NGHIÊN cứu BIẾN đổi của một số GEN TY THỂ ở BỆNH UNG THư vú

ADN ty thể từ lâu đã được cho là có mối liên quan với quá trình phát sinh ung thư vú Carew, 2002, trong đó có sự thay đổi về số lượng bản sao, biến đổi mức độ biểu hiện và hoạt động của

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

Công trình đƣợc hoàn thành tại:

Bộ môn Sinh lý học và Sinh học người, Khoa Sinh học, Trường Đại

học Khoa học Tự nhiên, ĐHQG Hà Nội

Người hướng dẫn khoa học: PGS TS Trịnh Hồng Thái

vào hồi: giờ ngày tháng năm 20

Có thể tìm hiểu luận án tại:

- Thư viện Quốc gia Việt Nam

- Trung tâm Thông tin - Thư viện, Đại học Quốc gia Hà Nội

MỞ ĐẦU

Ung thư vú là loại ung thư phổ biến nhất và là nguyên nhân gây

tử vong hàng đầu trong các loại ung thư ở nữ giới(Globocan 2012), tuy nhiên, tỉ lệ sống sót có thể được cải thiện nếu bệnh nhân được chẩn đoán ở giai đoạn sớm của bệnh (Anderson, 2008) Đối với sàng lọc và chẩn đoán sớm ung thư vú, chụp nhũ ảnh và thăm khám vú vẫn là phương pháp chuẩn trong lâm sàng (Vahabi, 2003), tuy nhiên nguy cơ phát hiện dương tính giả cao (Elmore, 2010) Điều này cho thấy cần phải có các chỉ thị sinh học đặc hiệu đối với sàng lọc và phát hiện sớm bệnh

ADN ty thể từ lâu đã được cho là có mối liên quan với quá trình phát sinh ung thư vú (Carew, 2002), trong đó có sự thay đổi về số lượng bản sao, biến đổi mức độ biểu hiện và hoạt động của các tiểu đơn vị của chuỗi hô hấp và các đột biến điểm của ADN ty thể (Tseng, 2006; Fan, 2009) Tuy nhiên, kết quả nghiên cứu trên các nhóm bệnh nhân khác nhau vẫn còn gây tranh cãi Trên đối tượng bệnh nhân người Việt Nam, nghiên cứu về về biến đổi của các gen ty thể còn ít và chưa có tính hệ thống Xuất phát từ thực tế trên, chúng

tôi đã tiến hành chọn đề tài: “Nghiên cứu biến đổi của một số gen ty thể ở bệnh ung thư vú” nhằm mục tiêu sau: (1) Cung cấp dữ liệu có

tính hệ thống ban đầu về biến đổi của một số gen ty thể, bao gồm biến đổi số bản sao ADN ty thể, mức độ mất đoạn lớn, biến đổi của

gen ATP6, tARN, ND1 và ND3, trên đối tượng bệnh nhân ung thư vú

người Việt Nam; (2) Xác định được mối liên quan giữa các biến đổi này với các đặc điểm bệnh học của ung thư vú Kết quả thu được của luận án là tiền đề có thể phát triển để sử dụng trong đánh giá nguy

cơ, hỗ trợ chẩn đoán cũng như tiên lượng bệnh

Chương 1 - TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 GIỚI THIỆU CHUNG VỀ UNG THƯ VÚ

1.1.1 Tình hình mắc ung thư vú trên thế giới và ở Việt Nam

Trong các loại ung thư ở nữ giới, ung thư vú là dạng ung thư phổ biến nhất và là nguyên nhân gây tử vong hàng đầu trên toàn thế giới cũng như tại Việt Nam (Globocan, 2012; Duc, 2010)

1.1.2 Các yếu tố nguy cơ gây ung thư vú

Các yếu tố nguy cơ được cho là nguyên nhân gây ung thư vú bao gồm phóng xạ ion hóa, virus, các hóa chất gây ung thư, chế độ

ăn uống, hoạt động thể chất, hormone ngoại sinh và một số yếu tố sinh sản ở nữ giới Các yếu tố này gây đột biến các gen tiền ung thư hoặc gen ức chế ung thư, từ đó gây ra sự mất ổn định của tế bào trong sửa chữa các lỗi di truyền và dẫn đến hoạt hóa các gen gây ung thư

1.1.3 Các giai đoạn của ung thư vú

Đánh giá giai đoạn của ung thư vú dựa vào hệ thống phân loại TNM, trong đó dựa vào kích thước và mức độ lan rộng của khối u thể hiện qua 3 yếu tố: T (Tumor) – u nguyên phát, N (Node) – hạch tại vùng và M (Metastase) – di căn xa (Edge, 2010)

1.1.4 Các chỉ thị sinh học của ung thư vú

Các chỉ thị sinh học hiện nay của ung thư vú được áp dụng chủ yếu cho chẩn đoán, lựa chọn phương pháp và theo dõi điều trị (Ludwig, 2005) Thăm khám vú và chụp nhũ ảnh là phương pháp chuẩn trong sàng lọc và chẩn đoán sớm, tuy nhiên lại có tỉ lệ phát hiện dương tính giả cao (Vahabi, 2003; Elmore, 2010) Do đó, cần

phải tìm kiếm các chỉ thị sinh học đặc hiệu sử dụng trong sàng lọc và phát hiện sớm bệnh

1.2 TỔNG QUAN VỀ ADN TY THỂ NGƯỜI

ADN ty thể là phân tử mạch vòng, bao gồm 16.569 bp, chứa 37 gen mã hóa cho 13 protein của phức hệ phosphoryl hóa oxi hóa (OXPHOS), 22 tARN và 2 rARN

1.3 BIẾN ĐỔI CỦA ADN TY THỂ VÀ BỆNH UNG THƯ

Biến đổi của các gen ty thể được cho là có liên quan với quá trình tạo u bởi vì các tế bào ung thư sử dụng con đường OXPHOS ít hơn so với tế bào bình thường (Warburg, 1956) Biến đổi này bao gồm: thay đổi số bản sao ADN ty thể, giảm biểu hiện của các gen ty thể hoặc biến đổi hoạt tính enzyme của ty thể và các đột biến soma hoặc đột biến dòng mầm của ADN ty thể (Kulawiec, 2008; Brandon, 2006)

1.4 MỘT SỐ BIẾN ĐỔI CỦA ADN TY THỂ Ở BỆNH UNG THƯ

VÚ

1.4.1 Biến đổi số bản sao của ADN ty thể

Các phân tử ADN ty thể dễ bị tổn thương hơn trong các tế bào ung thư, và do đó ty thể thay đổi số lượng bản sao ADN của chúng

để phản ứng lại với hiện tượng này (Pelicano, 2004) Đối với ung thư

vú, số bản sao ADN ty thể được cho là giảm ở mô u so với mô không ung thư (Tseng, 2006) và có liên quan với độ tuổi, độ mô học, tình trạng của thụ thể estrogen và progesteron, kích thước khối u (Yu, 2007; Fan, 2009; Bai, 2011) Ngược lại, số bản sao ADN ty thể có xu hướng tăng trong mẫu máu của các bệnh nhân ung thư vú so với đối chứng và được cho là có liên quan với độ tuổi, giai đoạn bệnh (Shen,

2009; Lemnrau, 2015) Các kết quả này cho đến nay vẫn còn gây tranh cãi và còn nhiều điều vẫn cần được làm sáng tỏ

1.4.2 Mất đoạn lớn của ADN ty thể

Hệ gen ty thể được đặc trưng bởi một số ít các trình tự lặp đóng vai trò là các điểm cắt để tạo ra các mất đoạn lớn của ADN ty thể (Dakubo, 2010) Mất đoạn 4977 bp (∆mtDNA4977), dạng biến đổi thường gặp nhất, tạo ra phân tử ADN ty thể nhỏ hơn bình thường nhưng vẫn có thể sao chép được và được tích lũy với tỉ lệ khác nhau

ở các mô sau nguyên phân Trong nghiên cứu của Zhu (2004),

∆mtDNA4977

được cho là không đặc trưng ở ung thư vú Ngược lại,

∆mtDNA4977 được tìm thấy trong 28/60 mẫu mô vú thường (47%) trong khi đó chỉ có 3/60 mẫu u (5%) là có mất đoạn này (Tseng, 2006) Các kết quả thu được vẫn còn nhiều mâu thuẫn, do đó vẫn cần phải tiếp tục nghiên cứu để đưa ra được kết luận chính xác hơn

1.4.3 Biến đổi của gen ATP6

Gen ATP6, nằm từ vị trí 8527 – 9207 trên ADN ty thể, mã hóa

cho dưới đơn vị a của tiểu phần F0 thuộc phức hệ tổng hợp ATP Trên đối tượng bệnh nhân ung thư vú, Sharp (1992) không phát hiện

thấy có biến đổi nào trên gen ATP6 Tuy nhiên, một số nghiên cứu khác lại phát hiện thấy tỉ lệ biến đổi của gen ATP6 trong khoảng từ

72% – 82,14%, trong đó có một số biến đổi được cho là làm tăng nguy cơ mắc ung thư vú (Grzybowska-Szatkowska, 2014a; Ghaffarpour, 2014; Thapa, 2016)

1.4.4 Biến đổi của gen tARN ty thể

Đột biến các gen tARN ty thể thường làm suy giảm hoạt tính aminoacyl hóa của phân tử tARN, từ đó ảnh hưởng đến quá trình tổng hợp và biểu hiện protein và chức năng của các enzyme

OXPHOS (Abbott, 2014) Trên đối tượng bệnh nhân ung thư vú, Grzybowska-Szatkowska (2012) cho rằng 6 biến đổi A15924G, A12308G, T7581C, A8348G, T10034C và T10463C đều có mối liên quan với ung thư vú Ngược lại, Meng (2015) cho rằng các biến đổi T7581C và A12308G có vai trò tiềm năng trong biểu hiện lâm sàng của ung thư vú, còn các biến đổi khác thì không Có thể thấy hiểu biết về vai trò của các biến đổi gen tARN ty thể trên bệnh ung thư vú còn rất hạn chế, do đó gây khó khăn trong việc dự đoán tác động đến biểu hiệu lâm sàng của bệnh

1.4.5 Biến đổi của gen ND3

Biến đổi A10398G làm thay đổi trình tự axít amin từ Threonine

thành Alanine trong sản phẩm của gen ND3 ty thể Các nghiên cứu

trước đây đã phân tích mối liên quan giữa biến đổi A10398G và nguy cơ mắc ung thư vú, tuy nhiên kết quả thu được cho đến nay còn mâu thuẫn và gây nhiều tranh cãi (Canter, 2005; Bai, 2007)

1.4.6 Biến đổi của gen ND1

Gen ND1 của ty thể mã hóa cho một trong 7 tiểu đơn vị của

phức hệ hô hấp I và là bước đầu tiên trong chuỗi vận chuyển điện tử

của ty thể Biến đổi gen ND1 được cho là làm thay đổi cấu trúc và

chức năng của protein NADH dehydrogenase subunit 1, từ đó thúc

đẩy quá trình phát sinh khối u Một số biến đổi của gen ND1 được

báo cáo có liên quan với ung thư vú như T3398C, T4216C, A3796G

và được coi như là chỉ thị sinh học mới trong phát hiện sớm ung thư

vú (Tan, 2002; Grzybowska-Szatkowska, 2014b; Thapa, 2015) Ngược lại, nghiên cứu khác lại cho rằng biến đổi của các gen thuộc

phức hệ V thường gặp hơn so với gen ND1 ở bệnh nhân ung thư vú

Do đó cần tiếp tục tiến hành nghiên cứu biến đổi của gen này trên các nhóm đối tượng khác để cho kết quả chính xác hơn

1.5 NGHIÊN CỨU BIẾN ĐỔI CỦA ADN TY THỂ Ở VIỆT NAM

Tại Việt Nam, các nghiên cứu về biến đổi của gen ty thể trên đối tượng bệnh nhân ung thư vú còn ít và chưa có tính hệ thống Do đó, nghiên cứu này được thực hiện với mục đích xác định các biến đổi của một số gen ADN ty thể trên bệnh nhân ung thư vú người Việt Nam và phân tích mối liên quan với các đặc điểm lâm sàng của bệnh, góp phần làm sáng tỏ vai trò của ADN ty thể đối với bệnh ung thư vú

và cung cấp dữ liệu có tính hệ thống ban đầu cho các nghiên cứu tiếp theo nhằm hỗ trợ cho đánh giá nguy cơ, hỗ trợ chẩn đoán cũng như tiên lượng bệnh hiệu quả hơn

Chương 2 – NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 NGUYÊN LIỆU

2.1.1 Đối tượng

Mẫu mô u (được lấy tại vị trí khối u) và mô lân cận u (cách vị trí

có khối u từ 5 – 10 cm) của 102 bệnh nhân ung thư vú; mẫu mô u và

mô máu của 20 bệnh nhân mắc u xơ vú và mẫu máu của 65 người cho máu khỏe mạnh

2.1.2 Hóa chất

Các hóa chất được mua từ các hãng tin cậy (Sigma, Merk) và đạt độ tinh khiết cần thiết cho nghiên cứu sinh học phân tử

2.1.3 Thiết bị

Các thiết bị được sử dụng thuộc phòng Proteomics và sinh học cấu trúc (KLEPT) và Phòng thí nghiệm Bộ môn Sinh lý học và Sinh học người, Khoa Sinh học, Trường ĐHKHTN đều có độ chính xác

và tin cậy cao

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1 Tách chiết ADN tổng số

2.2.1.1 Tách chiết ADN tổng số từ mẫu mô

Mẫu mô được tách chiết bằng QIAamp DNA Mini Kit (QIAGEN, Đức) theo quy trình của nhà sản xuất

2.2.1.2 Tách chiết ADN tổng số từ mẫu máu

Mẫu máu được tách chiết bằng GeneJET Whole Blood Genomic DNA Purification Mini Kit theo quy trình của nhà sản xuất

2.2.2 Điện di kiểm tra sản phẩm trên gel agarose và polyacrylamide

2.2.3 Khuếch đại đoạn gen quan tâm bằng phương pháp PCR 2.2.4 Tinh sạch sản phẩm PCR

Sử dụng ExoSAP-IT (Affymetrix) theo quy trình của nhà sản xuất

2.2.5 Phân tích PCR-RFLP

Các đột biến điểm trong ADN ty thể được phát hiện bằng kỹ

thuật PCR-RFLP sử dụng các enzyme giới hạn NlaIII, DdeI, Hin6I, SatI, FspBI (Thermo Scientific) theo quy trình của nhà sản xuất

2.2.6 Nhân dòng và tách chiết ADN plasmid

Nhân dòng bằng vector pJET1.2/blunt Cloning Vector theo kit của Fermentas Tách chiết ADN plasmid sử dụng QIAprepSpin Miniprep Kit (Qiagen) và thực hiện theo quy trình của nhà sản xuất

2.2.7 Định lượng ADN bằng realtime PCR

Định lượng số bản sao và mất đoạn lớn trong ADN ty thể bằng

phương pháp realtime PCR dựa trên gen HBB đại diện cho ADN nhân), gen ND1 (nằm trong vùng ít mất đoạn) và gen ND4 (nằm

trong vùng hay xảy ra mất đoạn) đại diện cho ADN ty thể

Hiệu suất khuếch đại của phản ứng realtime PCR được xác định dựa vào đường chuẩn theo công thức:

% Hiệu suất = (10 -1/slope – 1) x 100%

Trong đó: slope là hệ số góc của đường chuẩn định lượng Công thức xác định số bản sao tương đối của ADN ty thể là:

Số bản sao tương đối của ADN ty thể = 2(Ct HBB – Ct ND1)

Mức độ mất đoạn của ADN ty thể được xác định bằng công thức:

Mức độ mất đoạn = (1 – 2(Ct ND1 – Ct ND4))*100%

2.2.8 Định lượng ADN bằng HPLC

Phương pháp HPLC được sử dụng để định lượng số bản sao

ADN ty thể dựa trên gen ACTB đại diện cho ADN nhân và gen ND1

đại diện cho ADN ty thể Tỉ số bản sao của ADN ty thể so với ADN nhân được tính toán dựa theo công thức:

Số bản sao tương đối của ADN ty thể = k x S1/S2

Trong đó: k = 1,235 S1: Diện tích đỉnh sắc ký của sản phẩm

gen ND1 S2: Diện tích đỉnh sắc ký của sản phẩm gen ACTB

2.2.9 Xử lý số liệu và tính toán thống kê

Sử dụng các công cụ tin sinh: BioEdit v7.0, BLAST, ClustalX, chương trình RNAfold WebServer để phân tích số liệu Xử lý các số liệu thu được theo các phương pháp thống kê thường dùng: phép thử χ², Shapiro-Wilk (Expanded) Test, Mann-Whitney U Test và Kruskal – Wallis Test Ước tính nguy cơ gây bệnh được biểu thị bằng tỉ số odds (OR) và khoảng tin cậy 95% (95% CI) Tất cả các kiểm định thống kê được ghi nhận theo 2 chiều và giá trị p < 0,05 được coi là

có ý nghĩa thống kê

Chương 3 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 TÁCH CHIẾT ADN TỔNG SỐ TỪ MẪU MÔ VÀ MẪU MÁU

ADN tổng số được tách chiết từ 102 cặp mẫu mô u và lân cận u của bệnh nhân mắc ung thư vú, 20 cặp mẫu mô u và mẫu máu của bệnh nhân mắc u xơ vú và 65 mẫu máu của người khỏe mạnh

3.2 PHÂN TÍCH BIẾN ĐỔI SỐ BẢN SAO CỦA ADN TY THỂ

Trong nghiên cứu này, biến đổi số bản sao của ADN ty thể được tiến hành phân tích định lượng đồng thời bằng HPLC và realtime PCR nhằm so sánh kết quả thu được khi thực hiện bằng cả hai phương pháp

3.2.1 Kết quả định lượng số bản sao của ADN ty thể bằng HPLC

Sử dụng kỹ thuật PCR, đã khuếch đại thành công đoạn đoạn

ADN của gen ND1 có kích thước 433 bp đại diện cho ADN ty thể và đoạn ADN của gen ACTB có kích thước 107 bp đại diện cho ADN

nhân Sản phẩm được nhân dòng bằng vector pJET1.2 và biến nạp

vào E Coli DH5 và giải trình tự để khẳng định chính xác Sau đó,

tiến hành xây dựng đường chuẩn giữa tỉ số hàm lượng ADN của gen

ND1/ACTB và tỉ số băng HPLC thu được Kết quả thu được đường

chuẩn với hệ số tương quan cao (R2 = 0,9961)

Tiến hành định lượng số bản sao của ADN ty thể trong các mẫu

nghiên cứu sử dụng sản phẩm PCR đa mồi của gen ACTB và ND1

Kết quả thu được cho thấy giảm số bản sao ADN ty thể ở mô u (2,9

± 3,9) so với mô lân cận u (4,1 ± 4,8) và giảm số bản sao ở mô u xơ (2,7 ± 3,1) so với mô lân cận u của bệnh nhân ung thư vú Sự khác biệt này có ý nghĩa thống kê với p < 0,05 Kết quả định lượng số bản sao của ADN ty thể trong các mẫu nghiên cứu được thể hiện trong Hình 3.9

Hình 3.1 Biến đổi số bản sao mtDNA xác định bằng phương pháp

HPLC (*: p < 0.05)

Giảm số bản sao ADN ty thể được cho là liên quan đến sự hình thành khối u ở bệnh nhân ung thư vú do ảnh hưởng đến chức năng điều hòa quá trình chết theo chương trình của tế bào, từ đó làm cho các tế bào đột biến gây ung thư thoát khỏi chết theo chương trình để trở thành tế bào bất tử

3.2.2 Kết quả định lƣợng số bản sao của ADN ty thể bằng realtime PCR

Các plasmid mang đoạn gen HBB và ND1 đã tách dòng và tinh

sạch được pha loãng với hệ số 10, từ 109 đến 101 bản sao/µl, để xây dựng đường chuẩn và xác định giới hạn phát hiện của phản ứng Kết quả cho thấy giới hạn phát hiện của phương pháp là khoảng 20 bản sao ADN trong một phản ứng với đường chuẩn có hệ số tương quan

R2 = 0.999 và 0.9934 đối với gen ND1 và HBB tương ứng Hiệu suất khuếch đại tương ứng của gen ND1 và HBB là 96.69% và 93.08%

Kết quả định lượng số bản sao của ADN ty thể trong các mẫu nghiên cứu được thể hiện trong Hình 3.15

Hình 3.2 Biến đổi số bản sao ADN ty thể trong các loại mô nghiên

cứu (*: p < 0.05)

Kết quả cho thấy số bản sao của ADN ty thể trong mô u thấp

hơn có ý nghĩa thống kê so với mô lân cận u (p = 0,0173) Kết quả

này phù hợp với các nghiên cứu trước đây cho rằng số bản sao ADN

ty thể giảm ở mô u so với mô lân cận u ở bệnh nhân ung thư vú (Fan, 2009; Bai, 2011; Hu, 2016) Số bản sao ADN ty thể trong mô của

bệnh nhân mắc u xơ thấp hơn có ý nghĩa thống kê so với mô u (p =

0,0143) và mô lân cận u (p = 0,0001) của bệnh nhân mắc ung thư vú

Bên cạnh đó, số bản sao của ADN ty thể trong máu của bệnh nhân u

xơ cao hơn có ý nghĩa thống kê so với số bản sao trong máu của

người khỏe mạnh bình thường với mức ý nghĩa 0,05 (p = 0,0003)

Trong các nghiên cứu trước đây, số bản sao của ADN ty thể trong máu cao hơn được cho là làm tăng nguy cơ mắc ung thư vú (Shen, 2009; Lemnrau, 2015)

So sánh sự thay đổi số bản sao ADN ty thể theo các đặc điểm lâm sàng cho thấy không có mối liên quan có ý nghĩa thống kê giữa

số bản sao của ADN ty thể theo độ tuổi (< 50 hoặc ≥ 50), kích thước khối u (< 5 hoặc ≥ 5 cm3), số hạch (< 10 hoặc ≥ 10), kích thước hạch (< 0,5 hoặc ≥ 0,5 cm), giai đoạn hạch N, mức độ biệt hóa và giai đoạn bệnh Tuy nhiên, số bản sao ADN ty thể thấp hơn có ý nghĩa thống kê ở giai đoạn T3-4 so với giai đoạn T1-2 (p = 0,0058) ở nhóm

bệnh nhân ung thư vú Tương tự với nghiên cứu của Mambo và cs (2005), kết quả không thấy có mối liên quan giữa biến đổi số bản sao với độ mô học của khối u và di căn, do đó biến đổi này được cho là xảy ra ở giai đoạn sớm của quá trình phát sinh khối u và có thể được

sử dụng như là một công cụ chẩn đoán phân tử để xác định các bất

thường di truyền của khối u 3.3 PHÂN TÍCH MỨC ĐỘ MẤT ĐOẠN LỚN CỦA ADN TY THỂ

3.3.1 Xác định mất đoạn 4977 bp

Xác định ∆mtDNA4977 được dựa trên phản ứng nhân bản các

đoạn gen ND1 đại diện cho vùng không mất đoạn của ADN ty thể, gen ND3 thuộc vùng mất đoạn 4977 bp và đoạn ADN nằm ngoài các

trình tự lặp 13 bp (ngoài vùng mất đoạn 4977 bp) bằng phương pháp PCR lồng