Nghiên cứu sản xuất oligocarrageenan từ rong sụn kappaphycus alvarezii (doty) doty bằng phương pháp enzyme và ứng dụng trong chế biến và bảo quản surimi

TÓM TẮT NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN Đề tài luận án: Nghiên cứu sản xuất oligocarrageenan từ rong sụn Kappaphycus alvarezii Doty Doty bằng phương pháp enzyme và ứng dụng trong chế biế

MỤC LỤC

MỤC LỤC i

DANH MỤC KÝ HIỆU iv

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT v

DANH MỤC CÁC BẢNG vi

DANH MỤC CÁC HÌNH ix

TÓM TẮT NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN xiv

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 3

1.1 GIỚI THIỆU VỀ RONG SỤN VÀ CARRAGEENAN TỪ RONG SỤN 3

1.1.1 Giới thiệu về rong sụn 3

1.1.2 Giới thiệu về carrageenan 4

1.1.3 Tính chất lý hoá của carrageenan 7

1.1.4 Giới thiệu một số kỹ thuật sản xuất carrageenan 10

1.2 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC VỀ OLIGOCARRAGEENAN 13

1.2.1 Tình hình nghiên cứu oligocarrageenan ở Việt Nam 13

1.2.2 Tình hình nghiên cứu oligocarrageenan ở nước ngoài 14

1.3 GIỚI THIỆU VỀ ENZYME POLYSACCHARASE 14

1.3.1 Enzyme viscozyme L và khả năng sử dụng trong sản xuất carrageenan từ rong sụn 14

1.3.2 Enzyme Termamyl 120L và khả năng sử dụng trong thủy phân carrageenan 16

1.4 MỘT SỐ KỸ THUẬT TINH SẠCH CARRAGEENAN VÀ OLIGOCARRAGEENAN 17

1.5 PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH THÀNH PHẦN VÀ CẤU TRÚC CỦA CARRAGEENAN 19

1.5.1 Phương pháp phân tích thành phần và cấu trúc của carrageenan 19

1.5.2 Nghiên cứu cấu trúc của carrageenan 22

1.6 GIỚI THIỆU VỀ NGHIÊN CỨU ĐỘC CHẤT 24

1.7 SURIMI VÀ KHẢ NĂNG SỬ DỤNG CARRAGEENAN, OLIGOCARRAGEENAN

TRONG SẢN XUẤT SURIMI 26

1.7.1 Giới thiệu về surimi 26

1.7.2 Nghiên cứu ứng dụng carrageenan và oligocarrageenan trong đồng tạo gel thực phẩm 30

CHƯƠNG 2 NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 32

2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU 32

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 33

2.2.1 Phương pháp lấy mẫu và phân tích 33

2.2.2 Phương pháp tinh sạch, xác định cấu trúc và độc chất 35

2.2.3 Phương pháp bố trí thí nghiệm 41

2.4 HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ CHỦ YẾU SỬ DỤNG TRONG LUẬN ÁN 56

2.4.1 Hóa chất 56

2.4.2 Thiết bị chủ yếu sử dụng trong luận án 56

2.5 PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU 57

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 58

3.1 NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG ENZYME VISCOZYME L TRONG SẢN XUẤT CARRAGEENAN TỪ RONG SỤN KAPPAPHYCUS ALVAREZII (DOTY) DOTY 58

3.1.1 Tối ưu hóa quá trình xử lý rong sụn bằng enzyme viscozyme L 58

3.1.2 Xác định chế độ chiết carrageenan 66

3.2 NGHIÊN CỨU TINH SẠCH CARRAGEENAN THU NHẬN TỪ RONG SỤN 77

3.2.1 Xác định nhiệt độ tinh sạch 77

3.2.2 Xác định nồng độ ethanol kết tủa protein trong tinh sạch carrageenan 78

3.2.3 Xác định chế độ kết tủa carrageenan trong dung dịch car sau kết tủa protein 80

3.2.4 Đề xuất quy trình tinh sạch carrageenan bằng ethanol 82

3.3 NGHIÊN CỨU THỦY PHÂN CARRAGEENAN THÀNH OLIGOCARRAGEENAN BẰNG PHƯƠNG PHÁP SỬ DỤNG ENZYME POLYSACCHARASE 86

3.3.1 Nghiên cứu lựa chọn loại enzyme polysaccharase thích hợp cho thủy phân carrageenan thành oligocarrageenan 86

3.3.2 Nghiên cứu xác định điều kiện thích hợp cho quá trình thủy phân carrageenan

thành oligocar bằng enzyme Termamyl 120L 88

3.4 NGHIÊN CỨU TINH SẠCH VÀ XÁC ĐỊNH MỘT SỐ ĐẶC TÍNH CẤU TRÚC CỦA OLIGOCARRAGEENAN 97

3.4.1 Xác định nhiệt độ tinh sạch 97

3.4.2 Xác định nồng độ ethanol kết tủa phân đoạn protein 98

3.4.3 Xác định chế độ kết tủa oligocarrageenan trong dung dịch oligocarrageenan sau kết tủa protein 100

3.4.4 Đề xuất quy trình tinh sạch oligocarrageenan bằng ethanol 103

3.4.5 Đánh giá độ sạch của oligocarrageenan tinh sạch 104

3.4.6 Xác định một số đặc tính cấu trúc của oligocarrageenan 107

3.5 NGHIÊN CỨU ĐÁNH GIÁ ĐỘC CHẤT HỌC CỦA CARRAGEENAN VÀ OLIGOCARRAGEENAN 121

3.5.1 Đánh giá độc tính liều đơn 121

3.5.2 Đánh giá độc tính liều lặp lại 125

3.6 THỬ NGHIỆM SỬ DỤNG CARRAGEENAN VÀ OLIGOCARRAGEENAN TRONG SẢN XUẤT SURIMI TỪ CÁ ĐỔNG 134

3.6.1 Thử nghiệm sử dụng carrageenan trong sản xuất surimi từ cá đổng 134

3.6.2 Thử nghiệm sử dụng oligocarrageenan trong sản xuất surimi từ cá đổng 145

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 157

DANH MỤC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ 159

TÀI LIỆU THAM KHẢO 160 PHỤ LỤC

GLU: đường niệu

JECFA: Ủy ban Chuyên gia về Phụ gia Thực phẩm

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Thành phần hóa học cơ bản của rong sụn 4

Bảng 1.2 Một số tính chất đặc trưng của các loại carrageenan 8

Bảng 1.3 Độ dịch chuyển hoá học sigma từ cơ sở dữ liệu SUGABASE của dạng glucose và galactose 21

Bảng 2.1 Thành phần hóa học chính của cá Đổng cờ 33

Bảng 2.2 Tóm tắt thiết kế nghiên cứu đối chứng 39

Bảng 2.3 Đánh giá các biểu hiện lâm sàng trên chuột thí nghiệm an toàn 39

Bảng 2.4 Tóm tắt thiết kế nghiên cứu đối chứng không làm mù 40

Bảng 2.5 Các tiêu chí đánh giá kết quả trong nghiên cứu độc tính 41

Bảng 2.6 Nhiệt độ và pH tối thích của các enzyme 48

Bảng 3.1 Điều kiện thí nghiệm được chọn 58

Bảng 3.2 Kết quả ma trận thực nghiệm trực giao cấp I, k = 3 58

Bảng 3.3 Tối ưu hóa quá trình xử lý rong sụn bằng enzyme Viscozyme L theo hàm mục tiêu sức đông của carrageenan 61

Bảng 3.4 Kết quả thí nghiệm leo dốc theo hàm mục tiêu hiệu suất thu car từ rong sụn 63

Bảng 3.5 Kết quả thí nghiệm theo hướng leo dốc của hàm chập YL 64

Bảng 3.6 Kết quả thí nghiệm leo dốc cho hàm mục tiêu YL 65

Bảng 3.7 So sánh các thí nghiệm leo dốc theo từng hàm mục tiêu 65

Bảng 3.8 Kết quả đánh giá chất lượng carrageenan theo phương pháp xử lý bằng enzyme với phương pháp xử lý bằng hóa chất 74

Bảng 3.9 Thành phần hóa học chính của mẫu carrageenan trước tinh sạch 77

Bảng 3.10 Nhiệt độ nóng chảy và nhiệt độ đông đặc của carrageenan thô 77

Bảng 3.11 Ảnh hưởng của nồng độ ethanol tới hàm lượng protein, lipid, carbohydrate trong kết tủa và trong dung dịch car sau tinh chế 78

Bảng 3.12 Ảnh hưởng của nồng độ ethanol tới khối lượng kết tủa car và hàm lượng protein, lipid, car còn lại trong dung dịch 80

Bảng 3.13 Ảnh hưởng của thời gian đến khối lượng kết tủa carrageenan 82

Bảng 3.14 Kết quả phân tích một số chỉ tiêu hóa lý của carrageenan trước và sau tinh sạch 84

Bảng 3.15 Kết quả xác định một số chỉ tiêu vi sinh vật của carrageenan trước và sau tinh sạch 84

Bảng 3.16 Thành phần hóa học chính của mẫu oligocarrageenan trước tinh sạch 97

Bảng 3.17 Nhiệt độ đông đặc và tan chảy của oligocarrageenan thô 98

Bảng 3.18 Ảnh hưởng của nồng độ ethanol tới hàm lượng protein, lipid, carbohydrate trong kết tủa và trong dung dịch oligocar sau tinh chế 99

Bảng 3.19 Ảnh hưởng của nồng độ ethanol tới khối lượng kết tủa oligocarrageenan và hàm lượng protein, lipid, oligocar còn lại trong dung dịch 101

Bảng 3.20 Ảnh hưởng của thời gian đến khối lượng kết tủa oligocarrageenan 102

Bảng 3.21 Kết quả phân tích một số chỉ tiêu hóa lý của oligocarrageenan trước và sau tinh sạch 104

Bảng 3.22 Kết quả xác định một số chỉ tiêu vi sinh vật của oligocarrageenan trước và sau tinh sạch 105

Bảng 3.23 Kết quả phân tích thành phần hoá học của oligocarrageenan 110

Bảng 3.24 Một số dải hấp thụ chính trên phổ hồng ngoại 111

Bảng 3.25 Độ dịch chuyển hoá học 13C-NMR 112

Bảng 3.26 So sánh độ dịch chuyển hóa học trong phổ 13C-NMR của mẫu carrageenan chuẩn (của Hãng Sigma) 114

Bảng 3.27 Độ dịch chuyển hóa học của các proton ở vị trí α 115

Bảng 3.28 Liên kết từ phổ 1H-1H COSY 118

Bảng 3.29 Tương tác của các proton trên phổ ROESY 120

Bảng 3.30 Độ dịch chuyển hoá học 13C NMR và 1H NMR của oligocarrageenan 121

Bảng 3.31 Biểu hiện lâm sàng của chuột nhắt uống carrageenan và oligocarrageenan 122

Bảng 3.32 Kết quả xét nghiệm nước tiểu chuột lang 127

Bảng 3.33 Kết quả xét nghiệm huyết học - sinh hóa máu, carrageenan, 21 ngày 128

Bảng 3.34 Kết quả xét nghiệm huyết học - sinh hóa máu, carrageenan, 42 ngày 129 Bảng 3.35 Kết quả xét nghiệm huyết học - sinh hóa máu, oligocarrageenan, 21 ngày 130 Bảng 3.36 Kết quả xét nghiệm huyết học - sinh hóa máu, oligocarrageenan, 42 ngày 130 Bảng 3.37 Trọng lượng tươi trung bình của các cơ quan gan, lách, thận (2 bên) của lần giải phẫu thứ nhất (ngày 21) 131 Bảng 3.38 Trọng lượng tươi trung bình của các cơ quan gan, lách, thận (2 bên) của lần giải phẫu thứ hai (ngày 42) 132 Bảng 3.39 Kết quả đánh giá surimi sản xuất thử nghiệm 145 Bảng 3.40 Kết quả đánh giá surimi sản xuất thử nghiệm 156

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Hình ảnh về rong sụn Kappaphycus alvarerii (Doty) Doty 3

Hình 1.2 Cấu trúc của carrageenan với luân phiên liên kết của 1,3 βD Galactose pyranose và 1,4 αD Galactose pyranose 5

Hình 1.3 Cấu trúc của κ-carrageenan 6

Hình 1.4 Cấu trúc của -carrageenan 6

Hình 1.5 Cấu trúc của -carrageenan 6

Hình 1.6 Sự chuyển hóa mu-carrageenan thành κ-carrageenan trong môi trường kiềm 7

Hình 1.7 Sự chuyển hóa nu-carrageenan thành - carrageenan trong môi trường kiềm 7

Hình 1.8 Sự chuyển hóa -carrageenan thành theta-carrageenan trong môi trường kiềm 7

Hình 1.9 Vị trí tồn tại của carrageenan trong rong sụn 15

Hình 1.10 Quá trình thủy phân carrageenan thành oligocarrageenan 16

Hình 1.11 Quá trình thủy phân tinh bột của enzyme amylase 17

Hình 2.1 Hình ảnh về nguyên liệu rong sụn (K alvarrezii (Doty) Doty) 32

Hình 2.2 Hình ảnh về cá đổng cờ (Nemipterus virgatus (Tanaka, 1916)) 32

Hình 2.3 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát của luận án 42

Hình 2.4 Sơ đồ nghiên cứu sản xuất carrageenan từ rong sụn 43

Hình 2.5 Sản xuất carrageenan theo phương pháp xử lý rong bằng NaOH 46

Hình 2.6 Sơ đồ bố trí thí nghiệm lựa chọn được loại enzyme amylase thích hợp cho thủy phân car thành oligocar 48

Hình 2.7 Mô hình liên kết giữa carrageenan và protein 50

Hình 2.8 Quy trình công nghệ sản xuất surimi 50

Hình 2.9 Sơ đồ nghiên cứu ảnh hưởng của việc phối trộn carrageenan, oligocarrageenan đến chất lượng của surimi trong quá trình chế biến 53

Hình 2.10 Sơ đồ nghiên cứu ảnh hưởng của việc phối trộn carrageenan, oligocarrageenan đến chất lượng của surimi trong quá trình bảo quản đông 54

Hình 2.11 Sơ đồ nghiên cứu ảnh hưởng của quá trình hấp đến hiệu suất thu hồi surimi

theo thời gian bảo quản đông 55

Hình 2.12 Sơ đồ nghiên cứu ảnh hưởng của việc phối trộn carrageenan, oligocarrageenan đến độ đồng nhất của surimi trong quá trình bảo quản đông 56

Hình 3.1 Ảnh hưởng của thời gian chiết đến hiệu suất thu hồi carrageenan 66

Hình 3.2 Ảnh hưởng của thời gian chiết đến sức đông và độ nhớt của carrageenan 66

Hình 3.3 Ảnh hưởng nhiệt độ chiết đến hiệu suất thu nhận carrageenan 68

Hình 3.4 Ảnh hưởng nhiệt độ chiết đến sức đông và độ nhớt của carrageenan 68

Hình 3.5 Ảnh hưởng của tỷ lệ nước/rong đến hiệu suất thu carrageenan 70

Hình 3.6 Ảnh hưởng của tỷ lệ nước/rong đến sức đông và độ nhớt của carrageenan 70

Hình 3.7 Sơ đồ quy trình sản xuất carrageenan từ rong sụn K alvarezii (Doty) Doty bằng phương pháp sử dụng enzyme Viscozyme L 72

Hình 3.8 Hình ảnh vi ảnh hiển vi thành tế bào rong sụn sau khi xử lý NaOH và Viscozyme L 74

Hình 3.9 Hình ảnh về sản phẩm carrageenan sản xuất theo quy trình sử dụng NaOH và quy trình sử dụng enzyme Viscozyme L xử lý rong sụn 75

Hình 3.10 Quy trình tinh sạch carrageenan tinh sạch car bằng cách sử dụng ethanol 960 để kết tủa phân đoạn protein và car 83

Hình 3.11 Phổ 1H-NMR của mẫu carrageenan ban đầu 85

Hình 3.12 Phổ 13C-NMR của mẫu carrageenan ban đầu 85

Hình 3.13 Phổ 1H-NMR của mẫu carrageenan sau tinh sạch 85

Hình 3.14 Phổ 13C-NMR của mẫu carrageenan sau tinh sạch 85

Hình 3.15 Ảnh hưởng của loại enzyme đến mức độ thủy phân carrageenan 87

Hình 3.16 Ảnh hưởng của loại enzyme đến hàm lượng đường khử tạo thành 87

Hình 3.17 Ảnh hưởng của nồng độ enzyme Termamyl 120L đến hàm lượng đường khử tạo thành bằng enzyme Termamyl 120L 89

Hình 3.18 Ảnh hưởng của nồng độ enzyme Termamyl 120L đến mức độ thủy phân carrageenan 90

Hình 3.19 Ảnh hưởng của pH đến đến hàm lượng đường khử tạo thành bằng enzyme

Temamyl 120L 90

Hình 3.20 Ảnh hưởng của pH đến mức độ thủy phân carrageenan bằng enzyme Temamyl 120L 91

Hình 3.21 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hàm lượng đường khử tạo thành bằng enzyme Temamyl 120L 92

Hình 3.22 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến mức độ thủy phân carrageenan bằng enzyme Termamyl 120L 92

Hình 3.23 Ảnh hưởng của nồng độ carrageenan đến hàm lượng đường khử tạo thành bằng enzyme Termamyl 120L 93

Hình 3.24 Ảnh hưởng của nồng độ carrageenan đến mức độ thủy phân car bằng enzyme Termamyl 120L 94

Hình 3.25 Ảnh hưởng của thời gian thủy phân đến hàm lượng đường khử tạo thành bằng enzyme Termamyl 120L 95

Hình 3.26 Ảnh hưởng của thời gian thủy phân đến mức độ thủy phân bằng enzyme Termamyl 120L 96

Hình 3.27 Quy trình sản xuất oligocarrageenan từ rong sụn K alvarezii (Doty) Doty 96

Hình 3.28 Quy trình tinh sạch oligocarrageenan bằng cách sử dụng ethanol 960 để kết tủa phân đoạn protein và oligocarrageenan 103

Hình 3.29 Phổ 1H, 13C-NMR của mẫu oligocarrageenan sau tinh sạch 106

Hình 3.30 Sự phụ thuộc độ nhớt riêng vào nồng độ dung dịch oligocarrageenan 107

Hình 3.31 Phổ khối lượng của oligocarrageenan 109

Hình 3.32 Phổ sắc ký khí của mẫu oligocarrageenan nghiên cứu 110

Hình 3.33 Phổ hồng ngoại của mẫu carrageenan 112

Hình 3.34 Phổ 13C-NMR của mẫu oligocarrageenan 112

Hình 3.35 Cấu trúc disaccharide của carrageenan lý tưởng 113

Hình 3.36 Phổ 13C-NMR của mẫu chuẩn κ-carrageeanan 115

Hình 3.37 Phổ 1H-NMR của mẫu chuẩn κ-carrageenan 115

Hình 3.38 Phổ HSQC 116

Hình 3.39 Phổ 1H-1H COSY 118

Hình 3.40 Phổ HMBC của oligocarrageenan 119

Hình 3.41 Phổ ROESY của oligocarrageenan 119

Hình 3.42 Tương tác của các proton trên phân tử oligocarrageenan 120

Hình 3.43 Phổ 1H-NMR của oligocarrageenan 120

Hình 3.44 Tăng trọng trung bình của chuột nhắt đực uống carrageenan 123

Hình 3.45 Tăng trọng trung bình của chuột nhắt cái uống carrageenan 123

Hình 3.46 Tăng trọng trung bình của chuột nhắt đực uống oligocarrageenan 123

Hình 3.47 Tăng trọng trung bình của chuột nhắt cái uống oligocarrageenan 124

Hình 3.48 Hình ảnh giải phẫu của chuột nhắt trong nghiên cứu tính an toàn 125

Hình 3.49 Trọng lượng trung bình của chuột uống carrageenan so với nhóm chứng 126

Hình 3.50 Trọng lượng trung bình của chuột uống oligocarrageenan so với nhóm chứng 126

Hình 3.51 Hình ảnh vi thể của gan, lách trong nghiên cứu độc chất 132

Hình 3.52 Hình ảnh vi thể của thận trong nghiên cứu độc tính 133

Hình 3.53 Ảnh hưởng của nồng độ carrageenan đến cường độ gel của surimi 135

Hình 3.54 Ảnh hưởng của nồng độ carrageenan đến tổng điểm cảm quan của surimi 136

Hình 3.55 Biến đổi chất lượng cảm quan của surimi khi phối trộn carrageenan trong quá trình bảo quản đông 137

Hình 3.56 Sự biến đổi cường độ gel của surimi khi phối trộn carrageenan trong quá trình bảo quản đông 138

Hình 3.57 Sự biến đổi lượng dịch thoát ra sau rã đông surimi bảo quản lạnh đông 139

Hình 3.58 Ảnh hưởng của thời gian bảo quản đông và phụ gia sử dụng đến hiệu suất thu hồi surimi cá đổng sau hấp 141

Hình 3.59 Sự biến đổi hàm lượng protein tại các vị trí khác nhau của các mẫu surimi bảo quản lạnh đông 142

Hình 3.60 Quy trình sản xuất thử nghiệm surimi cá đổng 144 Hình 3.61 Ảnh hưởng của nồng độ oligocarrageenan phối trộn đến cường độ gel của surimi cá đổng 146 Hình 3.62 Ảnh hưởng của nồng độ oligocarrageenan phối trộn đến chất lượng cảm quan của surimi cá đổng 146 Hình 3.63 Biến đổi chất lượng cảm quan của surimi khi phối trộn oligocarrageenan trong quá trình bảo quản đông 148 Hình 3.64 Sự biến đổi cường độ gel của surimi khi phối trộn oligocarrageenan trong quá trình bảo quản đông 150 Hình 3.65 Sự biến đổi lượng dịch thoát ra sau rã đông của surimi trong quá trình bảo quản lạnh đông 151 Hình 3.66 Ảnh hưởng của quá trình hấp đến hiệu suất thu hồi surimi cá đổng trong quá trình bảo quản đông 152 Hình 3.67 Hàm lượng protein giữa các vị trí khác nhau của mẫu surimi sau quá trình bảo quản lạnh đông 153 Hình 3.68 Quy trình sản xuất thử nghiệm surimi cá đổng 155

TÓM TẮT NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN

Đề tài luận án: Nghiên cứu sản xuất oligocarrageenan từ rong sụn Kappaphycus

alvarezii Doty (Doty) bằng phương pháp enzyme và ứng dụng trong chế biến và bảo

1) Luận án đã xác định được các thông số thích hợp cho quy trình sử dụng enzyme

Viscozyme L trong sản xuất carrageenan (car) từ rong sụn K alvarezii (Doty) Doty nuôi

trồng tại đầm Thủy Triều, xã Cam Đức, huyện Cam Lâm, tỉnh Khánh Hòa: tỷ lệ nước/rong khô 20/1, nồng độ enzyme thích hợp 1,45%, pH môi trường 5,1, nhiệt độ thích hợp 420C, thời gian xử lý enzyme 60 phút; Sau khi xử lý enzyme, chiết car với tỷ lệ nước nấu/rong đã xử lý enzyme là 50/1, nhiệt độ chiết 900C, thời gian nấu 80 phút

2) Luận án đã xác định được các thông số thích hợp cho qui trình tinh sạch car theo phương pháp kết tủa phân đoạn các thành phần có trong dung dịch car 5% ở nhiệt

độ 700C bằng ethanol 960: kết tủa phân đoạn protein hòa tan và các tạp chất trong dung dịch car bằng ethanol 960 ở nồng độ gây kết tủa 25%, ly tâm loại bỏ kết tủa protein và tạp chất ở tốc độ 10.000 v/phút trong 15phút, thu dung dịch car và kết tủa car trong dung dịch bằng ethanol 960 ở nồng độ gây kết tủa 60% trong thời gian 40 phút, lọc thu kết tủa car và sơ bộ tách nước khỏi car bằng cách rửa kết tủa hai lần bằng ethanol 960, sấy khô kết tủa car bằng kỹ thuật sấy lạnh ở nhiệt độ 45±20C với tốc độ gió 2m/s Chế phẩm car sau tinh sạch đạt các chỉ tiêu hóa lý, tiêu chuẩn kim loại nặng cũng như đạt tiêu chuẩn về vi sinh vật gây bệnh của sản phẩm car dùng trong thực phẩm theo quy định hiện hành của Bộ Y tế

3) Luận án đã xác định được các thông số tối ưu cho quy trình sử dụng enzyme polysaccharase thủy phân car thành oligocarrageenan (oligocar): nồng độ car thích hợp 1%, nồng độ enzyme Termamyl 120 L thích hợp 0,5%, nhiệt độ thích hợp 850C, pH thích hợp 6,5, thủy phân trong 16 giờ Sản phẩm oligocar thu được có từ 2 đến 10 monose và có khối lượng phân tử trung bình nhỏ hơn car khoảng 132 lần

4) Luận án đã xác định được các thông số thích hợp cho qui trình tinh sạch oligocar theo phương pháp kết tủa phân đoạn các thành phần có trong dung dịch oligocar 5% ở nhiệt độ 600C bằng ethanol 960: kết tủa phân đoạn protein hòa tan và các tạp chất trong dung dịch oligocar bằng ethanol 960 ở nồng độ gây kết tủa 30%, ly tâm loại bỏ kết tủa protein và tạp chất ở tốc độ 10.000 v/phút trong 15phút, thu dung dịch oligocar và kết tủa oligocar trong dung dịch bằng ethanol 960 ở nồng độ gây kết tủa 80% trong thời gian 60 phút, lọc thu kết tủa oligocar, trước khi sấy khô dùng ethanol 960 để rửa kết tủa oligocar hai lần nhằm tách bớt nước khỏi kết tủa oligocar, sấy khô kết tủa oligocar bằng kỹ thuật sấy lạnh ở nhiệt độ 45±20C với tốc độ gió 2m/s Chế phẩm oligocar sau tinh sạch đạt các chỉ tiêu hóa lý, tiêu chuẩn kim loại nặng cũng như đạt tiêu chuẩn về vi sinh vật gây bệnh của sản phẩm oligocar dùng trong thực phẩm theo quy định hiện hành của Bộ Y tế

5) Đã xác định được một số đặc tính và cấu trúc của oligocar

6) Luận án đã nghiên cứu thử nghiệm độc tính của car và oligocar trên chuột thí nghiệm cho thấy chế phẩm car và oligocar hoàn toàn không độc với chuột thí nghiệm 7) Luận án đã nghiên cứu thử nghiệm sử dụng car và oligocar trong sản xuất surimi từ cá đổng cho thấy bổ sung car 1% hoặc oligocar 0,2% vào surimi cá đổng có thể làm tăng chất lượng, tăng tính ổn định, hạn chế biến đổi chất lượng của surimi trong quá trình bảo quản đông

Người hướng dẫn Nghiên cứu sinh

MỞ ĐẦU

Rong sụn Kappaphycus alvarezii (Doty) Doty được di nhập vào Việt Nam từ

những năm 90 của thế kỷ trước và hiện đang được phát triển nuôi trồng tại một số địa phương như Nha Trang - Khánh Hòa, Ninh Thuận, Bình Thuận Hiện rong sụn chủ yếu được người dân thương mại hóa dưới dạng rong khô nguyên liệu bán cho thương

lái nước ngoài, đặc biệt là thương lái Trung Quốc [21], [26], [39] Rong sụn K alvarezii (Doty) Doty là loại rong giàu car - một loại polysacharid có hoạt tính sinh

học và được sử dụng rãi trong nhiều lĩnh vực sản xuất và đời sống Hàm lượng car của rong sụn lên tới 40% trọng lượng chất khô [2], [6], [34], [37] Hiện có nhiều nghiên cứu sản xuất car từ rong sụn và đa số các nghiên cứu sản xuất car từ rong sụn tại Việt Nam và trên thế giới đều sử dụng phương pháp hóa học để xử lý rong trong quá trình chiết car Từ car người ta có thể thủy phân tạo thành oligocar - một loại oligosaccharide có hoạt tính sinh học và có nhiều ứng dụng trong dược học, y học và thực phẩm như làm tăng khả năng nhũ hóa thuốc, tăng khả năng tạo độ dẻo dai cho thực phẩm, kích thích sinh trưởng thực vật, hoạt tính chống oxy, hỗ trợ phòng chống

và điều trị viêm loét dạ dày, … [34], [35], [36], [38] Hiện có nhiều kỹ thuật thủy phân car thành oligocar như: phương pháp hóa học, phương pháp sử dụng tia bức xạ hay phương pháp sử dụng enzyme polysaccharase Phương pháp hóa học là phương pháp

sử dụng các chất hóa học để phân cắt car thành oligocar Phương pháp này có nhược điểm là sau khi sản xuất, hóa chất lẫn với oligocar nên quá trình tinh sạch oligocar tốn kém Trong khi đó, phương pháp sử dụng tia bức xạ đòi hỏi phải có thiết bị bức xạ mà các phòng thí nghiệm thông thường không có Phương pháp sử dụng enzyme polysaccharase xử lý rong sụn để sản xuất car và sử dụng enzyme polysaccharase trong thủy phân car tạo ra các oligocar có ưu điểm là ít gây ô nhiễm môi trường và người ta dễ dàng tinh sạch car cũng như oligocar khỏi enzyme polysaccharase Chính

vì thế, sản phẩm car và oligocar sản xuất theo phương pháp sử dụng enzyme polysaccharase được gọi là sản phẩm sản xuất theo công nghệ “sạch” Vì thế, hướng nghiên cứu sử dụng enzyme polysaccharase để xử lý rong sụn trong sản xuất car và sử dụng enzyme polysaccharase phân cắt car thành oligocar đang được nhiều nhà nghiên

cứu quan tâm Do vậy, luận án tiến hành “Nghiên cứu sản xuất oligocarrageenan từ rong sụn Kappaphycus alvarezii Doty (Doty) bằng phương pháp enzyme và ứng dụng trong chế biến và bảo quản surimi”

Mục tiêu chung của luận án

Sản xuất car và oligocar từ rong sụn K alvarezii Doty (Doty) bằng phương pháp

sử dụng enzyme và thử nghiệm sử dụng car, oligocar trong sản xuất surimi cá đổng

Mục tiêu cụ thể của luận án

- Sản xuất được car từ rong sụn K alvarezii Doty (Doty) bằng phương pháp sử dụng enzyme polysaccharase

- Sản xuất được oligocar từ rong sụn K alvarezii Doty (Doty) bằng phương pháp sửu dụng enzyme polysaccharase

- Đánh giá được khả năng ứng dụng car và oligocar trong sản xuất surimi từ cá đổng

Nội dung nghiên cứu

1) Nghiên cứu sử dụng enzyme Viscozyme L trong sản xuất car từ rong sụn K alvarezii (Doty) Doty

2) Nghiên cứu tinh sạch car thu nhận từ rong sụn

3) Nghiên cứu thủy phân car thành oligocar bằng phương pháp sử dụng enzyme polysaccharase

4) Nghiên cứu tinh sạch và xác định một số đặc tính cấu trúc của oligocar

5) Nghiên cứu đánh giá độc chất học của car và oligocar

6) Thử nghiệm sử dụng car và oligocar trong sản xuất surimi từ cá đổng

Ý nghĩa khoa học

Lần đầu tiên ở Việt Nam, luận án tiến hành nghiên cứu sử dụng enzyme

polysaccharase trong thủy phân car từ rong sụn K alvarezii Doty (Doty) để sản xuất

oligocar cũng như lần đầu nghiên cứu tinh sạch và xác định cấu trúc của oligocar thu nhận bằng phương pháp enzyme Kết quả nghiên cứu của luận án là các dữ liệu mới và

là nguồn tài liệu phục vụ cho giảng dạy thuộc lĩnh vực chế biến, cho cao học viên, nghiên cứu sinh, các nhà nghiên cứu quan tâm đến lĩnh vực này

Ý nghĩa thực tiễn

Kết quả nghiên cứu của luận án đã tạo ra sản phẩm car và oligocar từ rong sụn theo phương pháp sử dụng enzyme nên sản phẩm car, oligocar là sản phẩm “sạch”, thân thiện với môi trường Mặt khác, kết quả nghiên cứu của luận án có thể được các doanh nghiệp ứng dụng để sản xuất và thương mại hóa sản phẩm oligocar Do vậy, luận án sẽ góp phần mở rộng đầu ra cho nghề nuôi trồng rong sụn, hạn chế tình trạng xuất khẩu rong nguyên liệu, tăng thu nhập cho nghề nuôi trồng rong sụn và tạo điều kiện cho nghề nuôi trồng rong sụn tại Việt Nam phát triển một cách bền vững

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 GIỚI THIỆU VỀ RONG SỤN VÀ CARRAGEENAN TỪ RONG SỤN 1.1.1 Giới thiệu về rong sụn

Rong sụn thuộc ngành tảo hồng (Rhodophyta),

Ngành phụ: Rhodophytina

Lớp: Florideophyceae Lớp phụ: Rhodymeniophycidae Bộ: Gigartinales

Họ: Areschougiaceae Giống: Kappaphycus Loài: bao gồm các loài alvarezii, cottonii, inermis, interme, procrusteanum, striatum Trong đó loài Kappaphycus alvarezii (Doty) Doty là loài có sản lượng cao nhất

Hình 1.1 Hình ảnh về rong sụn Kappaphycus alvarerii (Doty) Doty

Tháng 3/1993, trên cơ sở của chương trình hợp tác về Khu hệ và nguồn lợi rong biển kinh tế Việt Nam giữa Phân viện Vật liệu Nha Trang (nay là Viện nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ Nha Trang) và Nhật Bản, Phân viện Vật liệu Nha Trang đã tiến hành di nhập rong sụn giống từ Nhật Bản để nghiên cứu nhân giống và thử nghiệm nuôi trồng rong sụn tại các vùng ven biển của tỉnh Khánh Hòa và Ninh Thuận Kết quả thử nghiệm cho thấy rong sụn hoàn toàn thích nghi với điều kiện tự nhiên ở nước ta

Từ đó đến nay, nghề nuôi trồng rong sụn phát triển mạnh ở các tỉnh: Ninh Thuận, Khánh Hòa, Phú Yên, Bình Định, Kiên Giang và hiện đang là đối tượng nuôi được nhiều tỉnh ven biển miền Trung từ Nghệ An trở vào phía Nam quan tâm Đến nay,

nuôi trồng rong sụn trở thành một nghề mới của Việt Nam, góp phần tạo công việc làm cho hàng ngàn lao động [21], [50], [98]

Rong sụn tươi thường có màu xanh hoặc màu xanh đỏ nâu do trong rong có hai loại sắc tố là phycobline (bao gồm phycocyanine có màu xanh tím, phycocythine có màu đỏ) và chlorophyll Rong sụn thuộc loài đơn trụ chia thành 2 phần:

Phần lõi: gồm một tế bào trung trụ chạy dọc thân từ gốc đến ngọn Xung quanh

có từ 3 ÷ 4 hàng tế bào vây trụ có kích thước lớn, hình tròn hay hình đa giác, trong suốt, vách mỏng chứa các chất dinh dưỡng (car)

Phần da: gồm nhiều tế bào nhỏ sắp xếp khít nhau, hình tròn hay hình bầu dục, không trong suốt, chứa đầy sắc tố Ngoài cùng là lớp vỏ keo chứa cellulose, chiếm khoảng 4% trọng lượng rong khô, đóng vai trò bảo vệ các lớp bên trong [39]

Thành phần chính của rong sụn là car Hàm lượng car có thể chiếm đến 40% trọng lượng khô của rong sụn Trong đó, car tan chiếm khoảng 33%, car không tan chiếm 7% Thành phần hóa học cơ bản của rong sụn nguyên liệu trình bày ở bảng 1.1

Bảng 1.1 Thành phần hóa học cơ bản của rong sụn [10]

Thành

phần

Hàm lượng

Đơn vị tính

Thành phần

Hàm lượng

Đơn vị tính

1.1.2 Giới thiệu về carrageenan

Carrageenan có cấu trúc chung là một polymer mạch thẳng với liên kết luân phiên của βD Galactose pyranose qua liên kết 1-3 và αD Galactose pyranose qua liên

kết 1-4 (hình 1.2) Các liên kết ở vị trí số 3 xuất hiện ở các gốc có 2 và 4 sunphat hoặc không có sunphat trong khi liên kết ở vị trí số 4 ở các gốc có 2 sunphat, gốc 2,6 anhydrit và 3,6 anhydrit-2-sunphat, gốc 2,6 disunphat, gốc 2,6 anhydrit và 3,6 anhydrit-2-sunphat Hợp phần cấu tạo của car gồm có D-Galactose (17 ÷ 31%) còn L-Galactose chiếm lượng rất nhỏ Do đó, car tạo thành chủ yếu bởi các mạch poly D-Galactose bị sunphat hoá có phân tử lượng 500 ÷ 700Dalton [16]

Các phân tích bằng phương pháp cộng hưởng từ hạt nhân cho thấy car có nhiều dạng cấu trúc hoá học khác nhau Dựa vào cấu trúc hoá học, người ta có thể phân car thành các loại như sau: mu, kappa, nu, iota, lamda, theta và xi Các loại này chỉ khác nhau ở mức độ sunphat hoá, vị trí sunphat hoá, mức độ dehydrat hoá của chuỗi polysacharid Khối lượng phân tử của đại phân tử car khoảng từ 105 đến 106 phụ thuộc

vào nguồn gốc nguyên liệu và quá trình chiết [50], [51], [65], [87]

Hình 1.2 Cấu trúc của carrageenan với luân phiên liên kết của 1,3 βD Galactose

pyranose và 1,4 αD Galactose pyranose

Car tự nhiên từ các loài rong khác nhau có thể là hỗn hợp khác nhau của các loại car đã nêu ở trên Người ta phân chia car ra hai nhóm chính: nhóm 1 chứa các loại mu,

nu, kappa, iota và các dẫn xuất của chúng Các car này tạo gel với ion K+ hoặc có thể

xử lý kiềm để có tính chất tạo gel, chúng có đặc điểm là gốc đường có liên kết 1,3 hoặc không có nhóm sunphat hoá ở vị trí C4 Nhóm thứ 2 là lambda, xi, theta và các dẫn xuất của chúng Chúng không có khả năng tạo gel ngay cả trước và sau khi xử lý kiềm Đặc trưng của cấu trúc này là cả hai loại gốc đường liên kết 1,4 và 1,3 đều có nhóm sunphat ở ví trí C2 Ngoài ra, thành phần của car gồm có H2SO4, Ca2+ và 3,6 anhydro D-Galactose Dạng tồn tại của car trong rong đỏ gắn với Ca2+, K+, Na+ như: R=(OSO3)2Ca hoặc R-OSO3Na, ROSO3K (R là gốc polysacharid) Hàm lượng SO3–2

cũng ảnh hưởng đến sức đông của car [16]

Về cơ bản car có 3 loại khác nhau là: κ-car, -car, -car Trong đó, κ-car chiếm

thị phần lớn nhất (80%) Mu và Nu là chất ban đầu tổng hợp nên kappa và iota, việc

chuyển đổi này là do enzyme dekinkase có trong rong biển hay trong quá trình sản xuất khi dùng xúc tác để loại nhóm 6 sunphat [16]

* κ-carrageenan: là một loại polymer mạch ngắn, có cấu tạo xen kẽ giữa galactose-4-sunphat (GalS) và 3,6 anhydro D-galactose (GalA) (Hình 1.3) Cấu trúc phân tử của κ-car là vòng xoắn kép bậc III

D-Hình 1.3 Cấu trúc của κ-carrageenan

* -carrageenan: là một loại car có số lượng gốc sunphat nằm trung gian giữa số lượng gốc sunphat của κ-car và -car (Hình 1.4) Khi tạo gel, khối gel của -car có tính

đàn hồi tốt hơn khối gel của các loại car khác

Hình 1.4 Cấu trúc của -carrageenan

* -carrageenan: trong mạch phân tử của -car, các đơn vị monomer gồm: galactose-2-sunphat (1,3) và D-Galactose-2-6-disunphat nối xen kẽ với nhau (Hình 1.5)

D-Hình 1.5 Cấu trúc của -carrageenan

Các phân đoạn này đều có tính đa phân tán, nhưng chúng chỉ khác nhau về thành phần sunphat ester và gốc quay quang -car có khối lượng phân tử cao và mạch dài hơn κ-car Thành phần của phân đoạn này cũng phụ thuộc vào nhiệt độ chiết và loại rong nguyên liệu [16], [57], [87]

Sự khác nhau của các loại car trên ở vị trí và số lượng nhóm ester sunphat đính vào chuỗi polysacharid, do đó mỗi loại có tính chất vật lý và hoá học đặc trưng khác nhau

1.1.3 Tính chất lý hoá của carrageenan

* Tính chất của carrageenan

Môi trường kiềm có ảnh hưởng lớn đến trạng thái cấu tạo hoá học của car, cụ thể trong môi trường kiềm, nhóm (HOSO3-) bị khử tách dần khỏi cấu trúc của car Tùy thuộc vào mức độ tách nhóm (HOSO3-) từ car ban đầu sẽ hình thành nên cấu trúc của

một loại car khác với ban đầu [16], [57], [87] Chẳng hạn:

Từ Mu-car khi bị khử nhóm (HOSO3-) trong môi trường kiềm sẽ tạo thành κ-car (hình 1.6)

Hình 1.6 Sự chuyển hóa mu-carrageenan thành κ-carrageenan trong môi trường kiềm

Từ Nu-car khi bị khử nhóm (HOSO3-) trong môi trường kiềm sẽ tạo thành -car (hình 1.7)

Hình 1.7 Sự chuyển hóa nu-carrageenan thành - carrageenan trong môi trường kiềm

Trong môi trường kiềm - car bị khử nhóm (HOSO3-) sẽ tạo thành theta-car (hình 1.8)

Hình 1.8 Sự chuyển hóa -carrageenan thành theta-carrageenan trong môi

trường kiềm

Car là một polymer mang điện âm nên bị ngưng kết khi có mặt của các đại phân

tử mang điện tích dương như: metylen xanh, safranine, phẩm màu azo thiazo khác, tính chất này giống như một vài alkaloid và protein Mặt khác, car còn có khả năng kết tủa khi có mặt của ethanol nồng độ cao (ethanol đóng vai trò là tác nhân dehydrate hoá) Do vậy, người ta có thể sử dụng ethanol nồng độ cao để kết tủa thu car

Car là hợp chất cao phân tử (polysaccharide) có cực nên hydrat hóa và hòa tan tốt trong môi trường có cực, chẳng hạn như nước Khi car hút nước sẽ xảy ra hiện tượng hydrat hóa và dẫn tới sự hòa tan Khi hòa tan trong nước, car tạo thành dung dịch lỏng, sánh Do vậy, người ta sử dụng đặc tính này để làm tăng khả năng ổn định của các hỗn hợp thực phẩm lỏng hay dung dịch thực phẩm hoặc làm tăng khả năng hydrate hóa của các loại thuốc

* Tính tan

Car tan trong anhydrous hydrazine (N2H4), ít tan trong formamide (CH3NO) và methyl sulfoxide ((CH3)2SO), không tan trong dầu và dung môi hữu cơ Car tan trong nước, đặc biệt là nước nóng, tuy nhiên tính tan còn phụ thuộc vào loại car

Bảng 1.2 Một số tính chất đặc trưng của các loại carrageenan [28]

Nước nóng Tan ở nhiệt độ trên 70oC Tan ở nhiệt độ trên

Nước lạnh

Tan trong dung dịch muối

Na+ Không tan trong dung dịch muối K+, Ca2+

Tan trong dung dịch

* Nhiệt độ nóng chảy

Nhiệt độ nóng chảy của gel car thấp hơn nhiều so với agar Gel car 3% nóng chảy ở nhiệt độ 27oC đến 30oC, gel car 5% nóng chảy ở nhiệt độ 40oC đến 410C

* Sự tạo gel (gelation)

Khả năng keo hoá của car nằm trung gian giữa agar và gelatin, gần giống gelatin hơn Sự hình thành gel của dung dịch car là một quá trình nhiệt thuận nghịch Khi nhiệt độ cao hơn giá trị nhiệt độ tạo gel thì gel sẽ tan chảy (cân bằng bị phá vỡ) Tuy

nhiên, khoảng cách nhiệt từ trạng thái tạo gel đến tan chảy là một giá trị không đổi

Khả năng hình thành gel của car phụ thuộc vào nhiệt độ và nồng độ dung dịch, loại và

số lượng muối có mặt trong dung dịch Ngoài ra, tính chất tạo gel còn phụ thuộc vào loài rong, độ nhớt, công nghệ sản xuất, sự hình thành và phân bố các gốc galactose trong mạch polymer Sử dụng đặc tính tạo gel của car, người ta đã ứng dụng car trong rất nhiều lĩnh vực của đời sống như làm chất nhũ hóa, tạo độ đặc, sánh, tạo cấu trúc và giúp phân bố và cố định đều trong thực phẩm [16], [57], [94]

* Tính bền acid: trong môi trường có pH thấp cùng với sự tác dụng của nhiệt độ

cao thì sự thuỷ phân car xảy ra nhanh hơn Vì vậy, nên tránh chế biến dung dịch car ở

pH thấp và nhiệt độ cao trong thời gian dài

* Tính hấp thu hồng ngoại và màu

Dung dịch car là một chất hữu cơ, nên có khả năng hấp thu phổ hồng ngoại có bước sóng trong phạm vi nhất định, phụ thuộc vào loại và thành phần car Dựa vào

tính chất này, người ta có thể biết được car thuộc loại -, -, - … Các loại

polysaccharide thường cho bước sóng ở vùng hồng ngoại trong khoảng 1000-1100cm

-1

, các loại car tạo gel cho mũi hấp thu cực đại (mũi hấp thụ trong khoảng rộng) ở 1065cm-1, loại không tạo gel ở vùng 1020cm-1

* Tính thuỷ phân và sự metyl hoá xác định công thức cấu tạo của carrageenan

Dung dịch car ít bị thủy phân ở môi trường pH 9 và pH 7; dung dịch muối natri car bị thoái hoá do phân tử car bị đứt liên kết 3,6-anhydrogalactose Từ phản ứng xác định tính thuỷ phân kiềm nhóm ester sunphat của car đã nói lên cấu trúc của car có nhóm ester sunphat gắn ở C4 trong gốc galactose Car, đặc biệt là phân đoạn -car sẽ

bị thuỷ phân bởi enzyme Pseudomonate carrageenan hay appa-carovora Khi car (-,

-) bị thuỷ phân bởi enzyme này thì độ nhớt của dung dịch giảm rất nhiều và làm tăng khả năng khử, tạo các sản phẩm thuộc dãy đồng đẳng của oligosaccharide sunphat, 3-6

-(3, 6- anhydrose-D-galactose pyranose)-D-galactose-4-6-sunphat O- sunphat)

(neocarrabiose-4-Car bị metyl hoá tạo ra các dẫn xuất methyl như 2, 3, 4, galactose hoặc 2,4,6-tri-methyl-D(L)-galactose và dựa vào đặc tính này người ta đã xác định thành phần cấu trúc của nó

6-tetra-methyl-D(L)-* Độ nhớt

Độ nhớt của dung dịch car phụ thuộc rất lớn vào khối lượng phân tử, nồng độ car, nhiệt độ dung dịch và các yếu tố ảnh hưởng khác như sự có mặt của các muối trong dung dịch Độ nhớt dung dịch tỷ lệ thuận với nồng độ dung dịch và tỷ lệ nghịch với nhiệt độ Sử dụng khả năng tạo độ nhớt của car, trong thực phẩm, dược phẩm car được sử dụng như chất ổn định để làm tăng độ nhớt của pha liên tục, từ đó chúng đảm bảo chất béo không bị phân riêng trong dung dịch [94]

Từ các phân tích ở trên cho thấy car là một polymer tự nhiên có nhiều tính chất công nghệ đáng quý như khả năng tạo gel và đồng tạo gel, tạo độ nhớt cho dung dịch, làm tăng độ chắc và tính chất cơ lý của thực phẩm Ngoài ra, car còn có thể dùng để sản xuất thực phẩm chức năng hoặc ứng dụng trong y dược Tuy nhiên, đa số các công trình công bố nghiên cứu về car và cấu trúc của car là do các tác giả nước ngoài Do vậy, việc đầu tư nghiên cứu để làm chủ công nghệ sản xuất car tại Việt Nam và mở rộng ứng dụng car vào sản xuất và đời sống là cần thiết

1.1.4 Giới thiệu một số kỹ thuật sản xuất carrageenan

Hiện nay, trên thế giới có các phương pháp sản xuất car như: phương pháp kết tủa, phương pháp đông lạnh, phương pháp PES, phương pháp ATC,… nhưng trong thực tế do tính chất đơn giản về công nghệ và hiệu quả kinh tế nên người ta chọn để áp

dụng hai phương pháp sản xuất car chính sau:

Phương pháp thứ nhất chỉ áp dụng từ cuối năm 1970 đến đầu năm 1980, car được tách ra từ rong đỏ bằng nước nóng, bã rong được lọc tách ra và dịch chiết chứa car được đem sấy khô trực tiếp trên thiết bị sấy kiểu “rulô” thu được car ở dạng màng mỏng, sau đó nghiền thành bột Một số cơ sở sản xuất tiến hành tinh chế dịch chiết trước khi làm khô, nhưng thực tế cho thấy sản phẩm vần còn nhiêu tạp chất

Phương pháp thứ hai, rong được rửa sạch, sau đó xử lý bằng dung dịch kiềm KOH ở nhiệt độ thích hợp cho từng loại rong cụ thể Việc sử dụng dung dịch KOH sẽ giúp loại bỏ

các tạp chất như sắc tố, protein, muối khoáng Rong sau xử lý chủ yếu chứa car và

cellulose Sau đó, sấy khô rong và nghiền thành bột car bán tinh chế (SRS) [50], [65],

[82], [87]

Sự khác nhau cơ bản giữa car tinh chế và bán tinh chế là car bán tinh chế chứa cellulose, trong khi car tinh chế thì cellulose đã được tách hoàn toàn trong quá trình sản xuất Do vậy, khi hoà tan car bán tinh chế vào nước thường có hiện tượng dung dịch kém trong suốt

Đối với nước ta, những năm gần đây, các nhà khoa học tại một số cơ quan nghiên cứu và đào tạo như Trường Đại học Thủy sản (nay là Trường Đại học Nha Trang, Viện Hóa học, đã quan tâm nghiên cứu chế biến rong sụn và ứng dụng car vào sản xuất sản phẩm mới Công nghệ sản xuất car từ rong sụn đã được các nhà nghiên cứu trong nước tiếp thu từ nước ngoài và điều chỉnh cho phù hợp với các đặc điểm của nguyên liệu rong và điều kiện sản xuất ở nước ta Cụ thể như sau:

- Car được chiết từ rong Hồng Vân (Eucheuma gelatinae) bằng phương pháp

chiết trong môi trường nước nóng ở nhiệt độ 900C trong 2giờ [34]

Phương pháp sử dụng nước nóng để chiết car có nhược điểm là hiệu quả chiết rút không cao và để đảm bảo chiết rút triệt để car từ nguyên liệu đòi hỏi phải chiết nhiều lần Do đó, dung dịch car thu được có nồng độ car không cao và thể tích lớn gây khó

khăn cho việc thu nhận car sau này và sản phẩm car thu được lẫn nhiều tạp chất

- Chiết car bằng dung dịch NaOH có nồng độ 7 - 13%, kết hợp với nhiệt độ [20] Hoặc sử dụng dung dịch NaOH để xử lý rong sụn trước, tiếp theo chiết car trong môi

trường nước nóng [22], [13] Ngoài ra, kết hợp sử dụng KOH và acid HCl để xử lý rong

trước khi chiết car trong môi trường nước nóng [26] Giảm thiểu các tạp chất phi car bằng công nghệ xử lý rong sụn trong môi trường kiềm nhẹ để sản xuất car bán tinh chế SRC, công nghệ có ưu điểm hiệu suất quy trình rất cao gần 70% [18]

Sản xuất car theo phương pháp trên có một số hạn chế là car thu được thường lẫn với hóa chất nên quá trình tinh chế gặp nhiều khó khăn, gây ô nhiễm môi trường, độc hại với người sản xuất

- Với phương pháp sử dụng enzyme để xử lý rong, phản ứng xảy ra trong điều kiện nhẹ nhàng, hiệu quả cao do tính đặc hiệu của enzyme, không độc hại cho người sản xuất và ít ảnh hưởng đến môi trường và đảm bảo an toàn thực phẩm, đang là một

hướng nghiên cứu được nhiều nhà khoa học trong và ngoài nước quan tâm Sau đây, xin giới thiệu một số kết quả nghiên cứu của thế giới về lĩnh vực này:

Zhao Mouming và cộng sự, có thể thu được car bằng cách xử lý rong với enzyme

cellulase Nhược điểm của phương pháp làm cường độ gel của car giảm nhẹ [108]

Tang và cộng sự (1998), đã mô tả kỹ thuật chiết car từ Eucheuma cottonii và E okanurai bằng cách sử dụng enzyme cellulase và hơi nước áp suất cao Phương pháp

sử dụng cellulase cho hiệu suất thu nhận car cao hơn nhưng cường độ gel thấp hơn so

với phương pháp xử lý rong bằng hơi nước áp suất cao [95]

Soovendran A/l Varadarajan và cộng sự (2009) cho rằng hiệu suất thu nhận car

từ rong bị ảnh hưởng nhiều bởi phương pháp xử lý rong trước khi chiết Cụ thể, phương pháp xử lý rong bằng cellulase cho hiệu suất thu car cao nhất, sau đó đến đun sôi truyền thống và thấp nhất là xử lý rong bằng dịch chiết enzyme nấm mốc Tuy nhiên, độ nhớt của car sản xuất theo phương pháp xử lý rong bằng enzyme cellulase cao hơn so với car thu được khi xử lý rong bằng dịch chiết enzyme nấm mốc nhưng thấp hơn so với phương pháp sản xuất car truyền thống [93]

Từ các phân tích ở trên cho thấy các tác giả nước ngoài chủ yếu sử dụng enzyme cellulase để phá vỡ thành tế bào của rong để thu nhận dịch chiết car Việc sử dụng enzyme cellulase vào sản xuất car đã nâng cao hiệu suất thu hồi sản phẩm, khắc phục được việc sử dụng hóa chất gây ô nhiễm môi trường Tuy nhiên, phương pháp sử dụng cellulase trong sản xuất car có nhược điểm là độ nhớt của car bị giảm Trong nước, các công trình nghiên cứu ứng dụng enzyme trong xử lý rong để sản xuất car không đáng kể Công nghệ sản xuất car từ rong sụn vẫn chủ yếu theo hướng sử dụng HCl và NaOH để xử lý rong nên chất thải quy trình sản xuất chắc chắn sẽ gây ô nhiễm môi trường và việc xử lý chất thải là một vấn đề phức tạp và tốn kém Do vậy, chúng ta cần đầu tư nghiên cứu sử dụng các công nghệ sạch ít gây ô nhiễm môi trường trong sản xuất car từ rong sụn, đặc biệt là “ứng dụng công nghệ enzyme” để sản xuất car từ rong sụn nhằm tạo ra sản phẩm car đáp ứng tiêu chuẩn “xanh và sạch” cung cấp cho các ngành công nghiệp trong nước và hướng đến xuất khẩu, góp phần hạn chế tình trạng xuất khẩu rong nguyên liệu khô với giá rẻ và nhập khẩu car với giá cao như hiện nay Từ đó, góp phần giải quyết đầu ra cho nghề nuôi trồng rong sụn, nâng cao giá trị thương phẩm, thúc đẩy nghề trồng rong sụn tại Việt Nam phát triển bền vững

1.2 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC VỀ OLIGOCARRAGEENAN

1.2.1 Tình hình nghiên cứu oligocarrageenan ở Việt Nam

Tại Việt Nam có một số công trình nghiên cứu về oligocar như Nguyễn Quốc Hiến

và cộng sự nghiên cứu làm giảm khối lượng của car bằng chùm electron năng lượng thấp Tuy nhiên, phương pháp này đòi hỏi đầu tư thiết bị bức xạ khá tốn kém và người tham gia sản xuất phải có trình độ kỹ thuật cao [85]

Bùi Huy Chích (2009) đã nghiên cứu và nhận thấy enzyme Termamyl 120L là

loại enzyme thích hợp cho thủy phân car từ rong sụn K alvarezii Ngoài ra, kết quả

nghiên cứu cũng cho thấy enzyme amylase chỉ cắt mạch liên kết glycoside mà không ảnh hưởng đến sự phá vỡ cấu trúc phân tử car [6], [23]

Trần Đình Toại và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu thủy phân car chiết từ rong

Hồng Vân Eucheuma gelatinae để tạo oligocar bằng phương pháp sử dụng acid HCl

Kết quả phân tích cấu trúc của sản phẩm oligocar thu được bằng phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H-NMR, 13C-NMR) và phổ khối kết hợp sắc ký lỏng (LC-MS) cho thấy thủy phân car không làm thay đổi cấu trúc của car mà chỉ phá vỡ các

liên kết glycosid dẫn tới làm cắt ngắn mạch polymer [35], [36]

Sử dụng acid HCl để thủy phân car là một phương pháp thường dùng trong nghiên cứu thủy phân car, phương pháp này có ưu điểm là đơn giản Tuy nhiên, sử dụng phương pháp này để sản xuất oligocar có nhược điểm là gây nhiễm môi trường

và độc hại cho người trực tiếp sản xuất

Trần Đình Toại và cộng sự (2009) đã tiến hành thủy phân car bằng enzyme Phitopain do trung tâm Kỹ nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học - Nga cung cấp Kết quả nghiên cứu cho thấy, thủy phân car bằng enzyme Phitopain làm thay đổi không đáng

kể cấu trúc của car, chỉ có tác dụng phá vỡ các liên kết glycosid, cắt ngắn mạch tạo thành

oligocar [38] Tuy nhiên, enzyme Phitopain không phải là enzyme thương mại nên chưa

có công bố về thành phần của enzyme và hiện không có bán ở thị trường Việt Nam

Từ các phân tích ở trên cho thấy việc nghiên cứu sản xuất oligocar từ car rong sụn

K alvarezii (Doty) Doty theo phương pháp sử dụng enzyme polysaccharase hiện chỉ mới bắt đầu ở Việt Nam và chưa có tác giả nào công bố nghiên cứu một cách đầy đủ

về lĩnh vực này

1.2.2 Tình hình nghiên cứu oligocarrageenan ở nước ngoài

Trên thế giới đã có một số nghiên cứu sản xuất oligocar với mục đích nghiên cứu cấu trúc và thử nghiệm ứng dụng trong phòng thí nghiệm Về phương pháp sản xuất oligocar có thể chia thành hai phương pháp chính:

Thứ nhất, dùng acid để thủy phân liên kết  -(1-3) glycosid Acid được nhiều

nghiên cứu sử dụng là acid HCl Cụ thể, nghiên cứu của Guangli Yu và cộng sự (2002)

[63], Astier và cộng sự (2012) [43], J Vera và cộng sự (2012) [72] đã sử dụng HCl để thủy phân car thành oligocar

Thứ hai, dùng enzyme κ-carrageenase để thủy phân liên kết -(1-4) glycosid của κ-car, sản phẩm tạo thành là neo-κ-carrabiose, -tetraose, -hexaose, -octaose và decaose sunphat Enzyme κ-carrageenase được sản xuất từ các loài vi khuẩn biển Chẳng hạn,

các tác giả J Weigl và W Yaphe (1966) [103], Maitland W Mc Lean và cộng sự

(1979) [81], Guibet và cộng sự (2006) [64], Lemoine và cộng sự (2009) [77], Y X

Ma và cộng sự (2010) [107], Jouanneau và cộng sự (2010) [75], Henares và cộng sự

(2010) [44] đã nghiên cứu sử dụng vi khuẩn Pseudoalteromonas carrageenovora để

sản xuất enzyme κ-carrageenase dùng trong thủy phân car Tác giả Jouanneau và cộng

sự (2011) lại sử dụng vi khuẩn Alteromonas fortis để sản xuất enzyme κ-carrageenase

dùng trong thủy phân car [76] Trong khi đó, tác giả Mou Haijin và cộng sự (2004) lại sử

dụng vi khuẩn Cytophaga sp trong sản xuất enzyme κ-carrageenase dùng thủy phân car [83] Tượng tự như vậy, tác giả Barbeyron và cộng sự (2000) sử dụng vi khuẩn Zobellia galactanovorans [99], còn tác giả Ni Min (2008) lại sử dụng vi khuẩn Cellulophaga sp QY201 trong sản xuất enzyme κ-carrageenase dùng thủy phân car [86]

Từ các phân tích ở trên cho thấy việc nghiên cứu ứng dụng enzyme polysaccharase trong thủy phân car thành oligocar đã được các tác giả nước ngoài đề cập và các kết quả nghiên cứu đều cho thấy việc sử dụng enzyme polysaccharase trong thủy phân car tỏ ra có nhiều triển vọng như sản phẩm “xanh và sạch hơn” Do vậy, việc đặt vấn đề nghiên cứu lựa chọn một loại enzyme polysaccharase trong thủy phân car thành oligocar của luận án là phù hợp xu thế của thời đại và hoàn toàn có tính khả thi

1.3 GIỚI THIỆU VỀ ENZYME POLYSACCHARASE

1.3.1 Enzyme viscozyme L và khả năng sử dụng trong sản xuất carrageenan

từ rong sụn

Khi cắt dọc và ngang cây rong, có thể nhìn thấy vị trí tồn tại của chất keo rong đỏ

ở phần trung tâm của thân rong, lớp ngoài cùng là màng cellulose, sau đó đến lớp

trong là các lớp tế bào nhỏ chứa đầy sắc tố và chất khoáng Trong phần lõi là các lớp

tế bào mỏng, lớn chứa đầy các chất keo rong [18] Do vậy, dùng enzyme phá hủy lớp

thành tế bào (thành phần chính là cellulose), sẽ giúp cho việc chiết, thu nhận car dễ dàng hơn Vì thế, các tác giả nước ngoài chủ yếu sử dụng enzyme cellulase để phá vỡ thành tế bào của cây rong, sau đó chiết và sử dụng các dung môi để kết tủa thu sản phẩm car

Hình 1.9 Vị trí tồn tại của carrageenan trong rong sụn

Enzyme Viscozyme L là một sản phẩm của hãng Novozyme - Đan Mạch, được

sản xuất từ Aspergillus aculeatus Dịch enzyme có màu nâu, điều kiện thích hợp cho

hoạt động của enzyme: pH 3,3 - 5,5 và nhiệt độ 45 - 550C, hoạt độ 100 FBG/g Enzyme cần được bảo quản ở nhiệt độ lạnh từ 1-100C Dịch enzyme chứa một hỗn hợp polysaccharase như: cellulase, hemicellulase, xylanase, β -glucanase, arabanase Cụ thể, enzyme cellulase thủy phân liên kết 1,4- β-glucoside trong cellulose nên sẽ phân cắt cellulose thành cellobiose và glucose tùy thuộc điều kiện thủy phân Hemicellulase thủy phân thành phần hemicellulose, xylanse thủy phân lớp xylan, arabanse thủy phân thành phần araban và β-glucanase có tác dụng thủy phân cellulose Như vậy, khi sử dụng hỗn hợp các enzyme cellulase, hemicellulase, xylanase, β -glucanase, arabanase

sẽ giúp cho việc thủy phân cấu trúc thân rong dễ dàng tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình thu nhận car từ rong sụn [12]

Viscozyme L hiện đang được sử dụng trong việc tách bóc lớp vỏ cà phê, vỏ hồ tiêu Chế phẩm Viscozyme L chứa hỗn hợp đa enzyme nên hiệu quả thủy phân thân rong tốt hơn khi sử dụng một enzyme cellulase đơn lẻ Ngoài ra, sử dụng enzyme

Tế bào

Viscozyme L xử lý rong trong quá trình sản xuất car từ rong K alvarrezii (Doty) Doty

có nhiều ưu điểm so với phương pháp xử lý rong bằng NaOH Cụ thể, sử dụng enzyme Viscozyme L xử lý rong cho hiệu suất quy trình và sức đông car cao hơn, khắc phục những hạn chế của quá trình sản xuất car theo phương pháp sử dụng NaOH xử lý rong như: car thu được thường lẫn hóa chất, quá trình tinh chế rất khó khăn, ô nhiễm môi trường, độc hại cho người sản xuất [8] Do vậy, luận án sẽ thử nghiệm sử dụng enzyme Viscozyme L nghiên cứu trong việc phá hủy lớp cấu trúc thân rong sụn tạo điều kiện thuận lợi cho việc chiết và thu nhận car sau này

1.3.2 Enzyme Termamyl 120L và khả năng sử dụng trong thủy phân carrageenan

Car thu nhận từ rong sụn có cấu tạo luân phiên đều đặn của disacarit: D-galactose(4SO3-)-(1-4)α-3,6 anhydro-D-galactose(1→3) hoặc →3)-β-D-galp 4S-(1-4)--3,6-An Galp (1→3) [96], [97] Ngoài ra, car trong dung dịch có độ nhớt cao, ở nhiệt độ nhỏ hơn 440C [41] Do đó, đòi hỏi enzyme thủy phân car phải chịu được nhiệt

(1→3)--độ cao trên 440C Quá trình thủy phân car bằng enzyme được thể hiện trên hình 1.10

Hình 1.10 Quá trình thủy phân carrageenan thành oligocarrageenan [16]

Enzyme Termamyl 120 L có dạng lỏng, màu nâu, tỷ trọng là 1,2g/ml, được sản

xuất từ chủng Baccillus licheniformis Termamyl 120 L là một endo-amylase, có tác

dụng thủy phân mối nối 1-4 α-glycosid (quá trình thủy phân bằng enzyme Termamyl 120L được thể hiện trên hình 1.11 dưới đây) Với cơ chất tinh bột, dưới tác dụng của Termamyl 120 L sẽ nhanh chóng tạo thành dextrin và oligosaccharid tan trong nước Điều kiện thích hợp cho chế phẩm enzyme này hoạt động: Nhiệt độtừ 40  950C; pH

từ 5,0  7,0 Đặc biệt, enzyme Termamyl 120 L có khả năng ổn định nhiệt độ cực cao (105 đến 1100C), phạm vi pH hoạt động tương đối lớn và việc đòi hỏi canxi của

enzyme tương đối thấp [5].

Hình 1.11 Quá trình thủy phân tinh bột của enzyme amylase [5]

Kết quả khảo sát tính chất của enzyme Termamyl 120L trên cơ chất car từ rong sụn

K alvarezii (Doty) Doty dựa vào việc xác định hoạt độ của enzyme Termamyl 120L theo

phương pháp DNS cho thấy enzyme Termamyl 120L hoạt động tối ưu ở điều kiện: t0

850C; pH 6,5; nồng độ enzyme Termamyl 120L 0,5%; nồng độ car 1% [7]

Từ các phân tích ở trên cho thấy, việc sử dụng enzyme Termamyl 120L trong nghiên cứu thủy phân car thành oligocar (microgel) là có cơ sở và khả thi

1.4 MỘT SỐ KỸ THUẬT TINH SẠCH CARRAGEENAN VÀ OLIGOCARRAGEENAN

Việc sử dụng enzyme để phân cắt car thành oligocar sẽ thu được hỗn hợp các chất bao gồm car, oligocar và các tạp chất có trong car Vì vậy, để thu được sản phẩm car và oligocar tinh sạch người ta cần phải tiến hành tinh sạch để tách riêng car và oligocar ra khỏi các tạp chất

Để tinh sạch car và oligocar, người ta có thể sử dụng các phương pháp như: sắc

ký lọc gel, chủ yếu để loại muối và monomer [63], [76], [43], [90], sắc ký trao đổi ion [4], [91], [92], màng siêu lọc để tách oligocar thành các phân đoạn có trọng lượng phân tử khác nhau [79] Các phương pháp tinh sạch trên tuy cho phép nhận được car

và oligocar có độ tinh sạch cao và trọng lượng phân tử đồng đều, nhưng đòi hỏi thiết

bị, dụng cụ và hóa chất chuyên dụng đắt tiền, hiệu suất thấp, chỉ áp dụng ở quy mô

phòng thí nghiệm

Một phương pháp khác hay được sử dụng để thu nhận cũng như tinh sạch car và oligocar, kể cả tiêu chuẩn của Châu Âu về car là sử dụng dung môi hữu cơ như: ethanol, isopropanol và xeton để kết tủa car, oligocar và tách ra khỏi dung dịch thu sản phẩm [16], [20], [84]

Với mục tiêu loại bỏ các thành phần không phải car (oligocar), có khả năng ảnh hưởng đến tác dụng chức năng mong muốn của car (oligocar) là ứng dụng trong chế biến và bảo quản surimi, hỗ trợ phòng chống và điều trị bệnh viêm loét dạ dày, đồng thời gây khó khăn cho việc xác định cấu trúc của car (oligocar) Mặt khác, quá trình tinh sạch car phải phù hợp với thực tế sản xuất, có tính khả thi để áp dụng vào thực tế sản xuất một cách thuận lợi (không phức tạp, đòi hỏi thiết bị và công nghệ phức tạp, không yêu cầu đầu tư lớn dẫn đến làm tăng chi phí sản xuất…) Quá trình tinh sạch car ngoài các yêu cầu đã trình bày ở trên và để phù hợp với yêu cầu của đề tài là xây dựng quy trình tinh sạch car và oligocar ở quy mô pilot, tiến tới áp dụng trong thực tế sản xuất car và oligocar dùng làm thực phẩm chức năng ở quy mô công nghiệp, đồng thời còn cần đảm bảo an toàn, vệ sinh môi trường, an toàn cho người công nhân sản xuất,

dư lượng trong sản phẩm không ảnh hưởng đến vệ sinh, an toàn thực phẩm, luận án lựa chọn áp dụng kỹ thuật tinh chế car và oligocar bằng phương pháp sử dụng dung môi hữu cơ (ethanol) để kết tủa và tách car, oligocar ra khỏi dung dịch, một phương pháp đã được khá nhiều nghiên cứu sử dụng để tinh sạch car Phương pháp này có ưu điểm là đơn giản, cho phép nhận được sản phẩm có độ tinh khiết cần thiết dùng làm thực phẩm, có thể dễ dàng áp dụng trong thực tế sản xuất

Ngoài ra, để tinh sạch car và oligocar, cần phải tách protein và lipid ra khỏi các mẫu thô Để loại protein và lipid có nhiều phương pháp khác nhau Cơ sở của các phương pháp này dựa trên khả năng tủa protein trong môi trường axit nhẹ và trong một

số dung môi khác nhau Các tác nhân dùng để tủa protein thường sử dụng như hệ Trichloroacetic acid (TCA) - Na deoxycholate (DOC); tủa bằng TCA, acetone, ethanol, TCA-DOC/Acetone, acetone/methanol axit hóa, chloroform và methanol [104] Mục đích thu được sản phẩm tinh sạch dùng làm thực phẩm, vì vậy dùng ethanol để loại protein ra khỏi các sản phẩm thô, lipid không bị kết tủa cùng với protein bị loại ra cùng với dung dịch; khó khăn chính của phương pháp này là car, oligocar cũng bị tủa, vì vậy cần tiến hành khảo sát ảnh hưởng của nồng độ ethanol lên khả năng tủa protein, car và oligocar Từ đó, tìm ra nồng độ ethanol chỉ kết tủa protein, không kết tủa với car hay oligocar Ngoài ra, quá trình kết tủa protein, car và oligocar chỉ thực hiện được khi car (oligocar) ở trạng thái dung dịch Theo một số công bố, car

có nhiệt độ tan gel và nhiệt độ tạo gel nằm trong vùng nhiệt độ (46 đến 520C) và (380C đến 440C) tương ứng [41] Để thuận lợi cho việc kết tủa protein, car và oligocar cần

tiến hành trong điều kiện nhiệt độ car, oligocar có khả năng hòa tan tốt Do đó, cần xác định nhiệt độ tan gel và nhiệt độ tạo gel của chúng

Một trong những khó khăn trong công nghệ sản xuất polysaccharide từ rong biển nói chung và car nói riêng đó là độ nhớt cao, khả năng hòa tan hạn chế vì vậy đòi hỏi

thiết bị cồng kềnh [94] Để giảm độ nhớt và tăng độ hòa tan của car, các nhà sản xuất

thường cho thêm vào dung dịch car một lượng nhỏ axit để hạn chế khả năng tạo gel

1.5 PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH THÀNH PHẦN VÀ CẤU TRÚC CỦA CARRAGEENAN

1.5.1 Phương pháp phân tích thành phần và cấu trúc của carrageenan [74], [83]

Thông thường việc phân tích cấu trúc của polysaccharide gồm 5 bước chính sau: 1- Xác định thành phần monosaccharide bằng con đường thuỷ phân mạch cacbohydrat với việc cắt các liên kết glycosid Các nhóm thế có trong mạch được xác định bằng phổ hồng ngoại (IR)

2- Methyl hoá sản phẩm phân tích thông qua chuỗi phản ứng hoá học dẫn xuất hoá các monosaccharide, để việc xác định chúng có thể thực hiện bằng phổ khối (MS)

3- Ghi dữ liệu cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) với các tín hiệu cộng hưởng 1D và 2D NMR

4- Xác định trật tự liên kết glycosid và các vị trí nhóm thế

5- Nghiên cứu cấu trúc không gian polysaccharide bằng các thông số NMR được

hỗ trợ bởi kỹ thuật mô hình hoá phân tử Đây là hướng nghiên cứu còn rất mới mẻ

Kết hợp giữa con đường nghiên cứu hóa học với sự phát triển hiện nay của các phương pháp hoá lý trong nghiên cứu cấu trúc, đã sử dụng các phương pháp nghiên cứu sau:

- Phương pháp hoá học

Phương pháp hoá học là phương pháp khá phổ biến được sử dụng để xác định thành phần monomer của các polysaccharide Tính chất đặc biệt của car liên quan chủ yếu đến hàm lượng 3,6-D-anhydrogalactose và hàm lượng OSO3- có trong mạch, vì vậy việc phân tích xác định hàm lượng các thành phần này là rất quan trọng Không giống các monomer khác, 3,6-D-anhydrogalactose rất nhạy cảm với axit và bị phá huỷ hoàn toàn khi thuỷ phân Tính chất này được sử dụng rộng rãi để phân tích định lượng

3,6-D-anhydrogalactose khi có mặt các monomer khác bằng phản ứng tạo màu với recorcinol và axit clohydric đậm đặc Tuy nhiên, phương pháp này không phân biệt được 3,6-D-anhydrogalactose và các dẫn xuất của nó, không định dạng được cấu hình tuyệt đối Để giải quyết vấn đề này người ta thường dùng các phương pháp hoá học khác nhau như aceto hoá, methanol hoá, methyl hoá, thuỷ phân oxi hoá, thuỷ phân khử rồi kết hợp phương pháp sắc kí khí để phân tích thành phần Mặc dù phương pháp hoá học cho những thông tin quý giá về thành phần từng cấu tử trong phân tử car nhưng phương pháp này đòi hỏi những phản ứng phức tạp, cần quá trình chiết tách phức tạp trong phòng thí nghiệm

- Phương pháp vật lý

+ Phương pháp hồng ngoại: phương pháp hồng ngoại là một phương pháp đơn

giản, thuận tiện được sử dụng để nghiên cứu cấu trúc của car Phép đo này chỉ đòi hỏi một vài milligam mẫu khô được sấy, nghiền và trộn với bột KBr theo tỷ lệ 1: 10 Tiến hành đo mẫu, các đặc trưng nhóm chức của một loại car cho trước được đánh giá tại các số sóng đặc trưng S=O của ester sunphat tại 1240cm-1, CO của 3,6-anhydro-D-galactose tại 930 - 940cm-1 C-O-S của sunphat axial thứ hai ở C-4 của galactose tại 845cm-1 C-O-S của sunphat equatorial thứ hai ở C-2 của galactose tại 830cm-1 C-O-S của sunphat equatorial thứ nhất ở C-6 của galactose tại 820cm-1 C-O-S của sunphat axial thứ hai ở C-2 của 3,6 anhydro-D- galactose tại 805cm-1 [92]

Dải hấp thụ tại 895-900cm-1 cũng xuất hiện trên phổ IR của κ-car Dải này thường không xuất hiện trên phổ của các car không được desunphat hoá [105] Đây chính là điểm phân biệt giữa car và các agar Các peak đặc trưng chính đã có thể đo được trong rong khô ban đầu (car chiếm 50 – 70%) hoặc sau các phân đoạn chiết car Sigma Các thành phần ít, ở nồng độ 5 - 7% trọng lượng cũng có thể xác định bằng cách sử dụng kĩ thuật này

+ Phương pháp cộng hưởng từ hạt nhân (NMR): phổ 1H-NMR của polysaccharide có thể khẳng định độ tinh khiết của mẫu (không có mặt của các tín hiệu các oligonucleotide, protein hay lipid) [74] Phổ cũng có thể cho biết số monosaccharide thực từ số các cộng hưởng proton anomer thông qua các tín hiệu trong khoảng 4,4 đến 5,8 ppm Như vậy, dựa vào tỷ lệ tích phân tương đối của các cộng hưởng anome cũng có thể đánh giá tỷ lệ phân tử của các monosaccharide Về mặt này kết quả phân tích hoá học có thể phù hợp với kết quả phân tích 1H NMR Nhìn chung,

kết quả tính tích phân NMR là chính xác so với kết quả phân tích hoá học Nhiều nhóm thế có thể được xác định hoặc sự có mặt của chúng được dự đoán dựa vào phổ 1D 1H NMR Tiếp theo, số lượng chính xác của các monosaccharide có thể được khẳng định chính xác nhờ vào việc khảo sát vùng anome của phổ 2 chiều dị hạt nhân

1

H-13C HSQC

Độ dịch chuyển hoá học của proton anome (4,4 - 5,8ppm) được tách biệt một cách không hoàn toàn rõ rệt khỏi các cộng hưởng 1H ở các vị trí khác (3,2 - 4,5ppm) trong khi độ dịch chuyển 13C anome (95 - 110ppm) lại tách biệt rất rõ, không hề trùng chập với các cộng hưởng 13C ở các vị trí còn lại (60 - 85ppm)

Dạng vòng (hexose hay furanose) và các cấu hình anome được suy ra từ các thông tin kết hợp có giá trị từ độ dịch chuyển hoá học 1H (H cộng hưởng giữa 5,0 và 5,8 ppm trong khi H cộng hưởng trong khoảng 4,4 và 5,2ppm) với hằng số tương tác

vô hướng của C-1, H-1 (1JC-1, H-1 165-175 Hz đối với  trong khi 1JC-1, H-1 158-165 Hz đối với ) Tương tác dị hạt nhân liên kết 1JC-1,H-1 có thể thu được từ phổ 1H – 13C HSQC không khử tương tác

Bảng 1.3 Độ dịch chuyển hoá học sigma từ cơ sở dữ liệu SUGABASE của dạng

glucose và galactose [63]

Monosacarit

H-1 C-1

H-2 C-2

H-3 C-3

H-4 C-4

H-5 C-5

H-6a C-6

H-6b

-D-Glcp

5,11 0,30 97,5 4,5

3,520,06 72,51,0

3,760,10 73,80,4

3,410,05 70,70,6

3,740,10 72,90,5

3,640,16 61,40,4

3,780,08

-D-Glcp

4,840,46 102,92,4

3,310,05 74,11,1

3,550,07 76,31,4

3,510,13 70,41,0

3,550,09 76,01,3

3,770,05 61,51,0

3,940,05

-D-Galp

5,160,35 99,13,1

3,890,12 68,91,3

3,930,16 70,21,7

4,120,19 68,61,9

4,110,29 71,02,0

3,730,07 61,70,8

3,730,04

-D-Galp

4,680,26 103,52,4

3,530,17 71,72,1

3,800,16 73,51,7

4,080,18 67,92,0

3,740,20 75,51,1

3,740,05 61,80,7

3,740,05

Các vị trí được thế của monosaccharide được gọi là vị trí aglycon tương ứng với các nguyên tử C ở các vị trí không phải anome của liên kết glycosid Từ dữ liệu NMR, vị

trí liên kết được suy ra dựa trên sự tăng mạnh (> + 3ppm) về độ dịch chuyển hoá học của

13

C so với độ dịch chuyển hoá học của các monome không thế Việc phân tích này cũng mang lại thông tin giống với những phân tích khi metyl hoá Trật tự các đơn phân trong mạch của polysaccharide được xác định chính là chuỗi các liên kết glycosid, thể hiện thông tin cấu trúc chính cần xác định thu được từ hai loại phổ 1H- 13C HMBC và NOESY

+ Phương pháp khối phổ (MS): một thời gian dài, đối với car nói riêng và các

polysaccharide nói chung, phương pháp khối phổ chỉ có thể được áp dụng sau khi đã

có sự chuyển hoá hoá học Trước hết mẫu được thuỷ phân để tạo thành các mono hoặc disaccharide, sau đó các tiểu phân này cần được metyl hoá để có thể phân tích bằng GC/MS Quá trình phân tích đòi hỏi nhiều thực nghiệm, thời gian và hoá chất, trong khi kết quả thu được chỉ cho biết gián tiếp về các đơn phân hình thành nên mạch mà không cung cấp nhiều thông tin về trật tự liên kết, do các đơn phân đã được metyl hoá nên có thể thông tin về nhóm thế của đơn phân sẽ bị mất đi Chính vì thế, phương pháp

MS sử dụng kĩ thuật ion hoá thông thường va chạm electron EI không phát huy sức

mạnh đối với các mẫu car

Những năm gần đây, với sự phát triển của kĩ thuật ESI và MALDI, đã mở ra một hướng mới trong nghiên cấu trúc các polysaccharide bằng phương pháp khối phổ Tuy nhiên, các nghiên cứu này vẫn còn là bài toán mở vì phổ của chúng vô cùng phức tạp nên việc nghiên cứu cũng chỉ mới dừng lại ở một số oligomer Với những oligosaccharide thông thường không chứa các nhóm mang điện tích, người ta còn phải thêm các ion kim loại kiềm vào dung dịch mẫu để dễ thu được các ion hơn Những nghiên cứu ít ỏi này bước đầu cũng giúp các nhà hoá học nghiên cứu cấu trúc của một

số oligosaccharide [73], [91]

1.5.2 Nghiên cứu cấu trúc của carrageenan

Theo Maitland W McLean và cộng sự (1979), sản phẩm thủy phân κ-car bằng

enzyme κ-carrageenase thu được trong môi trường nuôi cấy Pseudomonas carrageenovora được tách bằng lọc gel, phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C Những kết quả này phù hợp với sản phẩm thủy phân là neocarrabiose 4-O-sulphate [81]

Năm 1991, Potin và cộng sự phân tích các sản phẩm thủy phân của κ-car bằng lọc gel và phổ 13C-NMR cho thấy, enzyme thủy phân κ-car thành κ-neocarratetraose sulfate [90]

Theo Guangli Yu và cộng sự (2002), ba oligocar được tinh chế bằng sắc ký trao

đổi anion hiệu suất cao; cấu trúc của nó được làm sáng tỏ bằng cách sử dụng dữ liệu quang phổ khối lượng và NMR Sắc ký lỏng khối phổ có kết nối bộ phun điện (ESI-MS) cung cấp trọng lượng phân tử của các hợp phần và làm sáng tỏ các mô hình phân mảnh của các oligocar Kỹ thuật 2D-NMR, bao gồm 1H-1H Cosy, 1H-1H TOCSY và

13

C-1H-HMQC được thực hiện để xác định cấu trúc của một pentasaccharide trisulfated 1D NMR và ESIMS đã được sử dụng để xác định cấu trúc của

pentasaccharide, heptasaccharide, và undecasaccharide có nguồn gốc κ-Car [63]

Năm 2003, Thành Thị Thu Thủy và cộng sự sử dụng phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR), hồng ngoại IR và sắc ký lọc gel (GPC)/sắc ký lỏng khối phổ có bộ kết nối phun điện (ESI-MS) đã xác định được car chiết xuất từ rong sụn nuôi trồng tại tỉnh Ninh Thuận là κ-car [96], [97]

In Guangli (2004), thủy phân κ-car bằng acid HCl chỉ xảy ra tại liên kết (1→3) glycosidic Sử dụng ESI-MS và FACE phân tích, chứng minh rằng các phân tử κ-car là một axit sulfuric galactan tuyến tính, không tồn tại phân nhánh [71]

α-Theo Guibet và cộng sự (2006), các sản phẩm thủy phân được phân tích bằng phổ 1H và 13C-NMR, tất cả các oligocar quan sát thuộc loại neo - carrabiose oligosaccharide chỉ ra rằng -carrageenase thủy phân liên kết -(1-4) glycosidic [64]

Trần Đình Toại và cộng sự (2008), sử dụng acid HCl để thủy phân car chiết từ

rong Hồng Vân Eucheuma gelatinae thuộc ngành rong đỏ Rhodophyta vùng biển Việt

Nam) để tạo oligocar và dùng phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H-NMR,

13

C-NMR) và phổ khối kết hợp sắc ký lỏng (LC-MS) để xác định cấu trúc của sản phẩm, đưa đến kết luận quan trọng: thủy phân car bằng acid HCl làm thay đổi không đáng kể cấu trúc của polymer, chỉ có tác dụng phá vỡ các liên kết glycoside làm cắt ngắn mạch polymer [36]

Bùi Huy Chích (2008), trên cơ sở xác định phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR (1H, 13C), chứng tỏ rằng enzym chỉ cắt mạch liên kết glycoside mà ít ảnh hưởng đến sự phá vỡ cấu trúc phân tử car, sau khi được thủy phân bằng enzyme amylase, sản phẩm thu được vẫn có dạng là - car [6], [23]

Năm 2009, theo Loan Hui các oligosaccharide tách bằng cách sử dụng phân đoạn ethanol, các phân đoạn được sắc ký lọc gel qua cột lọc Bio-Gel P-4, xác định phổ

IR và phân tích hóa học, chứng minh rằng: quá trình thủy phân enzyme làm thay đổi không đáng kể cấu trúc của κ-car [78]

Nghiên cứu của Jouanneau và cộng sự (2010) cho thấy, sự thay đổi hóa học của carbon proton anomeric và các ảnh hưởng mạnh mẽ bởi các carrabiose liền kề, điều này giải thích các tín hiệu NMR D6S-H1 không đối xứng khi quan sát Sử dụng NMR

và sắc ký để theo dõi chuyển đổi kiềm của κ-carrabiose, thấy rằng việc phân phối carrabiose (μ-,-μ-μ, μ-μ-μ) không ảnh hưởng đến tỷ lệ chuyển đổi [75]

μ-1.6 GIỚI THIỆU VỀ NGHIÊN CỨU ĐỘC CHẤT

Nghiên cứu tiền lâm sàng là một chiến lược nghiên cứu nhằm thu thập tối đa các thông tin về mức độ hiệu quả và độc tính của một sản phẩm mới trước khi sử dụng cho người Trong nghiên cứu tiền lâm sàng mô hình động vật thí nghiệm thích hợp sẽ được

áp dụng để đạt mục tiêu nghiên cứu Thiết kế nghiên cứu cần bao phủ mọi khía cạnh

có thể cân nhắc giữa lợi ích của hiệu quả tác dụng và nguy cơ tiềm ẩn khi sử dụng trên người đảm bảo sự an toàn hợp lý khi tiến hành thử nghiệm lâm sàng trên người

Các hướng dẫn về nghiên cứu tiền lâm sàng được các tổ chức quốc tế ban hành bao gồm Cơ quan đánh giá dược phẩm châu Âu (EAEM: The European Agency for the Evaluation of Medicinal Product), Hội đồng đăng ký dược phẩm (CPMP: Committee for Proprietary Medicinal Products) và Tổ chức hài hòa ba bên (ICH) Tại Việt nam, hướng dẫn nghiên cứu tiền lâm sàng chung cho các dược chất và vắc xin –sinh phẩm được quy định trong Thông tư số 22/2009/TT-BYT qui định về đăng ký

khó phân tích kết quả Chó, chồn, linh trưởng cũng là các loài được chọn lựa trong các nghiên cứu chuyên biệt, tuy nhiên các động vật này ít được sử dụng hơn vì liên quan đến giá thành và mức độ khó tìm kiếm, số lượng sử dụng ít, không đủ phân tích thống kê Ưu và nhược điểm của mỗi một loài cần được xem xét trong mối quan hệ với sản phẩm thử nghiệm, được lựa chọn trong thiết kế nghiên cứu và trong việc biện luận kết quả tiếp theo Lựa chọn một hay vài loài động vật nghiên cứu cho cùng sản phẩm chủ yếu có thể hiển thị và ngoại suy được các tác động của sản phẩm nghiên cứu

có thể xảy ra trên người

- Thiết kế nghiên cứu

Nhóm nghiên cứu: số lượng, giới tính, tuổi và trọng lượng của của con vật trong từng nhóm cần được thiết kế Tình trạng sức khỏe, điều kiện nuôi dưỡng, chăm sóc động vật thí nghiệm (ĐVTN) cũng cần được đề cập để giảm thiểu tối đa các ảnh hưởng không đặc hiệu đến kết quả của nghiên cứu Lý tưởng nhất là chọn được loài ĐVTN nhạy cảm với tác nhân sinh học hay độc tố Trong trường hợp chưa có thông tin về cơ chế bảo vệ hay tác động của sản phẩm mới có thể sử dụng nhiều hơn một loài ĐVTN cho nghiên cứu Số lượng động vật thí nghiệm trong một nhóm tùy thuộc vào

mô hình ĐVTN đã chọn Đối với các loại ĐVTN nhỏ như chuột nhắt, chuột cống… 6

-10 con vật cho 1 giới và cho 1 nhóm được khuyến cáo Nhóm nghiên cứu cần bao gồm nhóm liều cao (hight dose) và các nhóm liều thấp hơn (all doses)

Nhóm đối chứng: Cần thiết kế một nhóm chứng để xác định mức nền (baseline)

và tránh các ảnh hưởng nhiễu trong phân tích kết quả của quá trình nghiên cứu Tốt nhất là một giả dược giống như sản phẩm nghiên cứu nhưng không có hoạt chất

Nhóm đánh giá các tác động độc đảo ngược (recovery/reversibility): Nghiên cứu cũng cần thiết kế thêm một nhóm ĐVTN được theo dõi kéo dài sau thời gian nghiên cứu

đã định để đánh giá sự đảo ngược của các tác dụng phụ quan sát thấy trong giai đoạn nghiên cứu, đồng thời cũng để sàng lọc các tác dụng phụ tiềm ẩn xảy ra muộn hơn Liều lượng: Lựa chọn liều lượng là một trong các yếu tố quan trọng nhất trong thiết kế nghiên cứu Đối với nghiên cứu độc tính thường áp dụng liều tối đa cho 1 lần

sử dụng và tổng tích lũy của các liều lặp lại để đánh giá các nguy cơ gây độc tiềm ẩn Ngược lại, trong nghiên cứu xác định hiệu quả cần xác định liều vừa đủ tác dụng Sau khi quyết định liều cao, các liều lượng thấp hơn nên được lựa chọn theo một chuỗi