Xây dựng quy trình RT realtime PCR nhằm phát hiện virus sởi khóa luận tốt nghiệp đại học

Bên cạnh đó, có thể phát hiện nhiễm virus sởi bằng phương pháp phân lập virus sởi hoặc bằng việc phát hiện RNA của virus sởi từ các mẫu bệnh phẩm dịch tiết mũi-hầu, máu và nước tiể

Tp Hồ Chí Minh, tháng 5 năm 2015

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt những năm học tập tại trường em đã nhận được nhiều sự quan tâm, giúp

đỡ từ quý Thầy Cô, gia đình và bạn bè

Em xin chân thành cảm ơn đến thầy Cao Bảo Hiền, cô Nguyễn Thụy Dạ Thảo, cô Trương Thị Kim Phượng đã tận tình giúp đỡ, quan tâm, trực tiếp hướng dẫn em trong suốt quá trình làm đề tài thực tập

Em xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu trường Đại Học Mở Thành phố Hồ Chí Minh cùng quý thầy cô ở Khoa Công Nghệ Sinh học trường Đại Học Mở Thành phố

Hồ Chí Minh đã truyền đạt vốn kiến thức quý báu cho chúng em trong suốt quá trình học tập tại trường

Em xin chân thành cảm ơn đến Công ty Cổ phần Công nghệ Việt Á đã hỗ trợ em trong suốt quá trình làm đề tài

Em xin gửi lời cảm ơn chị Hồ Thị Tây đã dành thời gian giúp đỡ, chỉ dẫn, góp ý cho

em trong suốt thời gian thực tập

Em xin cảm ơn sự giúp đỡ của các anh chị phòng R&D trong Công ty Cổ phần Công nghệ Việt Á, nhờ có các anh chị mà em có thêm nhiều kĩ năng trong phòng thí nghiệm

Cuối cùng con xin tỏ lòng biết ơn tới ba mẹ, ba mẹ đã sinh thành nuôi nấng con nên người, luôn động viên, giúp đỡ trong suốt thời gian học tập, thực hiện đề tài

Trân trọng

Tp Hồ Chí Minh, ngày 26 tháng 05 năm 2015

Sinh viên thực hiện (Kí và ghi rõ họ tên)

Trần Đại Hiệp

DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT

BLAST Bacsic local alignment tool

dNTPs 2'deoxy nucleotide 5'triphosphate

MỤC LỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Thành phần các protein của virus sởi và chức năng 8

Bảng 1.2 Phân bố số trường hợp mắc sởi và kết quả xét nghiệm theo khu vực trong 3 tháng đầu năm 2014 17

Bảng 1.3 Các reporter hiện nay đang được các nhà nghiên cứu sử dụng cùng với bước sóng kích thích, huỳnh quang phát ra và quencher tương ứng 23

Bảng 3.1 Trình tự cặp mồi, mẫu dò 39

Bảng 3.2 Kết quả các đặc tính của cặp mồi và mẫu dò 40

Bảng 3.3 Năng lượng tự do của các cấu trúc Hetero-Dimer (kcal/mol) của cặp mồi MV 40

Bảng 3.4 Trình tự sản phẩm Realtime-PCR 46

Bảng 3.5 Kết quả khảo sát độ nhạy quy trình 48

Bảng 3.6 Kết quả khảo sát độ nhạy của quy trình 49

Bảng 3.7 Kết quả khảo sát độ đặc hiệu của hệ mồi và mẫu dò virus sởi 51

Bảng 3.8 Kết quả quy ứng dụng quy trình trên mẫu bệnh phẩm 52

MỤC LỤC CÁC BIỂU ĐỒ

Biểu đồ 1.2 Phân bố trường hợp mắc sởi trong 3 tháng đầu năm 2014 17 Biểu đồ 1.3 Phân bố ca sởi theo tuổi, từ ngày 1/1 đến 6/4/2014 18 Biểu đồ 1.4 Số trường hợp sởi theo tình trạng tiêm chủng, 3 tháng đầu năm 2014 18

MỤC LỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Cấu trúc của virus sởi 6

Hình 1.2 Dấu hiệu hạt Koplik 11

Hình 1.3 Ban sởi toàn thân 12

Hình 1.4 Bản đồ phân bố mắc sởi trên thế giới (tháng 2/2013-1/2014) 14

Hình 1.5 Bản đồ phân bố các chủng virus sởi trên thế giới, năm 2013 15

Hình 1.6 Bản đồ phân bố chủng virus sởi, 2013 - 2 tháng/2014 16

Hình 1.7 Ba bước hoạt động trong một chu kì của phản ứng PCR 21

Hình 1.8 Tóm tắt cơ chế hoạt động của Taqman probe trong Real-time PCR 24 Hình 3.1 Kết quả kiểm tra sự bắt cặp của cặp mồi, mẫu dò lên trình tự bảo tồn của vùng gene N 41

Hình 3.2 Kết quả BLAST mồi xuôi MV 42

Hình 3.3 Kết quả BLAST mồi ngược MV 42

Hình 3.4 Kết quả BLAST mẫu dò MV 43

Hình 3.5 Thí nghiệm Realtime PCR kiểm tra hoạt động mồi, mẫu dò của virus sởi 44

Hình 3.6 Hiệu quả nhân bản của cặp mồi MVF - MVR 45

Hình 3.7 Kết quả giải trình tự sản phẩm Realtime-PCR 46

Hình 3.8 Kết quả BLAST của trình tự sản phẩm Realtime PCR 46

Hình 3.9 Kết quả sắp gióng cột trình tự sản phẩm Realtime-PCR với trình tự chuẩn 47

Hình 3.10 Đồ thị khảo sát nhiệt độ lai tối ưu hệ mồi, mẫu dò của virus sởi được đánh dấu màu FAM 47

Hình 3.11 Đồ thị khảo sát độ nhạy của quy trình 48

Hình 3.12 Đồ thị kiểm tra độ đặc hiệu với các hệ mồi, mẫu dò được đánh dấu là màu FAM 50 Hình 3.13 Đồ thị kiểm tra độ đặc hiệu với hệ mồi mẫu dò của virus sởi được

đánh dấu màu FAM 50 Hình 3.14 Kết quả ứng dụng quy trình trên các mẫu bệnh phẩm 52 Hình 4.1.Hình ảnh giá trị năng lƣợng tự do của các cấu trúc hetero-dimer giữa mồi xuôi và mồi ngƣợc i Hình 4.2 Hình ảnh giá trị năng lƣợng tự do của các cấu trúc hetero-dimer giữa mồi xuôi và mẫu dò i Hình 4.3 Hình ảnh giá trị năng lƣợng tự do của các cấu trúc hetero-dimer giữa mồi ngƣợc và mẫu dò i

LỜI CẢM ƠN III DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT V MỤC LỤC CÁC BẢNG VI MỤC LỤC CÁC BIỂU ĐỒ VII MỤC LỤC CÁC HÌNH VIII ĐẶT VẤN ĐỀ 1

PHẦN 1 TỔNG QUAN 3

1.1 BỆNH SỞI 4

1.1.1 Đại cương về bệnh sởi 4

1.1.2 Đặc điểm dịch tễ bệnh sởi 4

1.2 VIRUS SỞI 6

1.2.1 Cấu tạo 6

1.2.2 Quá trình nhân lên của virus sởi 9

1.3 LÂM SÀNG VỀ BỆNH SỞI 10

1.3.1 Thể điển hình 10

1.3.2 Các thể lâm sàng đặc biệt 12

1.3.3 Chẩn đoán bệnh sởi 13

1.4 TÌNH HÌNH DỊCH BỆNH 14

1.4.1 Tình hình bệnh sởi trên thế giới 14

1.4.2 Tình hình bệnh sởi tại Việt Nam 16

1.5 CÁC PHƯƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN 19

1.5.1 Phương pháp ELISA 19

1.5.2 Phương pháp RT Realtime-PCR 20

1.6 SƠ LƯỢC CÁC CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN VIRUS SỞI BẰNG KỸ THUẬT RT REAL TIME PCR 28

1.6.1 Trên thế giới 28

1.6.2 Ở trong nước 29

PHẦN 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 30

2.1 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU 31

2.2 VẬT LIỆU 31

2.2.1 Mẫu 31

2.2.2 Mồi và mẫu dò 31

2.2.3 Thiết bị và dụng cụ 31

2.2.4 Hóa chất 32

2.3 PHƯƠNG PHÁP TIẾN HÀNH 32

2.3.1 Phương pháp thiết kế mồi 32

2.3.2 Phương pháp xử lý mẫu 33

2.4 PHƯƠNG PHÁP TÁCH CHIẾT RNA 33

2.4.1 Nguyên tắc 33

Phương pháp tiến hành 34

2.5 PHƯƠNG PHÁP RT- REALTIME PCR 35

2.5.1 Cách tiến hành phản ứng RT 35

2.5.2 Cách tiến hành phản ứng Realtime PCR 35

2.6 PHƯƠNG PHÁP KIỂM TRA KHẢ NĂNG HOẠT ĐỘNG CỦA HỆ MỒI VÀ MẪU DÒ 35 2.7 PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH NHIỆT ĐỘ LAI TỐI ƯU CỦA QUY TRÌNH 35

2.8 PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH ĐỘ NHẠY CỦA QUY TRÌNH 36

2.9 KHẢO SÁT ĐỘ ĐẶC HIỆU CỦA HỆ MỒI VÀ MẪU DÒ 36

PHẦN 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 38

3.1 KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ MỒI, MẪU DÒ TRÊN LÝ THUYẾT 39

3.1.1 Thiết kế mồi, mẫu dò 39

3.1.2 Kết quả thiết kế mồi và khảo sát đặc tính của mồi 39

3.1.3 Kết quả khảo sát độ đặc hiệu của mồi 40

3.2 KẾT QUẢ KHẢO SÁT CẶP MỒI, MẪU DÒ TRÊN THỰC TẾ 43

3.2.1 Kết quả khảo sát sự hoạt động của hệ mồi 43

3.2.2 Kết quả giải trình tự 44

3.2.3 Kết quả khảo sát nhiệt độ lai tối ưu của cặp mồi, mẫu dò 47

3.2.4 Kết quả khảo sát độ nhạy của quy trình 48

3.2.5 Kết quả kiểm tra độ đặc hiệu của hệ mồi, mẫu dò 49

3.3 KẾT QUẢ ỨNG DUNG QUY TRÌNH TRÊN MẪU BỆNH PHẨM 51

PHẦN 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 53

4.1 KẾT LUẬN 54

4.2 KIẾN NGHỊ 54

TÀI LIỆU THAM KHẢO 55 PHỤ LỤC I

ĐẶT VẤN ĐỀ

Virus sởi (measles virus) thuộc chi Morbillivirus, họ Paramyxoviridae, là tác

nhân gây bệnh nhiễm sởi cấp ở người Theo Tổ chức Y tế Thế giới, năm 2008 trên toàn cầu có 164.000 trường hợp chết vì sởi, chủ yếu ở trẻ dưới 5 tuổi và ở các nước đang phát triển[19]

Sởi là một bệnh truyền nhiễm cấp tính với các triệu chứng sốt, phát ban, chảy nước mũi, ho, mắt đỏ, thường gặp ở trẻ em nhưng cũng có thể gặp ở người lớn chưa có miễn dịch và có thể gây thành dịch[1, 20]

Các biến chứng của sởi có thể gặp là: viêm tai giữa, viêm phổi, tiêu chảy, khô loét giác mạc và đôi khi viêm não sau sởi, đặc biệt ở trẻ em suy dinh dưỡng, có thể dẫn đến tử vong[17, 19] Vì vậy, việc xây dựng quy trình phát hiện nhanh, chính xác tác nhân gây bệnh sởi là cần thiết

Hiện nay, việc chẩn đoán nhiễm virus sởi thường dựa vào phương pháp miễn dịch enzyme (ELISA, Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) phát hiện các kháng thể IgM giữa phase cấp và phase phục hồi[7, 19] Bên cạnh đó, có thể phát hiện nhiễm virus sởi bằng phương pháp phân lập virus sởi hoặc bằng việc phát hiện RNA của virus sởi từ các mẫu bệnh phẩm dịch tiết mũi-hầu, máu và nước tiểu (ngày 0-5 kể từ khi phát ban)[21]

Tuy nhiên, phương pháp phát hiện IgM có nhược điểm là không phân tích được kiểu gene virus sởi và có thể không phát hiện được IgM ở những trường hợp mới bị nhiễm virus sởi[1, 7] Chính vì vậy, việc phát hiện sớm và chính xác bệnh sởi rất cấp thiết trong việc chăm sóc sức khỏe cộng đồng

Nghiên cứu của Hummel và các cộng sự (2006) ghi nhận kỹ thuật real-time RT-PCR (quantitative gene-specific real-time Reverse transcription-PCR assays) phù hợp với việc định tính virus sởi trong các mẫu bệnh phẩm dịch phết cổ họng,

dựa trên các gene N (nucleoprotein), F (fusion) và H (hemagglutinin) Kết quả

nghiên cứu minh chứng quy trình RT-Realtime PCR có độ nhạy tương ứng với các gene mục tiêu, lần lượt là 100%, 93%, 82% và đều có độ đặc hiệu là 100%[8] Nghiên cứu của Akiyama và các cộng sự (2009) đã xây dựng quy trình phát

hiện và định lƣợng Measles virus trên vùng gene N(nucleoprotein) dựa trên kỹ

thuật real-time RT-PCR (quantitative gene-specific real-time Reverse transcription-PCR assays)

Dựa vào các cơ sở khoa học nêu trên, đƣợc sự cho phép của công ty Cổ phần

Công nghệ Việt Á, chúng tôi thực hiện chuyên đề thực tập tốt nghiệp "XÂY DỰNG QUY TRÌNH RT-REAL TIME PCR NHẰM PHÁT HIỆN VIRUS SỞI"

PHẦN 1 TỔNG

QUAN

1.1 BỆNH SỞI

1.1.1 Đại cương về bệnh sởi

Bệnh sởi là một bệnh truyền nhiễm do nhiễm siêu vi cấp tính, biểu hiện bằng hội chứng nhiễm trùng, viêm long ở kết mạc mắt, đường hô hấp, đường tiêu hóa và phát ban đặc trưng Bệnh sởi được viết theo tiếng anh là Measles, tiếng Latin - Morbilli, tiếng Pháp - Rougeole[2]

Bệnh đã được nghi nhận trong các y văn thời cổ đại cách nay hơn 2000 năm Bệnh được bác sĩ Razek (Ả Rập) mô tả cụ thể vào thế kỉ thứ IX Đến thế kỉ XVII, bác sĩ T.Sideham (Anh) và R.Morton (Pháp) mô tả như là một dang đặc biệt của hội chứng sốt phát ban Tuy nhiên, mãi đến thế kỉ XVIII bệnh sởi mới được chính thức phân biệt thành một căn bệnh riêng từ nhóm bệnh sốt phát ban[2]

Vào năm 1911, Andersson và Goldberger chứng minh được tính lây lan và tác nhân gây bệnh do siêu vi bằng thử nghiệm gây bệnh cho khỉ từ mẫu máu và dịch tiết từ mũi họng của bệnh sởi[2]

Vào năm 1954, J.Enders và T.C Piblc phân lập được siêu vi gây bệnh sởi Năm

1967, J.H Connoli chứng minh được sự xuất hiện hiệu giá kháng thể ở nồng độ cao trong huyết thanh và trong dịch não tủy của bệnh nhân tử vong do bệnh viêm não Cho đến năm 1969, siêu vi phân lập từ mẫu tử thiết não bệnh nhân tử vong do bệnh viêm não hoàn toàn tương tự về hình dạng, tính chất tạo miễn dịch và sinh học so với siêu vi gây bệnh sởi[2]

Việc phòng ngừa bệnh sởi bằng tiêm chủng huyết thanh người được thực hiện vào năm 1919 đã làm giảm nhanh tỉ lệ tử vong của căn bệnh này Trước đây, bệnh sởi vẫn được xem là một cẳn bệnh truyền nhiễm ở trẻ em Tuy nhiên, những năm gần đây, bệnh lại thường gặp ở trẻ lớn: 14 - 16 tuổi và cả người lớn Vì vậy, hiện nay vấn đề chẩn đoán bệnh sớm được đặt ra nhằm ngăn chặn sự lây lan và phát triển thành dịch ở những nơi đông dân cư[2]

1.1.2 Đặc điểm dịch tễ bệnh sởi

Bệnh sởi có thể được gặp khắp mọi nơi trên thế giới và bệnh xảy ra quanh năm Bệnh rất dễ lây lan, dễ phát triển thành dịch, chu kì 2-4 năm một lần ở các thành

Lứa tuổi dễ mắc bệnh nhất là trẻ em từ 2 đến 6 tuổi Khoảng 90% trẻ lớn hơn 10 tuổi đã có miễn dịch đặc hiệu đối với bệnh sởi và do đó người lớn rất ít khi mắc bệnh sởi do đã có miễn dịch Tuy nhiên, trên thực tế, các công trình nghiên cứu cho thấy có khoảng 20-30% thanh niên lứa tuổi từ 25-30 chưa có miễn dịch Trẻ

em dưới 6 tháng tuổi rất ít khi mắc bệnh sởi do có kháng thể truyền từ mẹ qua nhau thai khi còn là bào thai nằm trong bụng mẹ Sau 6 tháng tuổi nồng độ kháng thể thụ động từ mẹ giảm dần do đó khả năng mắc bệnh tăng lên Trẻ em sinh ra từ các bà mẹ chưa từng mắc bệnh sởi rất dễ bị mắc bệnh cùng lúc với mẹ trong thời

kì sơ sinh[2]

Siêu vi sởi mang một số đặc điểm sinh học tương tự như siêu vi gây bệnh đậu mùa: không có ổ chứa siêu vi ở động vật trong thiên nhiên, không có sinh vật trung gian truyền bệnh, chỉ có một chủng huyết thanh, thuốc chủng người đạt hiểu quả bảo vệ cao[2]

Về mặt lâm sàng, bệnh dễ chẩn đoán nhờ vào đặc điểm phát ban đặc hiệu Bệnh sởi có thể được khắc phục nhờ vào chương trình tiêm chủng Tại một số nước phát triển, từ thập niên 90 đến nay không còn ghi nhận có bệnh sởi với tỉ lệ trẻ em miễn dịch khoảng 90% Tại Liên Xô cũ, từ năm 1967, chương trình tiêm chủng ngừa bệnh sởi được áp dụng làm tỉ lệ mắc bệnh giảm 7 lần so với trước khi thực hiện chương trình tiêm chủng Tại Việt Nam, thuốc chủng ngừa sởi được tiêm phòng rộng rãi cho trẻ em theo chương trình "tiêm chủng mở rộng" nên tỉ lệ mắc bệnh và

tử vong đã giảm nhiều[2]

1.2 VIRUS SỞI

1.2.1 Cấu tạo

Virus sởi là thành viên của chi Morbillivirus thuộc họ Paramyxoviridae Virus

sởi chỉ có một type, không có type phụ, là dạng đa hình thái Dạng hình cầu, đường kính 120 - 250nm, trung bình là 150nm[1]

Bộ gene là một chuỗi RNA (-) với khối lượng phân tử 5.106, chứa 16000 nucleotid và có hệ số lắng là 52S Bộ gene với RNA - polymerase phụ thuộc RNA được bao bọc bởi vỏ capsid tạo nucleocapsid với cấu trúc đối xứng xoắn Nucleocapsid được bao bọc bởi màng protein M Đây là protein nền (matrix) kị nước Phía ngoài màng M là vỏ ngoài có cấu tạo từ lớp lipid kép[1]

Trên bề mặt vỏ ngoài nhô ra các gai H (hemaglutinin) và F (fusion) Gai H giúp virus gắn vào thụ thể của tế bào mẫn cảm, còn gai F là peptid dung hợp, giúp vỏ ngoài virus dung hợp với màng sinh chất của tế bào Điều khác biệt cơ bản với các

virus Paramyxo khác là virus sởi không có hoạt tính neuraminidase Virus sởi có 6

loại protein, trong đó có 3 loại protein tạo phức với RNA bộ gene (L, NP và P) và

3 loại protein tham gia vào cấu tạo của vỏ (H, M và F) [1]

Hình 1.1 Cấu trúc của virus sởi [29]

Protein P hay protein polymerase (protein photphoryl hóa) và protein L đều có liên quan đến chức năng polymerase và tham gia vào sự hình thành nucleocapsid Protein H và F là hai kháng nguyên chính Protein H là kháng nguyên ngưng kết hồng cầu, còn protein F là kháng nguyên tan máu Hoạt tính tan máu liên quan đến

khả năng gây hủy hoại tế bào sớm, đồng thời giúp virus dễ dàng xâm nhập vào tế bào Hoạt tính tan máu không biểu hiện nếu không có hoạt tính ngƣng kết hồng cầu

Virus sởi không bền do có vỏ lipid kép nên dễ bị bất hoạt bởi dung môi hòa tan lipid (cồn ete ) Nó cũng bị bất hoạt bởi nhiệt độ cao[1]

Bảng 1.1 Thành phần các protein của virus sởi và chức năng [1]

Thành

phần

Khối lƣợng phân tử (kDa)

- Có hoạt tính polymerase

- Là thành phần của phức hợp phiên mã H: Ngƣng

kết hồng cầu 79 – 80

Glycoprotein xuyên

màng

Hấp phụ trên màng tế bào và hồng cầu P:

- Có chức năng bảo vệ RNA virus

trong nucleocapsid

Không rõ chức năng, có thể là phần actin của tế

bào chủ M: Protein

Bao quanh nucleocapsid

F: Protein

dung hợp

41 (F1)

18 - 20 (F2)

Glycoprotein vỏ ngoài

- Chức năng bám dính, dung hợp, phân giải màng tế bào để virus xâm nhập

- Có hoạt tính tan máu

Vùng gene NP (gene N) của virus sởi nằm trong capsid mã hóa cho nucleoprotein

có chức năng bảo vệ RNA virus và có hoạt tính polymerase

Gene N có kích thước 1689 nu, nằm ở vị trí từ nucleotide 56 đến nucleotide thứ

1744 Theo Hummel và các cộng sự (2006) đã chứng minh rằng quy trình phát hiện virus sởi bằng phương pháp RT-Realtime PCR trên gene mục tiêu N cho độ nhạy là 100% Đây là vùng gene sẽ được sử dụng để làm gene đích cho việc thiết

kế mồi và mẫu dò Realtime-PCR[1],[17],[8]

1.2.2 Quá trình nhân lên của virus sởi

1.2.2.2 Sao chép và phiên mã

Bộ gene RNA (-) được dùng làm khuôn để tổng hợp mRNA nhờ enzyme RNA-polymerase phụ thuộc RNA có sẵn trong virion mRNA có 3 tiểu đơn vị là 18, 22,và 35S

mRNA được gắn đuôi poly A ở đầu 3' dùng để dịch mã tạo protein, trong đó có enzyme RNA-polymerase thứ cấp dùng để sao RNA (-) 52S thành chuỗi RNA (+) 52S (có chiều dài đủ), không được gắn đuôi polyA để rồi chuỗi này lại được dùng làm khuôn tổng hợp RNA (-) 52S, là bộ gene của virus mới[1]

1.2.2.3 Dịch mã

Protein cấu trúc đầu tiên được tổng hợp là protein nucleocapsid, sau đó là protein

H và F được tạo thành quanh vùng nhân, thông qua màng của bộ máy Golgi để gắn vào các vị trí đặc hiệu trên màng sinh chất của tế bào chủ Protein M cũng được đưa ra phía màng sinh chất để tạo màng trong M[1]

1.2.2.4 Lắp ráp và phóng thích

Các glycoprotein gắn vào vị trí chuyên biệt trên màng sinh chất Gai H và F hướng ra ngoài

Protein màng M xếp phía trong màng sinh chất

Nucleocapsid sau khi được lắp ráp vận chuyển tới vị trí nằm dưới M rồi ra ngoài theo lối nảy chồi, trong khi màng sinh chất của tế bào vẫn tiếp tục được khôi phục Các đám nucleocapsid sẽ được lập tức tập hợp dưới dạng thể vùi (inclusion) Trong quá trình nhân lên, virus không phá vỡ nhanh tế bào, ngược lại tế bào vẫn

có khả năng trao đổi chất trong một thời gian, tuy nhiên quá trình diễn ra chậm chạp[1]

Thời kì này còn được gọi là thời kì viêm long hay viêm xuất tiết, kéo dài từ 3 đến

5 ngày Đây là thời kì lây lan nhất với các biểu hiện chính là:

 Sốt khởi đầu là sốt nhẹ sau đó thân nhiệt tăng dần kèm theo mệt mỏi, uể oải toàn thân, nhức đầu, đau khớp

 Viêm long (viêm xuất tiết): chảy nước mắt, nước mũi gây hắt hơi, ho, viêm kết mạc mắt gây chảy nước mắt, nhiều ghèn, phù nề mi mắt Viêm long đường tiêu hóa gây tiêu chảy

 Nội ban xuất hiện: Khám họng ở thời kì này của bệnh (vào ngày thứ 2 của sốt) ta có thể thấy các hạt Koplik Đó là các hạt trắng, có kích thước nhỏ như đầu đinh ghim, nổi gồ lên trên bề mặt niêm mạc má (phía trong miệng, ngang răng hàm), xung quanh hạt Koplik niêm mạc má thường có sung huyết Các hạt Koplik chỉ tồn tại trong vòng 12 - 14 giờ Đây là dấu hiệu có giá trị chẩn đoán sớm và chắc chắn

Hình 1.2 Dấu hiệu hạt Koplik [30]

 Hạch bạch huyết sưng to, đau[2]

1.3.1.3 Thời kì toàn phát: giai đoạn phát ban

Bệnh nhân bắt đầu bị phát ban vào ngày thứ 4 - 6 của bệnh Ban có dạng dát sẩn, kích thước nhỏ, hơi nổi gồ lên mặt da, giữa các nốt ban là khoảng da lành Ban mọc rải rác hay dính liền với nhau thành những mảng tròn 3 - 6 mm Sự phát triển ban diễn ra theo trình tự:

Ngày đầu: mọc sau tai rồi lan dần ra hai bên má cổ

Ngày thứ 2: ban lan xuống ngực bụng và hai tay

Ngày thứ 3: ban lan ra sau lưng, hông và chân

Ban mọc trong niêm mạc (được gọi là nội ban) ở đường tiêu hóa sẽ gây rối loạn tiêu hóa, bệnh nhân đi tiểu phân lỏng; ở đường hô hấp gây viêm phế quản, ho[2] Khi bắt đầu phát ban, thân nhiệt tăng đột ngột, bệnh nhân có thể bị sưng to, đau hạch cổ, hạch góc hàm, lách to, sưng hạch màng bụng gây đau bụng Các tổn thương đặc hiệu của sởi ở niêm mạc ruột thừa có thể làm hẹp lòng ruột và gây ra các triệu chứng giống viêm ruột thừa Các triệu chứng tiêu hóa như: ói, tiêu chảy hoặc viêm tai giữa, viêm phế quản thường xảy ra ở trẻ nhỏ hơn trẻ lớn và nhất là ở trẻ bị suy dinh dưỡng[2]

Sau khi lan khắp toàn thân, ban sẽ tồn tại đến ngày thứ 6 kể từ ngày bắt đầu phát ban kế đó sẽ dần dần biến mất theo trình tự xuất hiện[2]

Hình 1.3 Ban sởi toàn thân [28]

1.3.1.4 Thời kì hồi phục (thời kì lui bệnh)

Thông thường sau 6 ngày, ban đỏ sẽ bắt đầu lặn theo thứ tự như khi xuất hiện Ban lặn dần từ mặt đến thân mình và chi, để lại các nốt thâm có tróc da mỏng, mịn giống như bụi phấn hay vảy cám Những lỗ thâm đen trên da mặt xem lẫn với những chỗ da bình thường được gọi là "vết dằn da cọp", đây là dấu hiệu khẳng định chẩn đoán bệnh sởi Những vết này sẽ lợt màu dần và biến mất trong vòng 7 đến 10 ngày[2]

1.3.2 Các thể lâm sàng đặc biệt

Ngoài thể lâm sàng như đã mô tả ở trên, một số trường hợp bệnh sởi rất khó nhận

ra do biểu hiện lâm sàng không điển hình[2]

1.3.2.1 Thể nhẹ

Bệnh nhân không sốt hoặc sốt nhẹ, chỉ chảy một ít nước mũi, ban thưa, mờ, lặn nhanh Thể này thường gặp ở trẻ em dưới 6 tháng tuổi do còn kháng thể của mẹ hay ở trẻ đã được gây miễn dịch bằng Gamma Glubulin hoặc vaccine[2]

1.3.2.2 Thể nặng (thể sởi ác tính)

Các dấu hiệu thể ác tính thường xuất hiện nhanh chóng trong vòng vài giờ vào cuối thời kì khởi phát, trước khi phát ban Các dấu hiệu ác tính bao gồm: sốt cao đột ngột 39 - 41o

C, rối loạn tri giác, lơ mơ, bứt rứt, vật vã, co giật, mạch nhanh, huyết áp tụt, thở nhanh, tím tái, nôn mửa, tiêu lỏng, tiểu ít, xuất huyết dưới da Đánh giá tiên lượng sởi phải căn cứ chủ yếu vào hội chứng nhiễm khuẩn, nhiễm độc toàn thân, chứ không dựa vào hội chứng phát ban Trên thực tế, thường gặp

phát ban ít ở thể nhẹ nhưng cũng có thể gặp ở thể nặng khi người bệnh bị suy giảm miễn dịch Ngược lại, ban mọc dầy không nhất thiết là bệnh nặng vì có thể gặp những người có đáp ứng miễn dịch mạnh, khi đó bệnh sởi diễn ra nhẹ và có tiên lượng tốt[2]

1.3.2.3 Các biến chứng của bệnh sởi

Biến chứng đường hô hấp: viêm thanh quản, viêm phế quản, viêm phổi ở giai đoạn sớm là do virus sởi và sau đó là do bội nhiễm (do tụ cầu, liên cầu, phế cầu )

 Giai đoạn sớm: dấu hiệu Koplik

 Giai đoạn toàn phát: phát ban theo trình tự từ mặt cổ lan dần xuống thân, tay, chân và biến mất theo thứ tự Sau để lại vết ban để lại các "vết rằn da cọp".[2]

1.3.3.3 Các kết quả xét nghiệm

Phân lập virus từ máu, mũi họng (giai đoạn sớm)

Tìm tế bào khổng lồ Heth ở dịch tiết mũi họng[21]

thể, phản ứng ELISA: thực hiện 2 lần, cách nhau 7 - 10 ngày Kết quả dương tính khi hiệu giá kháng thể lần 2 cao gấp 4 lần so với lần đầu[21]

Tuy nhiên, trên thực tế các xét nghiệm này rất ít được áp dụng vì khó thực hiện Việc chẩn đoán chủ yếu dựa vào các yếu tố dịch tễ và lâm sàng đặc trưng[21]

1.4 TÌNH HÌNH DỊCH BỆNH

1.4.1 Tình hình bệnh sởi trên thế giới

Năm 2012, trên toàn cầu ghi nhận 226.722 trường hợp mắc sởi Riêng năm 2013

và 2 tháng đầu năm 2014, ghi nhận 181.813 trường hợp mắc sởi, tập trung tại các khu vực Châu Phi (78.922 trường hợp), Tây Thái Bình Dương (37.989 trường hợp), Châu Âu (31.726 trường hợp) [23]

Hình 1.4 Bản đồ phân bố mắc sởi trên thế giới (tháng 2/2013-1/2014) [23]

Tại các nước khu vực Tây Thái Bình Dương: Năm 2013 cả khu vực ghi nhận 30.910 trường hợp mắc sởi, tăng gần 3 lần so với 2012 Riêng trong 2 tháng đầu năm 2014 đã có 11.139 trường hợp mắc sởi Các nước có số mắc gia tăng trong 2 tháng/2014 là: Trung Quốc, Philippines, Việt Nam, Nhật Bản, Singapore[23]

Phân bố chủng virus sởi

Các chủng virus sởi chính lưu hành tại khu vực Châu Phi và Địa Trung Hải là chủng B3, Châu Âu là chủng D4, Tây Á và Tây Thái Bình Dương là chủng H1, D8

và D9[23]

Hình 1.5 Bản đồ phân bố các chủng virus sởi trên thế giới, năm 2013 [23]

Tại khu vực Tây Thái Bình Dương, các chủng virus sởi được ghi nhận từ năm

2013 đến đầu năm 2014 là:

 Chủng H1: Trung Quốc, Hồng Kông, Việt Nam, Australia

 Chủng B3: Nhật Bản, Hồng Kông, Trung Quốc, Australia, New Zealand,

Hàn Quốc, Singapore

 Chủng D8: Nhật Bản, Australia, New Zealand, Singapore, Việt Nam [23]

Hình 1.6 Bản đồ phân bố chủng virus sởi, 2013 - 2 tháng/2014 [23]

1.4.2 Tình hình bệnh sởi tại Việt Nam

Từ đầu năm 2014 đến nay có 6.611 trường hợp sốt phát ban dạng sởi, trong đó

ghi nhận 2.492 trường hợp được xác định mắc bệnh sởi (bao gồm các trường hợp xét nghiệm dương tính và xác định dịch tễ học) tại 59 tỉnh/thành phố, các cơ sở y

tế đã lấy 4.335 mẫu xét nghiệm, có 2.303 mẫu dương tính với sởi (53%) Tích lũy

từ tháng 11/2013 đến 31/3/2014 ghi nhận 3.380 trường hợp mắc sởi, trong đó có

25 trường hợp tử vong; số mắc thấp hơn vụ dịch năm 2009-2010 (8.233 trường

hợp mắc) [24]

Các trường hợp mắc bệnh rải rác tại nhiều tỉnh Tuy nhiên tại một số tỉnh ghi

nhận ổ dịch sởi tập trung với quy mô nhỏ và vừa như Yên Bái, Lào Cai, Sơn La,

Tuyên Quang, Hà Giang Tại 2 thành phố lớn là Hà Nội và Hồ Chí Minh không

xuất hiện ổ dịch sởi tập trung lớn nhưng số mắc rải rác xảy ra trên diện rộng[24]

1.4.2.1 Số trường hợp mắc theo thời gian [24]

Biểu đồ 1.1 Phân bố trường hợp mắc sởi trong 3 tháng đầu năm 2014 [24]

Số trường hợp mắc sởi cao trong tuần 6 đến tuần 10 năm 2014 Số trường hợp mắc có dấu hiệu giảm từ tuần 11 năm 2014 đến nay[24]

1.4.2.2 Phân bố theo khu vực

Bảng 1.2 Phân bố số trường hợp mắc sởi và kết quả xét nghiệm theo khu

vực trong 3 tháng đầu năm 2014 [24]

Khu vực Số ca nghi ngờ Số mẫu huyết

thanh

Số ca sởi xét nghiệm (+)

1.4.2.3 Độ tuổi mắc bệnh

Biểu đồ 1.2 Phân bố ca sởi theo tuổi, từ ngày 1/1 đến 6/4/2014 [24]

Phân tích số sởi mắc trong 3 tháng/2014 cho thấy phần lớn số mắc là trẻ em dưới

10 tuổi (68,3%) Số mắc sởi ở trẻ dưới 1 tuổi chiếm 16,1% tổng số ca mắc, trong

đó số mắc <9 tháng tuổi chiếm tỷ lệ 11%[24]

1.4.2.4 Tình trạng tiêm chủng vắc xin sởi

Biểu đồ 1.3 Số trường hợp sởi theo tình trạng tiêm chủng, 3 tháng đầu năm

2014 [24]

Hầu hết ca mắc sởi là không được tiêm chủng hoặc không rõ tình trạng tiêm chủng vắc xin sởi (86%) Chỉ có 10% ca sởi đã tiêm chủng 1 mũi vắc xin sởi Điều này cho thấy tính cần thiết của việc tiêm chủng mũi 2 vắc xin sởi trong tiêm chủng thường xuyên[24]

1.4.2.5 Phân tích các trường hợp tử vong có liên quan bệnh sởi

Phân tích 25 trường hợp tử vong từ tháng 12/2013 đến 31/3/2014 đều ở khu vực phía Bắc Các trường hợp tử vong do viêm phổi liên quan đến sởi hoặc biến chứng viêm phổi sau mắc sởi[24]

Phân bố theo nhóm tuổi

+ Số trẻ chưa tiêm hoặc không rõ tình trạng tiêm chủng: 24/25 (96%)[24]

Trong đó chưa đến tuổi tiêm chủng: 7 (29,2%), đến tuổi tiêm chủng nhưng chưa được tiêm hoặc không rõ tình trạng tiêm chủng: 17 (70,8%)[24]

Về nguyên nhân tử vong chủ yếu là viêm phổi sau sởi liên quan đến giai đoạn chuyển mùa đông - xuân, khí hậu ở phía Bắc lạnh và ẩm các bệnh đường hô hấp phát triển mạnh trong giai đoạn này Song có nhiều bệnh do virus và vi khuẩn gây viêm phổi ở trẻ nhỏ đi kèm với sởi hoặc mắc biến chứng sau sởi rất khó phân lập

1.5.1 Phương pháp ELISA

phát hiện vi sinh vật giúp chẩn đoán bệnh Phương pháp này có tính đơn giản, độ nhạy và độ đặc hiệu cao, có thể được sử dụng hầu hết các loại kháng nguyên nên phương pháp này có hiệu quả cao[33]

Nguyên tắc của phương pháp ELISA là phản ứng kết hợp giữa kháng nguyên (virus) và một kháng thể đặc hiệu Tín hiệu của phản ứng miễn dịch có thể nhận biết thông qua sự ngưng tủa hay sự kết dính của kháng nguyên – kháng thể đã được đánh dấu bằng chất nhuộm huỳnh quang, đồng vị phóng xạ hay enzyme[33]

Virus sởi có thể được phát hiện bằng phương pháp ELISA, tuy nhiên phương pháp này phải thực hiện 2 lần, cách nhau 7-10 ngày Kết quả chẩn đoán chậm rất

dễ gây biến chứng cho bệnh nhân sởi[33]

1.5.2 Phương pháp RT Realtime-PCR

1.5.2.1 Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction)

Phản ứng chuỗi polymerase (polymease chain reaction, PCR) được Karl Mullis

và cộng sự phát minh vào năm 1985 đã đưa đến một cuộc cách mạng trong di truyền học[2]

Nguyên tắc

Các enzyne DNA polymerrase có khả năng tổng hợp một mạch mới từ khuôn (đoạn DNA đích) nhờ một mồi (là một trình tự nucleotic ngắn) bắt cặp bổ sung với một trình tự trên DNA đích Độ dài của đoan DNA mới tổng hợp) được giới hạn giữa hai đoan mồi xuôi (sense prime) và mồi ngược (antisense primer) [5]

Bước 2: Giai đoạn bắt cặp: Mồi và mạch khuôn bắt cặp với nhau nhờ nhiệt độ cao được hạ thấp hơn Tm của mồi (thấp hơn Tm của mồi khoảng 5oC) Khoảng nhiệt độ ở giai đoạn này là từ 40-70oC.,tùy thuộc vào Tm của mồi Thời gian từ 30

Bước 3: Giai đoan kéo dài: Nhiệt độ được tăng lên 72oC giúp DNA polymerase

sử dụng vốn là polymerase chịu nhiệt hoạt đông tổng hợp mạch mới Thời gian tùy thuộc độ dài của trình DNA cần khuếch đại, thường kéo dài 30 giây đến nhiều phút[4]

Một chu kỳ gồm 3 bước trên sẽ được lặp đi lặp lại nhiều lần, và mỗi lần làm tăng gấp đôi lượng mẫu từ trước Do đó phản ứng PCR có khả năng làm tăng số lượng bản mẫu theo 2n (n là số chu kỳ của phản ứng) [4]

Hình 1.7 Ba bước hoạt động trong một chu kì của phản ứng PCR Các thành phần và ảnh hưởng của chúng đến hiệu quả của phản ứng PCR: DNA mẫu (DNA template)

DNA mẫu là khuôn ban đầu cho phản ứng PCR Nó có thể là DNA mạch đôi hoặc cDNA từ quá trình phiên mã ngược RNA Hàm lượng DNA mẫu trong phản ứng có xu hướng giảm dần với việc sử dụng các polymerase cho hiệu quả cao Việc giẩm hàm lượng mẫu còn hạn chế sự khuếch đại “kí sinh” tạo ra sản phẩm không mong muốn. [3]

Mồi (primer)

Mồi là chỉ tiêu quan trọng nhất để đạt được một sự khuếch đại đặc trưng và có hiệu quả cao Việc chon mồi là giai đoạn quyết định của phương pháp PCR, và phải tuân theo một số nguyên tắc về trình tự hai mồi, Tm của hai mồi, độ dài đoạn

khuếch đại[5]

Enzyme

Hiện nay enzyme được sử dụng trong phản ứng PCR là Taq polymerase Enzyme

này không bị phá hủy ở nhiệt độ biến tính và xúc tác quá trình tổng hợp từ đầu đến cuối phản ứng Thông thường hàm lượng enzyme được sử dụng trong phản ứng PCR (thể tích 25 -50 µl) là 0.5-2.5 đơn vị[4]

Nồng độ MgCl 2

Trong phản ứng PCR, MgCl2 đóng vai trò cà cofactor cho DNA polymearase hoạt động Ngoài ra, các thành phần khác cũng có khả năng liên kết với Mg++, vì vậy nồng độ tối ưu phải xác định cho từng loại phản ứng qua nhiều thí nghiệm[5]

dNTPs (2'deoxy nucleotide 5'triphosphate)

Bốn loại nucleotide (dATP, dCTP, dGTP, và dTTP) thương được dùng ở nồng độ 200µM cho mỗi loại Nồng độ quá cao sẽ dẫn đến sự khuếch đại ký sinh Sự mất cân băng trong thành phần các nucleotide lại làm tăng các lỗi sao chép của polymerase[4]

1.5.2.2 Phương pháp Realtime-PCR

Realtime-PCR là phương pháp cho phép khuếch đại và xác đính số lượng các chuỗi DNA được tạo ra trong từng chu kỳ nhiệt Sau mỗi chu kỳ nhiệt số lượng các bản sao DNA được tổng hợp tăng lên sẽ cho các tín hiệu phát quang tăng tỷ lệ thuận và sẽ được ghi nhận.[4]

Real-time PCR sử dụng Taqman probe chất phát huỳnh quang

Probe được đích là "đoạn dò", đó là những đoạn oligonucleotides sợi đơn có trình

tự có thể bắt cặp bổ sung với một trình tự đặc hiệu trên DNA đích (trong PCR, đó

là sản phẩm khuếch đại đặc hiệu từ DNA đích) Sử dụng probe làm chất phát huỳnh quang dựa trên nguyên tắc là khi có mặt sản phẩm khuếch đại đặc hiệu trong ống phản ứng thì sẽ có sự bắt cặp của probe lên trình tự đặc hiệu của sản phẩm khuếch đại, và khi có sự bắt cặp này thì sẽ có sự phát huỳnh quang từ ống phản ứng khi nó nhận được nguồn sáng kích thích[4]

Taqman probe là những đoạn oligonucleotides có trình tự bổ sung với một trình

có gắn chất phát huỳnh quang (gọi là reporter) còn đầu 3' có gắn chất hấp phụ tương ứng (gọi là quencher) để hấp phụ được ánh sáng huỳnh quang được phát ra

từ reporter Có 2 loại quencher đó là quencher phát huỳnh quang và quencher phát nhiệt

- Quencher phát huỳnh quang: là quencher khi hấp phụ ánh sáng huỳnh quang từ reporter sẽ chuyển năng lượng hấp phụ được thành ánh sáng, do vậy quencher sẽ phát ra huỳnh quang nhưng không đến được cảm biến quang vì bị cản trở lại bởi kính lọc chỉ dành cho ánh sáng phát huỳnh quang phát ra từ reporter

- Quencher phát nhiệt là quencher sẽ chuyển năng lượng hấp phụ được thành nhiệt[4]

Bảng 1.3 Các reporter hiện nay đang được các nhà nghiên cứu sử dụng cùng với bước sóng kích thích, huỳnh quang phát ra và quencher tương ứng [4]

Nguyên tắc kĩ thuật Realtime PCR sử dụng Taqman probe [4]

Enzyme Taq polymerase có hoạt tính 5'-3' exonuclease để có khả năng thủy giải

cắt bỏ probe khi probe này bắt cặp lên sợi khuôn và cản đầu 3' của mồi khi enzyme kéo dài mồi tổng hợp sợi bổ sung Cơ chế phát huỳnh quang của Taqman probe trong các chu trình nhiệt có thể tóm tắt như sau:

- Khi chưa có sự xuât hiện của sản phẩm khuếch đại đặc hiệu từ DNA đích thì Taqman probe vẫn còn nguyên vẹn do vậy mà huỳnh quang phát ra được từ repoter ở đầu 5' sẽ bị quencher ở đầu 3' của probe hấp phụ, ống thử nghiệm sẽ không phát được huỳnh quang khi nhận được nguồn sáng kích thích

- Khi bắt đầu có sự xuất hiện của sản phẩm khuếch đại đặc hiệu thì Taqman

sẽ bị enzyme Taq polymerase cắt bỏ để kéo dài mồi tổng hợp trên sợi bổ sung, do

vậy mà reporter của Taqman probe sẽ bị cắt rời xa quencher và phát được huỳnh quang khi nhận được nguồn sáng kích thích Càng nhiều sản phẩm khuếch đại xuất hiện thì số lượng reporter tự do sẽ càng nhiều, đến một lúc nào đó cường độ huỳnh quang phát ra từ reporter đủ mạnh thì máy sẽ ghi nhận được tín hiệu huỳnh quang phát ra từ ống phản ứng khi nhận được nguồn sáng kích thích[4]

Hình 1.8 Tóm tắt cơ chế hoạt động của Taqman probe trong Real-time PCR [4]

Thiết kế mồi và Taqman probe [6]

Trong real-time PCR dùng Taqman probe thì nên thiết kế mồi có nhiệt độ nóng