1 MỞ ĐẦU Trong những năm gần đây việc nghiên cứu điều chế dược chất phóng xạ gắn kháng thể đơn dòng dùng trong điều trị miễn dịch phóng xạ đang được sự quan tâm lớn của y học.. Để khắc
Trang 11
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
NGUYỄN THỊ THU
“NGHIÊN CỨU ĐIỀU CHẾ, PHÂN BỐ SINH HỌC VÀ KHẢ NĂNG GẮN VỚI TẾ BÀO UNG THƯ CỦA PHỨC HỢP MIỄN DỊCH PHÓNG XẠ 131
Trang 2Công trình được hoàn thành tại: Viện Nghiên cứu hạt nhân, Đà Lạt,
Người hướng dẫn khoa học:
Có thể tìm hiểu luận án tại:
- Thư viện Quốc gia Việt Nam
- Trung tâm Thông tin - Thư viện, Đại học Quốc gia Hà Nội
Trang 31
MỞ ĐẦU
Trong những năm gần đây việc nghiên cứu điều chế dược chất phóng xạ gắn kháng thể đơn dòng dùng trong điều trị miễn dịch phóng xạ đang được sự quan tâm lớn của y học Nhiều nghiên cứu mới vẫn đang còn trong giai đoạn thử nghiệm lâm sàng Việc chữa trị bệnh u lympho ác tính không Hodgkin đang
áp dụng hiện nay là hóa trị, xạ trị và phẫu thuật Tuy nhiên tỷ lệ chết vẫn còn cao Việc tìm ra phương thức điều trị hiệu quả vẫn đang là thách thức đối với các nhà khoa học
Cho đến nay vẫn chưa có phương pháp nào hiệu quả hơn
để điều trị bệnh u lympho ác tính không Hodgkin, dược chất phóng xạ đang được sử dụng lâm sàng đã được sử dụng là Bexxar và Zevalin, tuy nhiên, kháng thể sử dụng vẫn là kháng thể mang bản chất chuột Để khắc phục nhược điểm trên, kháng thể đơn dòng thế hệ mới có bản chất humanized là rituximab ra đời, rituximab được chọn để đánh dấu với đồng vị phóng xạ 131
I tạo thành thuốc phóng xạ 131
I-rituximab Với nhiều ưu điểm là phức hợp miễn dịch 131
I-rituximab gắn đặc hiệu lên kháng nguyên CD20 biểu hiện mật độ cao trên tế bào lympho B ung thư, diệt tế bào ung thư bằng cơ chế tác động kép, đó là cơ chế bức xạ ion hóa và cơ chế sinh học, tạo hiệu quả tiêu diệt tế bào ung thư cao
Để điều chế phức miễn dịch phóng xạ 131
I-rituximab có thể ứng dụng lâm sàng, nâng cao hiệu quả điều trị bệnh u lympho
ác tính không Hodgkin, đề tài “Nghiên cứu điều chế, phân bố sinh học và khả năng gắn với tế bào ung thư của phức hợp miễn dịch phóng xạ 131
I-rituximab” được thực hiện trong luận án này
Trang 4Mục tiêu của luận án: Bao gồm hai phần, thứ nhất là
nghiên cứu xây dựng quy trình điều chế phức miễn dịch phóng
Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu của luận án: Bao gồm
nghiên cứu đánh dấu kháng thể đơn dòng rituximab với đồng vị phóng xạ 131I để tạo thành dược chất phóng xạ và nghiên cứu hoạt tính miễn dịch, tính an toàn của 131
I-rituximab cũng như phân bố thuốc trên chuột, thỏ thí nghiệm và nghiên cứu thăm dò liều thám thính trên người bệnh
Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận án:
Về ý nghĩa khoa học: Tạo ra sản phẩm thuốc phóng xạ nhắm
đích dùng trong điều trị ung thư lymphòao B không Hodgkin bằng kỹ thuật miễn dịch phóng xạ, có tác động kép trong quá trình điều trị, vừa tiêu diệt ung thư bằng cơ chế sinh học vừa tiêu diệt ung thư bằng bức xạ ion hóa
Ý nghĩa thực tiễn:
- Có khả năng cạnh tranh với thuốc phóng xạ nhập ngoại
- Khi kết hợp với đồng vị phóng xạ, dược chất phóng xạ có tác động kép trong quá trình điều trị, vừa tiêu diệt ung thư bằng
cơ chế sinh học vừa tiêu diệt ung thư bằng bức xạ ion hóa
- Góp phần nâng cao năng lực nghiên cứu điều chế trong nước Ứng dụng điều trị miễn dịch phóng xạ tại các bệnh viện trong nước
Trang 53
- Mở ra hướng chẩn đoán và điều trị mới, có ý nghĩa thiết thực cho bệnh nhân, nâng cao sức khỏe cho cộng đồng, giảm chi phí nếu như đi nước ngoài điều trị, tiết kiệm cho xã hội
Những điểm mới của luận án: Luận án đã nghiên cứu
điều chế và kiểm tra chất lượng dược chất phóng xạ 131
rituximab dùng trong điều trị u lympho ác tính không Hodgkin Các điểm mới trong luận án là:
I Điều chế được sản phẩm 131I-rituximab để điều trị ung thư bằng phương pháp miễn dịch phóng xạ
- Kết hợp được phân tử kháng thể rituximab với đồng vị phóng xạ bằng kỹ thuật đánh dấu phóng xạ dùng chất oxy hóa, chất khử với hàm lượng tối thiểu và kỹ thuật đánh dấu phóng xạ trong luận án đảm bảo được hoạt tính của kháng thể
- Kỹ thuật gắn phức hợp 131I-rituximab lên cột sắc ký ái lực
và kỹ thuật gắn với tế bào lấy từ bệnh nhân ung thư ác tính khôg Hodgkin
Cấu trúc của luận án: Gồm 5 phần
Mở đầu: Gồm 2 trang
Tổng quan: Gồm 15 trang Giới thiệu về kháng thể đơn dòng và
phương pháp điều trị miễn dịch phóng xạ, giới thiệu về đồng vị phóng xạ dùng trong chẩn đoán và điều trị hiện nay
Phương pháp nghiên cứu: Gồm 19 trang Trình bày các phương
pháp nghiên cứu đã được sử dụng trong luận án
Kết quả và bàn luận: Gồm 54 trang Trình bày các kết quả
nghiên cứu và đánh giá, bàn luận
Kết luận và kiến nghị: Gồm 2 trang Trình bày tóm tắt kết quả
nghiên cứu theo mục tiêu đề ra và hướng tiếp theo
Trang 6sự phát triển của ung thư, điều trị các ung thư ác tính Điều trị bằng kháng thể đơn dòng là phương pháp điều trị hiệu quả đối với tế bào ung thư nhưng mức độc thấp nhất đối với tế bào bình thường Sau khi tiêm, kháng thể đi khắp nơi trong cơ thể và gắn vào các kháng nguyên đặc hiệu trên tế bào ung thư Dựa vào đặc điểm đó kháng thể đơn dòng được gắn với đồng vị phóng
xạ để phát huy hiệu quả điều trị
Rituximab được cho phép sử dụng trên người vào năm
1997, được sản xuất bằng kỹ thuật di truyền, dung hợp vùng biến đổi chuỗi nặng và nhẹ của chuột với vùng hằng định IgG1/κ của người (Hình 1.1) Kháng thể tạo thành có khả năng
tiêu diệt các tế bào B in vitro và làm giảm lượng tế bào B trong máu ngoại vi in vivo Sự giảm tế bào B trong tủy xương, lách và
các hạch lympho trong đã được nghiên cứu kỹ sau nhiều năm
điều trị trên lâm sàng
Trang 75
Hình 1.1: Cấu trúc của kháng thể rituximab
Việc sử dụng rituximab được phê chuẩn phần lớn dựa trên các thử nghiệm đối với u lympho tế bào B không Hodgkin tái phát nhẹ Tỷ lệ đáp ứng trong nhóm khó chữa này là khoảng 50% khi chỉ sử dụng rituximab
1.2 Phương pháp đánh dấu kháng thể với đồng vị phóng xạ
131
I: Từ khi kỹ thuật sản xuất kháng thể đơn dòng phát triển,
người ta đã đánh dấu với các đồng vị phóng xạ như 131
I, 67Ga, 111
In, 123I, 99mTc, 90Y … Việc chọn đồng vị phóng xạ dựa trên những đặc điểm là thời gian bán rã phải từ 6 giờ đến 7 ngày là thích hợp, năng lượng gamma từ 70 - 300 keV, độ giàu gamma đơn năng trên mỗi phân rã phải cao, không có những bức xạ đặc biệt khác, đồng vị con phải ổn định và sản phẩm ở dạng không có chất mang Phức của nhân phóng xạ và protein phải
ổn định hóa học invivo Việc chọn nhân phóng xạ thích hợp cho quá trình đánh dấu ngoài tính chất riêng của từng nhân phóng
xạ thích hợp cho chụp hình hay điều trị còn phụ thuộc vào tính chất dược động học của phân tử kháng thể
Đồng vị phóng xạ 131I được dùng trong chẩn đoán vì nó có nhiều thuận lợi là giá thành thấp, dễ sản xuất, nhưng còn nhiều
Trang 8nhược điểm là còn tồn tại những iod tự do, liều bức xạ cao cho bệnh nhân, thời gian bán rã dài Năng lượng phát tia gamma cho chụp hình của 131I là 364 keV, các mức năng lượng cực đại của 131
I là Emax: 0,25, 0,33, 0,47, 0,61, 0,81 MeV, Eav 192 keV Kháng thể gắn 131I có thể dùng cho chẩn đoán và điều trị Có hai cách để gắn phóng xạ vào 131
I, đó là phương pháp thay thế trực tiếp iot phóng xạ vào trong vị trí ortho đã hoạt hoá trên vòng thơm, hầu hết là tyrosine, cách khác là cộng hợp phân tử hữu cơ đã iod hoá với nhóm chức năng trên dây chuyền phản ứng của phân tử kháng thể
Phương pháp thay thế trực tiếp là dùng chất oxy hoá nhẹ
để bảo toàn hoạt tính miễn dịch của kháng thể, các chất oxy hóa thường dùng là chloramin T, tetrachlorodiphenylglycouril (iodogen) và hydrogenperoxidase (lactoperoxidase) Các vấn đề chủ yếu liên quan đến kỹ thuật này là sự không gắn được của tyrosine dư thừa có thể làm duỗi phân tử protein Phân tử duỗi
ra này sẽ làm thay đổi cấu trúc toàn vẹn của protein trong môi trường phản ứng Ngoài ra, sự xạ phân có thể sẽ xảy ra, làm giải phóng iod tự do và có thể sẽ tích lũy trong tuyến giáp hoặc trong dạ dày Tuy nhiên trong những năm gần đây, các nhà nghiên cứu vẫn tiến hành nghiên cứu đánh dấu kháng thể với
131I cho mục đích điều trị bệnh ngày càng nhiều
Việc điều trị u lympho ào B không Hodgkin bằng kháng thể đơn dòng được mở đầu bởi Gerald DeNardo, Sally DeNardo, David trường đại học California năm 2006 Bên cạnh
đó, kháng thể đơn dòng gắn phóng xạ 131
I-rituximab đã được thực hiện lâm sàng bởi các tác giả Sang Mao Lim và cộng sự từ năm 2007 đến nay, hiệu quả điều trị cho thấy khả năng thành
Trang 97
công là đáng kể Các tác giả Leahy MF, Turner JH (2011) cũng
đã có nhiều thành công sau hơn 10 năm điều trị lâm sàng dùng 131
I-rituximab
2 PHƯƠNG PHÁP GHIÊN CỨU
Các nghiên cứu thực nghiệm được thực hiện tại Viện Nghiên cứu hạt nhân, Bệnh viện Bạch Mai và Học viện Quân y Các phương pháp nghiên cứu và trang thiết bị, nguyên vật liệu
đã sử dụng được trình bày như sau:
2.1 Phương pháp gắn kháng thể đơn dòng rituximab với đồng vị phóng xạ 131
I: Dùng phương pháp oxy hóa khử, đồng
vị phóng xạ 131I bị oxi hóa tạo thành iodine-131[131I+] và gắn vào phân tử tyrosine tại vị trí ortho trên vòng phenol với hiệu suất gắn cao Kháng thể đơn dòng rituximab được khảo sát đánh dấu với đồng vị phóng xạ 131
I Các khảo sát hàm lượng chloramin T, khảo sát pH, khảo sát hàm lượng kháng thể, thời gian phản ứng Kết quả được tính toán bằng phần mềm trên máy quét phóng xạ Bioscan hoặc Cyclone Hiệu suất đánh dấu của kháng thể được tính toán bằng cách chia hoạt độ phóng xạ tại vị trí đỉnh 131
I- rituximab cho hoạt độ tổng cộng
2.2 Phương pháp sắc ký lọc gel dùng sephadex G25: Để tách
phân đoạn kháng thề đánh dấu với đồng vị phóng xạ ra khỏi hỗn hợp phản ứng, cột sephadex PD10 pharmacia, GE Healthcare được sử dụng Phức hợp 131I-rituximab được tách ra khỏi 131I tự do và các thành phần khác Dung môi rửa giải là nước muối sinh lý 0,9% hoặc đệm PBS Vận tốc rửa giải là 30cm3/giờ Hoạt độ phóng xạ của phức hợp và hiệu suất đánh dấu được xác định
2.3 Phương pháp xác định độ tinh khiết hóa phóng xạ:
Dùng phương pháp điện di và các phương pháp sắc ký lớp
Trang 10mỏng TLC, TCC, sử dụng các bản mỏng thích hợp như TLC aluminum sheet silica gel 60 F254 TecControl Biodex 150771
Độ tinh khiết hóa phóng xạ và hiệu suất đánh dấu được tính toán bằng cách scan băng sắc ký trên thiết bị quét phóng xạ Bioscan hoặc máy phóng xạ tự chụp Cyclone, tính toán bằng phần mềm OptiQuan 5.0, phần mềm Biochrom Thử theo Tiêu chuẩn cơ sở DPPX-13:2010 ISO 17025
2.4 Phương pháp xác định độ tinh khiết hạt nhân phóng xạ:
Bằng các phương pháp đo phổ gamma trên hệ phổ kế gamma, thử theo Tiêu chuẩn cơ sở (TCCS-DPPX-14:2010 ISO 17025) Chấm 2 l dung dịch mẫu lên tâm giấy lọc hình tròn có đường kính là 1,5 cm Đo tốc độ đếm trên phổ kế gamma ORTEC® DSPEC jrTM (USA) Nhận diện các hạt nhân phóng xạ phát tia gamma qua các đỉnh năng lượng ghi được trên phổ kế gamma Tính diện tích các đỉnh gamma trên chương trình GammaVision 32 và phần trăm hoạt độ phóng xạ 131I tại đỉnh
364 keV so với tổng hoạt độ Hoạt độ phóng xạ của 131I lớn hơn 99,90 %
2.5 Các phương pháp kiểm tra chất lượng sinh học: Sản
phẩm được kiểm tra độ vô khuẩn, chí nhiệt tố, kiểm tra phân bố sinh học trên động vật Thử nội độc tố vi khuẩn được thực hiện trên máy Endosafe PTS100 Thử theo Tiêu chuẩn cơ sở DPPX-15:2010 ISO 17025 Thử vô khuẩn bằng phương pháp cấy thuốc vào các môi trường thioglicolat ủ ở nhiệt độ 30 - 350
C, môi trường soya - bean casein ủ ở nhiệt độ 20 -250
C, quan sát
14 ngày liên tục, thử theo Tiêu chuẩn cơ sở DPPX-13:2010 ISO
17025 Kiểm tra tính ổn định bằng cách bảo quản ở điều kiện
40C và -200C Sau các khoảng thời gian lấy sản phẩm phân tích
độ tinh khiết hoá phóng xạ bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng TLC Để làm ổn định sản phẩm trong huyết thanh người, pha
Trang 119
loãng dung dịch I- rituximab đến nồng độ 100 MBq/ml, thêm
vào đó huyết thanh và ủ 370C tại các khoảng thời gian Sản phẩm phân tích bằng phương pháp TLC hoặc điện di, đo đếm hoạt độ phóng xạ, tính toán phần trăm tỉ lệ giữa các phần trên hoạt độ tổng Phân bố sinh học trên chuột được thực hiện bằng cách tiêm thuốc vào tĩnh mạch đuôi chuột, chia chuột thành nhóm, 5 chuột, giết và mỗ theo các khoảng thời gian lấy các cơ quan nội tạng như gan, lách, thận, cơ, xương, phổi, tim, máu, ruột, dạ dày, bọng đái, đuôi, cân và đo đếm phóng xạ, tính phân
bố theo liều tiêm trên gam (ID%/g)
2.6 Các nghiên cứu in vitro và in vivo
- Nuôi cấy và tăng sinh tế bào ung thư Raij: Môi trường
nuôi cấy và bảo quản tế bào là RPMI có bổ sung thêm 10% FBS và 1% Penicillin/Streptomycin Tế bào sau khi gieo được nuôi trong tủ nuôi cấy tế bào, duy trì nhiệt độ ở 370C và nồng
độ CO2 là 5% Kiểm tra tế bào và thay môi trường 2-3 lần/ tuần Sau 1-2 tuần nuôi cấy, tế bào phát triển, khi đạt mật độ cấy chuyền sang các chai nuôi mới Sau thời gian nuôi cấy 8 -
10 ngày, thu hoạch tế bào và thêm đệm PBS để có nồng độ tế bào là 107 tế bào/ml
- Kiểm tra tính an toàn và đào thải trên động vật: Tiêm vào
tĩnh mạch tai thỏ dung dịch 131
I – rituximab với các liều từ 500
Ci đến 5000 Ci, thỏ được chia thành 6 nhóm, mỗi nhóm 5 con Tiêm tiền liều bằng rituximab, mỗi con 100 mcg theo đường tĩnh mạch tai Nhóm đối chứng tiêm nước muối sinh lý 0,9% Thỏ được gây mê bằng Thiopental và chụp hình phân bố thuốc trên máy máy xạ hình SPECT với tốc độ 10 cm/ phút, độ phân giải 256 x 1024 pixel tại các thời điểm sau tiêm theo các
Trang 12khoảng thời gian Xác định đào thải thuốc theo các thông số đếm trên máy SPECT
- Phương pháp gắn 131 I-rituximab với kháng nguyên CD20:
Kháng nguyên CD20 được cố định lên cột sắc ký ái lực dựa trên ái lực của niken nitroacetic acid agarose với đuôi histag trên phân tử kháng nguyên CD20 Sau khi gắn kháng nguyên CD20 lên cột niken NTA agarose Phức kháng thể 131
rituximab được ủ trong đệm tris-HCl Sau khi ủ, lấy hạt ra, rửa với Tris-HCl nhiều lần, lần sau cùng thay bằng đệm phosphate PBS, sau đó tách phần gắn không đặc hiệu và phần tự do, đo hoạt độ phóng xạ và tính phần trăm hoạt tính gắn
I Phương pháp gắn 131 I-rituximab với tế bào bạch cầu bệnh nhân NHL: Thực nghiệm gắn 131I-rituximab với tế bào được tiến hành theo phương pháp Lindmo Tách tế bào lympho với
số lượng đủ tế bào để làm ống đôi Cho 131
I-rituximab ủ với tế bào bạch cầu lấy từ bệnh nhân được chẩn đoán là u lympho ác tính không Hodgkin, có dấu ấn CD20 (+) Phản ứng gắn với tế bào được thực hiện trong các ống thủy tinh trong đệm PBS 0,15
mM, pH 7 và so sánh với các ống gắn không đặc hiệu Non Specific Binding (NSB) và các ống tổng
- Gắn 131 I-rituximab với tế bào Raji và nguyên bào sợi: Cho
phức hợp 131
I-rituximab gắn với một lượng tế bào ung thư Raji Các ống gắn không đặc hiệu Non Specific Binding (NSB) và ống gắn nguyên bào sợi được thực hiện đồng thời Sau khi ủ, đo hoạt độ phóng xạ của các ống ằng cách dùng hệ lọc milipore 96
lỗ, rửa 3 lần, thu màng lọc chứa tế bào, đo hoạt độ phóng xạ trên máy đo gamma cùng với ống tổng Tính đặc hiệu của kháng thể được xác định dựa trên hằng số Bmax và Kd bằng
Trang 1311
phương pháp phân tích Schatchard dùng phần mềm Graphpad Prism 7,01
* Các trang thiết bị chủ yếu đƣợc sử dụng
- Máy phóng xạ tự chụp Cyclone Plus Phosphor Scanner, B431200, PerkinElmer, Mỹ
- Máy đo hoạt độ phóng xạ Capintec, miền đo từ 8000mCi, Mỹ
0,001 Hệ phổ kế gamma đa kênh, độ phân giải tại đỉnh năng lượng 1332keV của Co-60 là 1,9keV của hãng Ortec, Mỹ
- Máy SPECT hãng SIEMENT
- Máy sắc ký lỏng cao áp FPLC 6850A, Perkin Elmer, cột Agilentb Zorbax GF-250
- Máy đo nhanh nội độc tố vi khuẩn Endosafe - PTSTM Portable Test System 100, Mỹ
- Phòng sạch vô trùng, class <10.000
- Tủ hút vô trùng, Class 100, Mỹ
* Nguyên liệu, hoá chất chủ yếu: Đồng vị phóng xạ 131I dạng
Na131I sản xuất tại Viện Nghiên cứu hạt nhân, nồng độ phóng
xạ 100-200 mCi/ml Rituximab, chai 500 mg/50ml, hãng ROCHE Kháng nguyên CD20 mua từ hãng fitzgerald, Mỹ Cột gel Sephadex G25 mua từ hãng Amersham Bioscences Ni-NTA Agarose R901-15, hãng invitrogen, Mỹ Các hoá chất chloramin T, natri metabisulphite, mua từ hãng Sigma Aldrich
3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1 Kết quả đánh dấu kháng thể rituximab với đồng vị phóng xạ 131
I
- Kết quả khảo sát đánh dấu phóng xạ: Hàm lượng ChT tham
gia trong phản ứng đánh dấu trong khoảng 20 - 200 g để oxy hóa từ 5 - 50 mCi 131
I (Hình 4.1A) Hàm lượng kháng thể là khoảng 100 g để có thể gắn với mức tối thiểu hoạt độ phóng