Đánh giá khả năng kiểm soát sinh học của các chủng BACILLUS SPP đối với nấm COLLETOTRICHUM SPP gây bệnh thán thư trên giống ớt sừng trâu (capsicum annuum)

Nhưng trong đó Bacillus thể hiện là tác nhân kiểm soát sinh học nấm Colletotrichum đã được chứng minh như hình thành khuẩn lạc hiệu quả ở vùng rễ, hoạt động linh hoạt để chống lại nhiều

LỜI CẢM ƠN

Chân thành cảm ơn anh Nguyễn Tấn Đức và chị Trần Thùy Trang đã truyền đạt cho em vốn kiến thức quý báu và kinh nghiệm thực tiễn trong suốt thời gian thực hiện khóa luận

Cảm ơn thầy Nguyễn Văn Minh cùng các thầy cô, bạn bè tại trường Đại học

Mở Tp HCM đã hỗ trợ em để hoàn thành tốt bài báo cáo

Cảm ơn Trung tâm Công Nghệ Sinh Học Tp.HCM đã tạo điều kiện cho em được thực tập và làm đề tài tại Trung tâm

Cảm ơn các anh chị trong phòng Công Nghệ Vi Sinh cùng sinh viên các trường thực tập tại đây luôn nhiệt tình và thân thiện đã giúp đỡ em trong thời gian thực hiện đề tài

Nguyễn Thế Bảo

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

MỤC LỤC ii

DANH MỤC HÌNH iv

DANH MỤC BẢNG v

DANH MỤC BIỂU ĐỒ vi

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

1 Tính cấp thiết của đề tài 1

2 Mục tiêu 2

PHẦN I: TỔNG QUAN 3

1 Bệnh thán thư 3

2 Các loài nấm Colletotrichum gây bệnh thán thư 3

2.1 Giới thiệu chung về nấm Colletotrichum 3

2.2 Các giai đoạn xâm nhiễm 4

2.3 Điều kiện xâm nhiễm của nấm 5

2.4 Vòng đời của nấm 6

3 Các loài nấm gây hại phổ biến ở Việt Nam 7

4 Các biện pháp phòng trừ 13

4.1 Giống kháng bệnh 14

4.2 Kiểm soát nuôi trồng 14

4.3 Kiểm soát hóa học 15

4.4 Kiểm soát sinh học 16

5 Chế phẩm sinh học 16

6 Vi khuẩn Bacillus 16

6.1 Các chủng Bacillus có khả năng đối kháng nấm cao 17

6.2 Các chất kháng nấm của Bacillus 20

6.2.1 Enzyme Mycolytic 20

6.2.2 Enzyme Chitinase 20

6.2.3 Enzyme Cellulase 21

6.2.4 Các chất thuộc Lipopeptide 22

6.2.4.1 Iturin 22

6.2.4.2 Surfactin 23

6.2.4.3 Fengycin 23

7 Các nghiên cứu khác 24

7.1 Phân tích các bài báo 25

PHẦN II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 31

1 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 32

2 Vật liệu nghiên cứu 32

3 Phương pháp nghiên cứu 33

3.1 Phương pháp xác định hiệu quả đối kháng in vitro 33

3.2 Phương pháp lây bệnh nhân tạo và xác định độc lực nấm bệnh in vitro 34

3.3 Phương pháp đếm bào tử nấm và vi khuẩn 34

3.3.1 Phương pháp đếm bào tử nấm 34

3.3.2 Phương pháp đếm khuẩn lạc vi khuẩn 35

3.4 Các thí nghiệm đánh giá khả năng phòng và trị bệnh thán thư của dung dịch Bacillus trực tiếp trên ớt in vitro 35

3.5 Phương pháp xử lý đất dùng trong thí nghiệm chậu, vại 36

3.6 Bố trí thí nghiệm trong nhà kính 37

3.6.1 Cách thực hiện: 37

3.6.2 Đánh giá hiệu quả Bacillus trong điều kiện in vivo 38

3.7 Phương pháp xử lý số liệu 39

PHẦN III: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 40

1 Đặc điểm đại thể và vi thể của nấm Colletotrichum spp 40

2 Tuyển chọn các chủng Bacillus spp có tính đối kháng mạnh với Colletotrichum spp và quan sát đặc điểm đại thể, vi thể 41

3 Đếm bào tử nấm và vi khuẩn 42

4 Kết quả đối kháng in vitro 43

5 Chủng bệnh nhân tạo trên ớt 49

6 Các thí nghiệm trên ớt 49

6.1 Đánh giá độc lực nấm bệnh 49

6.2 Đánh giá khả năng phòng bệnh 51

6.3 Đánh giá khả năng trị bệnh 53

7 Kết quả trồng ớt trong nhà kính 55

7.1 Cây ớt 55

7.2 Bệnh thán thư trên ớt 56

8 Kết quả đánh giá khả năng kiểm soát sinh học trong nhà kính 56

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 61

TÀI LIỆU THAM KHẢO 62

PHỤ LỤC 67

DANH MỤC HÌNH

Hình 1: Giai đoạn sinh trưởng và phát triển của nấm 7

Hình 2: Vị trí phân cắt enzyme chitinase 21

Hình 3 : Mô tả thí nghiệm đối kháng in vitro 33

Hình 4: Cách thức chủng bệnh nhân tạo 34

Hình 5 : Các giai đoạn sinh trưởng của ớt trong nhà kính 55

Hình 6: Các giai đoạn thán thư trên ớt 56

Hình 7 Đặc điểm hình thái khuẩn lạc nấm Colletotrichum accutatum theo thời gian 40

Hình 8: Đặc điểm vi thể của nấm Colletotrichum accutatum theo thời gian 41

Hình 9: Khả năng đối kháng nấm Colletotrichum spp của Bacillus spp và đối chứng lần 1 44

Hình 10: Khả năng đối kháng nấm Colletotrichum spp của Bacillus spp và đối chứng lần 2 46

Hình 11: Khả năng đối kháng nấm Colletotrichum spp của Bacillus spp và đối chứng lần 3 48

Hình 12 : Kết quả chủng bệnh nhân tạo với đối chứng sau 10 ngày 49

Hình 13: Kết quả phương pháp tiêm và tạo vết thương sau 7 ngày 50

Hình 14 : Thí nghiệm đánh giá khả năng phòng bệnh thán thư của Bacillus spp 53

Hình 15 : Tạo hỗn hợp 5 chủng Bacillus spp 53

Hình 16 : Kết quả đối kháng trên ớt ở các nồng độ 55

Hình 17 : Cách chủng bệnh cho cây ớt 57

Hình 18: những quả bệnh không lây lan sang những quả khác 58

Hình 19: Các nghiệm thức có phun Bacillus so với đối chứng 60

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1 : Một số loài nấm Colletotrichum spp gây bệnh trên ớt theo quốc gia 4

Bảng 2: Đặc điểm những loài nấm Colletotrichum spp chính gây bệnh thán thư ở Việt Nam 7

Bảng 3: Các chủng vi khuẩn Bacillus spp đối kháng nấm Colletotrichum spp 17

Bảng 4: Các thành phần iturin khác nhau 22

Bảng 5: Các nghiên cứu liên quan trong những năm gần đây 24

Bảng 6: Khả năng kháng nấm của Protein trong các điều kiện nhiệt độ 26

Bảng 7: Đường kính tăng trưởng khuẩn lạc của C gloeosporioides 26

Bảng 8: Hiệu quả kiểm soát sinh học: 29

Bảng 9: Đặc điểm đại thể và vi thể của một số chủng Bacillus spp 41

Bảng 10: Kết quả đối kháng in vitro lần 1 43

Bảng 11: Kết quả đối kháng in vitro lần 2 44

Bảng 12: Kết quả đối kháng in vitro lần 3 46

Bảng 13: Tổng số quả và số quả bệnh trong nhà kính 57

DANH MỤC BIỂU ĐỒ

Biểu đồ 1: Kết quả đối kháng lần 1 44

Biểu đồ 2: Kết quả đối kháng lần 2 45

Biểu đồ 3: Kết quả đối kháng lần 3 48

Biểu đồ 4: Kết quả chủng bệnh sau 10 ngày 49

Biểu đồ 5: Đường kính vết bệnh giữa tiêm và tạo vết thương 50

Biểu đồ 6: Trung bình đường kính vết bệnh ở các nghiệm thức 51

Biểu đồ 7: Kết quả đối kháng, D là đường kính vết bệnh, L là chiều dài quả ớt 54

Biểu đồ 8: Tỷ lệ bệnh sau 7 ngày, 14 ngày 58

Biểu đồ 9: Chỉ số bệnh sau 7 ngày, 14 ngày 58

Biểu đồ 10: tỷ lệ bệnh và tỷ lệ đối kháng sau 7 ngày, 14 ngày 59

ĐẶT VẤN ĐỀ

1 Tính cấp thiết của đề tài

Cây ớt (Capsicum sp.) thuộc chi Capsicum, họ cà (Solanaceae) Có hai nhóm

ớt phổ biến là ớt cay (Capsicum frutescens L.) và ớt ngọt (Capsicum annuum L.) Trong số các cây trồng thuộc họ cà (Solanaceae), cây ớt có tầm quan trọng thứ hai

chỉ sau cây cà chua Tổng sản lượng trồng ớt và lượng ớt bột trên thế giới năm 2013 đạt 3.458.634 tấn với diện tích 1.974.910 ha, cũng trong năm đó tính riêng ở Việt Nam ước tính khoảng 93.000 tấn trên cả nước với tổng diện tích khoảng 64.000 ha theo thông tin từ FAO [19] Qua đó nhận thấy được tầm quan trọng của ớt đối với kinh tế của Việt Nam và trên thế giới

Có rất nhiều tác nhân gây bệnh làm ảnh hưởng đến thu nhập của người dân trồng ớt như các bệnh do nấm, vi khuẩn, virus hoặc do côn trùng như sâu, bọ trĩ, rệp,

nhện Trong đó, nghiêm trọng nhất vẫn là bệnh thán thư do nấm Colletotrichum spp gây ra, kế đó là bệnh héo xanh do vi khuẩn Pseudomonas solanacearum, bệnh khảm

virus trên gân lá (CVMV) và bệnh khảm virus dưa chuột (CMV)[25]

Đối với bệnh thán thư, cây bị bệnh kém phát triển, lá vàng và rụng sớm Bệnh tấn công trên trái làm thối trái hàng loạt, đôi khi thất thu năng suất 100% Điều kiện thời tiết nóng, mưa nhiều, ẩm độ cao (từ 70-80%) thích hợp cho nấm phát triển Bào

tử nấm bệnh phát tán nhờ gió, mưa và côn trùng Bào tử nấm bệnh trong thời gian dài ngừng hoạt động đến khi quả chín sẽ phát bệnh Nếu trên giống nhiễm, bệnh gây hại

cả trái non

Các biện pháp để phòng bệnh thán thư được khuyên dùng như: thu gom, tiêu hủy trái bệnh, sử dụng giống khỏe sạch bệnh, luân canh cây trồng khác họ, đều mang lại hiệu quả nhưng không triệt để Bệnh vẫn có thể tích tụ trong đất và bùng phát Sử dụng thuốc hóa học để trị bệnh tuy đem lại hiệu quả cao nhưng làm ảnh hưởng đến môi trường, dễ làm nấm bệnh lờn thuốc và ảnh hưởng đến chất lượng quả ớt Hiện nay, sử dụng biện pháp sinh học để kiểm soát nấm bệnh đang là ưu tiên hàng đầu, vì các lợi ích về môi trường sinh thái và an toàn cho người tiêu dùng

Nhiều tác nhân kiểm soát sinh học được sử dụng để ức chế nấm Colletotrichum

sp như: nấm Trichoderma, Gliocladium, vi khuẩn Bacillus subtilis, Bacillus lichenifomis, Bacillus amyloliquefaciens, xạ khuẩn Streptomyces Nhưng trong đó Bacillus thể hiện là tác nhân kiểm soát sinh học nấm Colletotrichum đã được chứng

minh như hình thành khuẩn lạc hiệu quả ở vùng rễ, hoạt động linh hoạt để chống lại

nhiều tác nhân gây bệnh và khả năng sinh bào tử Ngoài ra Bacillus còn tiết ra một số enzyme và các chất có hoạt tính ức chế nấm hữu hiệu

Do vậy, chúng tôi đã thực hiện đề tài “Đánh giá khả năng kiểm soát sinh học

của một số chủng vi khuẩn Bacillus spp đối với nấm Colletotrichum spp gây bệnh thán thư trên giống ớt sừng trâu (Capsicum annuum).” để làm cơ sở hình thành chế

phẩm vi sinh phòng và trị bệnh thán thư trên cây ớt

2 Mục tiêu

Xác định khả năng đối kháng sinh học của các chủng Bacillus (B subtilis, B

 Đối kháng in vitro trên đĩa petri

 Đối kháng in vivo trên quả ớt

 Đối kháng in vivo trên cây ớt trong nhà kính

PHẦN I: TỔNG QUAN

1 Bệnh thán thư

Bệnh thán thư, bắt nguồn từ một từ tiếng Hy Lạp có nghĩa là 'than', là tên gọi chung cho các bệnh thực vật đặc trưng bởi rất tối, tổn thương sâu, có chứa các bào tử [25] Bệnh thán thư gây thiệt hại trên nhiều loại cây trồng và hoa màu như ớt, xoài,

cà chua, …

Bệnh thán thư là một trong những nguyên nhân chính gây thiệt hại kinh tế nghiệm trọng trong ngành trồng ớt trên thế giới, đặc biệt là vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới [50] Ở các quốc gia đang phát triển bệnh thán thư gây thiệt hại lớn về kinh

tế cho người trồng ớt, từ 10% đến 80% [41] Đây là một bệnh gây hại nghiêm trọng trên ớt trong mùa mưa, làm cho trái thối hàng loạt Bệnh gây hại nặng trên hầu hết các vùng trồng ớt ở nước ta

Chúng xuất hiện gây hại trên nhiều bộ phận của cây Trên lá, vết bệnh hình tròn hoặc không có hình dạng nhất định, xếp theo chiều dài của gân lá Lúc đầu, đốm bệnh ở mặt dưới lá có màu nâu nhạt, sau chuyển màu nâu sậm, có viền đỏ, lan rộng

và lõm sâu Trên cuống lá và thân cây vết bệnh cũng lõm xuống tạo thành vết dọc màu nâu đen Cây bị bệnh kém phát triển, lá vàng và rụng sớm Thiệt hại nặng nhất

là bệnh tấn công trên trái làm thối trái hàng loạt, đôi khi thất thu năng suất 100% Bệnh thường gây hại từ trái già đến trái chín Nếu trên giống nhiễm, bệnh gây hại cả trái non

Ảnh hưởng trên trái khi bị nhiễm bệnh, xuất hiện lúc đầu là những đốm tròn

có màu xanh đậm, lõm xuống, hơi ướt, sau đó vết bệnh lớn dần có màu vàng nhạt đến trắng xám hoặc đen, bên trong vết bệnh có nhiều vòng đồng tâm nhô lên, trên đó có những chấm nhỏ li ti màu vàng Trái ớt sau thu hoạch vẫn tiếp tục bị bệnh Nấm bệnh tồn tại trong hạt giống, tàn dư thực vật hoặc sống trong đất 1-2 năm

2 Các loài nấm Colletotrichum gây bệnh thán thư

2.1 Giới thiệu chung về nấm Colletotrichum

Loài nấm Colletotrichum đầu tiên được nghiên cứu bởi Corda (1837), lúc đó được gọi là Colletothrichum, sau đó chính tác giả đổi tên nhành Colletotrichum [6] Nấm Colletotrichum spp là tác nhân chính gây nên bệnh thán thư trên cây ớt

Colletotrichum spp được được phân loại vào giới nấm, ngành Ascomycota, lớp Sordariomycetes, bộ Phyllachorales, họ Phyllachoraceae, [50] Giai đoạn hữu tính là Glomerella Bệnh thán thư ớt được Halsted (1890) báo cáo đầu tiên tại New Jersey, USA vào năm 1980, Halsted đã mô tả các tác nhân gây ra là Gloeopsorium

piperatum và Colletotrichum nigrum Sự phân loại này có phần tương đồng với Colletotrichum gloeosporioides

Nhóm nghiên cứu ở trường đại học Kasetsart Kamphaeng Saen Campus,

Nakhom Pathom, Thái Lan (2007) đã xác định 5 loài trong chi Colletotrichum gây bệnh loét trên ớt: C acutatum, C coccodes, C gloeosporioides, C capsici, C graminicola [51]

Các loài khác nhau gây ra các bệnh của cơ quan khác nhau của cây ớt; ví dụ:

C acutatum và C gloeosporioides gây nhiễm trái cây ớt ở tất cả các giai đoạn phát triển, nhưng thường không phải là lá hoặc thân, mà chủ yếu là do C coccodes và C dematium C coccodes thường gây bệnh ở lá [38]

Bảng 1 : Một số loài nấm Colletotrichum spp gây bệnh trên ớt theo quốc gia [31]

Quốc gia Tác nhân gây bệnh

Australia

Colletotrichum accutatum, C atramentarium, C dematium, C gloeosporioides var minor, C gloeosporioides var gloeosporioides

Ấn độ C capsici

Hàn Quốc C accutatum, C gloeosporioides, C coccodes, C dematium

Myanma Gloeosporium piperatum E và E., C nigrum E và Hals

New Zealand C coccodes

Đài Loan C accutatum, C gloeosporioides, C capsici

Thái Lan C accutatum, C gloeosporioides, C capsici

Việt Nam C accutatum, C gloeosporioides, C capsici, C nigrum

Ở các quốc gia khác nhau, thành phần nấm Colletotrichum gây bệnh thán thư trên cây ớt khác nhau Ở Việt Nam, C acutatum, C capsici và C gloeosporioides là

những nấm chính gây bệnh thán thư trên ớt

Nấm có thể gây bệnh ở hầu hết các thành phần của cây như : lá, hoa, cành, quả, và gây các bệnh như thối rễ, rụng lá, cháy bạc hoa hay thối quả Bệnh xuất hiện

ở hầu hết vật chủ trưởng thành, mặc dù nấm bệnh phát triển mạnh mẽ trong những khu vực ẩm ướt, ở điều kiện khô thì chúng không phát triển mạnh

Các loài nấm Colletotrichum có thể gây bệnh khi quả còn non và phát bệnh

khi quả chín hoặc phát bệnh khi trong thời gian bảo quản Có trường hợp quả khi trồng biểu hiện hoàn toàn khỏe mạnh nhưng khi bảo quản lại có bệnh là bởi vì nấm

có thể gây bệnh tiềm ẩn

2.2 Các giai đoạn xâm nhiễm

Giai đoạn tiền xâm nhập và điều kiện ảnh hưởng đến sự phát triển: Các giai đoạn đầu sự phát triển của nấm trong quá trình nhiễm trùng giống nhau ở tất cả các

Colletotrichum có thể chia thành: tích lũy bào tử nấm trên bề mặt thực vật, mang

những bào tử nấm tới những bề mặt khác, bào tử nảy mầm, sản xuất các tế bào chuyên

biệt gây bệnh, xâm nhập vào lớp biểu bì thực vật [43]

Giai đoạn xâm nhập và hình thành khuẩn lạc: đây là giai đoạn quan trọng trong

gây nhiễm ở thực vật Nấm hình thành các giác bám thâm nhập vào bề mặt cây, các

chồi ngủ hoặc các bộ phận đang sinh trưởng gây ra các triệu chứng khác nhau bao

gồm các vết bệnh rất điển hình được gọi chung là bệnh loét [6] Giai đoạn này thường

dựa trên sự hình thành của cấu trúc lây nhiễm chuyên biệt gọi là appressoria (một tế

bào chuyên biệt điển hình của nhiều tác nhân gây bệnh nấm được sử dụng để lây

nhiễm sang cây chủ) Appressoria cho phép nấm bệnh xâm nhập trực tiếp qua lớp

cutin và vách tế bào biểu bì [17] Sau khi xâm nhập, có hai phương thức gây nhiễm

cho vật chủ là: intracellular hemibiotrophy và subcuticular intramural

necrotrophy[13]

Các cách thức lây nhiễm của các loài Colletotrichum như mô tả của Bailey &

và cộng sự (1992) Các giai đoạn đầu là như nhau cho cả hai cách thức

Giai đoạn đầu, một bào tử nảy mầm và hình thành appressorium Các

appressorium tạo thành một cái lỗ móc thâm nhập, nó có thể xuyên qua lớp biểu bì

của vật chủ và trông như một điểm sáng có thể được nhìn thấy trong các appressorium

A: Trong intracellular hemibiotrophs, lỗ móc thâm nhập vào các tế bào biểu

bì và phình ra để sản xuất một túi nhiễm trùng và các sợi nấm lớn, được coi là sợi

nấm chính, nó có thể xâm chiếm biểu bì kế cận và các tế bào diệp nhục Trong giai

đoạn đầu của cách thức xâm thực này, sự tương tác giữa vật chủ và các tác nhân gây

bệnh là biotrophic Giai đoạn necrotrophic tiếp theo tương tác được đặc trưng bởi sự

hình thành của các sợi nấm thứ cấp mỏng Những sợi nấm thứ cấp phát triển trong tế

bào và giữa gian bào khi tiết enzyme phân hủy vách tế bào và giết chết các tế bào vật

chủ

B: Trong subcuticular intramural necrotrophs, sự xâm thực vật chủ ban đầu ở

dưới lớp biểu bì Các sợi nấm bên trong có giai đoạn biotrophic là rất ngắn hoặc

không xảy ra Nấm nhanh chóng lây lan khắp các mô và tăng trưởng ở cả gian bào và

trong tế bào

2.3 Điều kiện xâm nhiễm của nấm

Tuy nhiên, để nấm bệnh có thể phát triển thành công trong vật chủ thì nó phải

vượt qua được sự đề kháng của vật chủ Khả năng đề kháng của những quả chưa chín

có thể liên quan đến những cơ chế sau:

Những hợp chất độc hại với nấm được hình thành trước tiên: trong vỏ của quả bơ

chưa chín cho thấy xuất hiện nồng độ cao các chất ngăn cản sự phát triển của nấm

C Gloeosporioides (in vitro), và sau đó giảm dần nồng độ khi trái chín dần Ngoài ra

chất epicatechin trong quả chưa chín còn làm giảm hoạt động của nấm bệnh, và khi quả chín thì epicatechin cũng giảm dần Điều đó cho thấy khi quả chín thì hoạt động

của nấm bệnh cũng tăng dần và biểu hiện ra bệnh [43]

Nhu cầu dinh dưỡng của nấm bệnh: sự chín của quả trải qua một loạt các thay đổi sinh hóa và rõ ràng nhất là sự chuyển hóa cacbohidrate thành đường tan [23] Trong

số các bệnh nấm, sự đề kháng có liên quan đến đường Những giống ổi đề kháng tốt

với Glomerella cingulata có lượng chất rắn hòa tan và ascorbic acid cao hơn những giống dễ bị nhiễm bệnh

Những enzyme tiềm năng của nấm: bệnh do Colletotrichum thường tạo ra các vết

thương trũng, điều này thường gây chết hoặc làm ngập nước mô nhiễm bệnh Những

loài Colletotrichum tạo ra lượng lớn enzyme có khả năng phá hủy cấu trúc mô thực

vật và một số gây chết tế bào thực vật Có 2 enzyme thường gặp là giảm lượng cacbohydrat, phân hủy vách tế bào và thủy phân lớp cutin Các enzyme này thường

bị suy giảm khi gặp vách tế bào của những trái chưa chín [13]

Sản xuất chất kháng khuẩn ở những vùng bệnh (Phytoalexin): phytoalexin (chất kháng khuẩn và chất oxy hoá thường được tích tụ nhanh chóng bởi thực vật tại vùng nhiễm bệnh.) đã được xác định có trong những quả bị thối do bệnh thán thư Những quả chưa chín khi tiêm nấm gây bệnh thán thư thấy xuất hiện phytoalexin capsicannol bằng phương pháp sắc ký bản mỏng Những quả chín cũng thấy xuất hiện capsicannol nhưng khi vùng tổn thương mở rộng thì không phát hiện được phytoalexin capsicannol [10]

2.4 Vòng đời của nấm

Điều kiện thời tiết nóng, mưa nhiều, ẩm độ cao thích hợp cho nấm phát triển Nấm bệnh trải qua mùa đông trong thân, lá, trái cây ở dạng bào tử hoặc sợi nấm Túi bào

tử hay bào tử được tạo ra bởi sợi nấm còn sót lại ở mùa xuân gây nhiễm sơ cấp Sau

đó nếu gặp điều kiện nhiệt độ và độ ẩm thích hợp sẽ gây nhiễm thứ cấp Bào tử nấm phát tán khi cuống bào tử đính ẩm ướt, phát tán nhờ sự bắn tung tóe và thổi mưa hoặc khi tiếp xúc với côn trùng, dụng cụ

Hình 1: Giai đoạn sinh trưởng và phát triển của nấm [52]

3 Các loài nấm gây hại phổ biến ở Việt Nam

Bảng 2: Đặc điểm những loài nấm Colletotrichum spp chính gây bệnh thán thư

ở Việt Nam

Nấm

C accutatum Đặc điểm hình thái như hình thái khuẩn, hình dạng bào tử

đính, sự hiện diện hay vắng mặt của lông cứng và các hạch, và hình dạng và kích thước appressorium đã được sử dụng để phân

biệt các loài trong chi Colletotrichum Các đặc tính khác, chẳng

hạn như tốc độ tăng trưởng và nhạy cảm với benomyl (một loại

thuốc diệt nấm) là rất hữu ích để phân biệt C acutatum và C

gloeosporioides

C

gloeosporioides

Loài nấm Colletotrichum gloeosporioides có phạm vi

biến đổi rõ nhất trong các tiêu chuẩn dùng để phân loại sự khác

nhau giữa các loài Colletotrichum Loài nấm này có đặc điểm là

bào tử không đồng nhất trên môi trường nuôi cấy, chính vì vậy

mà việc phân loại chúng rất khó khăn vì không thể chỉ dựa vào các đặc điểm hình thái [6]

Theo Sutton, 1992 [48] giống Glomerella được phân ra

thành 6 loài chuyên tính dựa trên các đặc tính sinh lý của từng loài bao gồm:

- Glomerella cingulata f sp Aschynomenes Daniel & ctv., 1973

– Gây hại nhẹ trên A Indica nhưng không gây hại trên lúa, cỏ dại và các cây trồng khác

- Glomerella cingulata f sp Camelliae Dickens & Cook, 1989 –

Gây hại trên cây chè

- Colletotrichum gloeosporioides f sp clidemiae Truilo & ctv.,

1986 - Gây hại trên cây cỏ saphony

- Colletotrichum gloeosporioides f sp cucurbitae Menten &

ctv., 1980 - Gây hại trên cây bầu bí

- Colletotrichum gloeosporioides f sp.manihotis Chevaug., 1956

– Gây hại trên cây sắn

- Colletotrichum gloeosporioides var minus Simmond., 1965, có giai đoạn hữu tính là Glomerella cingulata var minor Wollenw.,

1949 - Gây hại trên cây xoài

C capsici

Phạm vi ký chủ

C accutatum Nhiều nghiên cứu đã cấy được tiến hành với

Colletotrichum spp., Chứng minh rằng hầu hết các chủng nấm

không có vật chủ cụ thể Tuy nhiên, vài nghiên cứu gần đây cho

thấy những vật chủ đặc trưng của C acutatum Theo Natalia A Peres và cộng sự [39] thì C acutatum có phổ ký chủ rộng trong

số các cây ăn quả, đặc biệt là quả dâu tây và ớt

C

gloeosporioides

Theo số liệu của CABI [16] thì nấm Colletotrichum gloeosporioides gây hại trên hầu hết các loại cây trồng ở 47 nước trên thế giới, đặc biệt phổ biến ở vùng nhiet đới và vùng á nhiệt đới Phạm vi ký chủ của nấm có khoảng 70 loài cây trông khác nhau bao gồm các ký chủ chính như : đay (Corchorus), đậu Lupins (Luinus spp.), điều (Anacadium occidentale), đu đủ,

bông, bơ, bưởi, cà chua, cà phê, cam, chanh, cao su, phong lan

và các ký chủ phụ khác như các loại đậu, bí ngô, dưa, vải

C capsici Theo Maiti và Sen (1982) nấm Colletotrichum capsici

(Syd.) E J Butler & Bisby gây bệnh nghiêm trọng ở Ấn Độ trên

nhiều ký chủ khác nhau, đặc biệt là trên cây ớt (Capsicum annuum) và hô tiêu (Piper betle) làm thiệt hại 35% năng suất,

gây hại trên cây khoai tây và cây nho ở Nigeria, phá hại mùa màng thiệt hại tới 50% năng suất (Okoli & Erinle, 1989) [16]

Việc xác định phạm vi ký chủ của các loài Coletotrichum

thường là rất khó (Johnston & Jones, 1997) Chúng thường gây bệnh ở các loài cây trồng có mối quan hệ trong họ cà như ớt

(Capsicum annuum: chilli, pepper), cà chua, khoai tây, cà tím

Đặc điểm sinh học

C accutatum Dưới nhiệt độ thuận lợi, tổn thương trên quả chín có thể

thấy được trong vòng 5-6 ngày sau khi nhiễm Khối bào tử vô tính màu cam có thể xuất hiện rãi rác hoặc trong vòng tròn đồng tâm trên các vùng tổn thương Bào tử đính màu đen đã được tạo

ra ngay dưới vỏ của trái cây bị nhiễm bệnh

Suốt quá trình gây nhiễm, bào tử nảy mầm trên bề mặt của trái xanh và hình thành appressoria Sợi nấm sau đó xâm nhập qua lớp biểu bì, duy trì trạng thái nghỉ cho đến khi trái chín Hiện tượng thối quả cuối cùng xuất hiện là sự hình thành khối bào tử màu cam có thể nhìn thấy được trên bề mặt quả

C

gloeosporioides

Nấm thường xuyên xâm nhiễm trên những phần đã chết hay những bộ phận bị tổn thương của cây trồng và thường có mặt trong các mẫu bệnh quan sát bên ngoài những mô khoẻ Trong điều kiện có ẩm độ và nhiệt độ cao nấm gây hại rất nghiêm trọng Trên nhiều lọai cây trồng nhiệt đới khi phân lập người ta thường bắt gặp nấm tồn tại dưới hai dạng : nội ký sinh và ngoại ký sinh trên bề mặt mô cây

Nấm có thể sinh trưởng ở nhiệt độ 4oC nhưng nhiệt độ thích hợp nhất cho nấm phát triển là từ 25 – 29oC và ẩm độ gần 100%, trong điều kiện này nấm gây hại nghiêm trọng nhất (Mordue, 1971 [16])

Bào tử nấm được sản sinh trong khối nhầy ưa nước, chính chất nhầy này ức chế, ngăn cản khả năng nảy mầm và tăng cường

sự lan truyền của bào tử trong nước do đó khi mật độ của bào tử quá cao có thể làm giảm hiệu quả của sự xâm nhiễm Đây là quá

trình tự điều chỉnh mật độ quần thể của nấm Colletotrichum gloeosporioides

C capsici Nấm ảnh hưởng đến các mô mới bởi sự sản sinh giác bám

màu nâu khi bào tử nảy mầm Những giác bám này thâm nhập vào bề mặt của cây và các chôi ngủ hoặc các bộ phận đang sinh trưởng gây ra các triệu chứng khác nhau bao gồm các vết bệnh rất điển hình được gọi chung là bệnh loét Ổ bào tử được hình thành trên mô chết, rải rác trên bề mặt các vết bệnh đã thành thục Bào tử phân sinh hình thành với số lượng lớn tạo thành một khối màu hồng nhạt

Bệnh tồn tại bên ngoài hạt giống nên biện pháp xử lý bằng tác nhân sinh học như sử dụng dung dịch vi khuẩn đối kháng cho hiệu quả tốt, kiểm soát tốt nhất việc lây nhiễm [16]

Đặc điểm hình thái

C accutatum Theo nghiên cứu của Svetlana Zivkovic và cộng sự [54],

khuẩn lạc của các chủng phân lập từ cà chua ban đầu màu trắng hoặc kem màu trắng, trở thành màu xám và sau đó chuyển màu xám đen, như các mẫu nuôi cấy trên môi trường PDA Hình dạng khuẩn lạc mặt dưới đĩa petri có màu trắng hoặc màu xám trắng Khối bào tử màu cam ở giữa khuẩn lạc Các mẫu nuôi cấy phát triển cuống bào tử đính màu đen xung quanh tâm của khuẩn lạc Chúng không có lông cứng, màu tối, trông giống như quả thể nhưng không tạo ra túi bào tử, thường được quan sát dễ dàng

Các mẫu nuôi cấy được xác định sự có mặt của C acutatum và

C gloeosporioides

Khuẩn lạc của C acutatum thường có màu trắng ban đầu

và sau này trở thành bao phủ với màu hồng (khi có sắc tố tạo màu) và màu trắng xám ( khi không có sắc tố tạo màu) Các mẫu nuôi cấy cho thấy khả năng tạo sắc tố cao, có thể bài tiết sắc tố

đỏ và hồng lên môi trường nuôi cấy [15] Bào tử chủ yếu tạo

thành bó cuống bào tử đính, tuy nhiên C acutatum cũng có khả

năng hình thành bào tử thứ cấp trên bề mặt lá Bào tử thường có hình elip hoặc hình thoi ở ít nhất một đầu, chứ không thường có

hai đầu tròn như C gloeosporioides Lông cứng thường thưa thớt

nếu tạo ra xung quanh Appressoria sắc tố được tạo ra khi bào tử nảy mầm và khác nhau về hình dạng và kích thước [38]

Sợi nấm được phân nhánh, có vách ngăn và trong suốt Bào tử trong suốt, không có vách ngăn, hình thoi hoặc hình trụ với đỉnh tù và nền thon nhỏ Appressoria đã được quan sát trên mặt dưới của vỏ mẩu vô trùng phát sinh từ các sợi nấm sinh dưỡng Appressoria mịn, đơn bào, hình gậy hoặc hình trứng và

có thể màu sáng hoặc màu nâu sẫm

Kích thước bào tử vô tính của C acutatum được mô tả

thay đổi như sau: 8,3-14,4 × 2,5-4 µm (Simmonds, 1965), 8-16

× 2,5-4 µm (Dyko và Mordue, 1979), 12,3-14,7 x 4,6-5,3 µm (Smith và Black, 1990), và 12,5-20 × 3-5 µm [54]

C

gloeosporioides

Colletotrichum gloeosporioides có thể chuẩn đoán rõ ràng

do hình thành trên đĩa cành và có màu hồng Tuy nhiên, theo Denis và ctv., 1993 [19] cho biết việc giám định loài nấm này

cũng gặp nhiều khó khăn vì trên vết bệnh do nấm Colletotrichum gloeosporioides gây ra thường kèm theo các loại nấm hoại sinh

và tác nhân xâm nhập thứ cấp Ngoài ra, giữa các loài

Colletotrichum có mối quan hệ chặt chẽ với nhau và cùng gây ra nhiều loại bệnh Colletotrichum gloeosporioides sinh trưởng

phát triển và hình thành bào tử thuận lợi trên môi trường PDA và môi trường tổng hợp

Trên môi trường PDA, tản nấm có màu trắng xám nhạt đến màu xám đậm Ở một số mẫu phân lập sợi nấm ký sinh chỉ hình thành những chòm liên quan đến sự hình thành quả thể và quả thể đôi khi hình thành trên tản nấm non phổ biến hơn so với tản nấm già

Quả thể mở hình thành trên các bộ phận khác nhau của cây trồng, mọc riêng rẽ hoặc từng đám hình câu hay hình quả lê, kích thước đường kính 85 – 350 μm Bên trong quả thể có các túi bào tử nằm rải rác, xen ke với các sợi nấm vô tính, thường có 8 bào tử túi Bào tử túi hình trụ hoặc hình chuỳ, kích thước 35 – 80

x 8 – 14 μm (Mordue,1971 [16])

Đĩa cành hình thành trên các bộ phận của cây, có lông cứng dài, màu nâu, thuôn vê phía đỉnh, hơi phồng nhẹ ở phần gốc, kích thước chiều dài khoảng 500μm, đường kính 4 – 8 μm,

có từ 1 – 4 vách ngăn Đôi khi bào tử cũng được sinh ra từ lông gai

Bào tử phân sinh hình thành trên cành bào tử ngắn, hẹp, trong suốt, hình trụ, đầu hơi tù, đỉnh tròn, không có vách ngăn, kích thước từ 9 – 24 x 3 – 6 μm Trên môi trường nhân tạo PDA, kích thước và hình dạng của bào tử có thể thay đổi so với trên cây ký chủ Khối bào tử màu hồng nhạt được hình thành trên cành bào tử phân sinh đơn độc sinh ra từ sợi nấm trong đĩa cành nhẵn hoặc không dễ nhìn thấy lông gai Bào tử nảy mầm và hình thành giác bám màu nâu, hình ô van hoặc hình quả đấm, kích thước 6 – 20 x 4 – 12 μm

C capsici Triệu chứng của bệnh do các loài nấm Colettotrichum gây

ra thể hiện rất khác nhau, thường là vết bệnh điển hình nhỏ hoặc

to được hình thành trên lá và quả (chủ yếu là trên quả), đôi khi

cả ở trên thân Nhưng trong một số trường hợp khác bệnh có thể phát triển như một đốm màu hơi đỏ tía hoặc nâu mà không có sự hình thành vết bệnh rõ ràng Thân và cuông lá có thể bị tróc vỏ, cụm hoa bị tàn lụi và chết đen khi bệnh phát triển mạnh ở giai đoạn này

Colletotrichum capsici gây ra rất nhiều triệu chứng bệnh

mà không bị hạn chế bởi các vết loét điển hình, có nghĩa là dựa vào triệu chứng thì không thể nhận dạng thậm chí tới mức độ giống hoặc loài [16]

Chỉ có thể nhận biết chắc chắn qua việc kiểm tra bằng kính hiển vi khi ổ bào tử đã hình thành trên vết bệnh điển hình hoặc là cấy mô bị bệnh để phân lập và nhận dạng Các loài nấm

sẽ sinh trưởng trên môi trường Agar chuẩn như PDA (có tác dụng cho việc phát hiện sự sản sinh chất sắc tố của tế bào nấm) và PCA (cho việc xúc tiến sự hình thành bào tử)

Đĩa cành trên quả, lá và thân, tròn hoặc thon dài, kích thước khoảng 350μm Lông gai màu nâu, có từ 1 – 5 vách ngăn, cứng, phình to ở phía gốc, phía đỉnh nhọn, mảnh và màu sắc nhạt dần, kích thước khoảng 250 x 6μm Bào tử phân sinh (18 – 23 x

5 – 4), hình lưỡi liềm, trong suốt, đỉnh nhọn, đơn bào, không có vách ngăn, được hình thành từ cành bào tử hình trụ màu nâu nhạt

Tản nấm trên PDA đầu tiên có màu trắng sau chuyển dần thành màu xám Sợi nấm hình thành mịn, màu trắng đến xám tối trên bế mặt tản nấm Đôi khi ban ngày nhìn thấy những khoang màu trên bề mặt tản nấm Lông gai được hình thành trên những vùng mỏng hơn, hạch nấm hiếm gặp hoặc không có Cụm bào tử màu nâu sẫm đến màu da cam Giác bám và các cấu trúc phụ của chúng hình thành với số lượng lớn áp vào bề mặt đĩa Petri Trên PCA sợi nâm mọc thưa thớt, màu sắc mờ nhạt và có rất ít cụm bào tử Giác bám màu nâu đỏ, kích thước 9 – 14 x 6,5 – 11,5 dạng hình chuỳ hoặc hình trứng (Mordue (1971) & Sutton (1980, 1982) [16]

4 Các biện pháp phòng trừ

Việc phòng trừ bệnh thán thư được áp dụng như là biện pháp sử dụng giống chống chịu, luân canh, xử lý hạt giống, phun thuốc hoá học Gân đây Viện nghiên cứu Rau quả cho ra đời 2 giống ớt HB9 và HB14 có khả năng chống chịu bệnh thán thư rất tốt Tuy nhiên nhiều vùng trồng ớt chuyên canh vẫn đang sử dụng giống địa phương và các giống lai đôi khi không rõ nguồn gốc nên tình hình bệnh thán thư còn rất nghiêm trọng Biện pháp canh tác được sử dụng nhiều nhất và ít nhiều mang lại hiệu quả trong phòng trị bệnh nói chung và bệnh thán thư nói riêng Các biện pháp canh tác hiệu quả được biết đến như là: luân canh cây ớt với các cây không thuộc họ

cà, sử dụng vôi cải tạo đất, diệt mầm mống bệnh trong đất và trong tàn dư, thu gom quả bệnh đem tiêu hủy, lên luống cao, che phủ luống, tưới nước rửa cây sau mưa, trồng xen, trồng gối với các cây không thuộc họ cà [6]

Ngoài ra các giải pháp hóa học để ngăn ngừa bệnh thán thư cũng hay được sử dụng, tuy có hiệu quả nhưng để lại nhiều ảnh hưởng đến môi trường và dễ làm nấm bệnh trở nên lờn thuốc Do vậy ngày nay việc sử dụng thuốc sinh học phòng ngừa bệnh hại đang là một xu hướng lớn của nền nông nghiệp hữu cơ, vì các lợi ích về môi trường và sinh thái

Theo Wharton, P S., and Diéguez-Uribeondo (2004) [52], Kiểm soát hiệu quả

các bệnh Colletotrichum thường bao gồm việc sử dụng một hoặc kết hợp của những

điều sau đây: 1) giống kháng bệnh, 2) kiểm soát nuôi cấy, 3) kiểm soát hóa chất, và 4) kiểm soát sinh học sử dụng các sinh vật đối kháng Việc ứng dụng các chiến lược kiểm soát phụ thuộc nhiều vào các đặc tính của cây trồng mà họ đang trồng, cũng như trên bệnh mà họ đang hướng tới

4.1 Giống kháng bệnh

Kháng bệnh có lẽ là khía cạnh quan trọng nhất của kiểm soát dịch bệnh ở cây trồng nông nghiệp, nhưng ứng dụng của nó trong cây ăn quả là rất ít Do thời gian yêu cầu để xác định đặc tính kháng của cây ăn quả khá dài và những lợi thế khi kiểm soát bệnh bằng hóa chất rất nhanh Giống kháng ở cây ăn quả là phức tạp bởi những

khả năng của hầu hết các tác nhân gây bệnh cây do Colletotrichum có thể gây nhiễm

trùng nhưng ở dạng tiềm ẩn Trong hầu hết các tương tác vật chủ - tác nhân gây bệnh, sức đề kháng liên quan đến việc kích hoạt các phản ứng bảo vệ vật chủ, ngăn chặn hoặc làm chậm sự phát triển mầm bệnh và có thể được quy định bởi một cặp gen duy nhất, một gen đề kháng của vật chủ và một gen làm mất tính độc của mầm bệnh Tuy nhiên, tương tác giữa các gen không ảnh hưởng tới sự đề kháng bệnh do

Colletotrichum của trái cây sau thu hoạch [20]

Gen đề kháng của vật chủ và một gen làm mất tính độc của mầm bệnh ngăn chặn hoặc làm chậm sự tăng trưởng của mầm bệnh khi vật chủ ở điều kiện sinh lý cụ thể Tuy nhiên, tình trạng sinh lý của vật chủ thay đổi khi nó trưởng thành, chín, và già đi Bảo quản, chấn thương cơ học, nhiệt độ cao, và thiếu oxy cũng làm thay đổi sinh lý vật chủ Và khi sinh lý thay đổi trong vật chủ, gây ức chế khả năng bảo vệ của vật chủ khỏi các tác nhân gây bệnh, dẫn đến vật chủ bị xâm nhập và gây bệnh.Do đó,

sự khác biệt về khả năng đề kháng sau thu hoạch giữa các giống có thể do nhiều điều kiện mà theo đó các trái cây được lưu trữ có khả năng đề kháng khác nhau (Prusky & al., 1991b)[44] Vì vậy, nên xác định khả năng đề kháng và sự nhạy cảm của các giống cây ăn quả ở gian đoạn ủ bệnh sau thu hoạch khi trái chín, lựa chọn những giống kháng có khả năng bảo quản và vòng đời dài hơn những giống nhạy cảm

Khả năng kháng của cây chủ có vẻ như là một cách hợp lý và hiệu quả để kiểm soát bệnh thán thư Tuy nhiên, thay vì tăng chi phí liên quan đến việc thay thế giống cây trồng thành giống kháng hoặc chống chịu hơn, hầu hết người trồng có xu hướng chọn giống dựa trên các tiêu chí khác (như năng suất, khả năng chịu hạn, chịu mặn, ) hơn là khả năng kháng bệnh

4.2 Kiểm soát nuôi trồng

Cách này thường liên quan đến chuỗi các phương pháp được sử dụng để kiểm soát dịch bệnh, chủ yếu là sử dụng các biện pháp nhằm phòng tránh bệnh qua việc tiêu hủy các nguồn bệnh có khả năng tái nhiễm, thực hiện các mô hình canh tác như luân canh cây trồng khác họ, trồng mật độ vừa phải, bón phân cân đối.

Tuy nhiên, đối với cây ăn quả cũng bao gồm việc sử dụng các kỹ thuật vệ sinh thích hợp trong quá trình chế biến của thu hoạch trái cây, vận chuyển, đóng gói và lưu trữ, để tránh tiếp xúc với trái cây đến các tác nhân gây bệnh Việc xử lý thích hợp

để tránh các yếu tố phi sinh học như tổn thương cơ học, nhiệt độ cao, và thiếu oxy,

mà có thể khiến trái cây lây nhiễm bởi các tác nhân gây bệnh

4.3 Kiểm soát hóa học

Phương pháp kiểm soát hóa chất được sử dụng rộng rãi trên cây ăn quả vì sự sẵn có và hiệu quả của kiểm soát hóa chất là tương đối lớn hơn so với các phương pháp kiểm soát khác

Nói chung, bệnh do nấm Colletotrichum có thể được kiểm soát bởi một loạt

các hoá chất như các hợp chất đồng, dithiocarbamates, benzimidazole và các hợp chất triazole, và thuốc diệt nấm khác như chlorothalonil, imazalil và prochloraz.Loại mới của thuốc trừ nấm như các strobilurins (ví dụ Azoxystrobin và pyraclostrobin) cũng

được chứng minh có hiệu quả cao đối với loài nấm Colletotrichum gây nhiễm trên

trái (Schilder & al., 2001)[46] Tuy nhiên, nếu sử dụng quá nhiều có thể gây lờn thuốc

Để kiểm soát hóa học thành công của nhiều bệnh do nấm Colletotrichum, thời

gian và vị trí có ý nghĩa quan trọng Nói chung, thuốc diệt nấm phải được áp dụng để bảo vệ các mô cây non mới lên, chống nhiễm trùng ở thời kỳ ẩm ướt cho lá và hoa Cần phải bổ sung chất hóa học liên tục để tránh những tình huống như các quả mới phát triển, mưa làm chảy mất thuốc nhằm đảm bảo sự bảo vệ cần thiết đối với cây trồng khỏi bệnh thán thư Tuy nhiên, các chất diệt nấm không sử dụng đúng thời gian

có thể tăng mức độ nghiêm trọng của bệnh do sự xáo trộn các cơ chế kiểm soát sinh học tự nhiên và tăng tính mẫn cảm của cây trồng

Các loại thuốc trừ nấm sau đây được biết là có hoạt tính chống lại C acutatum:

fosetyl-AL (Alliette), Captan (Captan), benomyl (Benlate), chlorothalonil (Bravo), ziram (Ziram), fenbuconazole (Indar 75 WP), microbutanil (Rally 40WP), thiophanate methyl (Topsin 75WP), Azoxystrobin (Abound) và pyraclostrobin (Cabrio) (Adaskaveg & Förster, 2000)[9].Tuy nhiên, việc sử dụng và hiệu quả của các thuốc diệt nấm có thể bị hạn chế bởi các yếu tố khác nhau Điều này có nghĩa rằng người trồng phải sử dụng thuốc diệt nấm tùy chọn một cách khôn ngoan để đạt được kiểm soát hiệu quả Mặc dù điều trị bằng thuốc diệt nấm có thể làm giảm đáng

kể tỷ lệ nhiễm và mức độ nghiêm trọng của bệnh, nhưng xóa bỏ bệnh là điều không thể (Adaskaveg & Förster, 2000)[41] Như vậy, nếu việc dùng thuốc dừng lại và điều kiện thuận lợi cho bệnh tái xuất hiện, bệnh trên cây trồng có thể nhiễm nặng hơn Do

đó, người dùng thuốc được khuyến khích nên quan tâm đến các điều kiện thuận lợi

và sử dụng luân phiên các loại thuốc hóa học

4.4 Kiểm soát sinh học

Các khả năng để kiểm soát sinh học của bệnh trái cây sau thu hoạch đã được xem xét và những tác động của hệ vi sinh bề mặt trên tần suất bệnh thán thư như bệnh quả cà phê, thán thư bơ và xoài hiện nay đang được làm rõ, nhằm tăng cường các cơ chế kiểm soát sinh học tự nhiên.Mặc dù hầu hết các công nghệ này vẫn đang trong giai đoạn nghiên cứu Tiến bộ gần đây đã tạo ra một số sản phẩm thương mại mới, bao gồm Aspire ™, BioSave ™, Trichodex ™, AQ10 ™, và Avogreen ™ Hầu hết các sản phẩm này ứng dụng sau thu hoạch (được trích dẫn từ nhiều nguồn bởi Wharton, P S.,và cộng sự năm 2004) [52]

Hiện tại không có sản phẩm thương mại được đăng ký tại Mỹ sử dụng chống

lại C acutatum trên việt quất hoặc hạnh nhân Tuy nhiên, thuốc diệt nấm sinh học có chứa các vi khuẩn đối kháng Bacillus subtilis (ví dụ SerenadeTM, RhapsodyTM) và Candida oleophila (ví dụ AspireTM) đang trong giai đoạn thử nghiệm để xác định hiệu quả của chúng chống lại C acutatum

5 Chế phẩm sinh học

Chế phẩm sinh học (CPSH) là những sản phẩm bao gồm hỗn hợp nhiều chủng

vi sinh vật có ích nhằm mục đích cải thiện môi trường, sức khỏe con người và cây trồng vật nuôi CPSH tập hợp các loài vi sinh vật gồm: Vi khuẩn quang hợp, vi khuẩn Lactic, nấm men, xạ khuẩn, nấm mốc sống cộng sinh trong cùng môi trường

CPSH là những sản phẩm an toàn với môi trường, con người, vật nuôi, cây trồng không gây hại và tác dụng phụ xấu khi sử dụng

* Theo tính chất, chia thành 3 dạng chính: Dạng lỏng (nước), dạng bột, dạng viên Trong đó thường gặp dạng lỏng và dạng bột

* Theo công dụng, chia thành các loại

 Nhóm chế phẩm sinh học ứng dụng cho việc phòng trừ sâu bệnh hại cây trồng

 Nhóm chế phẩm sinh học dùng cho sản xuất phân bón hữu cơ sinh học, phân hữu

cơ vi sinh, chất kích thích tăng trưởng bón cho cây trồng chủ yếu là các hệ men nấm phân giải chất hữu cơ

 Nhóm chế phẩm sinh học dùng cho cải tạo đất, xử lý phế thải nông nghiệp Việc sử dụng chế phẩm sinh học trong nông nghiệp cần được quan tâm và khuyến khích vì phù hợp với xu hướng nền sản xuất nông nghiệp bền vững gắn với bảo vệ sức khỏe con người [4]

6 Vi khuẩn Bacillus

Vi khuẩn Bacillus, nhóm trực khuẩn Gram dương, hình que, hiếu khí thuộc

về họ Bacillaceae trong Firmicues Bacillus phân bố hầu hết trong tự nhiên như đất,

nước, bụi, không khí, thực vật bị phân huỷ, hệ tiêu hóa người và động vật Khi điều kiện sống bất lợi (thiếu một trong các yếu tố như phốt pho, nitơ, hoặc lượng oxy kết hợp với một nguồn cacbon quá lớn), chúng có khả năng tạo ra bào tử gần như hình cầu, để tồn tại trong trạng thái "ngủ đông" trong thời gian dài

Hầu hết Bacillus không gây độc cho người và động vật Một số loại gây độc

cho côn trùng Chùng có khả năng sinh enzime ngoại bào do đó được ứng dụng nhiều trong công nghiệp, bảo vệ môi trường, nông nghiệp Phần lớn các chủng thuộc các loài của giống này đều có khả năng sinh ra nhiều α- amylase và protease kiềm, có một số chủng sinh ra cellulase

Trong số các chủng kiểm soát sinh học nghiên cứu, Bacillus sp cung cấp nhiều

lợi thế hơn các sinh vật khác như chúng tạo thành nội bào tử và do đó, có thể chịu được pH khắc nghiệt, nhiệt độ và các điều kiện thẩm thấu

Vi khuẩn Bacillus spp là tác nhân đối kháng trong đối kháng sinh học ở nhiều loại cây trồng khác nhau Ngoài ra, vi khuẩn Bacillus spp còn có tác động kích thích

tăng trưởng cây trồng (A Narasimhan, 2012)[34] Các đặc tính chính giúp vi khuẩn

Bacillus spp được sử dụng trong nhiều sản phẩm đối kháng sinh học là khả năng

phân bố rộng, tốc độ phát triển nhanh, hình thành bào tử, tương đối an toàn với người

và động vật cũng như được sản xuất được nhiều hoạt chất sinh học có giá trị

Nhiều thành viên của Bacillaceae tiết ra các enzym mycolytic cho phép chúng

làm suy giảm các đại phân tử ngoại bào trong số các enzyme mycolytic, chitinases

và cellulase (β -1,3, β -1,4) khá phổ biến có trong các đại diện của các vi khuẩn hoại sinh trong đất [34]

6.1 Các chủng Bacillus có khả năng đối kháng nấm cao

Theo kết quả nghiên cứu của những năm gần đây thì các chủng Bacillus có khả năng đối kháng cao với nấm Colletotrichum gây bệnh thán thư trên ớt, ức chế hơn 75% sự phát triển của nấm trong ống nghiệm được xác định là vi khuẩn B

nảy mầm của bào tử nấm [31]

Bảng 3: Các chủng vi khuẩn Bacillus spp đối kháng nấm Colletotrichum spp

Vi khuẩn

B subtilis Bacillus subtilis phân bố nhiều trong đất đặc biệt là cỏ

khô nên còn được gọi là trực khuẩn cỏ khô

Hình dạng: có dạng hình que, ngắn và nhỏ, kích thước

0,6 x (3-5) µm B subtilis là vi khuẩn Gram dương, đôi khi các

tế bào nối lại với nhau tạo thành chuổi dài, ngắn khác nhau hoặc các tế bào đứng riêng rẽ

Bào tử có hình bầu dục, kích thước 0,6µm – 0,9µm Phân bố không theo nguyên tắc chặt chẽ nào, lệch tâm, gần tâm nhưng không chính tâm Chúng phát tán rộng rãi, được tạo ra vào cuối thời kì sinh sản của vi khuẩn Do mỗi tế bào chỉ tạo

ra một bào tử nên đây không phải là một hình thức sinh sản mà chỉ là một hình thức thích nghi giúp vi khuẩn vượt qua các điều kiện sống bất lợi Bào tử có thể sống từ vài năm đến vài chục năm Đã có những chứng cứ về việc duy trì sức sống trong 200-

300 năm của bào tử B subtilis Khi gặp điều kiện thuận lợi

những bào tử này sẽ phục hồi và tiếp tục chu kì sống của mình

Hình thái khuẩn lạc có thể biến đổi, khuẩn lạc có hình tròn hay hình dạng bất thường và trung bình từ 2 – 4 mm ,xung quanh hình gợn sóng, uốn nếp hoặc có lông; chúng mờ đục, bề mặt mờ và nhăn nheo; có màu trắng, có thể là màu kem hoặc màu nâu

B subtilis có lớp màng nhầy, được cấu tạo chủ yếu từ

polypeptit như acid polyglutamic Việc hình thành màng nhày giúp vi khuẩn có khả năng chịu được điều kiện khắc nghiệt nhờ

có khả năng dự trữ thức ăn và bảo vệ vi khuẩn tránh bị tổn thương khi khô hạn Màng nhày có thể quan sát được khi nhuộm tiêu bản: qua kính hiển vi ta có thể nhìn thấy màng nhày

của vi khuẩn B subtilis là không màu, trong suốt, tế bào của

vi khuẩn bắt màu đỏ trên nền tiêu bản xanh hoặc đen

Sắc tố thay đổi từ kem qua màu vàng, cam, hồng và đỏ, nâu hoặc đen, có thể được hình thành trên khoai tây hoặc môi trường thạch có chứa glucose; chủng hình thành sắc tố màu

nâu hoặc đen trước đây gọi là "vi khuẩn Bacillus subtilis var aterrimus " Chủng hình thành sắc tố nâu đen trên tyrosine trước đây thường gọi là "Bacillus subtilis var niger, "

B licheniformis Vi khuẩn Gram dương, kỵ khí tùy ý, hình que di động,

tạo bào tử hình bầu dục hay hình trụ nằm ở trung tâm, gần tâm

Tế bào 0,6-0,8 x (1,5-3,0) μm Hình thái khuẩn lạc có thể biến đổi, trong và giữa các chủng, khuẩn lạc có hình dạng tròn hay bất thường và trung bình từ 2 – 4 mm, xung quanh hình gợn sóng, uốn nếp hoặc có lông; chúng mờ đục, với bề mặt là mờ

và có thể nhăn nheo; màu trắng, có thể trở thành kem hoặc màu nâu (có lẽ màu đỏ trên môi trường có chứa carbohydrate đủ sắt) cấu tạo ẩm và dầu hoặc chất nhầy, qua lớp màng với chất nền nhầy bên dưới, trên bề mặt có hoặc không có những giọt nhầy nên thô và giòn như chúng đã khô

B

amyloliquefaciens

Vi khuẩn hiếu khí, Gram dương, hình que có thể di động, tế bào 0,7-0,9 x (1,8-3,0) µm, thường ở dạng chuỗi và hình thành bào tử hình elip (0,6–0,8 x 1.0–1,4 μm) nằm ở trung tâm, gần tâm hoặc ở tận cùng trong các túi bào tử không phình ra

Đặc điểm sinh hóa

thiểu 5-20 oC và tối đa là 25-55 oC

Tăng trưởng ở pH khoảng 5,5 – 8,5 và nồng độ NaCl 7%, một số chủng chịu được nồng độ 10%

Thủy phân được Casein, esculin, gelatin và tinh bột Có khả năng phân hủy pectin và polysaccarit ở mô thực vật Citrate được sử dụng như là nguồn carbon duy nhất của hầu hết các chủng Giảm nitrate xuống nitrite

Phát triển ở pH 5,7 và 6,8 với nồng độ 7% NaCl

Thủy phân được casein, esculin, gelatin và tinh bột; các chủng thỉnh thoảng sẽ thủy phân urê

Phân hủy được pectin và polysaccharides trong mô thực vật Dextran và Levan được hình thành ngoại bào từ đường sucrose

Citrate và propionate được sử dụng như là nguồn carbon duy nhất của hầu hết các chủng Nitrate được khử thành nitrite

Theo Ashwini Narasimhan và cộng sự, những khảo nghiệm trên nhóm vi

khuẩn Bacillus spp chỉ phát hiện thấy 1,3, 1,4 cellulase mà không có

β-glucanases trong nhóm enzyme thủy phân [34]

6.2.2 Enzyme Chitinase

Chitin là một polymer sinh họ, được cấu tạo bởi glucoz liên kết với nhau bằng liên kết 1 beta -4 (như cellulose) Chitin phân bố rất rộng rãi ở dạng cấu trúc cơ bản trong thành tế bào của nấm và là bộ xương ngoài của tôm cua và côn trùng Đây là

một polymer có trọng lượng phân tử cao, không tan trong nước, chứa các đơn phân

là N-acetyl-glucosamine liên kết bởi liên kết 1,4-β-glucoside

Chitinase [Poly- Beta- 1- 4 – (2-acetalmido-2-deoxy) - D-glucoside glucanohydrolase] thuộc nhóm enzyme thủy phân (hydrolase), là enzyme thủy phân chitin thành chitobiose hay chitotriose qua việc xúc tác sự thủy giải liên kết 1,4 glucoside giữa C1 và C4 của hai phân tử Nacetyl Glucosamine liên tiếp nhau trong chitin (Mã số của enzyme chitinase là EC 3.2.1.14.) [3]

Hình 2: Vị trí phân cắt enzyme chitinase [3]

Trong kiểm soát nấm bệnh: vi khuẩn sản xuất được chitanase được sử dụng để

kiểm soát sinh học của một số nấm bệnh sinh trong đất, trong đó có Colletotrichum spp Chitinases và glucanase cho thấy đối kháng lại nấm (in vitro) Vì chitin không

phải là thành phần phổ biến ở thực vật nên enzyme phân hủy chitin không làm ảnh hưởng lớn đến thực vật Chitinase phân hủy chitin, là thành phần quan trọng hình thành vách tế bào nấm, ngăn cản sự phát triển của nấm bệnh [11]

6.2.3 Enzyme Cellulase

Enzyme cellulase được sản xuất chủ yếu là do nấm, vi khuẩn, và sinh vật đơn bào với vai trò xúc tác phân hủy cellulose và một số polysaccharides có liên quan, là một phức hệ hydrolase gồm các enzyme C1, Cx và -glucosidase Chúng tham gia các phản ứng kế tiếp nhau khi phân hủy cellulose cuối cùng tạo ra sản phẩm là đường glucose Cụ thể là thủy phân liên kết 1,4-beta-D-glycosidic trong cellulose, hemicellulose, lichenin, ngũ cốc và beta-D-glucans

Enzyme cellulase được phân chia theo chức năng thành 3 nhóm:

 Exocellulase (exobiohydrolase; 1,4--D-glucan cellobiohydrolase)

 Endocellulase (endoglucanase; 1,4--D-glucan-4 glucanohydrolase)

 -glucosidase (cellbiase; -D-glucoside glucohydrolase) [1]

Các enzyme cellulase có chức năng chính là thủy phân cellulose, nhưng cũng

có thể thủy phân được beta glucan trong thành tế bào nấm bệnh Enzyme cellulase

được phát hiện trong khảo nghiệm đối kháng giữa vi khuẩn Bacillus và nấm Colletotrichum bằng cách sử dụng dung dịch đỏ Congo trên tấm Carboxy Methyl

Cellulose (CMC) để hiển thị khu vực thủy phân Sau đó dùng đĩa chứa nấm bệnh glucan để xác định khả năng thủy phân glucan của enzyme cellulase [34]

6.2.4 Các chất thuộc Lipopeptide

Bacillus ngăn chặn tác nhân gây bệnh cây bằng cách sản xuất kháng sinh

lipopeptide, enzym thủy phân, hợp chất phức sắt và các chất chuyển hóa thứ cấp khác

Lipopeptides vòng của surfactin, iturin và fengycin là một trong những chất

chuyển hóa quan trọng được sản xuất bởi các loài vi khuẩn Bacillus và sự tham gia

của họ trong kiểm soát dịch bệnh (Ongena and Jacques 2008)

6.2.4.1 Iturin

Trong số các kháng sinh nhóm iturin, đại diện là iturin A, mycosubtilin và bacillomycin thường được nghiên cứu nhiều nhất cho hoạt động kiểm soát sinh học Đây là những heptapeptides với một axit béo β-amino, chúng có hoạt tính kháng nấm mạnh

Cho đến bây giờ sáu hợp chất của các nhóm iturin được biết đến và chúng có một số đặc điểm cấu trúc chung Tất cả các kháng sinh này có một cấu trúc tuần hoàn của các loại sau đây:

Bảng 4: Các thành phần iturin khác nhau [42]

Iturin A L-Asn L-Gln L-Pro D-Asn L-Ser Itutrin C L-Asn L-Gln L-Pro D-Asn L-Ser Bacillomycin D L-Asn L-Pro L-Glu D-Ser L-Thr Bacillomycin L L-Asn L-Ser L-Glu D-Ser L-Thr Bacillomycin F L-Asn L-Gln L-Pro D-Asn L-Thr Mycosubtilin L-Asn L-Gln L-Pro D-Ser L-Asn

Iturin A

Một lipopeptide chống nấm đặc trưng bởi sự hiện diện của các đồng phân Aminoacid tan trong chất béo Iturin A đã được xác định bởi sắc ký bản mỏng, phân tích acid amin và đặc tính của các amino acid liposoluble và peptide [15]

fl-Mycosubtilin

Các mycosubtilin vòng peptide gồm bảy acid a-amin trong một chuỗi LDDLLDL kết thúc bởi một s-amino axit liên kết giống nhau được tìm thấy trong các kháng sinh khác của nhóm iturin [40]

Trước đây cấu trúc của kháng sinh peptide này được xác định bằng phương pháp hóa học đã đưa ra một cấu trúc vòng chứa tám α-amino acids tan trong nước và một β-amino acid tan trong lipid Tất cả các kháng sinh khác trong cùng một nhóm cũng có một cấu trúc vòng với một β-amino acid tan trong lipid, nhưng chỉ có bảy α-amino acids

dương, Bacillus subtilis Surfactin có các đặc tính hiệu quả như kháng khuẩn, kháng

virus, kháng nấm, chống mycoplasma và các hoạt động làm tan máu

Surfactin, thể hiện hoạt tính kháng sinh mạnh, bao gồm heptapeptides vòng (L-asparagin, L-leucine, acid glutamic, L-leucine, L-valine và hai D-leucines), và một chuỗi axit béo kỵ nước dài 13-15 cacbon cho phép nó xâm nhập vào màng tế bào

6.2.4.3 Fengycin

Fengycin là một lipodecapeptide vòng có chứa một axit béo β-hydroxy với chiều dài phụ chuỗi 16-19 nguyên tử cacbon Fengycin có dạng bột, không màu, tan trong các dung môi hữu cơ phân cực: methanol, ethanol và -dimetylformamit, ít tan trong dichloromethane và tert-butanol, không hòa tan trong nước, acetone và diethylether

Fengycin ức chế sự tăng trưởng của nấm sợi, tuy nhiên lại không hiệu quả đối với nấm men và vi khuẩn

Theo Nongnuch Vanittanakom và Wolfgang Loeffler, fengycin có các dạng fengycin A (A1 và A2 ) và fengycin B (B1 và B2) được phân biệt dựa trên phân tích các acid amin và sắc ký phối hợp khối phổ Ví dụ, vị trí 6 D-alanine (ký hiệu là fengycin A) có thể được thay thế bởi D-valine (ký hiệu là fengycin B) Fengycin bao gồm hai thành phần chính khác nhau bởi một axit amin Fengycin A gồm 1 D-Ala, 1 L-Ile, 1 L-Pro, 1 D-allo-Thr, 3 L-Glx, 1 D-Tyr, 1 L-Tyr, 1 D-Orn, trong khi ở fengycin

B , D-Ala được thay thế bởi D-Val [37]

7 Các nghiên cứu khác

Bảng 5: Các nghiên cứu liên quan trong những năm gần đây

Năm Tác giả Công trình nghiên cứu Vi khuẩn đối

kháng

Tác nhân gây bệnh

của vi khuẩn Bacillus subtilis

chống Colletotrichum gloeosporioides

Colletotrichum lagenarium

amyloliquefaciens MET0908

Bacillus amyloliquefaciens

MET0908

Colletotrichum lagenarium

Kiểm soát Bệnh thán thư gây

ra bởi Colletotrichum musae trên cây nghệ Gagnep Sử dụng tác nhân đối kháng Bacillus spp

musae

và Fusarium oxysporum

2010 Svetlana

Zivkovic,

Sàng lọc hoạt tính đối kháng của một số vi sinh vật với

Colletotrichum acutatum và Colletotrichum

gloeosporioides

Trichoderma harzianum, Gliocladium roseum, Bacillus subtilis,

Streptomyces

Streptomyces natalensis

Colletotrichum

Colletotrichum gloeosporioides

2012 K.C

Kupper,

…

Sử dụng Bacillus subtilis để

kiểm soát sinh học

Colletotrichum acutatum gây

rụng quả sau khi nở hoa ở

điều kiện thực địa

(ACB-69)

Colletotrichum acutatum

của cây lạc và kiểm soát sinh

học nấm Fusarium sp và

Pythium sp

Trichoderma viride và Bacillus

Fusarium sp và Pythium sp

2014 Hyi Jin

Kim,

Kiểm soát sinh học bệnh thán thư (Colletotrichum gloeosporioides) trên ớt và cà chua bi bằng Streptomyces

sp A1022

Streptomyces sp

A1022

Colletotrichum gloeosporioides

7.1 Phân tích các bài báo

Bài báo 1: Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả kiểm soát sinh học của vi khuẩn

B subtilis chống C gloeosporioides [21]

Theo Havenga và cộng sự (1999) việc kiểm soát sinh học bệnh thán thư do

nấm C gloeosporioides gồm giai đoạn sử dụng các chất đối kháng trước thu hoạch

để ngăn ngừa nhiễm trùng hoặc sau thu hoạch để ức chế sự phát triển triệu chứng

Bacillus subtilis hiệu quả trong việc kiểm soát trước và sau thu hoạch bệnh thán thư trên bơ B subtilis và C gloeosporioides có thể sử dụng nhiều carbohydrate khác

nhau và các acid amin như carbon duy nhất và nguồn nitơ tương ứng Các carbohydrate cụ thể (acid citric, D (+) galactose, pyruvate và benzoate) và các acid

amin (L (+) asparagine và acid L-aspartic) là rất quan trọng để B subtilis thể hiện

khả năng đối kháng hiệu quả Do đó dinh dưỡng có tác động đáng kể vào sự tương tác của tác nhân gây bệnh và tác nhân đối kháng

Bài báo 2: Sản xuất protein kháng nấm trong việc kiểm soát C lagenarium bởi

Hoạt lực kháng nấm (%)

Nhóm nghiên cứu đã nhận xét: B amyloliquefaciens MET0908 tiết ra một enzyme

b-1,3-glucanase ngoại bào, là một enzyme quan trọng trong việc phân hủy thành tế

bào các sợi nấm C lagenarium

Bài báo 3: Kiểm soát sinh học bệnh thán thư trên ớt [28]

Năm 2006, Mitiku Tesso Jebessa và S.L Ranamukhaarachchi đã thực hiện

nghiên cứu sử dụng nấm Trichoderma để kiểm soát sinh học Colletotrichum gây bệnh thán thư trên ớt Loài Trichoderma khác nhau có hiệu quả trong việc kiểm soát các loại nấm như Rhyzoctonia solani (Claydon et al 1987), các loài Fusarium (Ogura và Hayashi 1974) và Macrophomina phaseolina (Elad et al 1986)

Kết quả cho thấy đường kính phát triển của các chủng tăng dần theo thời gian

Bảng 7: Đường kính tăng trưởng khuẩn lạc của C gloeosporioides

Nguồn biến thiên 5 ngày 6 ngày 7 ngày 8 ngày 9 ngày 10 ngày

T koningii 20.5b 21.2b 21.5b 21.7b 22.6b 22.9b

(Các chữ cái giống nhau thì không có sự khác biệt có ý nghĩa ở p < 0,05 LSD)

Nhóm nghiên cứu đã nhận thấy T koningii đã giảm mạnh nhất sự phát triển

của tất cả các chủng nấm bệnh ở tất cả các giai đoạn ủ, nó có một tiềm năng tốt hơn

để kiểm soát C gloeosporioides gây bệnh thán thư ớt Ba loài Trichoderma (Trichorderma harzianum, T koningii, T psedokoningii) có tác dụng khác nhau đối với các chủng C gloeosporioides, mặc dù tất cả chúng đã có một số tác dụng trong việc kiểm soát bệnh thán thư ớt T koningii là hiệu quả nhất trong số ba loài Trichoderma, mặc dù T harzianum thường được sử dụng chống lại nhiều tác nhân

gây bệnh

Bài báo 4: Kiểm soát Bệnh thán thư gây ra bởi C musae trên nghệ Gagnep Sử dụng tác nhân đối kháng Bacillus spp [33]

Năm 2007, Trên tạp chí khoa học về nông nghiệp và sinh học, các tác giả

Supuk Mahadtanapuk, Mondhon Sanguansermsri, đã sử dụng Bacillus spp để đối kháng nấm C musae trên cây nghệ Gagnep

Kết quả cho thấy, ba chủng ức chế tăng trưởng nấm trong điều kiện invitro hơn 75% là B licheniformis, B amyloliquefaciens and B Subtilis Các vi khuẩn B amyloliquefaciens và B subtilis cho thấy khả năng hình thành khuẩn lạc hiệu quả trên

lá của cây nghệ, B licheniformis ức chế sự tăng trưởng đáng kể C musae, và tất cả

ba chủng có thể ức chế 100% sự nảy mầm bào tử đính của nấm.Khi B licheniformis

được tiêm kết hợp với một trong hai loại vi khuẩn khác, khả năng ức chế các nấm

bệnh của B amyloliquefaciens và B subtilis đã bị giảm đáng kể..Điều này có thể

một phần do một hợp chất kháng khuẩn trong B licheniformis ức chế sự tăng trưởng

của hai loài vi khuẩn khác do đó làm giảm khả năng kháng nấm Cả B

amyloliquefaciens và B subtilis đã được phát hiện có chứa isoform của iturin A với hoạt tính kháng nấm chống lại C musae Như một biện pháp phòng ngừa để kiểm soát sự lây lan của C musae và làm giảm mức độ nghiêm trọng của nhiễm trùng nấm,

B amyloliquefaciens có thể được sử dụng để tiêm lên hoa nghệ với chi phí hợp lý và

giảm thiểu được các loại thuốc diệt nấm độc hại hiện đang sử dụng

Bài báo 5: Khả năng đối kháng của Bacillus spp phân lập từ màng sinh học dưới

biển ức chế tác nhân gậy bệnh nấm trên mặt đất [36]

Ortega-Morales và cộng sự (2009) đã thực hiện các nghiên cứu nhằm mục đích xác định các hoạt lực đối kháng của vi khuẩn có nguồn gốc từ màng sinh học biển

chống lại các tác nhân gây bệnh nấm trên cạn Một số vi khuẩn như Bacillus mojavensis (ba chủng) và Bacillus firmus (một chủng) thể hiện hoạt lực đối kháng với nấm Colletotrichum gloeosporioides, Colletotrichum fragariae, và Fusarium oxysporum

Các nghiên cứu về ủ bệnh và quét trên kính hiển vi điện tử cho thấy Bacillus

sp MC3B-22 đã có thể xâm thực, nhân đôi, và ức chế C gloeosporioides ATCC 42.374 Khi được thử nghiệm trên lá xoài, Bacillus sp MC3B-22 có thể soát sinh

bệnh thán thư trên cây ăn trái

Kết quả cho thấy những chủng vi khuẩn đối kháng này ức chế sự tăng trưởng của sợi nấm trong việc khảo nghiệm nuôi cấy kép và khả năng nảy mầm bào tử của

Colletotrichum Hai loài Streptomyces thể hiện khả năng đối kháng mạnh nhất các chủng C acutatum và C gloeosporioides với S noursei (92-99%) tiếp theo là S natalensis (89-96%), B subtilis (86-91%), T harzianum và G roseum gây ra hơn

86% và 89% Quan sát cấu trúc hiển vi cho thấy khả năng đối kháng nhờ vào hoạt

động của kháng sinh Các kết quả của nghiên cứu này xác định T harzianum, G roseum, B subtilis, S natalensis và S noursei là các chủng kiểm soát sinh học có

triển vọng để thử nghiệm thêm với bệnh thán thư trong hoa quả

Bài báo 7: Sử dụng B subtilis để kiểm soát sinh học C acutatum gây rụng quả

sau khi nở hoa ở điều kiện thực địa [31]

Năm 2012, K.C Kupper và cộng sự đã nghiên cứu khả năng của Bacillus subtilis (ACB-69) để kiểm soát các tác nhân thường gây rụng quả sau khi nở hoa, Colletotrichum acutatum ở điều kiện thực địa Trong suốt những mùa vụ 2007/2008

B subtilis được kiểm chứng với nồng độ 5% (5 × 108 cfu ml-1) và 10% (1 × 109 cfu

ml-1) trên cam ngọt ghép lên chanh Rangpur ở Brazil Một thí nghiệm tương tự trong mùa vụ 2008/2009 được thực hiện mà không thêm một nguồn carbon (mật đường 5%) Các thử nghiệm đã được tiến hành để xác định các giai đoạn phát triển hoa thích

hợp nhất để áp dụng tác nhân kiểm soát sinh học B subtilis (ACB-69) đã được phân

lập từ các mẫu lá của cam ngọt 'Valencia'

Kết quả cho thấy:

Bảng 8: Hiệu quả kiểm soát sinh học

Phương pháp Phần trăm hoa có triệu chứng

của C acutatum Hiệu lực

nở hoa là rất cần thiết

Bài báo 8: Tiêm riêng rẽ và kết hợp Trichoderma viride và Bacillus đến sự tăng trưởng của cây lạc và kiểm soát sinh học nấm Fusarium sp và Pythium sp [5]

Năm 2014, Nguyễn Văn Minh và cộng sự ở Trường Đại học Mở Tp Hồ Chí

Minh đã nghiên cứu khả năng kiểm soát sinh học 2 nấm Fusarium sp và Pythium sp gây bệnh thối thân, thối rễ, chết non trên cây lạc bằng cách sử dụng Trichoderma viride và Bacillus Các chủng được lấy từ bộ sưu tập 60 chủng Bacillus và 2 chủng vi nấm ( T viride và T longi) từ phòng thí nghiệm Công nghệ Vi sinh trường Đại học

Mở tp Hồ Chí Minh cung cấp

Kết quả được nhận thấy 6 chủng Bacillus F3, F5, F6, F9, F11, F12 và nấm T viride có khả năng kháng nấm Fusarium sp và Pythium sp Tuy nhiên, chủng Bacillus sp.F9 có khả năng kháng cả hai loại nấm Fusarium sp và Pythium sp cao nhất, lần lượt là 70,92±1,88% và 64,81±0,98% Chủng Trichoderma viride và Bacillus sp.F9

có khả năng kiểm soát nấm bệnh đồng thời kích thích tăng trưởng trên cây lạc Sau

thí nghiệm, nhóm nghiên cứu đã kết luận: sử dụng phương pháp điều trị với cả 2 nhân

tố (T viride và Bacillus sp.F9) sẽ cho hiệu quả cao

Bài báo 9: Kiểm soát sinh học bệnh thán thư C gloeosporioides trên ớt và cà chua bi bằng Streptomyces sp A1022 [25]

Năm 2014, Hyi Jin Kim và cộng sự đã thực hiện kiểm soát sinh học nhiều loại

bệnh trên cây trồng và rau quả bằng cách sử dụng Streptomyces sp A1022 Họ nhận thấy dung môi nuôi cấy của xạ khuẩn Streptomyces sp A1022 cò khả năng ức chế các loại nấm như Colletotrichum gloeosporioides, Phytophthora capsici, Pyricularia grisea, và Cercospora canescens Hoạt lực kháng nấm của dung môi đạt mức ổn định

(>93%) với phạm vi nhiệt độ rộng (25-90oC), pH 2-9

Sau đó họ thử khả năng ức chế của chủng với nấm C gloeosporioides gây

bệnh thán thư trên ớt và cà chua bi Kết quả cho thấy phần trăm bị tổn thương của ớt sau khi xử lý như sau: không xử lý ≈ eugenol ( chiết sopra) > tebucozarol ( thuốc diệt nấm hóa học) > azoxystrobin ( thuốc diệt nấm hóa học) ≈ chủng A1022 Chủng A1022 cũng cho thấy tác dụng ức chế lại bệnh thán thư trên cây cà chua bi Khả năng

ức chế của chủng trong khoảng từ 61.6 – 68% đối với bệnh thán thư

Nhóm tác giả kết luận: chủng A1022 SC có thể là một thay thế cho thuốc hóa học diệt nấm, ít nhất là cho nhiễm bệnh thán thư tiêu và cà chua bi gây nên bởi C

gloeosporioides

PHẦN II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Sơ đồ thực hiện đề tài

* Thực hiện giai đoạn II

Kiểm tra đối kháng invitro

trên đĩa petri

Kiểm tra đối kháng invivo

trên quả ớt

Kiểm tra đối kháng invitro

trên quả ớt

Giai đoạn I

Giai đoạn II

1 Địa điểm và thời gian nghiên cứu

Trung tâm Công Nghệ Sinh Học Tp HCM – Phòng Công Nghệ Vi Sinh Thời gian thực hiện: 20/10/2014 – 05/05/2015

2 Vật liệu nghiên cứu

Nấm bệnh được lấy chủ yếu từ giống ớt sừng trâu ở Tiền Giang và được giữ giống tại phòng Công Nghệ Vi Sinh

Các chủng Bacillus được phân lập từ đất trồng ớt nhiễm bệnh và một số chủng

có sẵn trong bộ sưu tập vi khuẩn của Trung tâm

Bảng 9: Nguồn gốc các chủng Bacillus

1 BA10 Bộ sưu tập phòng CN Vi sinh

2 BA88 Bộ sưu tập phòng CN Vi sinh

3 BA92 Bộ sưu tập phòng CN Vi sinh

4 BA98 Bộ sưu tập phòng CN Vi sinh

5 Amylose Bộ sưu tập phòng CN Vi sinh

6 CG1 – CG9 Xã Bình Phan, huyện Chợ Gạo, tỉnh Tiền Giang

7 CG10 – CG12 Xã Long Bình Điền, huyện Chợ Gạo, tỉnh Tiền Giang

8

D1 – D4

(chủng tham

khảo)

Bộ sưu tập từ tổ CNSH Môi trường-Thực phẩm

Môi trường nuôi cấy

Môi trường nuôi cấy nấm PDA (Potato

Các dụng cụ nghiên cứu: kính hiển vi, đĩa petri, pipet, lam kính, lamen, ống nghiệm, que cấy nấm, ống đong, becher, bình tam giác, bông, nước cất, cồn, đèn cồn,

tủ nuôi cấy, tủ lạnh đựng mẫu, túi đựng mẫu, các khay đựng mẫu ớt, máy chụp hình

Các quả ớt dùng trong các thí nghiệm chủng bệnh nhân tạo và thí nghiệm đối kháng được thu hoạch từ giống ớt sừng đỏ chilli TN20A (Trang Nông) trồng ở khu thử nghiệm đồng ruộng

Ưu tiên sử dụng ớt còn xanh, chưa chín trong các thí nghiệm Vì hai lý do: + Thời gian thử nghiệm kéo dài 7 – 10 ngày Ớt xanh vẫn giữ cấu trúc tốt so với ớt

đã chín

+ Trong thực tế, nấm gây hại ở giai đoạn ớt xanh và phát bệnh khi ớt chín, nên tập trung thử nghiệm ở giai đoạn ớt xanh

3 Phương pháp nghiên cứu

3.1 Phương pháp xác định hiệu quả đối kháng in vitro

Các chủng nấm Colletotrichum spp gây bệnh trên ớt được thử đối kháng sinh học với một số chủng vi khuẩn Bacillus Sử dụng phương pháp đồng nuôi cấy tham

khảo từ Ashwini Narasimhan (2012) và Lê Thị Mai Châm (2013)[3, 35]

Nuôi cấy nấm gây bệnh trên đĩa Petri chứa môi trường PDA trong 7 ngày Nuôi vi khuẩn trên môi trường TSA trong 24 giờ Dùng khoan thạch đường kính 5

mm ấn nhẹ lên bề mặt nuôi cấy nấm gây bệnh rồi đặt mẫu cấy sang giữa đĩa Petri chứa môi trường PDA, tương tự sau đó cấy vi khuẩn đối kháng hai bên mép đĩa Petri sao cho cách mép đĩa 1,5 cm và thẳng hàng theo đường kính đĩa Petri với nấm bệnh

Ủ đĩa đối kháng ở nhiệt độ phòng, và đánh giá kết quả sau 3, 6, 9 ngày nuôi cấy Ứng với mỗi chủng vi khuẩn đối kháng là một thí nghiệm, lặp lại 3 lần

Sử dụng phương pháp thử nghiệm kép, nấm bệnh và vi sinh vật nội sinh được nuôi cách nhau 3 cm trên đĩa môi trường PDA (đường kính 90 mm) ở 27oC trong 6 ngày Nếu vi sinh vật nội sinh có có khả năng ức chế nấm bệnh sẽ thấy vùng xung quanh khuẩn lạc vi sinh vật nội sinh, sợi nấm bệnh không sinh trưởng hoặc sinh trưởng yếu Còn nếu vi sinh vật nội sinh không có khả năng ức chế sự phát triển của nấm bệnh sẽ thấy nấm bệnh phát triển bình thường [27]

*Cách cấy theo điểm và theo đường

Hình 3 : Mô tả thí nghiệm đối kháng in vitro [46]

Lưu ý: Một đầu sợi nấm của Colletotrichum được đặt ở trung tâm của đĩa, và

các vi khuẩn phân lập được sọc các vệt trên mỗi bên của sợi nấm Khoảng cách giữa hai vi sinh vật là 2,5 cm Tấm này sau đó được ủ ở 25 ° C trong 4 ngày Tỷ lệ phần trăm ức chế tăng trưởng được tính theo công thức: ((A-B)/ A) x 100, A là khoảng

cách xa nhất xuyên tâm (đo bằng mm) được nuôi cấy bằng Colletotrichum sau 4 ngày

ủ trong theo hướng vuông góc đối kháng (một giá trị kiểm soát), và B là khoảng cách phát triển của nấm từ điểm của cấy để lề của khuẩn lạc theo hướng các đối kháng

Công thức tính:

H = ((A – B) / A ) x 100

H: Phần trăm ức chế nấm bệnh (%)

A: Đường kính khuẩn lạc nấm bệnh trong công thức đối chứng (cm)

B: Đường kính khuẩn lạc nấm bệnh khi được nuôi cùng với vi khuẩn (cm)

3.2 Phương pháp lây bệnh nhân tạo và xác định độc lực nấm bệnh in vitro

Phương pháp được thực hiện theo P Montri (2005)[34]

Năm trái ớt thuộc giống Ớt sừng trâu ở giai đoạn chín đỏ (40 – 50 ngày sau khi nở hoa, tùy theo giống Ớt) được chủng bệnh bằng phương pháp tiêm Đài quả ớt được loại bỏ, quả ớt được ngâm trong nước Javen (NaClO) 1% (w/v) trong 5 phút để khử trùng và trung hòa các loại hóa chất và vi sinh vật trên bề mặt vỏ quả Sau đó rửa nhẹ bằng nước cất vô trùng hai lần

Sử dụng phương pháp tạo vết thương hoặc tiêm trực tiếp 50µl bào tử nấm bệnh lên quả ớt Các quả ớt sau khi chủng bệnh được đặt vào một khay nhựa, kích thước (20 x 30 x 10 cm), đặt cạnh một khay chứa 500 ml nước, sau đó được ủ ở 28oC, đạy kín các khay để đảm bảo độ ẩm tương đối đạt 100% Sau 3 ngày, các khay được lấy

ra và độ ẩm giảm còn 70 – 80%

Biểu hiện bệnh thán thư được khảo sát sau 7 – 9 ngày từ lúc tiêm chủng Chỉ tiêu đo là phần trăm (%) kích thước vết bệnh so với kích thước toàn bộ quả Đánh giá mức độ nhiễm bệnh theo thang đo 9 cấp theo Quy phạm khảo nghiệm trên đồng ruộng hiệu lực phòng trừ bệnh thán thư hại ớt của các loại thuốc trừ bệnh [8]