NGHIÊN cứu THÀNH PHẦN hóa học một số LOÀI cây THUỘC CHI POLYGONUM, họ RAU răm (POLYGONACEAE)

Nhằm mục đích nghiên cứu làm rõ thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của ba loài cây này tại Việt Nam, làm cơ sở khoa học cho những nghiên cứu tiếp theo để tạo ra các sản phẩm chăm s

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

_

Trần Thanh Hà

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC MỘT SỐ LOÀI CÂY

THUỘC CHI POLYGONUM, HỌ RAU RĂM (POLYGONACEAE)

Chuyên ngành: Hóa hữu cơ

Mã số: 62.44.01.14

DỰ THẢO TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC

Hà Nội - 2016

Công trình được hoàn thành tại: khoa Hóa học, Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội và Khoa Hóa Thực Vật, Viện Dược liệu

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Nguyễn Văn Đậu

Phản biện:

Phản biện:

Phản biện:

Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng cấp Đại học Quốc gia chấm luận án tiến sĩ họp tại

vào hồi giờ ngày tháng năm 20

Có thể tìm hiểu luận án tại:

- Thư viện Quốc gia Việt Nam

- Trung tâm Thông tin - Thư viện, Đại học Quốc gia Hà Nội

I GIỚI THIỆU LUẬN ÁN

1 Đặt vấn đề

Điều kiện tự nhiên ưu đãi cho đất nước và con người Việt Nam một hệ sinh thái phong phú và đa dạng, có tiềm năng to lớn về tài nguyên cây thuốc Hệ thực vật ở Việt Nam ước tính có khoảng 13.000 loài với khoảng 11.000 loài thực vật bậc cao, 800 loài rêu, 600 loài nấm và hơn 2000 loài tảo Tính đến nay đã có hơn 3800 loài thực vật bậc cao và bậc thấp được dùng làm thuốc trong y học cổ truyền nhằm kháng khuẩn, kháng nấm, chống viêm nhiễm, chống ung thư, điều hòa miễn dịch, chữa các bệnh liên quan đến tim mạch, diệt côn trùng

Chi Polygonum (họ rau Răm, Polygonaceae) có khoảng 230 loài phân bố chủ yếu ở phía bắc bán cầu

trong đó có Việt Nam Nhiều loài trong chi này được sử dụng trong y học dân gian với công dụng kháng viêm, lưu thông máu, chữa lỵ, lợi tiểu Theo các nghiên cứu đã công bố thành phần hóa học của các loài

thuộc chi Polygonum bao gồm flavonoid, anthraquinon, coumarin, lignan, napthaquinon, polyphenol,

tecpenoid với nhiều tác dụng dược lý đáng chú ý như chống khối u, chống oxy hóa, chống viêm, chống HIV, chống suy giảm miễn dịch và chống côn trùng

Cả ba loài cây thuộc chi Polygonum là cây mễ tử liễu (Polygonum plebeium R Br.), cây thồm lồm gai (Polygonum perfoliatum L.), cây nghể trắng (Polygonum barbatum L.) tuy đã được nghiên cứu trên thế giới

nhưng ở Việt Nam hầu như chưa có công bố nào về thành phần hóa học cũng như hoạt tính sinh học Nhằm mục đích nghiên cứu làm rõ thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của ba loài cây này tại Việt Nam, làm

cơ sở khoa học cho những nghiên cứu tiếp theo để tạo ra các sản phẩm chăm sóc sức khỏe cộng đồng và góp

phần sáng tỏ công dụng chữa bệnh của các dược liệu này, chúng tôi lựa chọn đề tài:: “Nghiên cứu thành

phần hóa học một số loài cây thuộc chi Polygonum, họ Rau răm (Polygonaceae)”

2 Đối tượng nghiên cứu của luận án

Đối tượng nghiên cứu của luận án cụ thể là cây Polygonum perfoliatum L (thồm lồm gai), Polygonum

barbatum L (nghể trắng), Polygonum plebeium R.Br (mễ tử liễu, rau đắng),

3 Những đóng góp mới của luận án

3.1 Lần đầu tiên nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của ba loài thồm lồm gai (P

perfoliatum L.), nghể trắng (P barbatum L.) và mễ tử liễu (P plebeium R.Br.) ở Việt nam Bằng các phương

pháp sắc ký kết hợp với các phương pháp quang phổ hiện đại đã phân lập và xác định cấu trúc 24 hợp chất từ thân rễ cây thồm lồm gai, 17 hợp chất từ thân rễ cây nghể trắng, 20 hợp chất từ toàn cây mễ tử liễu Trong

đó, có hai hợp chất thuộc lớp chất sphingoglycolipid lần đầu tiên được công bố trong tài liệu khoa học, 9 hợp

chất lần đầu tiên phân lập được từ chi Polygonum, 12 hợp chất lần đầu tiên phân lập được từ loài P

perfoliatum L., 15 hợp chất lần đầu tiên phân lập được từ loài P barbatum L., 12 hợp chất lần đầu tiên phân

lập được từ loài P plebeium R.Br

3.2 Đã đánh giá hoạt tính độc tế bào của 11 cặn chiết (etanol, metanol, nước) từ các bộ phận khác nhau của

ba đối tượng nghiên cứu trên 5 dòng tế bào ung thư: khối u trung mô ác tính (HT-1080), tế bào ung thư vú ở người (MDA-MB 231, MCF-7/adr, MCF-7/TAMR), ung thư cổ tử cung ở người (Hela) Kết quả cho thấy cả

11 mẫu cặn chiết đều cho tác dụng độc tế bào với giá trị IC50 trong khoảng 5,1-19,9 µg/mL

3.3 Đã đánh giá hoạt tính chống oxy hóa quét gốc DPPH, ABTS của ba mẫu: cặn chiết etanol 90% thân rễ

P perfoliatum L., cặn chiết etanol 90% thân rễ P barbatum L., cặn chiết etanol 90% toàn cây P plebeium

R.Br Trong đó, cặn chiết etanol 90% thân rễ P barbatum L cho tác dụng loại gốc DPPH cao nhất với IC50 = 35,53 ± 2,41 µg/ml xấp xỉ bằng chất đối chứng là acid ascorbic IC50 = 34,08 ± 0,36 µg/ml

3.4 Đã đánh giá hoạt tính chống oxy hóa quét gốc DPPH của 14 hợp chất tinh khiết được chọn lọc từ các

hợp chất phân lập Kết quả cho thấy 5 hợp chất thể hiện hoạt tính bảo vệ, chống tác nhân oxi hóa DPPH tốt

là 3'-O-methyl-3,4-methylenedioxy ellagic acid (TLE1.1), acid N-[(4R)-2,5-dioxo-4- carbamic (TLE5), ethyl 3,4,5-trihydroxybenzoate (NTB3), isorhamnetin-3-O-(2-rhamnosyl)-rutinosid

imidazolidinyl]-(MTB6), quercetin-3-O-α-L-rhamnosyl-(1→6)-β-D-glucopyranosyl-(1→3)-β-D-glucopyranosid (MTB10.2)

với giá trị EC50 <128 µg/ml Trong số 5 chất có hoạt tính, hợp chất TLE1.1 thể hiện hoạt tính mạnh nhất ở

nồng độ EC50 =3,2 (µg/ml), mạnh hơn rất nhiều so với chất đối chứng là quercetin EC50 =10,82 (µg/ml)

4 Bố cục của luận án

Luận án gồm: 196 trang chưa kể 5 phụ lục, trong đó có 8 bảng số liệu, 10 sơ đồ, 13 hình vẽ, 166 tài liệu tham khảo Bố cục của luận án: Mở đầu (2 trang);Chương 1: Tổng quan tài liệu (33 trang); Chương 2: Phương pháp nghiên cứu (7 trang); Chương 3: Thực nghiệm (54 trang);Chương 4: Kết quả và Thảo luận (80 trang); Kết luận (4 trang); Các công trình đã công bố (1 trang); Tài liệu tham khảo (15 trang);Phụ lục (90 trang)

II NỘI DUNG LUẬN ÁN

MỞ ĐẦU

Phần mở đầu đề cập ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận án

Chương 1: TỔNG QUAN

Phần tổng quan tập hợp các nghiên cứu trong nước và quốc tế về các vấn đề:

- Đặc điểm thực vật, phân bố và ứng dụng của chi Polygonum;

- Các nghiên cứu về thành phần hóa học của chi Polygonum;

- Hoạt tính sinh học của các loài thuộc chi Polygonum;

- Đặc điểm thực vật; phân bố; ứng dụng và các nghiên cứu về thành phần hóa học; hoạt tính sinh học của ba

loài thồm lồm gai (P perfoliatum L.), nghể trắng (P barbatum L.) và mễ tử liễu (P plebeium R.Br.)

Chương 2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 PHƯƠNG PHÁP CHIẾT CÁC CHẤT TỪ NGUYÊN LIỆU THỰC VẬT

Sử dụng các phương pháp chiết lỏng-rắn và lỏng- lỏng để chiết xuất các chất ra khỏi nguyên liệu thực vật và phân đoạn các lớp chất có độ phân cực khác nhau

2.2 PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH VÀ PHÂN TÁCH

Sử dụng chủ yếu phương pháp sắc ký như lớp mỏng để phân tích các phần chiết, kiểm tra độ tinh khiết của các chất; Sắc ký cột với các chất hấp phụ khác nhau để phân lập các chất Bên cạnh đó luận án cũng sử dụng phương pháp kết tinh lại tách và làm sạch các chất

2.3 CÁC PHƯƠNG PHÁP KHẢO SÁT CẤU TRÚC HỢP CHẤT HỮU CƠ

Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập được dựa trên các thông số vật lý: điểm chảy, năng suất quay cực và các phương pháp phổ: phổ khối và phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều (1DNMR): 1H-NMR, 13C-

NMR kết hợp kỹ thuật DEPT, và hai chiều (2D-NMR): HSQC, HMBC, COSY

2.4 CÁC PHƯƠNG PHÁP KHẢO SÁT HOẠT TÍNH SINH HỌC

2.4.1 Thử tác dụng gây độc tế bào ung thư in vitro

Áp dụng phương pháp MTT được biên soạn bởi tác giả Mosmann (1983) để đánh giá độc tính của các cặn chiết trên 5 dòng tế bào ung thư: khối u trung mô ác tính (HT-1080), tế bào ung thư vú ở người (MDA-MB 231, MCF-7/adr, MCF-7/TAMR), ung thư cổ tử cung ở người (Hela)

2.4.2 Thử tác dụng chống oxy hóa

Nghiên cứu tác dụng chống oxy hóa của ba mẫu cặn chiết cồn 90% của các đối tượng theo phương pháp quét gốc DPPH, định lượng ABTS+. Nghiên cứu tác dụng chống oxy hóa của 14 hợp chất tinh khiết phân lập được theo phương pháp quét gốc DPPH

2.4.3 Phương pháp xử lý số liệu

Các số liệu nghiên cứu được xử lý thống kê theo phương pháp thống kê sinh học, sử dụng công cụ Data analysis, Excel và phần mềm thống kê GraphPad Prism 6.0 phù hợp tùy theo mỗi phép thử để có kết quả chính xác, đáng tin cậy

Chương 3: THỰC NGHIỆM 3.1 THIẾT BỊ VÀ HÓA CHẤT

3.4 ĐIỀU CHẾ CÁC PHẦN CHIẾT TỪ NGUYÊN LIỆU THỰC VẬT

3.4.1 Chuẩn bị nguyên liệu

Nguyên liệu dùng để điều chế các phần chiết là thân rễ của cây thồm lồm gai (P perfoliatum L.), thân

rễ của cây nghể trắng (P barbatum L.), toàn bộ cây mễ tử liễu (P plebeium R.Br) được sấy khô ở 50oC, sau

đó xay thành bột

3.4.2 Điều chế các phần chiết từ nguyên liệu thực vật

2,5 kg nguyên liệu được ngâm với cồn 90% ở nhiệt độ phòng (3 lần, mỗi lần 4 ngày) Các dịch chiết được gộp lại và cất loại cồn nước dưới áp suất giảm thu được cặn chiết tổng Cặn chiết này được phân bố

lại lần lượt trong các dung môi có độ phân cực tăng dần: n-hexan, etyl axetat, n-butanol; cất loại hết dung môi dưới áp suất giảm thu được các phần cặn chiết tương ứng n-hexan, etyl axetat, n-butanol Cất kiệt dịch

nước còn lại dưới áp suất giảm ở 80°C cho phần chiết nước

3.5 PHÂN TÍCH CÁC PHẦN CHIẾT BẰNG SẮC KÝ LỚP MỎNG

Phần này trình bày phân tích các phần chiết n-hexan, etyl axetat, n-butanol của ba đối tượng nghiên

cứu bằng sắc ký lớp mỏng nhằm định hướng cho quá trình phân lập các chất

3.6 PHÂN LẬP CÁC HỢP CHẤT TỪ CÁC PHẦN CHIẾT

Phần này trình bày chi tiết quá trình phân lập các hợp chất các phần chiết n-hexan, etyl axetat, n-butanol

của ba đối tượng nghiên cứu

3.6.1 Phân lập các hợp chất từ cây thồm lồm gai

3.6.1.1 Phân tách phần chiết n-hexan (TLH)

Phần chiết n-hexan (15 g) được phân tách bằng sắc ký cột thường (CC) trên silica gel (Merck, 63-200 µm) Mẫu được đưa lên cột theo phương pháp tẩm mẫu trên silica gel Rửa giải sắc ký với n-hexan và hệ dung môi gradient n-hexan/axeton với các tỷ lệ 100/1, 20/1, 10/1, 9/1, 4/1, 3/1 và 2/1 (v/v)

3.6.1.2 Phân tách phần chiết etyl axetat (TLE)

Phần chiết etyl axetat (TLE) (70 g) được phân tách bằng sắc ký cột thường (CC) trên silica gel (Merck,

63-200 µm) Mẫu được đưa lên cột theo phương pháp tẩm mẫu khô Rửa giải sắc ký với etyl axetat và hệ dung môi gradient etyl axetat/metanol 100/1, 20/1, 15/1, 10/1, 4/1 và 2/1 (v/v)

3.6.1.3 Phân tách phần chiết n-butanol (TLB)

Phần chiết chiết n-butanol (50 g) được phân tách bằng sắc ký cột thường (CC) trên silica gel (Merck, 63-200 µm) Mẫu được đưa lên cột theo phương pháp tẩm mẫu khô Rửa giải sắc ký với điclometan và hệ dung môi gradient gradient điclometan/metanol/nước với tỷ lệ 9/1/0,1 và 3/1/0,1 (v/v)

3.6.2 Phân lập các hợp chất từ cây nghể trắng

3.6.2.1 Phân tách phần chiết n-hexan (NTH)

Phần chiết n-hexan (30 g) được phân tách bằng sắc ký cột thường (CC) trên silica gel (Merck, 63-200 µm) Mẫu được đưa lên cột theo phương pháp tẩm mẫu khô Rửa giải sắc ký với n-hexan và hệ dung môi gradient n-hexan/axeton với các tỷ lệ 20/1, 10/1, 8/1, 5/1, 3/1 và 1/1 (v/v)

3.6.2.2 Phân tách phần chiết etyl axetat (NTE)

Phần chiết etyl axetat (NTE) (50 g) được phân tách bằng sắc ký cột thường (CC) trên silica gel (Merck,

63-200 µm) Mẫu được đưa lên cột theo phương pháp tẩm mẫu khô Rửa giải sắc ký với etyl axetat và hệ dung môi gradient etyl axetat/metanol 20/1, 9/1, 8/1, 5/1, (v/v)

3.6.2.3 Phân tách phần chiết n-butanol (NTB)

Phần chiết n-butanol (30 g) được phân tách bằng sắc ký cột thường (CC) trên silica gel (Merck, 63-200 µm) Mẫu được đưa lên cột theo phương pháp tẩm mẫu khô Rửa giải sắc ký với hệ dung môi gradient điclometan/metanol/H2O với các tỷ lệ (9/1/0,1; 6/1/0,1; 3/1/0,1; v/v; 1/1/0,1

3.6.3 Phân lập các hợp chất từ cây mễ tử liễu

3.6.3.1 Phân tách phần chiết n-hexan (MTH)

Phần chiết n-hexan (70 g) được phân tách bằng sắc ký cột thường (CC) trên silica gel (Merck, 63-200 µm) Mẫu được đưa lên cột theo phương pháp tẩm mẫu khô Rửa giải sắc ký với n-hexan và hệ dung môi gradient n-hexan/axeton với các tỷ lệ 99/1, 20/1, 9/1, 7/1, 5/1, 3/1 và 2/1 (v/v)

3.6.3.2 Phân tách phần chiết etyl axetat (MTE)

Phần chiết etyl axetat (MTE) (70 g) được phân tách bằng sắc ký cột thường (CC) trên silica gel (Merck,

63-200 µm) Mẫu được đưa lên cột theo phương pháp tẩm mẫu khô Rửa giải sắc ký với etyl axetat và hệ dung môi gradient etyl axetat/metanol 99/1, 9/1, 8/1, 5/1, 1/1 (v/v)

3.6.3.3 Phân tách phần chiết n-butanol (MTB)

Phần chiết n- butanol (MTB) (40 g) được phân tách bằng sắc ký cột (CC) trên silica gel (Merck, 63-200 µm) Mẫu được đưa lên cột theo phương pháp tẩm mẫu khô Rửa giải sắc ký với etyl axetat và hệ dung môi gradient etyl axetat/metanol/nước 99/1/0,11, 9/1/0,1, 8/1/0,1, 5/1/0,1, 1/1/0,1 (v/v)

3.7 HẰNG SỐ VẬT LÝ VÀ DỮ KIỆN PHỔ CỦA CÁC HỢP CHẤT

Phần này trình bày chi tiết các đặc trưng vật lý, các dữ kiện phổ của các hợp chất được phân lập từ

ba đối tượng nghiên cứu Dưới đây chỉ đưa ra hằng số vật lý và dữ kiện phổ của các chất tiêu biểu:

3-acetocycloart-25-ene-24(R/S)-ol (TLH9)- Hợp chất lần đầu tiên phân lập được từ loài thồm lồm gai

Được phân lập từ nhóm phân đoạn TLH9 Tinh thể hình kim màu trắng, đnc 123-125°C

Rf = 0,51 (TLC, silica gel, n-hexan/etyl axetat 3/1), hiện màu tím đậm với thuốc thử vanilin/H2SO4 1%, t°

1

H-NMR (500 MHz, CDCl3), δ (ppm): 3,28 (1H, m, H-3), 1,73 (3H, s, H-18), 0,33 (1H, d, J=4,5Hz, H-19a), 0,55 (1H,d, J=4,0Hz, H-19b), 0,97 (6H, s, H-21& H-28), 4,10 (1H, t, J=7,5Hz, H-24), 4,83 (1H, s, H-26a), 4,93 (1H, d, J=5,5 Hz, H-19b), 0,87 (3H, s, H-27), 0,80 (3H, s, H-29), 0,89 (3H, s, H-30), 2,17 (3H, s, 3-

COCH3) 13C-NMR (125 MHz, CDCl3), δ (ppm): 31,9 (C-1), 30,4 (C-2), 78,9 (C-3), 40,5 (C-4), 47,2 (C-5),

21,1 6), 26,0 7), 47,9 8), 20,0 9), 26,1 10), 26,5 11), 32,9 12), 45,3 13), 48,9 14), 35,6 (C-15), 28,1 (C-16), 52,2 (C-17), 18,0 (C-18), 29,9 (C-19), 35,9 (C-20), 18,3 (C-21), 31,9 (C-22),

(C-31,7 (C-23), 76,4 (C-24), 147,5 (24S) (C-25), 147,8 (24R) (C-25), 110,9 (24S) (C-26), 111,4 (24R) (C-26),

17,6 (C-27), 25,5 (C-28), 14,0 (C-29), 19,3(C-30), 170,0 (C=O), 21,4 (C-COCH3)

1-O-(β-D-glucopyranosyl)-(2S,3S,4R,8E)-2-[(2'R,10'Z)-2'-hydroxyicos-10'-enoylamino]-8-nonacosene-1, 3, 4-triol (TLH23)- Hợp chất chưa có công bố trong tài liệu khoa học

Được phân lập từ nhóm phân đoạn TLH23 Tinh thể hình kim màu trắng, đnc 216-218°C

Rf = 0,35 (TLC, silica gel, điclometan/metanol 10/1, v/v), hiện màu tím với thuốc thử vanilin/H2SO4 1%, t° LC/ESI-MS/MS: m/z 962 [M+Na]+, 800 [M+Na-Glc]+ M=939 đvC, C55H105NO10 1H-NMR (500

MHz, CD3OD), δ (ppm): 4,08 (1H, dd, J= 4,0; 10,5 Hz, H-1a), 3,82 (1H, dt, J= 2,0; 4,0; 10,5 Hz, H-1b), 4,27 (1H, m, H-2), 3,62 (1H, t, J=6,0 Hz, H-3), 3,53 (1H, m, H-4), 1,66 (1H, m, H-5a), 1,43 (1H, m, H-5b),

1,60 (2H, m, H-6), 1,99 (2H, m, H-7), 5,44 (1H, m, H-8), 5,44 (1H, m, H-9), 1,99 (2H, m, H-10), 1,31

(18x2H, m, 11→28), 0,92 (3H, t, J= 6,5 Hz, 29) 4,04 (1H, m, 2'),1,78 (1H, 3'a), 1,62 (1H,

H-3'b), 1,44 (2H, H-4'), 1,31 (4x2H, H-5'→8'), 2,08 (2H, m, H-9'), 5,38 (1H, m, H-10'), 5,38 (1H, m, H-11'),

2,08 (2H, m, H-12'), 1,31 (7x2H, m, H-13'→19'), 0,92 (3H, t, J= 6,5 Hz, H-20'); Glc: 4,30 (1H, d, J= 7,5 Hz, H-1''), 3,20 (1H, quartet, J= 8,0 Hz, H-2''), 3,38 (1H, m, H-3''), 3,29 (1H, m, H-4''), 3,30 (1H, m, H-5''), 3,89 (1H, d, J= 11,5, H-6''a), 3,68 (1H, dd, J= 12; 5,0 Hz, H-6''b) 13C-NMR (125 MHz, CD3OD), δ (ppm): 69,9

(C-1), 51,7 (C-2), 75,6 (C-3), 72,9 (C-4), 32,9 (C-5), 27,2 (C-6), 33,8 (C-7), 131,5 (C-8), 131,4 (C-9), 33,7 (C-10), 30,3-30,9 (C-11→C-26), 33,1 (C-27), 23,7 (C-28), 14,5 (C-29), 177,1 (C-1'), 72,9 (C-2'), 35,7 (C-3'), 26,1 (C-4'), 30,3-30,9 (C-5'→C-8'), 28,3 (C-9'), 130,8 (C-10'),130,9 (C-11'), 28,4 (C-12'), 30,3-30,9 (C-

13'→C-17'), 33,1 (C-18'), 23,7 (C-19'), 14,5 (C-20'); Glc: 104,7 (C-1''), 75,0 (C-2''), 77,9 (C-3''), 71,6 (C-4''),

78,0 (C-5''), 62,7 (C-6'')

3'-O-methyl-3,4-methylenedioxy ellagic acid (TLE1.1)- Hợp chất lần đầu tiên được phân lập từ chi

Polygonum

Được phân lập từ nhóm phân đoạn TLE1 Chất rắn màu trắng, đnc 296-298°C

Rf = 0,51 (TLC, silica gel, điclometan/metanol 20/1), hiện màu hồng với thuốc thử vanilin/H2SO4 1%, t°

1

H-NMR (500 MHz, DMSO-d6), δ (ppm): 6,39 (2H, s, H-3a), 7,535 (1H, s, H-5), 7,533 (1H, s, H-5'), 4,05

(3H, s, 3'-OCH3) C-NMR (125 MHz, DMSO-d6), δ (ppm): 112,7 (C-1), 131,0 (C-2), 138,3 (C-3), 104,3 (C-3a), 150,0 (C-4), 103,8 (C-5), 116,0 (C-6), 158,3 (C-6a), 110,9 (C-1'), 141,6 (C-2'), 140,2 (C-3'), 150,0 (C-4'), 112,1 (C-5'), 116,0 (C-6'), 157,6 (C-6'a), 60,9 (3'-OCH3)

N-[(4R)-2,5-dioxo-4- imidazolidinyl]-carbamic acid (TLE5)-Hợp chất lần đầu tiên được phân lập từ chi

Polygonum

Được phân lập từ nhóm phân đoạn TLE5 Tinh thể hình trụ, màu hồng nhạt, đnc 244-246ºC

Rf = 0,53 (TLC, silica gel, điclometan/metanol/nước 4/1/0,1, v/v/v), hiện màu hồng đậm với thuốc thử vanilin/H2SO4 1%

EI-MS (%) m/z: 158 (m/z, 5), 141 (10), 130 (58), 115 (32), 87 (98), 44 (100); CTPT: C4H5N3O4 1H- NMR

(500 MHz, DMSO-d6), δ (ppm): 10,52 (1H, s, O-H), 8,04 (1H, s, N1-H), 6,87 (1H, d, J=8,0 Hz, N6- H), 5,24

(1H, d, J= 8,0 Hz, C4-H), 5,77 (1H, s, N3-H) 13C- NMR (125 MHz, DMSO-d6), δ (ppm): 173,6 (C-7), 157,3

(C-5), 156,7 (C-2), 62,3 (C-4)

Kaempferol-3-β-D-glucopyranosyl-(1→6)-α-L-rhamnopyranosid (TLB4)- Hợp chất lần đầu tiên được

phân lập từ chi Polygonum

Được phân lập từ nhóm phân đoạn TLB4 Chất rắn màu vàng, đnc 188-190oC

Rf = 0,33 (TLC, silica gel, toluent/acid axetic/nước 4/1/5), hiện màu đen với dung dịch FeCl3/etanol 5%

ESI-MS: pos 595 [M+H]+, neg 593 [M-H]ˉ 1H-NMR (500 MHz, CD3OD-d4), δ (ppm): 6,22 (1H, d, J = 1,5

Hz, H-6), 6,42 (1H, d, J = 1,5 Hz, H-8), 8,10 (2H, d, J=9,0 Hz, H-2' & 6'), 6,90 (2H, d, J=9,0 Hz, H-3'& 5'),

glc: 5,05 (1H, d, J=8,0 Hz, 1''), 3,33 (1H, s, 2''), 3,63 (1H, m, 3''), 3,81 (1H, s, 4''), 3,55 (1H, m,

5''), 3,41 (1H, m, Ha-6''), 3,74 (1H, m, Hb-6''); Rha: 4,55(1H, s, 1'''), 3,63 (1H, m, 2'''), 3,55 (1H, m, 3'''), 3,82 (1H, m, H-4'''), 3,54 (1H, m, H-5'''), 1,20 (3H, d, J=6,0 Hz, H-6''') 13C-NMR (125 MHz, CD3OD-

H-d4), δ (ppm): 158,5 (C-2), 135,7 (C-3), 179,6 (C-4), 162,9 (C-5), 100,0 (C-6), 166,0 (C-7), 94,9 (C-8), 161,6

(C-9), 105,5 (C-10), 122,6 (C-1'), 132,5 (C-2'), 116,1 (C-3'), 159,4 (C-4'), 116,1 (C-5'), 132,5 (C-6'), 105,6 (C-1''), 73,9 (C-2''), 75,4 (C-3''), 70,1 (C-4''), 75,1 (C-5''), 67,4 (C-6''), 101,9 (C-1'''), 72,1 (C-2'''), 72,3 (C-3'''), 72,9 (C-4'''), 69,7 (C-5'''), 17,9 (C-6''')

1-O-(β-D-galactopyranosyl-2'-hydroxyditriaconta-10'-enoylamino]-8-octadecaene-1,3,4-triol

(NTH24.2)- chất mới chưa có công bố trên tạp chí khoa học

Được phân lập từ nhóm phân đoạn NTH24 Chất vô định hình màu trắng

Rf = 0,64 (TLC, silica gel, điclometan/metanol 9/1, v/v), hiện màu tím với thuốc thử vanilin/H2SO4 1% LC/ESI-MS/MS: (m/z): 972 [M+NH4]+, 902 [M+3H-3HOH]+, 792[M+H-Gal]+, 472 [M+H-Gal-C23H45]+• M=953, CTPT: C56H107NO10 1H-NMR (500 MHz, CDCl3& CD3OD), δ (ppm): 4,09 (1H, dd, J = 6,0; 10,5

Hz, H-1a), 3,80 (1H, dt, J = 2,0; 5,5; 10,5 Hz, H-1b), 4,23 (1H, m, H-2), 3,61 (1H, t, J = 6,0 Hz, H-3), 3,55

(1H, m, H-4), 1,66 (1H, m, H-5a), 1,43 (1H, m, H-5b), 1,59 (2H, m, H-6), 2,03 (2H, m, H-7), 5,41 (1H, m,

8), 5,41(1H, m, 9), 2,04 (2H, m, 10), 0,88 (3H, t, J = 6,5 Hz, 18), 4,04 (1H, m, 2'), 1,76 (1H, 3'a), 1,60 (1H, 3'b), 1,39 (2H, m, H-4'), 5,36 (1H, m, H-10'), 5,36 (1H, m, H-11'), 0,88 (3H, t, J = 6,5 Hz, H- 22'); galc: 4,32 (1H, d, J =8,0 Hz, H-1''), 3,24 (1H, t, J = 8,5 Hz, H-2''), 3,62 (1H, t, J =5,0 Hz, H-3''), 3,38 (1H, m, H-4''), 3,35 (1H, m, H-5''), 3,85 (1H, d, J = 12 Hz, H-6''a), 3,71 (1H, dd, J = 5,0; 12,0 Hz, H-6''b)

H-13

C-NMR (125 MHz, CDCl3& CD3OD), δ (ppm): 68,6 (C-1), 50,1 (C-2), 76,7 (C-3), 72,0 (C-4), 32,2 (C-5),

26,9 (C-6), 32,3 (C-7), 130,4 (C-8), 129,9 (C-9), 32,2 (C-10), 29,4-28,9 (C-11→ C-15), 31,6 (C-16), 22,3 (C-17), 14,3 (C-18), 222,4 (C-1'), 72,9 (C-2'), 34,2 (C-3'), 24,9 (C-4'), 29,4-29,0 (C-5'→C-8'), 28,9 (C-9'),

129,6 (C-10'), 129,1 (C-11'), 28,9 (C-12'), 29,4-29,0 (C-13'→C-19'), 32,3 (C-20'), 25,6 (C-21'), 14,3 (C-22'),

galc: 102,8 (C-1''), 73,3 (C-2''), 74,1 (C-3''), 69,8 (C-4''), 76,1 (C-5''), 61,3 (C-6'')

Isorhamnetin-3-O-(2-rhamnosyl)-rutinosid (MTB6)- chất lần đầu tiên được phân lập từ chi

Polygonum

Được phân lập từ nhóm phân đoạn MTB6 Chất rắn màu vàng, đnc 185-188oC

Rf = 0,25 (TLC, silica gel, n-butanol/acid acetic/nước 4/1/5), hiện màu đen với dung dịch FeCl3/etanol 5% ESI-MS m/z 793,1 [M+Na]+ , 769,1 [M-H]- , CTPT: C34H42O20 1H-NMR (500 MHz, CD3OD-d4), δ (ppm): 6,21 (1H, d, J= 2,0 Hz, H-6), 6,42 (1H, d, J=2,0 Hz, H-8), 7,96 (1H, d, J= 2,0 Hz, H-2'), 6,93 (1H, d, J=8,0

Hz, H-5'), 7,60 (1H, dd, J= 8,5; 2,0 Hz, H-6'), 3,99 (3H, s, O-CH3), glc: 5,75 (1H, d, J=7,5 Hz, H-1''), 3,64

(1H, m, H-2''), 3,58 (1H, m, H-3''), 3,62(1H, s, H-4''), 3,41 (1H, m, H-5''), 3,85(1H, m, H-6a''), 3,43(1H, m,

6b''); rham: 4,56 (1H, s, 1''' ), 3,79 (1H, dd, J= 9,5; 3,0 Hz 2'''), 3,49 (1H, s 3'''), 3,24 (1H, m 4'''), 4,05 (1H, q, H-5'''), 1,09 (3H, d, J=6,5Hz, H-6'''); rham: 5,21(1H, s, H-1''''), 4,02 (1H, s, H-2''''), 3,49 (1H, s, H-3''''), 3,35 (1H, m, H-4''''), 3,42 (1H, m, H-5''''), 0,94 (3H, d, J=6,0 Hz, H-6'''') 13C-NMR (125

chất lần đầu tiên được phân lập từ chi Polygonum

Được phân lập từ phân đoạn MTB10 Chất rắn màu vàng, đnc 191-193°C

Rf = 0,23 (TLC, silica gel, n-butanol/acid acetic/nước 4/1/5), hiện màu đen với dung dịch FeCl3/etanol 5%

ESI-MS: pos, m/z: 795,2 [M+Na]+, M=772 đvC, CTPT: C33H40O21.

1

H-NMR (500 MHz, CD3OD-d4), δ (ppm): 6,23 (1H, d, J= 2,0 Hz, H-6), 6,41 (1H, d, J=2,0 Hz, H-8), 7,68 (1H, d, J= 2,0 Hz, H-2'), 6,95 (1H, d,

J=8,5 Hz, H-5'), 7,56 (1H, dd, J= 8,5; 2,0 Hz, H-6'); β-glc: 5,30 (1H, d, J=7,5 Hz, H-1''), 3,33 (1H, m, H-2''),

3,77 (1H, s, H-3''), 3,44(1H, m, H-4''), 3,42 (1H, m, H-5''), 3,83 (1H, dd, J= 1,5; 2,0 Hz, Hb-6′′′), 3,74 (1H,

dd, J= 11,5, 5,0 Hz, Ha-6′′′); β-glc: 4,78 (1H, d, J=7,5 Hz, H-1'''), 3,42 (1H, m, H-2'''), 3,35 (1H, m, H-3'''), 3,33 (1H, m, H-4'''), 3,60 (1H, m, H-5'''), 3,37 (1H, s, Ha-6′′), 3,80 (1H, m , Hb-6′′); α-rham: 4,51(1H, d,

J=1,0 Hz, H-1''''), 3,50 (1H, dd, J= 9,5; 3,5 Hz, H-2''''), 3,60 (1H, m, H-3''''), 3,27 (1H, t, J=9,5 Hz, H-4''''),

3,45 (1H, m, H-5''''), 1,11 (3H, d, J=6,5 Hz , H-6'''') 13C-NMR (125 MHz, CD3OD-d4), δ (ppm): 158,5 (C-2),

134,9 (C-3), 179,6 (C-4), 163,1 (C-5), 99,9 (C-6), 165,9 (C-7), 94,9 (C-8), 159,2(C-9), 105,7 (C-10), 123,23

(C-1'), 116,2 (C-2'), 145,9 (C-3'), 149,8 (C-4'), 117,7 (C-1'), 123,17 (C-6'); β-glc: 101,2 (C-1''), 76,99 (C-2''), 82,6 (C-3''), 71,1 (C-4''), 77,9 (C-5''), 62,4 (C-6''), β-glc: 104,8 (C-1'''), 75,5 (C-2'''), 78,2 (C-3'''), 71,3 (C-4'''), 77,9 (C-5'''), 68,1 (C-6'''); α- rham: 102,2 (C-1''''), 72,3 (C-2''''), 72,1 (C-3''''), 73,9 (C-4''''), 69,7 (C-5''''), 17,8

(C-6'''')

Chương 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Chương này trình bày kết quả định tính các lớp chất có mặt trong ba đối tượng nghiên cứu, biện giải cấu trúc của các hợp chất phân lập được và kết quả thử hoạt tính sinh học của các cặn chiết và một số chất tinh khiết

4.1 ĐỊNH TÍNH CÁC NHÓM CHẤT TRONG NGUYÊN LIỆU THỰC VẬT

Kết quả định tính sơ bộ thành cho thấy thành phần hóa học chủ yếu của cả ba đối tượng là các flavonoid,

phytosterol, acid hữu cơ, chất béo

4.2 HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÁC CAO CHIẾT

4.2.1 Kết quả thử hoạt tính độc tế bào của các mẫu cặn chiết

Bảng 4.2 Hiệu suất của các cặn chiết khác nhau

2 P barbatum thân rễ EtOH 90% 6,9

5 P perfoliatum thân rễ MeOH 9,3

6 P perfoliatum thân rễ EtOH 90% 19,3

7 P perfoliatum thân rễ H2O 20,7

10 P plebeium toàn cây EtOH 90% 11,6

11 P plebeium toàn cây H2O 6,6

Theo tiêu chuẩn của U.S National Cancer Institute một dịch chiết được xem có khả năng độc tế bào in

vitro khi giá trị IC50 nhỏ hơn 20 μg/mL, trong khi với chất tinh khiết, giá trị này được tính là nhỏ hơn 10 μg/mL Qua bảng 4.3 kết quả thử hoạt tính độc tế bào có thể nhận thấy toàn bộ 11 cặn chiết từ ba loài cây nghiên cứu đều cho tác dụng độc tế bào trên năm dòng tế bào ung thư ở người bao gồm HT-1080, MDA-MB

231, MCF-7/adr, MCF-7/TAMR và Hela với giá trị IC50 trong khoảng 5,1-19,9 µg/mL

Bảng 4.3 Kết quả thử độc tế bào của các mẫu cao chiết trên 5 dòng tế bào ung thư

* Kết quả được lấy trung bình của 3 lần thí nghiệm khác nhau; ** chứng dương; - Không thử

Trong số các mẫu này, bốn cặn chiết từ cây P barbatum (1-4) thể hiện khả năng gây độc tế bào trên

năm dòng tế bào kể trên mạnh hơn cả với các giá trị IC50 chỉ từ 5,1 – 9,4 µg/mL, bốn mẫu P perfoliatum

(5-8) và ba mẫu P plebeium (9-11) thể hiện tác dụng này yếu hơn với IC50 từ 9,1 -19,9 µg/mL Các cao chiết

EtOH 90% bộ phận thân rễ của P perfoliatum, P barbatum và P plebeium, đều thể hiện tác dụng độc tế bào mạnh hơn các cao chiết metanol, nước của cùng một cây cũng như phụ thuộc vào từng dòng tế bào Đây

cũng là một cơ sở để định hướng cho quá trình chiết xuất, phân lập các hợp chất từ ba loài cây này Kết quả

nghiên cứu tác dụng độc tế bào này của luận án lần đầu tiên được công bố

4.2.2 Kết quả thử hoạt tính chống oxy hóa của các cặn chiết

Bảng 4.4 Kết quả đánh giá khả năng quét gốc tự do DPPH của các cặn chiết

Nhận xét: Từ bảng 4.2 cho thấy cả ba cặn chiết EtOH 90% của ba đối tượng nghiên cứu đều có khả

năng dọn gốc tự do ABTS•+ Trong đó cây mễ tử liễu cho tác dụng cao nhất với IC50 = 26,50 ± 5,92 µg/ml,

tiếp đó là cây nghể trắng với IC50 = 29,83 ± 6,60 µg/ml và cuối cùng là cây thồm lồm gai với IC50 = 48,57 ±

8,874 µg/ml với chất đối chứng Trolox IC50 =9,47 ± 0,25 µg/ml

Qua kết quả định tính nhóm chất và kết quả khảo sát tác dụng độc tế bào, chống oxy hóa của các phần chiết khác nhau từ các bộ phận khác nhau của cả ba loài nhận thấy cặn chiết etanol 90% bộ phận thân rễ của hai loài thồm lồm gai, nghể trắng và toàn cây mễ tử liễu cho thấy tác dụng độc tế bào và tác dụng quét gốc DPPH rõ rệt nhất Hơn nữa dung môi chiết xuất etanol 90% là dung môi có thể chiết xuất được hầu hết các các nhóm chất có độ phân cực khác nhau có mặt trong cả ba loài Vì vậy, luận án lựa chọn đối tượng nghiên cứu cụ thể cho quá trình phân lập các chất là thân rễ thồm lồm gai, thân rễ nghể trắng, toàn cây mễ tử liễu với dung môi chiết xuất là etanol 90%

4.3 ĐIỀU CHẾ CÁC PHẦN CHIẾT

Quy trình chiết được áp dụng chung cho cả ba mẫu thực vật nêu trên và được tóm tắt ở Sơ đồ 4.1

4.4 PHÂN TÍCH THÀNH PHẦN HÓA HỌC CÁC PHẦN CHIẾT

Phần này trình bày kết quả phân tích các phần chiết bằng sắc ký lớp mỏng, hệ dung môi dung để phân lập các chất bằng sắc ký cột

4.5 PHÂN TÁCH CÁC PHẦN CHIẾT

Phần này trình bày chi tiết quá trình phân lập các hợp chất từ các phân đoạn khác nhau của ba đối tượng nghiên cứu

4.5.1 Phân lập các hợp chất từ cây thồm lồm gai

Từ phần chiết n-hexan cây thồm lồm gai thu được các hợp chất TLH4 (30 mg), TLH5 (15 mg), TLH7

(12 mg), TLH9 (15 mg), TLH23.3 (21 mg), TLH24 (27 mg), TLH29 (13 mg) Từ phần chiết etyl axetat

(TLE) thu được chất TLE 1.1 (8 mg), TLE1.1.2 (12 mg), TLE1.1.3 (14 mg) TLE 1.1.4 (11 mg), TLE1.2

(20 mg), TLE1.3 (8 mg), TLE1.4 (11 mg), TLE1.5 (11 mg), TLE1.7 (21 mg), TLE1.8 (13 mg), TLE1.9 (13 mg), TLE 2.1 (13mg), TLE 2.1.3 (18 mg), TLE 2.1.4 (30 mg), TLE2.2 (12 mg), TLE2.6 (13 mg),

TLE3 (16 mg), TLE5 (17 mg) Từ phần chiết n- butanol thu được chất TLB1(11 mg), TLB4 (23 mg),

Mẫu nguyên liệu

(TL 2,5 kg; NT 2,5 kg, MT 2,5 kg)

Dịch nước

(TLB; 47,30 g, 1,89 %) (NTB; 35,76 g, 1,43 %) (MTB; 41,43 g, 1,66 %)

3 Cất loại kiệt n-hexan, 60 °C

Sơ đồ 4.1. Quy trình điều chế các phần chiết từ ba đối tượng nghiên cứu

1 Ngâm chiết với EtOH 90% (4 ngày, 3 lần)

2 Lọc, cất loại EtOH

Dịch nước Phần chiết n-hexan

(TLH; 17,00 g, 0,68 %) (NTH; 40,29 g, 1,61 %) (MTH; 71,86 g, 2,87 %)

1 Chiết với EtOAc

2 Cất loại kiệt EtOAc, 60 °C

Phần chiết EtOAc

(TLE; 100,00 g, 4,00 %)

(NTE; 50,97 g, 2,04 %) (MTE; 71,25 g, 2,85 %)

1 Chiết với n-butanol

2 Cất loại kiệt n-butanol, 70 °C

Cất loại kiệt nước, 100 °C

Phần chiết tổng (TL; 290,00 g, 11,60 %) (NT; 207,26 g, 8,29 %) (MT; 289,85g, 11,59 %)

TLB7 (24 mg), TLB11 (16 mg), TLB13 (13 mg)

4.5.2 Phân lập các hợp chất từ cây nghể trắng

Từ phần chiết n-hexan thu được chất NTH1 (50 mg), NTH2 (140 mg), NTH6 (14 mg), NTH24.1

(13 mg), NTH24.2 (21 mg), NTH26.2 (15 mg), NTH26.3 (35 mg), NTH30 (30 mg) Từ phần chiết etyl

axetat (NTE) thu được chất NTE1.1 (9 mg), NTE1.6 (14 mg), NTE2.4.2 (8 mg), NTE 2.6.1 (13 mg),

NTE2.6.2 (40 mg), NTE2.7.1 (15 mg), NTE3 (15 mg), NTE 5.7 (11 mg), NTE8 (22 mg), NTE12 (14 mg)

Từ phần chiết n-butanol thu được chất NTB3 (17 mg), NTB4 (20 mg), NTB8 (13 mg), NTB11 (38 mg)

4.5.3 Phân lập các hợp chất từ cây mễ tử liễu

Từ phần chiết n-hexan thu được chất MTH8.1 (31 mg), MTH10 (35 mg), MTH11 (15 mg), MTH13

(12 mg), MTH16 (17 mg), MTH 18 (205m g) Từ phần chiết etyl axetat (MTE) thu được chất MTE2.4 (17

mg), MTE2.5 (10 mg), MTE2.9 (17 mg), MTE2.9.9 (14 mg), MTE2.10.1 (13 mg), MTE2.10.2 (20 mg),

MTE3.4 (11 mg), MTE3.8 (16 mg), MTE4 (30 mg), MTE5 (15 mg), MTE8.1 (7 mg) Từ phần chiết etyl

axetat n- butanol thu được chất MTB4 (35 mg), MTB6 (22 mg), MTB 10.2 (56 mg)

4.6 CẤU TRÚC CỦA CÁC HỢP CHẤT PHÂN LẬP

Cấu trúc của các chất được xác định dựa vào việc phân tích các dữ kiện phổ thực nghiệm, kết hợp

khảo sát các đặc trưng vật lý, kết hợp tham khảo các tài liệu Dưới đây chỉ ra cấu trúc các chất đã được xác

định, và trình bày phương pháp xác định cấu trúc của một số hợp chất điển hình từ ba loài cây

4.6.1 Các hợp chất được phân lập từ thân rễ cây thồm lồm gai

Từ các phần chiết thân rễ cây thồm lồm gai đã phân lập và xác định cấu trúc được 24 hợp chất bao gồm:

HO

17 18

19

20 22

5

24 26

27

28 29

10

Musizin (TLH5) Mới trong cây

OH

1 3 5 8 9 10

13 14 17 18 19

20

21 22 23

24 25

26 27

18

1' 2'

5 6 7 8 9 10 11 12 13 29

4' 5' 6' 7' 8' 10' 11' 12' 13'

1' 2'

3' 4'

10' 5' 6'

7' 8' 9'

HOOCH36-Geranyl-7-hydroxy-8-methoxy coumarin (TLH29)-Mới trong chi

Polygonum

O

17 18 19

21 22

5

24 26

27

28 29

OH

OH OH

2 3 4 6 8

10 1' 4'

6'

Quercetin (TLE1.3)

O HO

OH OH

OH

1 2 3 4 5

7 9

10

1' 2' 3'

6'

OH

Myricetin (TLE 1.5)