NGHIÊN cứu PHÂN lập và CHUYỂN GEN LIÊN QUAN đến TÍNH CHỊU hạn vào GIỐNG lúa ở VIỆT NAM

Gần đây, dựa trên những thành tựu nghiên cứu về chức năng hệ gen thực vật, c ng với sự phát triển các kỹ thuật microaray, proteomic..., các nhà khoa học đã phát hiện và chứng minh vai tr

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

Công trình được hoàn thành tại:

Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội

Có thể tìm hiểu luận án tại:

- Thư viện Quốc gia Việt Nam

- Trung tâm thông tin - Thư viện, Đại học Quốc gia Hà Nội

Đặt vấn đề

Gần đây, do ảnh hưởng của hiện tượng biến đổi khí hậu toàn cầu, hạn hán xảy ra ngày càng thường xuyên hơn, với mức độ ngày càng trầm trọng, gây tác động lớn tới tổng sản lượng lương thực quốc gia, ảnh hưởng tới công tác xuất khẩu lúa gạo, đe doạ trực tiếp tới an ninh lương thực trong khu vực và trên thế giới.Trong điều kiện khí hậu toàn cầu biến đổi mạnh mẽ, việc tạo ra các giống cây trồng có năng suất cao, đồng thời chống/chịu được với các điều kiện bất lợi của môi trường trở thành một trong những nhiệm vụ then chốt của khoa học nông nghiệp Tuy nhiên, cho đến này tất cả những giống cây trồng chống chịu điều kiện môi trường bất lợi được sử dụng trong sản xuất đều được lai tạo dựa trên các phương pháp chọn giống truyền thống, hầu như chưa có giống cây trồng chịu hạn nào được tạo

ra b ng phương pháp công nghệ sinh học Sang thế k I, với sự phát triển b ng nổ của sinh học phân tử và công nghệ tế bào, hai định hướng chọn giống chịu hạn đang được các nhà khoa học đặc biệt quan tâm là chọn giống phân tử và chọn giống chuyển gen

Tính trạng chịu hạn là tính trạng đa gen (với sự tham gia của hàng trăm gen khác nhau), vì vậy định hướng chọn giống phân tử đang gặp khó khăn lớn trong việc quy tụ các tính trạng, gen quan trọng liên quan đến chịu hạn Gần đây, dựa trên những thành tựu nghiên cứu về chức năng hệ gen thực vật, c ng với sự phát triển các

kỹ thuật microaray, proteomic , các nhà khoa học đã phát hiện và chứng minh vai trò quan trọng của nhóm gen điều khiển trong việc tăng cường tính chịu hạn ở thực vật Nhóm gen điều khiển mặc d không tham gia trực tiếp vào quá trình đáp ứng với điều kiện hạn của thực vật nhưng sự biểu hiện của chúng lại có vai trò điều hòa biểu hiện của rất nhiều gen chức năng khác tham gia vào quá trình đáp

ứng hạn, dẫn tới làm tăng cường khả năng chịu hạn ở thực vật Phát hiện này đã mở ra một hướng nghiên cứu rất mới cho lĩnh vực chọn giống chuyển gen ở thực vật, đó là ch cần chuyển một hay một vài gen điều khiển thay vì vài trăm gen chức năng vào cây để tăng cường tính chống chịu của cây trồng Chính vì lí do này mà các nghiên cứu phân lập, đặc tính hoá các gen điều khiển liên quan đến tính chịu hạn đang trở thành định hướng nghiên cứu đầy tiềm năng trong việc chọn tạo giống chịu hạn

Ở Việt Nam, trong khoảng 10 năm trở lại đây, các nghiên cứu về phân lập gen chịu hạn và tạo giống cây trồng chống chịu hạn

b ng công nghệ chuyển gen thực vật đã bắt đầu được một số phòng thí nghiệm quan tâm Tuy nhiên, hầu hết các chương trình, dự án nghiên cứu về gen chống chịu stress môi trường nói chung và chống chịu hạn nói riêng đều sử dụng các nguồn gen từ nước ngoài hoặc các gen đã được công bố bởi các nhóm nghiên cứu khác trên thế giới Cho đến nay, chúng ta vẫn chưa có một đề tài nghiên cứu cơ bản hoàn ch nh nào về phân lập gen liên quan đến đáp ứng chống chịu hạn ở thực vật Từ đó, chúng tôi đề xuất và tiến hành thực hiện đề tài:

“Nghiên cứu phân lập và chuyển gen liên quan đến tính chịu hạn vào giống lúa ở Việt Nam” với mục đích để tạo nguồn vật liệu, số

liệu quan trọng trong việc tạo ra các giống cây trồng chuyển gen có khả năng chống chịu điều kiện hạn

Mục tiêu nghiên cứu

i) Phân lập được gen mã hóa nhân tố phiên mã s R 1 /2 liên quan tính chịu hạn trên giống lúa Việt Nam

ii) Tối ưu hoá được quy trình biến nạp gen thông qua vi khuẩn

Agrobacterium tumefaciens trên một số giống lúa Việt Nam

iii) Tạo ra được một số dòng lúa chuyển gen mã hóa nhân tố phiên mã s R 1 /2 có kiểu hình tương đồng cây đối chứng (cây không chuyển gen) trong điều kiện bình thường và có khả năng chống/chịu (tiếp tục sinh trưởng, cho thu hạt) khi bị xử l hạn trong điều kiện phòng thí nghiệm

Đối tượng v nội ung nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu của luận án là các gen

OsDREB1A/2A mã hóa nhân tố điều hòa phiên mã liên quan tới tính

chịu hạn của giống lúa Việt Nam và vai trò, biểu hiện của các gen mã hóa nhân tố phiên mã này trong các dòng chuyển gen dưới sự điều khiển của các promoter liên tục hoặc cảm ứng

ác n i ung nghiên cứu chính

 Nội dung 1: Phân lập gen hai gen OsDREB1A và OsDREB2A

liên quan đến tính chịu hạn từ thư viện c N của giống lúa Việt Nam; và thiết kế các cấu trúc chuyển gen thực vật (binary vector) cho

gen OsDREB1A/OsDREB2A dưới sự điều khiển của promoter liên tục (Ubiquitine)/cảm ứng (Lip9)

 Nội dung 2: Tối ưu hóa quá trình phát sinh callus và tái sinh cây từ callus của một số giống lúa Việt Nam; và hoàn thiện kỹ thuật

biến nạp gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens trên

một số giống lúa Việt Nam có tiềm năng phát sinh callus và khả năng tái sinh cao

 Nội dung 3: iến nạp các cấu trúc biểu hiện nhân tố phiên

mã vào giống lúa Việt Nam và sàng lọc các dòng cây chuyển gen (kiểu hình- so sánh với cây đối chứng, kiểu gen- xác định sự tồn tại

ổn định và số lượng cấu trúc biến nạp trong cây chuyển gen)

 Nội dung 4: Đánh giá biểu hiện (kiểu hình và kiểu gen) của các dòng chuyển gen (T3, một cấu trúc biến nạp) trong điều kiện xử

l hạn tại phòng thí nghiệm

Địa điểm nghiên cứu

Luận án được thực hiện tại 2 địa điểm chính: ộ môn ệnh học Phân tử, Viện i truyền Nông nghiệp (Viện hoa học Nông nghiệp Việt Nam) là địa ch uy tín, dẫn đầu trong cả nước về công tác phân lập, nghiên cứu chức năng của các gen mã hóa nhân tố phiên mã; và Phòng Thí nghiệm tương tác cây trồng-vi sinh vật thuộc Trung tâm nghiên cứu vì sự phát triển (IR ) tại ontpellier là phòng thí nghiệm có trang bị hiện đại, có các chuyên gia uy tín trong nghiên cứu chức năng, biểu hiện của gen/bộ gen thực vật (đặc biệt là lúa)

Đóng góp mới của luận án

Luận án là công trình đầu tiên ở Việt Nam thực hiện một cách có hệ thống về nghiên cứu cơ bản theo định hướng ứng dụng

trên hai gen mã hóa nhân tố phiên mã OsDREB1A và OsDREB2A

liên quan tính chịu hạn Trong nghiên cứu này, trình tự mã hóa

OsDREB1A/OsDREB2A dưới sự điều khiển bởi promoter hoạt động liên tục (Ubiquitin) hoặc promoter cảm ứng stress (Lip9) đã được

nghiên cứu biểu hiện và ảnh hưởng đến cây lúachuyển gen trong cả điều kiện thông thường và điều kiện bất lợi Luậnánđã chọn được 04

dòng lúa Chành trụi chuyển gen (OsDREB1A) kiểu hình bình thường

và có khả năng tăng cường chịu hạn (đã duy trì đến T3)

Ngoài ra, trong nghiên cứu này, lần đầu tiên ở Việt Nam chúng tôi tiến hành khảo sát chi tiết khả năng phát sinh callus và khả năng tái sinh cây hoàn ch nh từ callus của nhiều giống lúa Việt Nam (giống phổ biến, giống chịu hạn, giống địa phương ) ết quả nghiên cứu đã ch ra một số giống lúa có tiềm năng để tiếp tục tối ưu

quy trình chuyển gen cho từng giống lúa sau này Đây là tiền đề cho các nghiên cứu tiếp theo nh m tạo ra các giống lúa công nghệ sinh học b ng công nghệ ch nh sửa hệ gen không qua lai tạo có các đặc điểm nông sinh học vượt trội mà vẫn giữ các phẩm chất của giống gốc ban đầu

Luận án lần đầu tiên ở Việt Nam đã thành công trong việc ứng dụng phản ứng PCR định lượng trong việc ước tính số lượng bản sao của cấu trúc chuyển gen và xác định các dòng chuyển gen đồng hợp ngay từ thế hệ T1 Với kết quả từ nghiên cứu này, chúng tôi tin

r ng đây có thể là phương pháp ph hợp cho điều kiện phòng thí nghiệm còn nhiều hạn chế trong nước khi tiến hành nghiên cứu, sàng lọc các dòng cây chuyển gen

Ứng ụng thực tiễn của luận án

ết quả nghiên cứu của luận án đã tạo ra được các dòng T2

(đồng hợp, một bản sao gen OsDREB1A dưới sự điều khiển của

promoter cảm ứng Lip9) có kiểu hình tương đồng cây đối chứng không chuyển gen và đặc biệt có khả năng phục hồi và kết hạt sau 3 tuần ngừng tưới nước Đây là kết quả quan trọng, chứng tỏ tiềm năng

ứng dụng của OsDREB1A và điều hòa biểu hiện của gen mã hóa

nhân tố phiên mã dưới sự điều khiển của promoter cảm ứng trong công tác tạo giống cây chuyển gen chịu hạn Trên cơ sở kết quả của

luận án, các vector biểu hiện gen OsDREB1A và OsDREB2A do luận

án tạo ra đang được nghiên cứu chuyển vào các giống cây trồng quan trọng như ngô, đậu tương, bông… để chọn tạo các giống cây chuyển gen chịu hạn nh m đáp ứng nhu cầu cấp thiết của sản xuất trong điều kiện thay đổi khí hậu toàn cầu Các dòng chuyển gen được duy trì theo dõi trong nhà lưới để làm nguyên liệu cho công tác lai tạo giống

khi điều kiện thực tế cho phép (chấp nhận cây lúa chuyển gen và vật liệu di truyền do sự kiện chuyển gen tạo ra)

1 Bố cục của luận án

Luận án gồm 137 trang, bao gồm: Phần mở đầu (06 trang); Tổng quan tài liệu (32 trang); Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu (18 trang); Kết quả nghiên cứu và thảo luận (36 trang); Kết luận (02 trang); Kiến nghị (01 trang); Các công trình khoa học của tác giả liên quan đến luận án (01 trang); Tài liệu tham khảo (12 trang) với 135 tài liệu gồm 2 thứ tiếng: tiếng Việt (12 tài liệu) và tiếng Anh (123 tài liệu); Phụ lục (14 trang) Luận án có 18 bảng, 24 hình

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 ẢNH HƯỞNG CỦA HẠN HÁN ĐẾN NÔNG NGHIỆP & THỰC VẬT

Hạn đối với thực vật là khái niệm được d ng để ch trạng thái thiếu nước

do môi trường gây nên trong suốt quá trình sống hay trong từng giai đoạn sống, làm ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng và phát triển của thực vật

ôi trường khô hạn gây ra hàng loạt những tác động tiêu cực tới thực vật ở tất cả các cấp độ, từ hình thái tới phân tử và ở tất cả các giai đoạn phát triển

Để đối phó với điều kiện hạn hán, thực vật sẽ khởi động cơ chế phòng vệ chống lại sự thiếu hụt nước, sau đó sẽ là một loạt các cơ chế ở các cấp độ khác nhau Đáp ứng chống chịu stress hạn của thực vật được thực hiện thông qua một chuỗi các quá trình rất phức tạp với sự tham gia của hàng loạt các yếu tố và có thể chia thành 3 giai đoạn: nhận tín hiệu – dẫn truyền tín hiệu – đáp ứng chống chịu khởi đầu chuỗi truyền tín hiệu

1.2 PHẢN ỨNG CỦA THỰC VẬT TR NG ĐIỀU KIỆN HẠN Thực vật thích nghi với môi trường sống nhờ khả năng điều hòa nhanh biểu hiện của các gen chức năng Quá trình điều hòa biểu hiện gen đóng một vai trò quan trọng trong đáp ứng của thực vật với các điều kiện stress phi sinh học, trong đó có hạn hán Các nghiên cứu gần đây đã chứng minh stress hạn tác động tới tất cả các bước trong quá trình điều hòa hoạt động gen của thực vật, bao gồm: điều hòa quá trình phiên mã, điều hòa sau phiên mã, điều hòa quá trình dịch mã, điều hòa sau dịch mã, điều hòa hoạt động gen thông qua các phân tử RNA không mã hóa và yếu tố di truyền ngoại sinh (ví dụ như quá trình methyl hóa DNA hay quá trình biến đổi histone)

1.3 VAI TRÒ CỦA NHÂN TỐ PHIÊN Ã TR NG ĐÁP ỨNG STRESS HẠN

Trong hệ gen thực vật có khoảng 7% gen mã hóa nhân tố phiên mã (TF), trong số đó có rất nhiều gen liên quan đến đáp ứng chống chịu stress Các TF tham gia trong mạng lưới điều hòa hoạt động gen đáp ứng stress hạn đã biết cho tới nay được xác định thuộc hầu hết các nhóm TF lớn của thực vật, trong đó được nghiên cứu nhiều nhất là các nhóm AP2/ERF, NAC, WRKY, MYB/MYC, bZIP hay ZF

1.4 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TẠO GIỐNxG LÚA CHUYỂN GEN CHỊU HẠN TRÊN THẾ GIỚI VÀ Ở VIỆT NAM

Việc phát triển các giống lúa chịu hạn và giảm lượng nước tiêu thụ trong sản xuất lúa gạo có nghĩa vô c ng to lớn để tăng sản lượng và đảm bảo an ninh lương thực Một hướng nghiên cứu phổ biến và rất được quan tâm hiện nay là tăng cường biểu hiện các gen đáp ứng hoặc liên quan đến đáp ứng chống chịu hạn trong cây lúa chuyển gen o cơ chế chống chịu hạn phức tạp của thực vật, việc

sử dụng các gen điều hòa (mã hóa các protein tham gia vào mạng lưới điều hòa đáp ứng stress) trong nghiên cứu chuyển gen tạo giống lúa chịu hạn thường mang lại hiệu quả cao hơn so với các gen chức năng (mã hóa protein/enzyme trực tiếp tham gia vào đáp úng chống chịu stress) Tuy nhiên, cho đến nay mới ch có một vài nghiên cứu chứng minh khả năng chịu hạn của các dòng lúa chuyển gen trong điều kiện thử nghiệm trên đồng ruộng Ở Việt Nam, cho đến nay chưa có một nghiên cứu hoàn ch nh nào về các gen liên quan đến đáp ứng chống chịu stress ở thực vật, đặc biệt là nhóm gen mã hoá nhân tố phiên mã liên quan tới tăng cường đáp ứng chống chịu hạn ở lúa

Chương 2 VẬT LIỆU & PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 VẬT LIỆU

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Thư viện c N sơ cấp của lúa Oryza sativaL.xử lý hạn và mặn

được cung cấp bởi Bộ môn Bệnh học phân tử, Viện Di truyền Nông nghiệp 47 giống lúa được cung cấp bởi Trung tâm Tài nguyên Di truyền

2.1.2 Chủng vi sinh vật

Chủng vi khuẩn Escherichia coli H5α được mua từ hãng Fermentas (Mỹ); chủng vi khuẩn E coli XLOR, XL1-Blue MRF và

phage “trợ giúp” được mua từ Công ty Agilent Technologies (Mỹ);

chủng vi khuẩn E coli Rosetta (DE3) khả biến được mua từ Công ty Merck Millipore (Mỹ); chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens

LBA4404 khả biến

2.1.3 Vector và oligonucleotide

Các cặp mồi sử dụng làm mồi và các mẫu oligonucleotide đầu dò được đặt mua từ hãng Invitrogen (Mỹ) và Sigma (Mỹ)

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

- Xử lý mẫu thực vật theo phương pháp của Qin (2007), Dubouzet (2003)

và Tran (2004)

- Tách chiết, định lượng DNA/RNA

- Nhân dòng trình tự mã hóaOsDREB1A/OsDREB2Avào vectorpUC19

- Thiết kế vector biểu hiện OsDREB1A/OsDEB2A

Hình 2.2 | Giản đồ quy trình thiết kế vector chuyển gen

- Đánh giá khả năng tạo callus và tái sinh chồi từ callus của một số giống lúaở Việt Nam

- Khảo sát một số quy trình chuyển gen cho lúa indica

- Tạo cây chuyển gen biểu hiện OsDREB1A/OsDREB2A

- Sàng lọc kiểu gen, kiểu hình của các cây chuyển gen

- Đánh giá khả năng chịu hạn của cây chuyển gen ở giai đoạn sinh trưởng, ra hạt

Chương 3 KẾT QUẢ & THẢO LUẬN

3.1 PHÂN LẬP THIẾT KẾ VECTOR CHUYỂN GEN

OSDREB1A/OSDREB2A

3.1.1 Phân lập trình tự mã hóa gen OsDREB1A/OsDREB2A

Trình tự mã hóa gen OsDREB1A đã được phân lập b ng phản

ứng PCR với cặp mồi gen OsDREB1A-Fw/Rv từ DNA hệ gen giống Cườm Dạng và thư viện cDNA xử lý hạn của giống lúa Mộc tuyền Trình tự mã hóa s R 2 đã được phân lập b ng phản ứng PCR với cặp mồi gen OsDREB2A-Fw/Rv từ khuôn cDNA xử lý hạn của giống lúa Cườm Dạng Sản phẩm khuếch đại trình tự mã hóa của hai gen đã được nhân dòng vào vector pUC19 Vector tái tổ hợp đã được

biến nạp vào vi khuẩn E coli chủng H5α, sàng lọc b ng phương

pháp PCR trực tiếp khuẩn các lạc màu trắng(hình 3.5) và tiếp đó

được giải trình tự theo phương pháp Sanger với cặp mồi vector

Hình 3.5 | Kết quả PCR kiểm tra trực tiếp khuẩn lạc mang

vector pUC19 tái tổ hợp

Ghi chú: ên trái- i h ợc biến n p vector tái tổ hợ

ên ph i- i h ợc biến n p vector tái tổ hợp pUC19/OsDREB2A:

giế g i chứng âm (không có DNA khuôn); 12-15: sản ph h h n

l c biến n p sản ph m ghép n i giữa pUC19 và sản ph m khuế h i trình tự mã hóa OsDREB2A t cDNA của gi g ú ờm D ng