/ml vào 1ml dung d h m phosphate pH = 6.9 và 1 ml dung

d h h t p-nitrophenyl-α-D-glucosidase 5 mM vào h n h p trên L u h n

h p, ổn nh nhi t phòng Th i gian ph n ng c th c hi n trong 50 phút, trong m i phút chúng tôi l y m u i o h p thụ t i ớc s ng 405 nm Sau

vẽ ồ th bi u di n m i quan h gi a th i gian ph n ng v h p thụ, t xá

nh c kho ng th i gian ph n ng nhanh nh t t kho ng tuy n tính tr n ồ th

Trong thí nghi m này, enzyme α-glucosidase và h t

p-nitrophenyl-α-D-glu osi s u c pha trong dung d h m phosphate pH = 6.9

2.4.4 Chỉ êu đán g á

– Xá nh l ng p-nitrophenol sinh ra khi cho h n h p enzyme α-glucosidase

và h t p-nitrophenyl-α-D-glucosidase ph n ng

t qu thí nghi m l s li u trung nh ủ 3 l n l p l i x l th ng k ằng ph n m m St tgr phi plus 3.0

2.5 Nghiên cứu sự ản ưởng của nồng độ cơ c ất đến vận tốc phản ứng của enzyme -glucosidase

Thí nghi m nghi n u s nh h ng ủ p-nitrophenyl-α-D-glucosidase n

Thí nghi m c ti n h nh nh s u: ho 2 ml dung d ch enzyme α-glucosidase

0.5 mg/ml và 1ml dung d h m m phosphate pH = 6.9 vào m i ng nghi m

Ti p theo, cho 1 ml dung d h h t p-nitrophenyl-α-D-glucosidase t ng ng với các nồng nh trí b ng 2.1 vào h n h p trên L u h n h p, s u ổn

nh nhi t phòng trong th i gian t i u thu c thí nghi m 2.4 ho enzyme α-glucosidase v h t p-nitrophenyl-α- -glu osi s ph n ng S u khi

ủ th i gi n ph n ng ti n h nh o h p thụ ớ s ng 405 nm S u vẽ

ồ th bi u di n m i quan h gi h p thụ và nồng

p-nitrophenyl-α-D-glucosidase, kho ng nồng h t c ch n ph i tuy n tính với h p thụ

Trong thí nghi m này, enzyme α-glucosidase và h t

p-nitrophenyl-α-D-glu osi s u c pha trong dung d h m phosphate pH = 6.9

2.5.4 Chỉ êu đán g á

– Xá nh l ng p-nitrophenol sinh ra khi cho h n h p enzyme α-glucosidase

và h t p-nitrophenyl-α-D-glucosidase ph n ng

t qu thí nghi m l s li u trung nh ủ 3 l n l p l i x l th ng k ằng ph n m m St tgr phi plus 3.0