Ứng dụng của sắc ký lọc gel (GFC) trong phân tích thực phẩm Báo cáo khoa học

Bài báo cáo được tác giả thực hiện tại Trường Đại học Bách khoa TPHCM. Bài báo cáo nêu chi tiết cụ thể về tổng quan những đặc điểm của sắc ký lọc gel GFC, nguyên lý của sắc ký gel, phân loại các loại gel khác nhau, nêu ra những đặc điểm quan trọng, từ đó định hướng ứng dụng của GFC trong phân tích thực phẩm. Bài báo cáo là tài liệu hay, ý nghĩa cho các bạn đang học sau đại học có học môn “Ứng dụng của sắc ký trong phân tích thực phẩm” để làm tài liệu tham khảo trong quá trình học tập.

Trang 1

HCM UNIVERSITY OF TECHNOLOGY

FACULTY OF CHEMICAL ENGINEERING

BÁO CÁO KHOA HỌC

ỨNG DỤNG CỦA SẮC KÝ TRONG PHÂN TÍCH THỰC PHẨM

Trang 2

GIỚI THIỆU SẮC KÝ GEL

Trang 3

Sắc kí gel dùng để tách các phân tử dựa

bằng liên kết hóa học nên thành phần của

trực tiếp đến độ giải li (resolution)

Trang 4

Thường được sử dụng để tinh

polysaccharides, nucleic acids và

sinh học

Trang 5

NGUYÊN LÝ CỦA SẮC KÝ GEL

Trang 6

Trang 7

- Gel được nhồi vào cột tạo thành đệm, đệm là mạng lưới lỗ xốp hình thành từ hạt hình cầu bền vật lý, bền hóa học và trơ Lớp gel cân bằng với dung dịch đi qua và dung dịch điền đầy vào mạng lưới lỗ xốp và khoảng không giữa các hạt

- Chất lỏng bên trong lỗ xốp được xem là pha tĩnh, chất lỏng bên ngoài lỗ xốp là pha động

- Mẫu được đưa vào cột, Pha động kéo mẫu di chuyển qua cột

- Phân tử khuếch tán vào và ra khỏi lỗ xốp, những phân tử nhỏ đi vào sâu trong lỗ xốp và bị giữ lại trong cột lâu hơn

- Pha động qua cột liên tục, các phân tử lớn không thể chui vào các lỗ xốp nên sẽ đi ra khỏi cột trước Những phân tử nhỏ khuếch tán vào và ra khỏi lỗ xốp nên ra khỏi cột sau

Trang 8

PHỔ ĐỒ SẮC KÝ GEL

Trang 9

Kết quả của quá trình sắc kí gel thường được biểu diễn trên giản đồ giải li hay phổ đồ sắc ký cho thấy sự khác nhau về nồng độ (liên quan đến mức độ hấp thu tia UV ở vùng 280 nm) của các thành phần trong mẫu khi chúng được giải li khỏi cột dựa trên trật tự về kích thước phân tử Trên giản đồ chia

ra làm 3 loại phân tử Những phân tử không vào mạng lưới đệm mà được giải li thẳng ra khỏi cột với cùng tốc độ cùa dòng lưu chất của pha động (buffer) ở thể tích Vo (xét trên 1 đơn vị thể tích cột), gọi là thể tích khoảng trống (void volume) Những phân tử có một phần đi vào mạng lưới đệm silicagel, rồi mới giải li ra khỏi cột theo trật tự kích thước nhỏ hơn sẽ ra trước Và còn lại là những phân tử được giữ hoàn toàn trong mạng lưới lỗ xốp và đi ra khỏi cột trước giá trị tổng thể tích cột Vt (total column volume) của pha động đi qua cột

Trang 10

Cách xác định thể tích

Ve (elution volume) trên sắc ký đồ:

Khi thể tích của mẫu quá nhỏ so với thể tích rửa giải (Ve) thì Ve được xác định từ vị trí ban đầu đến vị trí cao nhất của mũi sắc ký

Trạng thái của mỗi cấu tử được biểu diễn liên quan đến thể tích giải li của chúng được đo trực tiếp từ

phổ đồ sắc ký Có 3 cách:

Trang 11

Khi thể tích của mẫu lớn không thể bỏ qua so với thể tích rửa giải (Ve) thì Ve được xác định

từ vị trí ½ thể tích mẫu đến vị trí cao nhất của mũi sắc ký

Trang 12

Khi thể tích của mẫu quá lớn tạo nên mũi sắc ký

Trang 13

gelmatrix o

t

o e

i

o e

d

V V

V

V V

V

V V

o e

av

V V

V

V K

Trang 14

gelmatrix o

t

o e

i

o e

d

V V

V

V V

V

V V

o e

av

V V

V

V K





- Vo là thể tích khoảng trống, cột được nhồi tốt thì thể tích Vo xấp xỉ 30% thể tích cột

- Vi là thể tích pha động bên trong mạng lưới,

trong thực tế Vi rất khó xác định do phải xác

định thể tích mạng lưới gel, do đó để thuận

tiện thì Vi= Vt-Vo

Trang 15

Đường cong chọn lọc và lựa chọn phương pháp

Trang 16

Đường cong chọn lọc và lựa chọn phương pháp

tử Tỷ trọng và kích thước giống nhau của các phân tử

- Bằng cách vẽ đường cong đi qua những điểm giá trị

dựng được đường cong chọn lọc

- Phương pháp lọc gel được chọn lựa sao cho khối lượng phân tử lớn được giải li ở thể tích khoảng trống

- Những hợp chất có khối lượng phân tử nhỏ nhất

Trang 17

uf

Độ phân giải (độ giải li)

Trang 18

Độ phân giải (độ giải li)

Độ giải li là độ phân tách giữa các peak, chịu ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố: tỷ lệ thể tích mẫu với thể tích cột, tốc độ chảy, kích thước cột, kích thước hạt gel, độ phân bố kích thước hạt gel, tỷ trọng cột nhồi, độ xốp của hạt và độ nhớt của pha động Thành công của phương pháp phân tích sắc ký gel lựa chọn điều kiện sao cho độ chọn lọc cao và khống chế sự của ngoại cảnh trong quá trình tách

Vr1 và Vr2 là thể tích lưu chất ra khỏi cột của 2 peak liền kề tính ở tâm peak

W1 và W2 độ rộng của các peak

(Vr2 – Vr1) là khoảng cách giữa các peak

và 1/2 (W1 + W2) độ rộng trung bình của các peak

Trang 19

Độ phân giải

Trang 20

Phân tách với độ giải li cao (High resolution fractionation):

trên sự khác nhau về kích thước Mục đích là

khối lượng phân tử hoặc phân tích sự phân

bố khối lượng phân tử

Độ phân giải

Trang 21

PHÂN LOẠI GEL

Việc tách trong sắc ký gel tùy vào đặc điểm của lỗ rỗng trong hệ mạng không gian ba chiều Hạt gel phải có:

Trang 22

Có hai loại nguyên liệu để chế tạo gel là xerogel

và aerogel

tạo mạng ngang, khi cho tiếp xúc với dung môi gel

sẽ trương nở để tạo thành mạng gel với các lỗ trống tương đối mềm

vd: thủy tinh có lỗ rỗng hay silica có lỗ rỗng

Trang 23

Khi lựa chọn gel sử dụng cần cần xem xét 2 yếu tố:

cao hay tách thành từng nhóm hợp chất)

tách

Serphacryl, Superose, Sephadex, Sephadex LH - 20

Trang 24

SUPERDEX

Là sự lựa chọn cho độ giải li cao, thời gian ngắn và độ thu hồi cao

Là một loại composite dựa trên liên kết ngang giữa các hạt rỗng agrose đến mạng dextran bằng liên kết cộng hóa trị

Có độ bền vật lý và hóa học cao do mạng agrose liên kết ngang và các tính chất lọc gel tốt do chuỗi dextran Độ bền cơ hoc của Superdex cho phép những dung môi giải li có độ nhớt cao như ure 8M chảy qua với tốc độ dòng khá lớn Loại gel này có thể chịu được tốc độ dòng cao trong suốt quá trình ổn định hay lúc rửa cột Tính bền giúp Superdex phù hợp cho sử dụng trong công nghiệp với tốc độ dòng cao, nhanh và hiệu quả làm sạch tại chỗ Với điều kiện làm việc bình thường những tương tác giữa protein và gel Superdex được bỏ qua khi sử dụng dung môi có nồng độ ion trong khoảng 0,15M đến 1,5M

Trang 25

Được sản xuất với 2 loại kích thước hạt (13mm và

Peptide, Superdex 30, Superdex 75 and Superdex 200)

phân giải cao với thể tích mẫu nhỏ

nghiệp

SUPERDEX

Trang 26

SUPERDEX

Trang 27

Trang 28

Sephacryl HR là một loại composite được hình thành bởi liên kết ngang cộng hóa trị giữa allyl dextran với N,N’-methylane bisacrylamine tạo nên mạng ưa nước có độ bền cơ học cao

SEPHACRYL

Trang 29

SEPHACRYL

Trang 30

Superose có thể dùng trong các phân đoạn khối lượng phân tử

rộng nhưng không phù hợp cho phân tách quy mô công nghiệp

SUPEROSE

Superose là loại gel bền vật lý và hóa học cao dựa trên liên kết ngang của phân

tử lỗ xốp agarose

Một vài tương tác kỵ nước cần chú ý, đặc trưng là các phân tử kỵ nước nhỏ aromatic peptides, membrane proteins, lipoproteins có thể được giải li chậm hơn dự đoán Tuy nhiên trong một số ứng dụng những tương tác này có thể làm tăng độ giải li của quá trình phân tách

Trang 31

Superose được sản xuất với các kích thước hạt khác nhau (11

µm, 13 µm and 30 µm) và với các độ chọn lọc khác nhau

SUPEROSE

Trang 32

SEPHADEX

Trang 33

SEPHADEX

Sephadex dùng để tách nhanh những nhóm có khối lượng phân tử nhỏ, khử muối, đổi dung môi và làm sạch mẫu

Sephadex được tạo thành từ các liên kết ngang của

dextran với epichlorohydrin

Các loại khác nhau của Sephadex là do mức độ khác nhau của liên kết ngang và vì vậy nó có độ trương nở và độ chọn lọc cho các kích thước phân tử đặc trưng

Trang 34

SEPHADEX

Trang 35

SEPHADEX

Sephadex G-10 phù hợp cho việc tách những phân tử

labeled protein hay DNA Loại gel này còn được sử dụng

để loại bỏ các nucleotic nhỏ ra khỏi các chuỗi axit nucleic mạch dài

Sephadex G-25 được ứng dụng chính để tách nhóm protein dạng cầu Loại gel này hiệu quả trong việc khử muối hay những chất bẩn nhỏ ra khỏi những phân tử có

Trang 36

SEPHADEX LH-20

Trang 37

- Sephadex LH-20 được tạo thành từ những chuỗi hydroxypropylated dextran có liên kết ngang đến mạng lưới polysaccharide Loại này có thể trương nở trong nước hoặc dung môi hữu cơ

- Sephadex LH-20 phù hợp cho giai đoạn tinh chế ban đầu trước khi tinh chế với độ tinh khiết cao bằng sắc ký trao đổi ion hay sắc ký pha đảo hay nó có thể dung trong giai đoạn tinh chế với độ tinh khiết cao đối với đồng không đối quang

- Sephadex LH-20 có thể tách những cấu tử bằng sự phaanchia giữa mạng gel và dung môi hữu cơ Gel

SEPHADEX LH-20

Trang 38

SEPHADEX LH-20

Trang 39

SEPHADEX LH-20

Sephadex LH-20 được sử dụng tách sơ bộ amidobenzoic acid và 4-acetamidobenzoic acid

Trang 40

2-acet-ỨNG DỤNG SẮC KÝ GEL

separations):

Loại bỏ những phân tử nhỏ như muối,

lớn Thường được sử dụng để tinh chế protein kết hợp khử muối và đổi dung môi

Trang 41

ỨNG DỤNG SẮC KÝ GEL

resolution fractionation):

dựa trên sự khác nhau về kích thước Mục đích là phân lập một hoặc nhiều cấu tử để

tích sự phân bố khối lượng phân tử

Trang 42

42

ỨNG DỤNG SẮC KÝ LỌC GEL

Sử dụng cột sắc ký gel để phân tách dựa trên sự khác biệt về khối lượng phân tử để loại muối và những phân tử nhỏ Cột được nhồi với Sephadex G-25, chỉ trong một bước mẫu sẽ được loại bỏ muối, những phân tủ nhỏ

Trang 43

protein bằng AKTA prime

Trang 44

5ml với chương trình AKTA prime cài đặt sẵn

clorua 0,15M, pH=7

tia UV (280nm) và tín hiệu đầu ra của muối được xác định bằng độ dẫn điện

Trang 45

THANK YOU!

Định dạng
Số trang	45
Dung lượng	1,67 MB