Xác định cơ sở phân tử của bệnh cao cholesterol trong máu có tính chất gia đình liên quan đến gen LDLR (low density lipoprotein receptor)

Do đó, việc xác định một số yếu tố nguy cơ liên quan đến bệnh FH trên bệnh nhân Việt Nam, cụ thể là tính chất đột biến điểm trên gen LDLR có ý nghĩa khoa học, thiết thực đối với việc ti

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP HỒ CHÍ MINH

KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP

Tên chuyên đề:

XÁC ĐỊNH CƠ SỞ PHÂN TỬ CỦA BỆNH CAO CHOLESTEROL TRONG MÁU CÓ TÍNH CHẤT GIA ĐÌNH LIÊN QUAN ĐẾN

GEN LDLR (LOW DENSITY LIPOPROTEIN

RECEPTOR)

KHOA: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

CHUYÊN NGÀNH: VI SINH - SINH HỌC PHÂN TỬ

GVHD: PGS TS LÊ HUYỀN ÁI THUÝ

ThS TRƯƠNG KIM PHƯỢNG SVTH: NGUYỄN THỊ NGỌC MỸ MSSV: 1153010494

KHOÁ: 2011 - 2015

Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 05 năm 2015

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP HỒ CHÍ MINH

KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP

Tên chuyên đề:

XÁC ĐỊNH CƠ SỞ PHÂN TỬ CỦA BỆNH CAO CHOLESTEROL TRONG MÁU CÓ TÍNH CHẤT GIA ĐÌNH LIÊN QUAN ĐẾN

GEN LDLR (LOW DENSITY LIPOPROTEIN

RECEPTOR)

KHOA: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

CHUYÊN NGÀNH: VI SINH - SINH HỌC PHÂN TỬ

GVHD: PGS TS LÊ HUYỀN ÁI THUÝ

ThS TRƯƠNG KIM PHƯỢNG

MSSV: 1153010494 KHOÁ: 2011 - 2015

Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 05 năm 2015

Chuyên Đề KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP

SVTH: NGUYỄN THỊ NGỌC MỸ Trang i

LỜI CẢM ƠN

Đầu tiên, em xin gửi lời cảm ơn đến quý thầy cô trong khoa Công Nghệ Sinh Học trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh và quý thầy cô chuyên ngành Vi sinh - Sinh học phân tử đã tận tình dạy bảo, truyền đạt cho em những kiến thức, kinh nghiệm trong suốt thời gian qua

Em xin chân thành cảm ơn PGS.TS Lê Huyền Ái Thuý, ThS Lao Đức Thuận - phụ trách, nghiên cứu và làm việc tại phòng thí nghiệm Sinh học phân tử, các anh chị và các bạn làm khoá luận tại Phòng đã tạo điều kiện thuận lợi và giúp

đỡ em tận tình trong suốt thời gian khoá luận tốt nghiệp

Đặc biệt, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến ThS Trương Kim Phượng

đã hết lòng giúp đỡ, trực tiếp hướng dẫn em trong suốt quá trình làm thực tập tốt nghiệp Cô đã chỉ dạy em không chỉ nhiều kiến thức bổ ích mà còn tinh thần làm việc, thái độ nghiên cứu khoa học nghiêm túc và hiệu quả

Sau cùng, con xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến Cha Mẹ và gia đình đã nuôi dưỡng, dạy bảo để con có được ngày hôm nay Xin cảm ơn anh chị em trong gia đình, bạn bè đã động viên, giúp đỡ trong quá trình học tập và hoàn thành khoá luận tốt nghiệp

Xin Chân Thành Cảm Ơn!

Sinh viên

Nguyễn Thị Ngọc Mỹ

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

ApoB Apolipoprotein B - 100

ApoE Apolipoprotein E

BLAST Basic Local Alignment Search Tool

CHD Coronary Heart Disease

CVD Cardiovascular Disease

DGGE Denaturing Gradient Gel Electrophoresis

DNA Deoxyribonucleic Acid

FH Familial Hypercholesterolemia

HDL High Density Lipoprotein

heFH heterozygous Familial Hypercholesterolemia

hoFH homozygous Familial Hypercholesterolemia

LDL Low Density Lipoprotein

LDLR Low Density Lipoprotein Receptor

LDLRAP1 LDLR adaptor protein 1

MLPA Multiplex Ligation – dependent Probe Amplification

NCBI National Center for Biotechnology Information

NIH National Institutes of Health

PCR Polymerase Chain Reaction

PCSK9 Proprotein convertase subtilisin/kexin type 9

RER Rough Endoplasmic Reticulum

SRE Steroid Response Element

SREBP Steroid Response Element Binding Protein

SSCP Single – Strand Conformation Polymorphism

Chuyên Đề KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP

SVTH: NGUYỄN THỊ NGỌC MỸ Trang iii

DANH MỤC BẢNG

Bảng II.1 Thành phần phản ứng PCR với bộ mồi LDLR13_F và LDLR13_R 19

Bảng II.2 Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR với bộ mồi LDLR13_F và LDLR13_R .19

Bảng III.1 Số lƣợng công trình nghiên cứu đƣợc thu thập từ PubMed (NCBI) 21

Bảng III.2 Các công trình nghiên cứu về bệnh FH trên NCBI 22

Bảng III.3 Các dạng đột biến điểm trên gen LDLR thu thập đƣợc trên thế giới 23

Bảng III.4 Số dạng đột biến điểm trên gen LDLR ở các châu lục 25

Bảng III.5 Các dạng đột biến điểm trên gen LDLR ở các quốc gia trên thế giới 26

Bảng III.6 Số dạng đột biến điểm trên các exon gen LDLR 28

Bảng III.7 Cơ sở dữ liệu gen LDLR đƣợc thu thập trên NCBI 31

Bảng III.8 Các bộ mồi khuếch đại vùng trình tự exon 4 33

Bảng III.9 Thông số chi tiết các cặp mồi khuếch đại exon 4 thu thập đƣợc 34

Bảng III.10 Một số thông số vật lý của bộ mồi 38

Bảng III.11 Giá trị đo mật độ quang của 6 mẫu bệnh phẩm 39

Bảng III.12 Tổng hợp kết quả gải trình tự exon 4 gen LDLR 50

Bảng VI.1 Số lƣợng đột biến trên exon của gen LDLR 64

Bảng VI.2 Kết quả đánh giá độ đặc hiệu của bộ mồi LDLR13 bằng Annhyb…….78

Bảng VI.3 Thông số của các mẫu bệnh phẩm thu thập đƣợc……… 79

DANH MỤC HÌNH

Hình I.1 Con đường chuyển hóa của thụ thể LDL [27] 4

Hình I.2 Xơ vữa động mạch [75] 5

Hình I.3 Một số biểu hiện ở bệnh nhân FH [57] 8

Hình I.4 Vị trí gen LDLR trên nhiễm sắc thể số 19 (Genecards) 9

Hình I.5 Các vùng chức năng của thụ thể LDL [7] 10

Hình III.1 Tỉ lệ đột biến gen LDLR trên exon 4 29

Hình III.2 Biểu đồ thể hiện các phương pháp xác định đột biến trên gen LDLR 30

Hình III.3 Đánh giá độ tương đồng của trình tự gen LDLR bằng công cụ Bioedit 32 Hình III.4 Khảo sát độ đặc hiệu của mồi LDLR13_F bằng công cụ BLAST 36

Hình III.5 Khảo sát độ đặc hiệu của mồi LDLR13_R bằng công cụ BLAST 37

Hình III.6 Xác định vị trí bắt cặp của mồi LDLR13_F và LDLR13_R bằng công cụ Annhyb 37

Hình III.7 Kết quả điện di sản phẩm khuếch đại gen LDLR với bộ mồi LDLR13_F và LDLR13_R 40

Hình III.8 Kết quả điện di khuếch đại gen LDLR với bộ mồi LDLR13_F và LDLR13_R 40

Hình III.9 Kết quả khảo sát mức độ tương đồng trình tự A2F bằng công cụ BLAST .44

Hình III.10 Một số vị trí nghi ngờ xuất hiện đột biến điểm trên trình tự A2F 44

Hình III.11 Kết quả khảo sát mức độ tương đồng trình tự A6F bằng công cụ BLAST 45

Hình III.12 Sắp gióng cột trình tự A6F với NM_000527.4 bằng công cụ BioEdit 45 Hình III.13 Kết quả khảo sát mức độ tương đồng trình tự A7F bằng công cụ BLAST 46

Hình III.14 Sắp gióng cột trình tự A7F với NM_000527.4 bằng công cụ BioEdit 46 Hình III.15 Kết quả khảo sát mức độ tương đồng trình tự A1F bằng công cụ BLAST 47

Hình III.16 Một số vị trí xuất hiện đột biến điểm trên trình tự A1F 47

Chuyên Đề KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP

SVTH: NGUYỄN THỊ NGỌC MỸ Trang v

Hình III.17 Kết quả khảo sát mức độ tương đồng trình tự A3F bằng công cụ

BLAST 48

Hình III.18 Một số vị trí xuất hiện đột biến điểm trên trình tự A3F 48

Hình III.19 Kết quả khảo sát mức độ tương đồng trình tự A4F bằng công cụ BLAST 49

Hình III.20 Một số vị trí xuất hiện đột biến điểm trên trình tự A4F 49

Hình VI.1 Tỉ lệ đột biến trên exon của gen LDLR [49] 64

Hình VI.2 Mức độ tương đồng của trình tự NG_009060 và NM_000527.4 65

Hình VI.3 Kết quả khảo sát độ tương đồng của trình tự NG_009060.1 bằng công cụ BLAST 65

Hình VI.4 Kết quả khảo sát độ tương đồng của trình tự NM_000527.4 bằng công cụ BLAST 66

Hình VI.5 Đánh giá IDT trình tự mồi LDLR13_F 67

Hình VI.6 Đánh giá IDT trình tự mồi LDLR13_R 68

Hình VI.7 Kết quả khảo sát độ đặc hiệu của trình tự mồi LDLR13_R bằng công cụ BLAST 68

Hình VI.8 Kết quả giải trình tự mẫu A1 71

Hình V.9 Kết quả giải trình tự mẫu A2 72

Hình V.10 Kết quả giải trình tự mẫu A3 73

Hình V.11 Kết quả giải trình tự mẫu A4 74

Hình V.12 Kết quả giải trình tự mẫu A6 75

Hình V.13 Kết quả giải trình tự mẫu A7 76

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

PHẦN I TỔNG QUAN 3

I.1 TỔNG QUAN VỀ CAO CHOLESTEROL 3

I.1.1 Cholesterol 3

I.1.2 Bệnh rối loạn mỡ máu (Dyslipidemia) 4

I.1.2.1 Khái niệm 4

I.1.2.1 Nguyên nhân 4

I.1.2.1 Dấu hiệu và triệu chứng 5

I.1.2.1 Chẩn đoán 6

I.1.3 Bệnh cao cholesterol có tính gia đình (Familial Hypercholesterolemia) 6

I.1.3.1 Khái niệm 6

I.1.3.1 Đột biến gen và bệnh FH 7

I.1.3.1 Chẩn đoán 8

I.2 TỔNG QUAN VỀ GEN LDLR 9

I.2.1 Gen LDLR 9

I.2.2 Protein LDLR 9

I.2.3 Thụ thể LDL 10

I.2.4 Các dạng ảnh hưởng của gen LDLR đến thụ thể LDL 11

I.3 KỸ THUẬT XÁC ĐỊNH ĐỘT BIẾN TRÊN GEN LDLR 12

I.3.1 Giải trình tự tự động: 12

I.3.2 Single Strand Conformation Polymorphism - SSCP 13

I.4 MỘT SỐ CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU VỀ BỆNH CAO CHOLESTEROL CÓ TÍNH GIA ĐÌNH 13

PHẦN II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15

II.1 VẬT LIỆU 15

II.1.1 Các công cụ tin sinh học: 15

Chuyên Đề KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP

SVTH: NGUYỄN THỊ NGỌC MỸ Trang vii

II.1.2 Các trang web sử dụng: 15

II.1.3 Mẫu bệnh phẩm 15

II.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15

II.2.1 Khai thác dữ liệu 15

II.2.2 Khảo sát in silico gen LDLR 16

II.2.2.1 Thu thập trình tự gen, xác định cấu trúc gen LDLR 16

II.2.2.1 Đánh giá bộ mồi thu thập được 16

II.2.3 Khảo sát thực nghiệm 16

II.2.3.1 Tách chiết DNA 16

II.2.3.1 Kiểm tra chất lượng DNA thu nhận được 17

II.2.3.1 Phương pháp điện di 19

II.2.3.1 Phương pháp giải trình tự 20

PHẦN III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 21

III.1 KHAI THÁC DỮ LIỆU 21

III.1.1 Nguồn dữ liệu về bệnh FH 21

III.1.2 Dữ liệu dạng đột biến điểm trên gen LDLR ở các quốc gia, châu lục 22

III.1.3 Tính chất đột biến điểm trên các exon thuộc gen LDLR 27

III.2 KHẢO SÁT IN SILICO GEN LDLR 31

III.2.1 Thu thập trình tự gen, xác định cấu trúc gen LDLR 31

III.2.2 Đánh giá bộ mồi khuếch đại exon 4 trong xác định đột biến trên gen LDLR liên quan đến bệnh FH 32

III.3 KHẢO SÁT THỰC NGHIỆM 39

III.3.1 Tách chiết DNA 39

III.3.2 Kết quả phản ứng PCR và điện di 39

III.3.3 Phân tích kết quả giải trình tự 41

PHẦN IV KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 52

IV.1 Kết luận 52

IV.1.1 Khai thác dữ liệu 52

IV.1.2 Khảo sát in silico 52

IV.1.3 Khảo sát thực nghiệm 52

IV.2 Kiến nghị 53

TÀI LIỆU THAM KHẢO 54

PHỤ LỤC 64

Chuyên Đề KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP

SVTH: NGUYỄN THỊ NGỌC MỸ Trang 1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Cao cholesterol máu có tính gia đình (Familial hypercholesterolaemia, FH) là dạng rối loạn di truyền mang tính trội trên nhiễm sắc thể số 19, ảnh hưởng đến quá trình chuyển hóa lipoprotein mật độ thấp (Low Density Lipoprotein, LDL), đặc trưng bởi nồng độ cholesterol LDL trong máu cao bất thường từ 190 mg/ dL đến hơn 450 mg/dL [48] Hằng năm, trên thế giới ước tính có hơn 10 triệu người mắc bệnh FH và 200.000 người chết do bệnh tim mạch vành [53]

FH thể dị hợp có tỉ lệ mắc bệnh là 1:500 dân số thế giới và phổ biến hơn ở một số cộng đồng người Afikan ở Nam Phi và người Canada gốc Pháp [13] Cholesterol lắng đọng trong các cơ quan và nội tạng dẫn đến các biểu hiện đặc trưng của bệnh như: tích tụ các khối xanthomas ở gân (Tendon Xanthomas), cung giác mạc (Corneal Arcus) hoặc tích tụ cholesterol ở thành động mạch, làm tăng nguy cơ mắc bệnh tim mạch vành (Coronary Heart Disease, CHD) trước 50 tuổi ở nam giới và trước 60 tuổi ở nữ giới [39] FH thể đồng hợp có tỉ lệ mắc bệnh là 1:1.000.000 dân số thế giới, dẫn đến xuất hiện các khối xanthomas ở gân, cung giác mạc, bệnh tim mạch từ khi mới sinh hoặc bị nhồi máu cơ tim, đột quỵ và có khả năng dẫn đến tử vong trước 30 tuổi [13]

Một trong những nguyên nhân gây ra bệnh FH là tính chất đột biến điểm trên

gen LDLR (Low Density Lipoprotein Receptor) [61], với tỷ lệ mắc bệnh là 85 - 90%

[9] Gen LDLR nằm trên vị trí 19p13.1 – 19p13.3, gồm 18 exon và 17 intron [16],

mã hóa cho thụ thể LDL tham gia vào quá trình chuyển hóa cholesterol, acid béo trong máu và ở tế bào [32] Một số công trình ngiên cứu trên thế giới đã xác định

khoảng 1.200 – 1.700 dạng đột biến trên gen LDLR liên quan đến bệnh FH [48,32]

Trên thế giới cũng có nhiều nghiên cứu nhằm xác định tính chất đột biến

điểm trên gen LDLR Năm 1938, Muller và cộng sự ghi nhận bệnh cao cholesterol

có tính chất gia đình là dạng rối loạn di truyền trong quá trình chuyển hóa lipoprotein [61] Năm 1986, Brown và cộng sự (1986) phát hiện nguyên nhân dẫn

đến bệnh FH là do các dạng đột biến trên gen LDLR [15] Sau đó, công trình nghiên

cứu của nhóm Humphries và cộng sự (2014) phân tích các dạng đột biến điểm trên

gen LDLR bằng phương pháp PCR kết hợp giải trình tự [40] Tuy nhiên, hiện nay

có rất ít công bố đề cập đến vấn đề di truyền phân tử của bệnh FH tại Việt Nam

Do đó, việc xác định một số yếu tố nguy cơ liên quan đến bệnh FH trên bệnh

nhân Việt Nam, cụ thể là tính chất đột biến điểm trên gen LDLR có ý nghĩa khoa

học, thiết thực đối với việc tiên lượng, chẩn đoán và điều trị của bệnh FH Vì vậy,

chúng tôi thực hiện chuyên đề khoá luận tốt nghiệp: “Xác định cơ sở phân tử của

bệnh cao cholesterol trong máu có tính chất gia đình liên quan đến gen LDLR

(Low Density Lipoprotein Receptor)”

o Mục tiêu:

Xác định cơ sở phân tử (tính chất đột biến điểm) trên gen LDLR liên quan

đến bệnh cao cholesterol có tính chất gia đình

o Nội dung nghiên cứu:

 Thu thập dữ liệu về cơ sở phân tử của bệnh FH, tập trung vào tính chất đột

biến điểm nổi trội trên các exon thuộc gen LDLR liên quan đến bệnh FH trên

thế giới và ở Việt Nam

 Khảo sát in silico bộ mồi của quy trình PCR kết hợp giải trình tự nhằm xác

định tính chất đột biến điểm nổi trội ở gen LDLR liên quan đến bệnh FH

 Thực hiện quy trình PCR kết hợp giải trình tự nhằm xác định đột biến điểm

nổi trội trên gen LDLR ở Việt Nam, cụ thể trên các mẫu bệnh phẩm cao

cholesterol của một số bệnh viện thuộc khu vực Thành phố Hồ Chí Minh

PHẦN I.

TỔNG QUAN

Chuyên Đề KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP

SVTH: NGUYỄN THỊ NGỌC MỸ Trang 3

PHẦN I TỔNG QUAN I.1 TỔNG QUAN VỀ CAO CHOLESTEROL

I.1.1 Cholesterol

Cholesterol (Cholest-5-en-3β-ol) là một thành viên của nhóm hợp chất polycyclic (sterols), được xác định lần đầu tiên vào thế kỉ 17 Cholesterol là thành phần thiết yếu cho hoạt động của tế bào động vật, là tiền chất tham gia sản xuất acid mật, hormone tuyến thượng thận, tuyến sinh dục và vitamin D, được tìm thấy trong hầu hết tế bào của cơ thể 25 - 30% cholesterol được cung cấp cho cơ thể thông qua chế độ ăn uống và 70 - 75% được tổng hợp ở gan [39]

Cholesterol là dạng lipid không phân cực (không hoà tan trong nước) nên được vận chuyển trong huyết tương bởi các dạng lipoprotein: lipoprotein mật độ thấp (Low - Density Lipoproteins, LDL) và lipoprotein mật độ cao (High - Density Lipoproteins, HDL) [36]

Cholesterol HDL còn được gọi là "cholesterol tốt" Hạt HDL là những lipoprotein có kích thước nhỏ nhất, có chức năng vận chuyển cholesterol từ các cơ quan về gan để bài tiết và tổng hợp acid mật Nồng độ cholesterol HDL trong máu cao làm giảm nguy cơ mắc các bệnh tim mạch [61]

Cholesterol LDL còn được gọi là "cholesterol xấu", có chức năng vận chuyển cholesterol từ gan đến cung cấp cho các cơ quan khác và từ các cơ quan khác về gan để bài tiết và tổng hợp acid mật, chủ yếu là tuyến thượng thận và các

mô mỡ [39] Nồng độ cholesterol LDL trong máu cao làm gia tăng nguy cơ nhồi máu cơ tim và mắc các bệnh tim mạch Những bệnh nhân mắc bệnh cao cholesterol máu có tính gia đình có nồng độ cholesterol LDL trong máu cao do cholesterol LDL không được chuyển hoá hoặc chỉ được chuyển hoá một phần ở gan [61]

Nồng độ cholesterol LDL trong máu thông thường ở 200 mg/dL, nồng độ cholesterol LDL máu từ 200 - 239 mg/dL được xem là vượt giới hạn và nồng độ cholesterol LDL máu lớn hơn 240 mg/dL được xem là cao cholesterol máu

Cân bằng cholesterol nội bào được điều hoà thông qua con đường thụ thể LDL (LDL Receptor) Thụ thể LDL được tổng hợp ở lưới nội chất, sau đó được xử

lý ở bộ máy Golgi và được vận chuyển đến bề mặt tế bào Thụ thể LDL liên kết đặt hiệu với các hạt LDL tại vị trí ApoB hình thành phức hợp thụ thể - LDL và xâm nhập vào bên trong tế bào 75% hạt LDL được hấp thụ ở gan Các túi nội bào liên kết với lysosome thoái hoá apoprotein, thuỷ phân ester cholesterol thành cholesterol

tự do và vận chuyển đến màng tế bào khi cần thiết Cuối cùng, cholesterol được bài tiết ở mật dưới dạng cholesterol tự do hoặc tổng hợp thành acid mật ở gan [39]

Hình I.1 Con đường chuyển hóa của thụ thể LDL [27]

I.1.2 Bệnh rối loạn mỡ máu (Dyslipidemia)

I.1.2.1 Khái niệm

Rối loạn mỡ máu là tình trạng tăng nồng độ cholesterol, triglyceride, cholesterol LDL hoặc giảm nồng độ cholesterol HDL trong huyết tương dẫn đến rối loạn quá trình chuyển hoá cholesterol trong cơ thể, tích tụ cholesterol ở các cơ quan dẫn đến xơ vữa động mạch [44]

I.1.2.1 Nguyên nhân

Rối loạn mỡ máu có thể do 2 nguyên nhân chính: nguyên nhân tiên phát (rối loạn di truyền) và nguyên nhân thứ phát (thói quen sinh hoạt, chế độ ăn uống, ảnh hưởng của một số bệnh lý khác, ) [25]

Chuyên Đề KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP

I.1.2.1 Dấu hiệu và triệu chứng

Rối loạn mỡ máu thường không có các dấu hiệu và triệu chứng đặc trưng, chủ yếu là do xơ vữa động mạch hình thành các mảng bám trên thành động mạch làm hẹp động mạch và hạn chế dòng chảy của máu về tim Theo thời gian, diện tích mảng xơ vữa vỡ ra hình thành cục máu đông trên bề mặt của mảng bám hoặc chặn hoàn toàn dòng chảy của máu về tim dẫn đến đau thắt ngực hoặc đau tim [72] Nếu không chữa trị kịp thời có thể dẫn đến xơ vữa động mạch, nhồi máu cơ tim và tử vong Bên cạnh đó cholesterol và các chất béo còn tích tụ bên ngoài cơ thể hình thành các khối "xantholamas" ở mắt hoặc cung giác mạc, "xanthomas" ở gân, khuỷ tay hoặc khớp gối [39]

Hình I.2 Xơ vữa động mạch [75]

Rối loạn mỡ máu tiên phát với các dấu hiệu lâm sàng như: xơ vữa động mạch trước tuổi 50 ở nam giới và trước tuổi 60 ở nữ giới, tiền sử gia đình có người mắc bệnh động mạch vành hoặc nồng độ cholesterol trong máu lớn hơn 240 mg/ dL (6.2 mmol/ L) [44]

I.1.2.1 Chẩn đoán

Phương pháp chẩn đoán bệnh rối loạn mỡ máu thường được dựa vào các chỉ số: cholesterol toàn phần (Total cholesterol), Triglyceride (TG), cholesterol HDL, cholesterol LDL,

I.1.3 Bệnh cao cholesterol có tính gia đình (Familial Hypercholesterolemia)

I.1.3.1 Khái niệm

Bệnh cao cholesterol máu có tính gia đình là một dạng rối loạn di truyền chủ yếu trên nhiễm sắc thể thường (nhiễm sắc thể số 19) [1], ảnh hưởng đến quá trình chuyển hoá lipoprotein mật độ thấp (Low Density Lipoprotein, LDL), với biểu hiện nồng độ cholesterol LDL lưu thông trong máu cao gấp nhiều lần so với người bình thường (lớn hơn 200 mg/dL) [39,18]

Bệnh FH dẫn đến cholesterol lắng đọng trong các mô và cơ quan gây xơ vữa động mạch, dẫn đến các bệnh về tim mạch, bệnh u vàng gân, [14,20,27] làm tăng nguy cơ mắc bệnh tim mạch vành sớm (20 - 39 tuổi) gấp 100 lần so với người bình thường [14,63] Ước tính trên toàn thế giới có hơn 10.000.000 người mắc bệnh FH

và 200.000 người chết mỗi năm do bệnh tim mạch vành [38,53]

Bệnh FH ở thể đồng hợp tử (homozygous, hoFH) và FH thể dị hợp tử (heterozygous, heFH) Bệnh nhân mắc bệnh FH thể đồng hợp tử (homozygous, hoFH) có chỉ số cholesterol tổng trong khoảng 650 - 1.000 mg/dL (17 - 26 mmol/L)

và chỉ số cholesterol LDL trong máu lớn hơn 600mg/dL (15.5mmol/L) Bệnh nhân mắc bệnh FH thể dị hợp tử (heterozygous, heFH) có chỉ số cholesterol tổng trong khoảng 350 - 550 mg/dL (9 - 14 mmol/L) và cholesterol LDL trong máu lớn hơn

200 mg/dL (5 mmol/L) ảnh hưởng đến 1:500 dân số thế giới [1,18]

Cholesterol LDL tích tụ trong các cơ quan và nội tạng dẫn đến một số biểu hiện: tích tụ các khối xanthomas ở gân (Tendinous) và cung giác mạc (Corneal

Chuyên Đề KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP

SVTH: NGUYỄN THỊ NGỌC MỸ Trang 7

Arcus) hoặc tích tụ trong động mạch gây ra các triệu chứng của bệnh tim mạch (Cardiovascular Disease, CVD) trước tuổi trung niên ở cả nam giới (40 - 50 tuổi) và

nữ giới (50 - 60 tuổi) [1]

I.1.3.1 Đột biến gen và bệnh FH

Dựa trên các công trình nghiên cứu của Müller và cộng sự (1938), Brown (1968), Ajmal (2010), xác định bệnh FH xảy ra là do các dạng đột biến điểm trên

gen LDLR (Low Density Lipoprotein Receptor), ApoB (Apolipoprotein B), PCSK9 (Pro - protein convertase subtilisin/kexin 9) [1]

Hiện nay, có hơn 1700 dạng đột biến điểm ở gen LDLR liên quan đến bệnh

FH đã được xác định [11,1] Các dạng đột biến dị hợp tử trong những gen này có thể dẫn đến sự gia tăng gấp 2 - 3 lần nồng độ cholesterol LDL trong huyết tương và làm gia tăng nguy cơ mắc các bệnh tim mạch so với người bình thường [11].Công

bố nghiên cứu của Fouchier và cộng sự (2011) xác định nguyên nhân phổ biến nhất gây ra bệnh cao cholesterol có tính gia đình là do các dạng đột biến điểm ở gen

LDLR, ảnh hưởng đến quá trình vận chuyển cholesterol LDL trong máu [6]

Các dạng đột biến điểm trên gen ApoB làm mất khả năng liên kết của các hạt

LDL với thụ thể LDL trên bề mặt tế bào dẫn đến nồng độ cholesterol LDL lưu thông trong máu cao [1] Năm 1999, nhóm nghiên cứu của Fisher và cộng sự đã xác định đột biến R3500Q ở 21 bệnh nhân được khảo sát và 6 bệnh nhân mang đột biến

R3500W trên gen ApoB Đột biến trên gen ApoB không phổ biến bằng đột biến trên gen LDLR [29]

Năm 2003, nghiên cứu của Abifadel và cộng sự đã xác định hai dạng đột

biến trên gen PCSK9 liên quan đến bệnh FH Gen PCSK9 mã hóa cho enzyme

“neural apoptosis regulated convertase 1” tham gia vào quá trình phân hủy protein LDLR trong lysosome của tế bào để ngăn quá trình tái chế LDLR [11] Các dạng

đột biến trên gen PCSK9 được phát hiện năm 2003 dẫn đến mất chức năng gắn kết

và nhập bào của phức hợp LDLR - LDL và giảm khả năng thoái hoá của lysosome [2]

Hình I.3 Một số biểu hiện ở bệnh nhân FH [57]

I.1.3.1 Chẩn đoán

Bệnh FH thường được chẩn đoán dựa trên kết quả xét nghiệm các chỉ số cholesterol trong máu kết hợp với các yếu tố nguy cơ khác như lịch sử gia đình có người thân bị mắc bệnh FH, hút thuốc, huyết áp cao hoặc xuất hiện các khối xanthomas trên cơ thể [1]

Cao cholesterol máu có tính gia đình là bệnh di truyền trội trên nhiễm sắc thể thường, vì vậy những thành viên trong gia đình bệnh nhân là những đối tượng có nguy cơ mắc bệnh cao với tỉ lệ 50% số thành viên trong gia đình có thể bị bệnh [62] Do đó, những thành viên trong gia đình của bệnh nhân nên được xét nghiệm các chỉ số cholesterol trong máu để phát hiện bệnh sớm khi chưa có triệu chứng lâm sàng và kịp thời thực hiện chế độ ăn kiêng và can thiệp bằng thuốc trước khi xuất hiện các triệu chứng tổn thương tim mạch [69]

Chuyên Đề KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP

SVTH: NGUYỄN THỊ NGỌC MỸ Trang 9

I.2 TỔNG QUAN VỀ GEN LDLR

I.2.1 Gen LDLR

Hình I.4 Vị trí gen LDLR trên nhiễm sắc thể số 19 (Genecards)

Gen LDLR (Low Density Lipoprotein Receptor) có kích thước 45 kb, nằm ở

vị trí 19p13.2 trên nhiễm sắc thể số 19, gồm 18 exon và 17 intron, mã hoá cho thụ thể LDL Sản phẩm phiên mã dài 5,3 kb, trong đó vùng không dịch mã dài 2,7 kb,

mã hoá cho chuỗi peptide dài 860 amino acid [28,34]

I.2.2 Protein LDLR

Protein LDLR (160 kD) là một thụ thể nằm trên bề mặt tế bào, đóng vai trò trung gian hấp thụ cholesterol LDL bằng quá trình nhập nội bào, giúp cho LDL trong máu được hấp thu vào gan [23,71] Protein LDLR bao gồm 860 acid amin được sắp xếp trong các vùng "domain" chức năng tương ứng với các exon là: trình

tự tín hiệu ở đuôi amino tận cùng (exon 1), vùng bám với phối tử (exon 2 - 6), vùng

có yếu tố tăng trưởng biểu bì (exon 7 - 14), vùng liên kết với nhóm đường O (exon 15), vùng xuyên màng (exon 16 và 41 bp của exon 17), vùng tế bào chất (phần còn lại của exon 17 và exon 18) [50]

Hình I.5 Các vùng chức năng của thụ thể LDL [7]

I.2.3 Thụ thể LDL

Thụ thể LDL (Low Density Lipoprotein Receptor) là một glycoprotein được tìm thấy trên bề mặt tế bào, có nhiệm vụ gắn kết với ApoB - 100 của cholesterol LDL khi ở trạng thái bình thường Thụ thể LDL được tổng hợp ở lưới nội chất nhám (Rough Endoplasmic Reticulum, RER) và sau đó được vận chuyển đến bộ máy Golgi (Golgi apparatus) để gắn chuỗi carbohydrate tạo thành thụ thể LDL hoàn chỉnh Sau đó, thụ thể LDL hoàn chỉnh được tiếp tục di chuyển và tập trung ở "phần lõm áo" trên bề mặt tế bào Tại đây, thụ thể LDL liên kết với các lipoprotein có

Chuyên Đề KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP

SVTH: NGUYỄN THỊ NGỌC MỸ Trang 11

chứa ApoB - 100, ApoE hoặc ApoB - 100 và ApoE hình thành phức hợp thụ thể - lipoprotein Sau khi phức hợp thụ thể - lipoprotein được gắn với nhau, một loại bọc clathrin được hình thành nhằm đưa phức hợp phối tử - thụ thể vào trong nội bào cùng với các protein khác thông qua tương tác với LDLR adaptor protein 1 (LDLRAP1) Trong tế bào, phức hợp phối tử - thụ thể bị phân tách, cholesterol tự

do được sử dụng bên trong tế bào và thụ thể LDL được phục hồi trên màng tế bào [27]

Cholesterol được xem như là "chìa khoá" trong việc điều hoà quá trình tổng hợp thụ thể LDL Khi nồng độ cholesterol trong tế bào tăng, quá trình tổng hợp thụ thể LDL bị ức chế Ngược lại, khi nồng độ cholesterol trong tế bào giảm, quá trình tổng hợp thụ thể LDL tăng [27] Sự điều hòa sản xuất thụ thể LDL trong nhân theo các con đường: (1) protein Steroid Response Element Binding Protein (SREBP) gắn

kết với Steroid Response Element (SRE) trên DNA kích thích gen LDLR phiên mã

để làm giảm cholesterol nội bào; (2) thụ thể trong nhân trung gian sterol LXR, giúp tạo ra IDOL (Inducible Degrader of the LDLR) kích hoạt quá trình thoái hoá cholesterol LDL Con đường này nhằm đảm bảo sự hấp thu cholesterol LDL trong máu phù hợp với nhu cầu của cơ thể [27]

I.2.4 Các dạng ảnh hưởng của gen LDLR đến thụ thể LDL

Đột biến trên gen LDLR là đột biến phổ biến nhất gây bệnh FH, chiếm

khoảng 70 - 80% trường hợp mắc bệnh FH được chẩn đoán dựa trên các triệu chứng lâm sàng Kể từ khi được phát hiện và nghiên cứu từ năm 1986, số lượng đột biến

gen LDLR gia tăng liên tục Theo cơ sở dữ liệu của Trường Đại học London năm

2008, có tổng cộng 1.066 dạng đột biến trên gen LDLR được phát hiện bao gồm:

689 dạng đột biến thay thế DNA, 260 dạng đột biến tái sắp xếp DNA nhỏ (<100 bp)

và 117 dạng đột biến tái sắp xếp DNA lớn (>100 bp) [50] Đột biến trên gen LDLR

được chia thành 5 nhóm chính [13]:

 Đột biến gen LDLR dẫn đến không tổng hợp được thụ thể LDL trong lưới

nội chất: đây là nhóm đột biến phổ biến nhất, chiếm một nửa số lượng đột

biến đã được phân tích cho đến nay Bệnh nhân dị hợp tử FH chỉ sản xuất được một nửa số lượng thụ thể LDL [13]

 Đột biến gen LDLR dẫn đến tổng hợp thụ thể LDL bất thường: thụ thể LDL

vẫn được tổng hợp nhưng không có khả năng rời khỏi lưới nội chất để đến

bộ máy Golgi Đây là nhóm đột biến phổ biến thứ hai, những thụ thể mang đột biến này không xuất hiện trên bề mặt tế bào, chúng vẫn nằm trong lưới nội chất cho đến khi bị thoái hoá hoàn toàn [15]

 Đột biến gen LDLR dẫn đến sản xuất thụ thể LDL bất thường, thụ thể LDL

được sản xuất có khả năng di chuyển tới bề mặt tế bào, nhưng không gắn được với cholesterol LDL [13,15]

 Đột biến gen LDLR dẫn đến tổng hợp được thụ thể LDL, gắn được với

cholesterol LDL nhưng không tới được những lõm áo ở bề mặt màng tế bào

và do đó không thể vận chuyển LDL vào trong tế bào [13,15]

 Đột biến gen LDLR dẫn tới sản xuất thụ thể LDL bất thường, những thụ thể

này gắn được với cholesterol LDL nhưng khi vào trong tế bào không tách được thụ thể LDL Do đó những thụ thể này không thể quay trở lại màng tế bào [13,15] Mỗi loại đột biến trên làm giảm số lượng hoặc tính chất của thụ thể LDL, do vậy làm giảm số lượng thụ thể LDL trên bề mặt tế bào dẫn đến nồng độ cholesterol lưu thông trong máu cao

I.3 KỸ THUẬT XÁC ĐỊNH ĐỘT BIẾN TRÊN GEN LDLR

Hiện nay, các nghiên cứu trên thế giới đã áp dụng rất nhiều kỹ thuật sinh học

phân tử để xác định đột biến trên gen LDLR liên quan đến bệnh FH

I.3.1 Giải trình tự tự động:

Năm 1977, Maxam và Gillber lần đầu tiên phát minh ra phương pháp giải trình tự gen bằng phương pháp hoá học Nguyên tắc của phương pháp này dựa trên phản ứng hoá học thuỷ giải đặc hiệu, các DNA không xoắn lại, tạo thành một tập hợp nhiều phân đoạn có kích thước khác nhau [43]

Năm 1997, Sanger và cộng sự đã phát triển phương pháp này dựa vào sự tổng hợp mạch bổ sung cho trình tự xác định nhờ hoạt động của enzyme DNA

Chuyên Đề KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP

SVTH: NGUYỄN THỊ NGỌC MỸ Trang 13

polymerase Đến nay, các nucleotide không được đánh dấu bằng đồng vị phóng xạ

mà được đánh dấu bằng các chất phát màu huỳnh quang khác nhau nên các đoạn trình tự cùng kết thúc cùng một loại dNTP sẽ có cùng một màu [31] Vì vậy, phương pháp giải trình tự tự động thường được sử dụng để xác định trình tự nucleotide trên gen mục tiêu hoặc bộ gen nhằm phát hiện các đột biến điểm và các đột biến tái sắp xếp nhỏ dẫn đến bệnh FH [10]

I.3.2 Single Strand Conformation Polymorphism - SSCP

Phương pháp phân tích tính đa hình trong cấu hình sợi đơn DNA (Single Strand Conformation Polymorphism, SSCP) là phương pháp phổ biến và có độ nhạy cao trong phát hiện các đột biến điểm Phương pháp này bao gồm các bước cơ bản: (1) Thực hiện phản ứng PCR khuếch đại vùng gen cần khảo sát; (2) Tiến hành quá trình biến tính sản phẩm PCR mạch đôi thành mạch đơn; (3) Thực hiện phương pháp điện di

Độ nhạy của phương pháp phụ thuộc vào chiều dài đoạn khuếch đại, điều kiện điện di, độ rộng của các lỗ trong gel acrylamide, có hoặc không có glycerol

Bên cạnh đó, một số phương pháp khác được áp dụng trong những nghiên cứu xác định đột biến điểm nói chung và cụ thể là các dạng đột biến điểm liên quan

Năm 1964, nghiên cứu của Fredrickson và cộng sự đã chứng minh rằng bệnh

FH có liên quan đến sự rối loạn chuyển hoá cholesterol LDL [47]

Năm 1986, công trình nghiên cứu của Brown và Goldstein đã xác định được nguyên nhân gây ra các kiểu hình lâm sàng của bệnh FH là do các đột biến điểm

trên gen LDLR [11]

Năm 2003, nghiên cứu của Cao và cộng sự đã xác định 2 dạng đột biến

C122Y và T383I ở exon 4 và 9 của gen LDLR trên bệnh nhân người Trung Quốc

bằng phương pháp PCR kết hợp giải trình tự [19]

Năm 2013, công trình nghiên cứu của Ahmed và cộng sự đã xác định đột biến R105Q gây mất chức năng của thụ thể LDL trên những bệnh nhân xuất hiện các khối xanthomas/xanthelasma hoặc có tiền sử bệnh tim mạch ở quần thể người Pakistan [4]

Năm 2015, nghiên cứu của Jannes và cộng sự đã xác định đặc điểm phân tử của bệnh FH ở 248 bệnh nhân người Brazil xuất hiện các dấu hiệu lâm sàng của

bệnh FH và ghi nhận được 70 dạng đột biến trên gen LDLR, 2 dạng đột biến trên gen ApoB và không tìm thấy dạng đột biến nào trên gen PCSK9 Đồng thời, nhóm tác giả cũng khẳng định các dạng đột biến điểm nổi trội trên gen LDLR tập trung

chủ yếu ở exon 4 và 14 [45]

PHẦN II

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Chuyên Đề KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP

 Mẫu được bảo quản trong các ống bảo quản mẫu và được giữ ở nhiệt độ

-20oC trước khi tiến hành tách chiết DNA

II.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

II.2.1 Khai thác dữ liệu

Dựa trên nguồn dữ liệu của các công cụ trực tuyến (NCBI, NIH, ), chúng tôi tiến hành tìm kiếm các nghiên cứu về bệnh cao cholesterol có tính gia đình trên thế giới với các từ khoá: Familial Hypercholesterolemia, hypercholesterolemia,

cholesterol, HDL, LDL, LDLR receptor, LDLR gene, nhằm mục đích tạo ra bộ dữ liệu về bệnh cao cholesterol có liên quan đến gen LDLR nói riêng và bệnh FH nói

chung

II.2.2 Khảo sát in silico gen LDLR

II.2.2.1 Thu thập trình tự gen, xác định cấu trúc gen LDLR

Chúng tôi thu thập trình tự nucleotide gen LDLR từ ngân hàng gen NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene) tạo bộ dữ liệu về trình tự gen LDLR Bên cạnh

đó, chúng tôi thu thập các trình tự mồi từ các công trình nghiên cứu đã công bố trước đây với tính chuyên biệt với các dạng đột biến nổi trội và vùng exon mang đột

biến nổi trội trên gen LDLR

II.2.2.1 Đánh giá bộ mồi thu thập được

Chúng tôi tiến hành khảo sát lại bộ mồi thu thập được của nhóm nghiên cứu

và đánh giá lại bằng một số công cụ tin sinh học:

 Kiểm tra độ đặc hiệu của bộ mồi với trình tự cần khảo sát và kích thước sản phẩm tạo thành bằng phần mềm Annhyb

 Để đánh giá các cặp mồi, chúng tôi sử dụng phần mềm trực tuyến IDT analyzer (http://www.idtdna.com/analyzer/applications/oligoanalyzer/) nhằm xác định các thông số của mồi như: chiều dài mồi, nhiệt độ nóng chảy, năng lượng hình thành các cấu trúc thứ cấp (cấu trúc kẹp tóc, primer dimer)

 Độ đặc hiệu của mồi được kiểm tra lại bằng chương trình BLAST trên NCBI (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)

II.2.3 Khảo sát thực nghiệm

II.2.3.1 Tách chiết DNA

Chuyên Đề KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP

 Hút 50 μl mẫu máu/huyết tương cho vào ống eppendorf loại 1,5ml

 Thêm 1ml H2O, vortex nhẹ, ly tâm 13.000 vòng trên phút trong 3 phút, thu tủa

 Bổ sung một thể tích dung dịch ly giải gồm: NaCl 0,45M, Tris HCl 10mM (pH=8,2), EDTA 1M (pH=8), SDS 10%

 Hoà trộn nhẹ nhàng, bổ sung 5 μl proteinase K (20 mg/ml), trộn đều Ủ ở nhiệt độ 56oC trong 1 giờ

 Bổ sung một thể tích dung dịch phenol: chloroform (tỉ lệ 1:1), hoà trộn đều

Ly tâm ở nhiệt độ phòng, 13.000 vòng/phút trong 3 phút Thu dịch nổi

 Bổ sung một thể tích Chloroform tương đương với thể tích mẫu Ly tâm ở nhiệt độ phòng, 13.000 vòng/ phút trong 3 phút Thu dịch nổi

 Bổ sung 0,25 lần thể tích NH4OAc 5M và 2,5 lần thể tích Ethanol tuyệt đối (Trữ lạnh) Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 30 phút ở 4oC và thu tủa

 Bổ sung một thể tích Ethanol 70%, ly tâm 13.000 vòng/phút trong 10 phút ở

4oC

 Loại bỏ dịch nổi và để khô tự nhiên

 Bổ sung 50 μl TE (pH=8), bảo quản ở -20oC

II.2.3.1 Kiểm tra chất lượng DNA thu nhận được

 Nguyên tắc:

Hàm lượng DNA có thể xác định được nhờ sự hấp thụ ánh sáng ở bước sóng

260 nm Giá trị mật độ quang OD 260 nm (Optical Density 260 nm) của các mẫu

DNA ghi nhận được cho phép xác định nồng độ DNA trong dung dịch (với A260=1OD=50 μg/ml DNA sợi đôi) Độ tinh sạch của DNA sợi đôi được đánh giá qua tỉ lệ A260/A280.

PCR là một phương pháp in vitro để tổng hợp DNA dựa trên mạch khuôn là

một trình tự đích DNA ban đầu, khuếch đại, nhân số lượng bản sao của DNA mạch khuôn thành hàng triệu bản sao nhờ hoạt động của enzyme Taq polymerase và cặp mồi đặc hiệu

 Thiết bị và hoá chất:

 Máy PCR Bio Rad

 Master mix 2X Fermentas

Chuyên Đề KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP

Bảng II.2 Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR với bộ mồi LDLR13_F và LDLR13_R

Bước Nhiệt độ ( o C) Thời gian Số chu kỳ

 Thiết bị và hoá chất

 Buồng điện di Bio Rad

 Máy đọc gel Bio Rad

 Agarose Bio Basic

 TAE buffer Bio Basic

 Ethidium Bromide Bio Rad

 Thang 50 bp Bio Line

 Loading dye 6X Bio Line

 Các bước tiến hành:

Sử dụng khoảng 5 - 10 μl sản phẩm PCR hoặc DNA bộ gen sau tách chiết tiến hành điện di với gel agarose 1,5 % ở hiệu điện thế 70V trong 30 phút Kết quả điện di được thể hiện thành các băng sản phẩm với chất nhuộm là Ethidium Bromide trên máy đọc gel (thiết bị Gel Doc)

II.2.3.1 Phương pháp giải trình tự

Các mẫu sau khi điện di được các băng sản phẩm có kích thước từ 500 - 600

bp được tiến hành gửi mẫu giải trình tự ở Công ty Nam Khoa Biotek với lượng sản phẩm là 20 μl tương ứng với cặp mồi phù hợp

PHẦN III

KẾT QUẢ - THẢO LUẬN

Chuyên Đề KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP

SVTH: NGUYỄN THỊ NGỌC MỸ Trang 21

PHẦN III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN III.1 KHAI THÁC DỮ LIỆU

Chúng tôi thu thập các công bố nghiên cứu trên thế giới với các từ khoá:

Familial hypercholesterolemia, LDLR mutation, trên PubMed của ngân hàng dữ

liệu NCBI (cập nhật đến tháng 05/2015)

III.1.1 Nguồn dữ liệu về bệnh FH

Chúng tôi thu thập được 70 bài báo khoa học tiếng Anh đề cập đến bệnh cao cholesterol có tính chất gia đình Trong đó, 38 công bố khoa học mô tả thông tin: cholesterol, bệnh cao cholesterol và FH, 14 công trình nghiên cứu về tính chất đột

biến điểm trên gen LDLR liên quan đến bệnh FH, 15 công trình nghiên cứu đề cập đến phương pháp phát hiện đột biến trên gen LDLR (Sequencing, DGGE, MLPA,

Bên cạnh đó, chúng tôi thu thập 22 bài báo khoa học liên quan đến gen

ApoB, 8 bài báo khoa học liên quan đến gen PCSK9 (dữ liệu không trình bày)

III.1.2 Dữ liệu dạng đột biến điểm trên gen LDLR ở các quốc gia, châu lục

Chúng tôi thu thập đƣợc 17 công trình nghiên cứu mô tả các dạng biến thể và

tần số đột biến điểm trên gen LDLR liên quan đến bệnh FH ở các quốc gia và châu

lục (Bảng III.2)

Bảng III.2 Các công trình nghiên cứu về bệnh FH trên NCBI

Dựa vào 17 công trình nghiên cứu, chúng tôi ghi nhận có khoảng 187 dạng

đột biến điểm trên gen LDLR liên quan đến bệnh FH xảy ra phổ biến ở các quốc

gia: Ba Lan, Đức, Ý, Hy Lạp, Hà Lan, Trung Quốc, Mỹ, Liban, Thông tin chi tiết

về các dạng đột biến đƣợc trình bày ở bảng III.3