Nghiên cứu nhân giống cây quýt bắc kạn bằng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật

Nghiên cứu ảnh hưởng của tổ hợp BAP hoặc kinetin với IBA đến sự phát sinh chồi trong ống nghiệm của giống quýt Bắc Kạn.. Kỹ thuật nhân giống in vitro trong công nghệ tế bào thực vật Nhâ

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: PGS TS NGUYỄN THỊ TÂM

THÁI NGUYÊN - 2017

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đã trực tiếp làm các nghiên cứu trong luận văn này Mọi kết quả thu được là trung thực, không chỉnh sửa, không sao chép từ kết quả nghiên cứu khác Các số liệu, kết quả nghiên cứu của luận văn này chưa từng được công bố

Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm với lời cam đoan trên!

Tác giả luận văn

Phí Hữu Việt

LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình thực hiện luận văn, tôi đã nhận được sự quan tâm giúp

đỡ tận tình của nhiều cá nhân, cơ quan đơn vị Nay luận văn đã hoàn thành, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới:

PGS TS Nguyễn Thị Tâm, người đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và tạo

mọi điều kiện, giúp đỡ tôi nghiên cứu và thực hiện đề tài này

Các thầy giáo, cô giáo thuộc khoa Sinh học, bộ phận Sau đại học của Phòng Đào tạo, Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên đã nhiệt tình giảng dạy và tạo mọi điều kiện cho tôi hoàn thành khóa học

Cán bộ kỹ thuật viên phòng Công nghệ tế bào thực vật – Khoa Sinh học- Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên đã tận tình hướng dẫn, giúp

đỡ và tạo mọi điều kiện cho tôi tiến hành luận văn này

Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn những người thân trong gia đình, bạn bè và đồng nghiệp đã tạo điều kiện, giúp đỡ và động viên tôi trong suốt thời gian học tập

Thái Nguyên, tháng 3 năm 2017

Tác giả luận văn

Phí Hữu Việt

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT iv

DANH MỤC CÁC BẢNG v

DANH MỤC CÁC HÌNH vi

MỞ ĐẦU 1

1 Đặt vấn đề 1

2 Mục tiêu nghiên cứu 2

3 Nội dung nghiên cứu 2

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Đặc điểm phân loại, sinh học và thành phần dinh dưỡng của quả quýt 3

1.1.1 Đặc điểm phân loại và đặc điểm sinh học 3

1.1.2 Thành phần dinh dưỡng của quả quýt 4

1.2 Tình hình sản xuất quýt trên thế giới và ở Việt Nam 5

1.2.1 Tình hình sản xuất quýt trên thế giới 5

1.2.2 Tình hình sản xuất quýt ở Việt Nam 5

1.3 Kỹ thuật nhân giống in vitro trong công nghệ tế bào thực vật 6

1.3.1 Ưu thế và các phương thức nhân giống in vitro 7

1.3.2 Quy trình nhân giống in vitro 9

1.4 Chất điều hòa sinh trưởng thuộc nhóm auxin và cytokinin sử dụng trong nuôi cấy mô thực vật 11

1.4.1 Auxin 12

1.4.2 Cytokinin 13

1.5 Một số yếu tố ảnh hưởng đến nhân giống cây trồng trong ống nghiệm 14 1.6 Một số thành tựu nhân giống cây ăn quả có múi bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro 15

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19

2.1 Vật liệu, hoá chất, thiết bị và địa điểm nghiên cứu 19

2.1.1 Vật liệu thực vật 19

2.1.2 Hoá chất, thiết bị 19

2.1.3 Địa điểm nghiên cứu 20

2.2 Phương pháp nghiên cứu 20

2.2.1 Nhóm phương pháp nuôi cấy in vitro 20

2.2.2 Phương pháp đưa cây ra vườn ươm 22

2.2.3 Phương pháp xử lí số liệu 23

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 24

3.1 Ảnh hưởng của thời gian khử trùng đến sự nảy mầm của hạt quýt Bắc Kạn 24

3.2 Ảnh hưởng riêng rẽ của BAP hoặc kinetin đến sự phát sinh chồi của quýt Bắc Kạn 27

3.2.1 Ảnh hưởng của BAP đến sự phát sinh chồi của quýt Bắc Kạn 27

3.2.2 Ảnh hưởng của kinetin tới sự phát sinh chồi của quýt Bắc Kạn 30

3.3 Ảnh hưởng của tổ hợp BAP hoặc kinetin với IBA đến sự phát sinh chồi của quýt Bắc Kạn 33

3.3.1 Ảnh hưởng của tổ hợp BAP và IBA đến sự phát sinh chồi cây quýt Bắc Kạn 33

3.3.2 Ảnh hưởng của tổ hợp kinetin và IBA đến sự phát sinh chồi quýt Bắc Kạn 35

3.4 Ảnh hưởng của α-NAA đến sự hình thành rễ cây quýt Bắc Kạn 38

3.5 Ảnh hưởng của giá thể đến việc đưa cây in vitro giống quýt Bắc Kạn ra ngoài tự nhiên 40

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 43

1 Kết luận 43

2 Đề nghị 43

TÀI LIỆU THAM KHẢO 44

PHỤ LỤC 47

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

2,4-D : 2,4 - dichlorophenoxy acetic acid BAP : Benzylamino purine

cs : Cộng sự

CT : Công thức DNA : Deoxyribo nucleic acid

ĐC : Đối chứng IAA : indol acetic acid IAA : indole acetic acid IBA : Indol butyric acid Kinetin : 6-furfurylamino purine

MS : Murashige and Skoog (1962) α-NAA : α- naphthalene acetic acid

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1 Thành phần cơ bản của môi trường MS 19Bảng 3.1 Ảnh hưởng của thời gian khử trùng đến sự nảy mầm của hạt

quýt Bắc Kạn (sau 6 tuần nuôi cấy) 25

Bảng 3.2 Ảnh hưởng của BAP đến sự phát sinh chồi của cây quýt Bắc Kạn 28Bảng 3.3 Ảnh hưởng của kinetin đến sự phát sinh chồicủa cây quýt Bắc Kạn 31Bảng 3.4 Ảnh hưởng của tổ hợp BAP và IBA đến sự phát sinh chồi của

cây quýt Bắc Kạn 34Bảng 3.5 Ảnh hưởng của tổ hợp kinetin và IBA đến sự phát sinh chồi của

cây quýt Bắc Kạn 36Bảng 3.6 Ảnh hưởng của α-NAA đến sự phát sinh rễcủa cây quýt Bắc Kạn 39

Bảng 3.7 Ảnh hưởng của giá thể đến việc đưa cây in vitro giống quýt Bắc

Kạn ra ngoài tự nhiên (sau 6 tuần) 41

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 3.1: Ảnh hưởng của thời gian khử trùng đến sự nảy mầm của hạt

quýt Bắc Kạn (sau 6 tuần) 26Hình 3.2 Ảnh hưởng của BAP đến sự phát sinh chồi của quýt Bắc Kạn 30Hình 3.3 Ảnh của kinetin đến sự phát sinh chồi của quýt Bắc Kạn (sau

8 tuần) 32Hình 3.4 Ảnh hưởng của tổ hợp BAP và IBA đến sự phát sinh chồi của

quýt Bắc Kạn (sau 8 tuần nuôi cấy) 35Hình 3.5 Ảnh hường của tổ hợp kinetin và IBA đến sự phát sinh chồi của

quýt Bắc Kạn (sau 8 tuần nuôi cấy) 37Hình 3.6 Ảnh hưởng của NAA đến sự hình thành và phát triển rễ của cây

quýt Bắc Kạn (sau 8 tuần nuôi cấy) 40Hình 3.7 Ảnh hưởng của giá thể đến việc đưa cây in vitro giống quýt Bắc

Kạn ra ngoài tự nhiên (sau 6 tuần) 42

MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề

Cây quýt (Citrus recutilata Blanco) là cây ăn quả được nhiều người biết

đến với vị ngọt mát, thơm đặc trưng, có chứa nhiều vitamin, chất khoáng và các chất dinh dưỡng cần thiết khác cho con người Các chuyên gia về dinh

dưỡng khuyên ta nên tích cực ăn quýt hàng ngày

Cây quýt không chỉ là nguồn cung cấp chất dinh dưỡng mà còn đóng vai trò tích cực trong việc phát triển kinh tế của nhiều địa phương Do chất lượng quả tốt nên nhu cầu tiêu thụ quýt trên thị trường ngày càng tăng với số lượng lớn Giá thành ổn định đã mang lại hiệu quả kinh tế cao cho người trồng quýt, nhiều hộ gia đình đã thoát nghèo và vươn lên làm giàu từ cây quýt

Trồng quýt còn có vai trò phủ xanh đất trống đồi trọc, giúp tạo cảnh quan

và bảo vệ môi trường sinh thái Với chiều cao cây từ 2,0-3,5m, lá xanh che phủ quanh năm, thích nghi với điều kiện sống khô hạn, nên cây quýt rất phù hợp với vùng trung du và miền núi Do đó, có thể trồng quýt trên các đồi dốc vừa đem lại hiệu quả kinh tế vừa phủ xanh đồi trọc chống xói mòn, bảo vệ môi trường sinh thái Không những thế, quýt cũng có thể trồng trong vườn nhà, cây cao vừa phải, lá thường xanh, hoa quả màu sắc đẹp, có tinh dầu tỏa ra mùi thơm mát, do đó nó còn được trồng để làm cảnh

Cây quýt Bắc Kạn được trồng chủ yếu ở huyện Chợ Đồn, có vị nọt mát, hương thơm đặc trưng, là loại quả quý cần được bảo tồn Đồng thời, cây quýt

đã được Ủy ban Nhân dân tỉnh Bắc Kạn xác định là cây trồng thế mạnh đóng vai trò chiến lược trong phát triển kinh tế, do đó đã có nhiều chính sách và chế

độ phát triển cây quýt Tính đến năm 2015, diện tích quýt của toàn tỉnh Bắc Kạn lên tới 2200 ha, tăng gấp 5 lần so với năm 2005, tổng sản lượng khoảng

10000 tấn/năm đã mang lại giá trị sản xuất trên 100 tỷ đồng cho nông dân Tuy nhiên, giá trị đó vẫn chưa xứng tầm với tiềm năng sẵn có của địa phương Một

trong những lí do làm năng suất của cây quýt còn thấp là nhiều vườn quýt khai thác lâu năm đã bị thoái hóa không những làm năng suất thấp mà chất lượng quả cũng bị giảm Do đó, để tăng năng suất và nâng cao chất lượng thì cần có biện pháp trồng cải tạo những diện tích quýt thoái hóa Bên cạnh đó, chiến lược trong những năm tới, tỉnh định hướng khoảng 1000 ha quýt chăm sóc theo tiêu chuẩn VietGap nên nhu cầu cây giống tốt là rất lớn

Phương pháp nhân giống in vitro giúp tạo ra một số lượng lớn giống cây

trồng trong khoảng thời gian ngắn, các cây con mang đặc điểm giống nhau và

giống với dòng mẹ nên có thể tạo quần thể đồng nhất Đặc biệt, nhân giống in vitro còn tạo ra giống cây sạch bệnh do được nuôi cấy trong điều kiện vô trùng,

từ đó đáp ứng yêu cầu sản suất rau quả sạch ngày nay

Từ những lí do trên, chúng tôi chọn đề tài "Nghiên cứu nhân giống cây quýt Bắc Kạn bằng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật"

2 Mục tiêu nghiên cứu

Nghiên cứu được môi trường nhân giống quýt Bắc Kạn phù hợp trong ống nghiệm

Xác định được giá thể phù hợp cho việc chuyển cây từ môi trường nuôi cấy ra vườn ươm

3 Nội dung nghiên cứu

Nghiên cứu khử trùng hạt quýt Bắc Kạn nhằm tạo nguồn mẫu sạch ban đầu trong ống nghiệm

Nghiên cứu ảnh hưởng riêng rẽ của BAP và kinetin lên sự phát sinh chồi trong ống nghiệm của giống quýt Bắc Kạn

Nghiên cứu ảnh hưởng của tổ hợp BAP hoặc kinetin với IBA đến sự phát sinh chồi trong ống nghiệm của giống quýt Bắc Kạn

Nghiên cứu tạo cây hoàn chỉnh thông qua thăm dò ảnh hưởng của NAA tới sự phát sinh rễ từ chồi giống quýt Bắc Kạn

α-Nghiên cứu đưa cây ra môi trường tự nhiên

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Đặc điểm phân loại, sinh học và thành phần dinh dưỡng của quả quýt

1.1.1 Đặc điểm phân loại và đặc điểm sinh học

Cây quýt thuộc bộ cam quýt: Rutales, họ cam quýt: Rutaceae, chi: Citrus, loài quýt: Citrus recutilata Blanco (tên khác: Citrus suhuiensis Hort ex

Tanaka hoặc: Citrus deliciosa Tennre) [111]

Cây quýt có bộ lá xanh quanh năm, lá đơn, mọc cách và có eo lá Lá thay nhau rụng trong lúc lá mới xuất hiện nên cây lúc nào cũng xanh lá Trong lá có

nhiều túi tiết tinh dầu nên khi vò lá có mùi thơm [3]

Quýt là cây thân gỗ, thiết diện tròn, mầu nâu thẫm, cao 2-3m, hình dạng ngoài của cây thường có hình chóp, thân cây có gai, phần trong vỏ cây có chứa nhiều túi tiết tinh dầu thơm Cây trồng bằng hạt thường có một gốc lớn, trồng cây bằng cành chiết thì có nhiều cành gốc

Quýt có rễ cọc khỏe, lan rộng, rễ phát triển ở nhiệt độ 10-37oC, khi nhiệt

độ cao hay thấp hơn, độ ẩm của đất 1% thì sự phát triển của rễ sẽ ngừng lại Tỉ

lệ ôxi trong đất từ 1,2 - 1,5% thì rễ cũng ngừng phát triển Cây trồng bằng chiết cành thì không có rễ chính rõ ràng mà có nhiều rễ cạnh có thể phát triển to nhưng không đâm sâu xuống đất như trồng bằng hạt

Hoa thường được hình thành ở nách lá, hoa mọc thành cụm, lưỡng tính, cánh hoa rời nhau và mẫu bốn Trong hoa thường có đĩa mật thích nghi với việc thụ phấn nhờ sâu bọ Nhị hoa thường có số lượng nhiều gấp ba đến bốn lần số cánh hoa Cây quýt miền Bắc ra lộc đầu tiên vào tháng 2 hoặc tháng 3 hàng năm, phần lớn sinh ra cành cho quả, đợt 2 vào tháng 5 và tháng 6 sinh ra hoa, đợt 3 tháng 7 và tháng 8 đợt lộc này sinh ra cành khỏe dài, lá to màu nhạt Trong các lứa ra hoa thì lứa hoa tháng 2 và tháng 3 là tốt nhất [3]

Quả quýt thuộc dạng quả mọng gồm vỏ, thịt và hạt Vỏ có túi tinh dầu, thịt quả có nhiều múi, trong múi có các tép mọng nước, mỗi quả có 9- 13 múi Quả quýt hình dẹp, vỏ màu vàng và mỏng, vỏ dễ bóc, múi dễ chia, trọng lượng trung bình đạt từ 35 đến 145 gam tùy giống Quả có vị ngọt, chua nhẹ và có hương thơm đậm đặc trưng rất dễ để phân biệt vơi bất kì loại quả nào trong nhóm cây ăn quả có múi Trong mỗi quả có từ 18 đến 20 hạt tùy giống Hạt quýt có 2 lá mầm, đa phôi hay đơn phôi, hạt có 2 lớp màng vỏ, màng ngoài cứng do thấm nhiều linhin, màng trong mỏng Hạt thường chín cùng quả, nảy mầm ở nhiệt độ từ 10oC đến 30oC, tốt nhất là 25- 30oC [3]

1.1.2 Thành phần dinh dưỡng của quả quýt

Trong quả quýt có nhiều chất dinh dưỡng, vitamin, chất khoáng cần thiết cho sức khỏe con người, đặc biệt có chứa vitamin C giúp chống lại một số bệnh tật, tăng cường sức đề kháng Trong 100 gam múi quýt (phần ăn được) có thành phần dinh dưỡng gồm: nước 66,5%, protein 0,6%, lipit 0,7%, gluxit 6,4% xelulozo 0,4%, năng lượng 32kcalo, canxi 25,9mg, photpho 12,6mg, sắt 0,3mg, caroten 0,44mg, vitamin B1 0,06mg, vitamin B2 0,02mg, vitamin PP 0,2mg, vitamin C 41mg và một số axit hữu cơ [3], [277]

Trong quả quýt ngoài vitamin, chất khoáng thì còn có một lượng chất xơ Các chất xơ khi vào ống tiêu hóa bị trương lên do hút nước trong ruột, giúp cặn

bã của quá trình tiêu hóa dễ dàng thải ra ngoài Chất xơ khi vào ruột kết hợp với đường và axit tạo thể đông có tác dụng làm chậm quá trình hấp thụ một số chất dinh dưỡng từ đó làm lượng đường trong máu tăng vừa phải, duy trì ở mức cần thiết, nhờ đó mà cơ thể không thừa đường, không chuyển hóa thành mỡ dự trữ ở các mô gây béo phì [266]

Qủa quýt được nhiều người ưa chuộng, là loại quả sử dụng để ăn tráng miệng, làm nước giải khát, làm mứt Quả quýt có vị chua tính ấm, có tác dụng làm mát tim, khai uất, trừ đàm, tan khí kết, giải rượu Người bị cao huyết áp, bệnh mạch vành, đau dạ dày, suy dinh dưỡng, cơ thể suy nhược sau khi ốm, ăn

quýt rất tốt Vỏ quýt khô gọi là trần bì, có tính ấm, có tác dụng làm khỏe dạ dày, long đờm, trị ho, trị phong, lợi tiểu, chữa ợ hơi, đau thượng vị Y học đã chứng minh, tinh dầu thơm trong vỏ quýt có tác dụng hưng phấn tim, ức chế vận động của cơ dạ dày, phòng xuất huyết Vỏ quýt còn dùng để điều trị cao huyết áp, nhồi máu cơ tim, có tác dụng tốt với các chứng bệnh đầy bụng, rối loạn tiêu hóa, kém ăn, buồn nôn, ho nhiều đờm Hạt quýt vị đắng tính bình, vào hai kinh can và thận, có tác dụng kiện tì, lý khí, táo thấp hóa đờm Lá quýt vị đắng, tính bình vào đường can kinh, có tác dụng trợ gan, hành khí, tiêu thủng, tan u cục, chữa đau mạng sườn, sa nang, đau vú, u cục ở vú [266], [277]

1.2 Tình hình sản xuất quýt trên thế giới và ở Việt Nam

1.2.1 Tình hình sản xuất quýt trên thế giới

Cam quýt là loại quả quan trọng, đứng trên cả nho, chuối, táo Quýt được trồng tập trung chủ yếu ở các nước có khí hậu cận nhiệt đới như Mêhico, Brazin, Mỹ, Trung Quốc, Ấn Độ và các nước ven Địa Trung Hải, các nước ở vĩ tuyến 30- 350 Ngày nay, sản xuất cam quýt từ vùng nhiệt đới đã tăng lên gần bằng các nước cận nhiệt đới Nguyên nhân là do điều kiện tự nhiên, kĩ thuật canh tác tiến bộ, nhiệt độ vùng ôn đới hạ thấp hơn ảnh hưởng đến sản lượng quýt Nguyên nhân quan trọng hơn là dân số các nước vùng nhiệt đới tăng nhanh, điều kiện kinh tế phát triển hơn, nhu cầu tiêu thụ cam quýt tăng, kéo theo sản xuất cũng tăng Theo FAO (năm 2013) tổng sản lượng cam quýt trên thế giới đạt 135,169 triệu tấn Trong đó, năm quốc gia có sản lượng cao nhất là Trung Quốc 32,1 triệu tấn, Brazin 19,9 triệu tấn, Mỹ 10,3 triệu tấn, Ấn Độ 9 triệu tấn, Mehico 7,18 triệu tấn [29]

1.2.2 Tình hình sản xuất quýt ở Việt Nam

Việt Nam có khí hậu nhiệt đới gió mùa, thích hợp với nhiều loại cây Do vậy, cây quýt ở nước ta được trồng trải dọc từ Bắc xuống miền Nam Ở miền Bắc, quýt được trồng nhiều ở một số tỉnh Hà Tây, Hưng Yên, Bắc Giang, Bắc Kạn, Tuyên Quang, Hà Giang Do nhu cầu tiêu thụ cao nên diện tích trồng

quýt ở các địa phương ngày càng được mở rộng, nhiều vườn quýt được trồng lại bằng các giống cho năng suất và chất lượng cao Theo FAO, năm 2012 tổng sản lượng cam quýt nước ta đạt 958000 tấn, sang năm 2013 sản lượng đã tăng lên và đạt 971000 tấn Về năng suất trung bình trong năm 2012 đạt 119,53/ha, sang năm 2013 chỉ số này đã tăng lên 119,77/ha Tuy nhiên, việc sản xuất quýt trong nước vẫn chưa đáp ứng nhu cầu tiêu thụ trong nước nên mỗi năm nước ta vẫn phải nhập khẩu quýt từ các nước, trong đó chủ yếu là từ Trung Quốc [29]

1.3 Kỹ thuật nhân giống in vitro trong công nghệ tế bào thực vật

Nhân giống in vitro (vi nhân giống) là một trong những ứng dụng chính

của công nghệ tế bào thực vật, sử dụng sự phát triển nhân tạo và nhân các điểm sinh trưởng hoặc các mô phân sinh trong cây Theo các công trình nghiên cứu thì chỉ có đỉnh sinh trưởng của chồi mới đảm bảo sự ổn định về di truyền, tiếp đến là đỉnh mô phân sinh với kích thước nhỏ, kết hợp xử lý nhiệt để làm sạch bệnh là nguyên liệu tốt cho nhân giống [1]

Kỹ thuật nhân nhanh được ứng dụng nhằm phục vụ các mục đích sau: (1) Duy trì và nhân nhanh các kiểu gen quý hiếm làm vật liệu của công tác chọn giống

(2) Duy trì và nhân nhanh các cá thể đầu dòng tốt để cung cấp hạt giống các loại cây trồng khác nhau như cây lương thực có củ, các loại cây rau, cây cảnh, cây dược liệu…

(3) Nhân nhanh ở điều kiện vô trùng cách li tái nhiễm kết hợp với việc làm sạch bệnh virus

(4) Rút ngắn thời gian đưa các cây lai và các loài cây tự nhiên có đặc điểm tốt vào sản xuất hoặc nhân nhanh bố mẹ của các cặp lai trong sản xuất hạt lai

(5) Bảo quản tốt tập đoàn giống vô tính về các loài cây giao phấn trong ngân hàng gen [1],[15]

1.3.1 Ưu thế và các phương thức nhân giống in vitro

Ngành công nghiệp nhân giống in vitro phát triển và mở rộng trong

những năm gần đây do yêu cầu về chất lượng và số lượng cây giống tăng lên nhanh chóng trên toàn thế giới nhằm phục vụ những dự án trồng lại rừng, sản xuất lương thực, thực phẩm, thức ăn gia súc, nông nghiệp và bảo vệ môi trường

toàn cầu Vì nhân giống in vitro có những ưu điểm lớn mà không một loại hình

nhân giống nào có được

Thứ nhất: Hệ số nhân giống cao, rút ngắn thời gian đưa giống vào sản

xuất Trong phần lớn các trường hợp công nghệ in vitro đảm bảo một tốc độ

nhân nhanh Đồng thời, tạo cây con giống cây mẹ, đáp ứng yêu cầu của việc bảo tồn nguồn gen quý hiếm

Thứ hai: Nhân được một số lượng cây lớn trong một diện tích nhỏ Trong 1m2 diện tích có thể để được tới 18.000 cây

Thứ ba: Làm sạch bệnh cây trồng và cách ly chúng với các nguồn bệnh

vì vậy đảm bảo các giống sạch bệnh

Thứ tư: Thuận tiện và làm hạ giá thành vận chuyển (một thùng 40.000 cây dâu tây cũng chỉ nặng 15kg); việc bảo quản cây giống giữ ở nhiệt độ 40C trong hàng tháng vẫn cho tỉ lệ sống trên 95%

Thứ năm: Sản xuất quanh năm, quá trình sản xuất có thể được vận hành trong bất cứ thời gian nào trong ngày, mùa nào trong năm

Các phương thức nhân giống in vitro được ứng dụng đó là nuôi cấy mô

phân sinh hoặc đỉnh sinh trưởng; tái sinh cây hoàn chỉnh từ các bộ phận khác của cây và nhân giống qua giai đoạn mô sẹo đã đem lại khả năng nhân giống cây trồng ở quy mô lớn, kể cả các đối tượng khó nhân giống bằng phương pháp thông thường, hệ số nhân giống cao, tiết kiệm vật liệu giống, cho ra sản phẩm đồng nhất về mặt di truyền Nguyên liệu nuôi cấy sạch bệnh cho sản phẩm hoàn toàn sạch bệnh, khả năng tái tạo, phục hồi nguồn gen có nguy cơ biến mất trong

tự nhiên [122]

Nuôi cấy mô phân sinh hoặc đỉnh sinh trưởng

Theo Lê Trần Bình (1997), mô phân sinh nuôi cấy là mẫu vật nuôi cấy được tách từ đỉnh sinh trưởng có kích thước trong vòng 0,1mm tính từ chóp của đỉnh sinh trưởng [1] Nhưng trong thực tế, việc nuôi cấy các mẫu vật như vậy rất khó thành công Người ta chỉ tiến hành nuôi cấy khi mục đích nuôi cấy là làm sạch virus cho cây trồng Nuôi cấy mô phân sinh hoặc đỉnh sinh trưởng được tiến hành phổ biến nhất ở các đối tượng như phong lan, dứa, mía, đỉnh sinh trưởng được tách với kích thước từ 5-10mm

Trong nuôi cấy mô phân sinh hoặc đỉnh sinh trưởng cần chú ý tới tương quan giữa độ lớn chồi, tỷ lệ sống và mức độ ổn định về mặt di truyền của chồi

vì thông thường nếu độ lớn của chồi tăng thì tỷ lệ sống và tính ổn định của chồi cũng giảm Nhưng xét hiệu quả kinh tế nuôi cấy thì khi độ lớn của chồi tăng, hiệu quả kinh tế sẽ giảm và khi độ lớn của chồi giảm, hiệu quả kinh tế sẽ tăng

Do vậy phải kết hợp giữa các yếu tố để tìm ra phương thức lấy mẫu tối ưu Một đỉnh sinh trưởng nuôi cấy ở điều kiện thích hợp sẽ phát triển thành một hay nhiều chồi và các chồi sẽ phát triển thành cây hoàn chỉnh có rễ đầy đủ [122]

Nếu xét về nguồn gốc của các cây nuôi cấy mô phân sinh hoặc đỉnh sinh trưởng có 3 khả năng: Cây phát triển từ chồi đỉnh (chồi ngọn), cây phát triển từ chồi nách phá ngủ, cây phát triển từ chồi mới phát sinh Tuy nhiên, trong thực

tế rất khó phân biệt được chồi phá ngủ và chồi mới phát sinh

Có 2 phương thức phát triển cây hoàn chỉnh từ đỉnh nuôi cấy đó là:

+ Phát triển cây trực tiếp: Chủ yếu ở các đối tượng 2 lá mầm như khoai tây, thuốc lá, cam chanh, hoa cúc, nhưng có cả ở cây một lá mầm như dứa sợi, mía…

+ Phát triển cây qua giai đoạn dẻ hành (protocorm)

Chủ yếu gặp ở các đối tượng đơn tử diệp (1 lá mầm) như phong lan, dứa, huệ Cùng một lúc đỉnh sinh trưởng tạo hàng loạt protocorm và các protocorm có thể tiếp tục phân chia thành các protocorm mới hoặc phát triển thành cây hoàn

chỉnh Bằng phương thức này, trong một thời gian ngắn người ta có thể thu được hàng triệu cá thể Do đó, đem lại hiệu quả nuôi cấy lớn, như ở phong lan vì có phương thức sinh sản qua dạng dẻ hành (protocorm) nên nhân giống vô tính hoa lan đạt được thành công lớn và được ứng dụng rộng rãi

Gần đây phương thức này cũng đã bắt đầu được áp dụng có kết quả ở các cây ăn quả và cây lâm nghiệp, trong đó có cây quý như cà phê, táo, lê, cây thông,

bồ đề, cam, quýt…

Tái sinh cây hoàn chỉnh từ các bộ phận khác của cây

Vì tế bào thực vật có tính toàn năng nên ngoài mô phân sinh và đỉnh sinh trưởng là bộ phận dễ nuôi cấy thành công, các bộ phận còn lại của cơ

thể thực vật đều có thể thực hiện cho việc nhân giống in vitro được Các bộ

phận đó là: Đoạn thân ở các đối tượng như thuốc lá, cam, chanh…; mảnh lá

ở thuốc lá, cà chua, bắp cải… ; các bộ phận của hoa như súp lơ, lúa mì…và nhánh củ ở tỏi, hành…

Nhân giống qua giai đoạn mô sẹo

Trong mục đích nhân giống vô tính, nếu tái sinh được cây hoàn chỉnh trực tiếp từ mẫu vật ban đầu thì không những nhanh chóng thu được cây mà cây cũng khá đồng đều về mặt di truyền Tuy nhiên, trong nhiều trường hợp mô nuôi cấy không tái sinh ngay mà phát triển thành khối mô sẹo Tế bào mô sẹo khi cấy chuyển nhiều lần sẽ không ổn định về mặt di truyền Do đó nhất thiết phải sử dụng các mô sẹo vừa phát sinh, tức là mô sẹo sơ cấp mới thu được cây tái sinh đồng nhất Thông qua giai đoạn mô sẹo có thể thu được những cây sạch virus [8], [10], [144]

1.3.2 Quy trình nhân giống in vitro

Theo Đỗ Năng Vịnh (2005) quy trình nhân giống in vitro gồm các giai

đoạn sau:

Giai đoạn 1: Chuẩn bị cây làm vật liệu gốc

Vì trong nuôi cấy in vitro cây con sẽ mang những đặc tính và tính trạng

của cây mẹ ban đầu nên giai đoạn này cần chọn cây mẹ cẩn thận, cây mẹ

thường là cây ưu việt, khỏe, có giá trị kinh tế cao Sau đó chọn cơ quan để lấy mẫu thường là mô non, đoạn thân có chồi ngủ, lá non, hoa non, hạt… Mô chọn

để nuôi cấy thường là mô có khả năng tái sinh cao trong môi trường nuôi cấy sạch bệnh, giữ được các đặc tính sinh học quý của cây mẹ, ít nguy cơ biến dị Tùy theo điều kiện, giai đoạn này có thể kéo dài 3 - 6 tháng

Giai đoạn 2: Thiết lập hệ thống cấy vô trùng

Là giai đoạn chuyển mẫu vật từ ngoài vào môi trường nuôi cấy, giai đoạn này được tiến hành theo các bước:

(1) Khử trùng bề mặt mẫu vật và chuẩn bị các môi trường nuôi cấy

(2) Cấy mẫu vật đã khử trùng vào ống nghiệm hoặc bình nuôi cấy có sẵn

môi trường nhân tạo (giai đoạn này còn gọi là cấy mẫu in vitro)

Các mẫu nuôi cấy nếu không bị nhiễm khuẩn, nấm, virus sẽ được nuôi trong phòng nuôi cấy với điều kiện nhiệt độ, ánh sáng phù hợp Sau một thời gian nhất định, từ mẫu nuôi cấy sẽ bắt đầu xuất hiện các cụm tế bào hoặc các

cơ quan hoặc các phôi vô tính Giai đoạn này yêu cầu 2 - 12 tháng hoặc ít nhất

4 lần cấy các mảnh

Giai đoạn 3: Nhân nhanh chồi

Đây là giai đoạn sản xuất cây nhân giống quyết định hiệu quả của quá trình nuôi cấy mô, cây được nhân nhanh theo nhu cầu của người nuôi cấy Khi mẫu cấy sạch đã được tạo ra và từ đó nhận được các cụm chồi và các phôi vô tính sinh trưởng tốt, quá trình nuôi cấy sẽ bước vào giai đoạn sản xuất Người

ta cần tạo ra tốc độ nhân nhanh cao nhất trong điều kiện nuôi cấy Thành phần

và điều kiện môi trường cần được tối ưu hóa nhằm đạt được mục tiêu nhân nhanh Quy trình cấy chuyển để nhân nhanh chồi thường trong khoảng 1 - 2 tháng tùy loài cây Tỉ lệ nhân nhanh khoảng 2 - 8 lần sau 1 lần cấy chuyển Nhìn chung giai đoạn này thường kéo dài 10 - 36 tháng Giai đoạn nhân nhanh chồi từ một vài chồi ban đầu không nên kéo dài quá lâu Ví dụ, từ một đỉnh sinh trưởng của một cây chuối chọn lọc ban đầu người ta chỉ nên nhân lên 2000

- 3000 chồi sau 7 - 8 lần cấy chuyển để tránh biến dị soma Đối với các cây khác như mía, hoa cúc, phong lan sau 1 năm có thể nhân lên 1.000.000 chồi từ cây mẹ ban đầu

Giai đoạn 4: Tạo rễ

Các chồi hình thành trong quá trình nuôi cấy có thể phát rễ tự sinh, nhưng thông thường các chồi này phải cấy chuyển sang một môi trường khác

để kích thích tạo rễ Ở một số loài khác thì chồi sẽ tạo rễ khi được chuyển trực tiếp ra đất Thông thường giai đoạn này cần 2 - 8 tuần

Giai đoạn 5: Chuyển cây ra đất trồng

Đây là giai đoạn đầu, cây được chuyển từ điều kiện vô trùng của phòng thí nghiệm ra ngoài môi trường tự nhiên, giai đoạn này quyết định khả năng

ứng dụng của quy trình nhân giống in vitro Đối với một số loài có thể chuyển

cây ra đất khi cây chưa có rễ, nhưng đối với đa số các loài cây trồng thì chỉ sau khi chồi đã ra rễ và tạo cây hoàn chỉnh mới được chuyển ra ngoài vườn ươm Quá trình thích nghi với điều kiện bên ngoài của cây yêu cầu cần được chăm sóc đặc biệt Vì cây được chuyển từ môi trường bão hòa hơi nước sang vườn ươm với những điều kiện khó khăn hơn, nên vườn ươm cần đáp ứng các yêu cầu: Che cây non bằng nilon bao phủ và có hệ thống phun sương cung cấp độ ẩm và làm mát cây; giá thể cây trồng có thể là đất mùn, hoặc các hỗn hợp nhân tạo không chứa đất, mùn cưa và bọt biển… Giai đoạn này thường đòi hỏi 4 - 16 tuần [144]

1.4 Chất điều hòa sinh trưởng thuộc nhóm auxin và cytokinin sử dụng trong nuôi cấy mô thực vật

Ngoài các chất cung cấp dinh dưỡng cho mô nuôi cấy, việc bổ sung một hoặc nhiều chất điều hòa sinh trưởng như auxin, cytokinin và gibberellin là rất cần thiết để kích thích sự sinh trưởng, phát triển và phân hóa cơ quan Tuy vậy, yêu cầu đối với những chất này thay đổi tùy theo loài thực vật, loại mô, hàm lượng chất điều hòa sinh trưởng nội sinh của chúng Các chất điều hòa sinh trưởng được sử dụng nhiều trong nuôi cấy mô thực vật thuộc nhóm auxin và nhóm cytokinin [6], [7]

1.4.1 Auxin

Bản chất hóa học của auxin tự nhiên trong tế bào thực vật là indol acetic acid (IAA) và nó là dạng auxin đầu tiên, chủ yếu và quan trọng nhất trong tất cả các loại thực vật Trong thực vật nó không chỉ tồn tại ở dạng tự do mà còn ở dạng liên kết không có hoạt tính sinh học như IAA-glucose, IAA-myoinositol, IAA-glucan, IAA-aspartate…Các dẫn xuất khác của indol cũng thể hiện hoạt tính của auxin là indol tryptamine, indol acetaldehyde, indol pyruvate, indol ethanol

Auxin được tổng hợp ở tất cả các thực vật bậc cao, tảo, nấm, vi khuẩn và chủ yếu ở đỉnh chồi ngọn rồi di chuyển xuống các bộ phận non của cơ thể thực vật như lá, rễ và các mô dự trữ…Auxin gồm có auxin tự nhiên và auxin tổng hợp (IBA, NAA, 2,4-D…) [2], [7]

Auxin có nhiều vai trò khác nhau trong đời sống thực vật, liên quan tới hàng loạt các quá trình sinh lý: Kích thích phân chia và kéo dài tế bào, kích thích sự mọc rễ ở cành giâm và kích thích sự phát sinh chồi phụ, auxin có các ảnh hưởng khác nhau đối với sự rụng lá, quả, sự đậu quả, sự phát triển và chín của quả, sự ra hoa…Do hoocmon thực vật tác động lên sự sinh trưởng thông qua mối tương quan nồng độ giữa các loại hoocmon khác nhau, nên các quá trình trên đây không chỉ ảnh hưởng của auxin mà còn của các hoocmon khác Tùy thuộc vào nồng độ tác dụng mà các mô thực vật có các kiểu phản ứng khác nhau đối với auxin Phản ứng chủ yếu và nhanh chóng nhất đối với xử lý auxin

là làm tăng độ kéo dài của tế bào thông qua tác dụng trực tiếp lên sự giãn nở của vách tế bào [2], [7]

Các chất điều hòa sinh trưởng thuộc nhóm auxin gồm một vài hợp chất

đã được sử dụng từ rất lâu trong nông nghiệp Chỉ một thời gian ngắn sau khi IAA được tìm thấy trong tự nhiên, nó đã được tổng hợp và trở thành một hợp chất có giá trị Nhưng IAA không có lợi để dùng trong nông nghiệp bởi nó dễ dàng bị phân hủy thành các hợp chất mất hoạt tính dưới ảnh hưởng của ánh

sáng và vi sinh vật Một trong những tác dụng của auxin là kích thích sự hình thành rễ của những lát cắt thân Một số hợp chất tổng hợp nhân tạo có vai trò tương tự như IAA, trong đó có IBA IBA là hợp chất có hoạt tính auxin yếu nhưng có khả năng ổn định và vô hiệu hệ enzyme làm mất hoạt tính của auxin [7]

Các auxin thường được dùng trong nuôi cấy mô và tế bào để kích thích

sự phân bào và sinh trưởng của mô sẹo, đặc biệt là 2,4-D, tạo phôi vô tính, tạo rễ… Những auxin dùng rộng rãi trong nuôi cấy mô là IBA (3-indol butiric acid), IAA (3-indol acetic acid), NAA (naphthalen acetic acid), 2,4-D (2,4-dichlorophenoxy acetic acid) Trong số các auxin, IBA và NAA chủ yếu sử dụng cho môi trường ra rễ và phối hợp với cytokinin sử dụng cho môi trường ra chồi Auxin thường hòa tan trong ethanol hoặc NaOH pha loãng [7]

Auxin thường được sử dụng từ 0,1-2,0mg/l, riêng IAA, do kém bền với nhiệt độ và ánh sáng nên nồng độ sử dụng cao hơn (1,0-3,0mg/l) Chúng có hiệu quả sinh lý ở nồng độ thấp Tùy theo loại auxin, hàm lượng sử dụng và đối tương nuôi cấy mà tác động sinh lý của auxin là kích thích sinh trưởng của

mô, hoạt hóa sự hình thành rễ hay thúc đẩy sự phân chia mạnh mẽ của tế bào dẫn đến hình thành mô sẹo [16]

1.4.2 Cytokinin

Phần lớn cytokinin là dẫn xuất của purin Loại cytokinin đầu tiên phát hiện được và cũng là dạng phổ biến nhất là zeatin tách từ mầm ngô Ngoài ra còn có hàng loạt cytokinin khác như kinetin, dihydrozeatin, benzyladenin, chlorephenylurea…, trong đó kinetin không có mặt trong tự nhiên, mà người ta thu nhận bằng cách xử lý nhiệt DNA [7]

Chứng minh về khả năng ngăn cản sự vàng lá của benzyladenin (BA) là một phát hiện thu hút nhiều nhà sinh lý học từ những năm 1950 Những năm

1960, các nhà nghiên cứu thấy rằng BA có thể kích thích nhiều quá trình, BA được sử dụng trong nuôi cấy mô để kéo dài chồi và phát sinh phôi với các nồng

độ khác nhau tùy theo đối tượng thực vật nuôi cấy và mục đích nuôi cấy [7]

Cytokinin có mặt trong mọi thực vật, với hàm lượng cao nhất trong phôi

và trong quả đang phát triển Hoạt tính của chúng được tăng cường khi chúng tương tác với myo-inositol, nhưng có thể bị mất khi kết hợp trong thành phần của các glycoside [7]

Cũng như auxin, cytokinin tham gia điều hòa các phản ứng trong cây, đồng thời làm tăng các quá trình trao đổi axit nucleic và protein Cytokinin điều chỉnh sinh trưởng bằng nhiều cách như điều chỉnh tốc độ tổng hợp ADN khi phân chia tế bào, làm chậm sự lão hóa của lá, góp phần phá vỡ trạng thái ngủ của hạt, kích thích hạt nảy mầm, kích thích ra hoa và sinh trưởng của quả, gây nên sự hình thành chồi mầm trong nhiều mô, làm tăng diện tích phiến lá do kích thích sự lớn lên của tế bào [144]

Trong môi trường nuôi cấy mô, cytokinin cần cho sự phân chia tế bào, tạo và nhân mô sẹo, phân hóa chồi từ mô sẹo hoặc từ các cơ quan, gây tạo phôi

vô tính, kích thích phát sinh chồi nách và kìm hãm ảnh hưởng ưu thế của chồi đỉnh, tăng cường phát sinh chồi phụ Các loại cytokinin thường được dùng là: kinetin, BAP… Cytokinin hòa tan trong dung dịch HCl pha loãng [144]

Hàm lượng sử dụng các loại cytokinin trong nuôi cấy mô dao động từ 0,1-2,0mg/l Ở những nồng độ cao hơn, cytokinin có tác dụng kích thích rõ rệt đến sự hình thành chồi bất định, đồng thời ức chế mạnh sự tạo rễ của chồi nuôi cấy Trong nuôi cấy, có loại mẫu chỉ cần auxin hoặc cytokinin, hoặc không cần

cả hai, còn đa số các trường hợp phải sử dụng phối hợp cả auxin và cytokinin với những tổ hợp tỷ lệ khác nhau [16]

1.5 Một số yếu tố ảnh hưởng đến nhân giống cây trồng trong ống nghiệm

Ánh sáng và nhiệt độ: Các mẫu nuôi cấy thường được đặt trong những

phòng nuôi ổn định về ánh sáng và nhiệt độ Tất cả các nuôi cấy đều cần ánh sáng, trừ một số trường hợp nuôi cấy tạo mô sẹo, nhưng quá trình tái sinh và nhân giống của chúng cũng yêu cầu có ánh sáng, tỉ lệ chiếu sáng và pha tối là 16/8 Nhiệt độ của phòng nuôi cấy được duy trì từ 25-280C nhờ các máy điều hòa nhiệt độ [16]

Nguồn Cacbon: Các mẫu nuôi cấy thực vật nói chung không thể quang

hợp, nếu có quang hợp thì cường độ cũng rất yếu do thiếu chlorophil, cường độ CO2 và nhiều điều kiện khác Vì vậy, phải đưa thêm những hợp chất hydratcacbon vào thành phần môi trường nuôi cấy kể cả mẫu cấy là chồi xanh

có khả năng quang hợp Loại hydratcacbon được sử dụng phổ biến là đường sucrose với hàm lượng từ 2%-6% [166]

Than hoạt tính: được dùng để hấp thụ các chất mầu, các hợp chất phenol

các sản phẩm trao đổi chất thứ cấp trong trường hợp các chất đó có tác dụng gây ức chế sinh trưởng của mẫu nghiên cứu Than hoạt tính cũng hút các chất hữu cơ như phytohoocmon, vitamin, sắt chelat, kẽm Hàm lượng sử dụng than hoạt tính 0,2%-0,3% Ngoài ra, than hoạt tính còn làm giảm hiệu quả của chất điều hòa sinh trưởng, làm thay đổi môi trường ánh sáng, có thể kích thích sự hình thành và phát triển của rễ một số trường hợp than hoạt tính thúc đẩy phát sinh phôi vô tính và kích thích sinh trưởng, phát sinh cơ quan của các loài cây thân gỗ [16]

Nước dừa: Nước dừa được xác định là rất giàu các hợp chất hữu cơ, chất

khoáng và chất kích thích sinh trưởng Nước dừa đã được sử dụng để kích thích phân hóa và nhân nhanh chồi ở nhiều loài cây Nước dừa thường được sử dụng

Nghiên cứu tạo chồi in vitro ở cây chanh dây (Passiflora edulis Sims.),

Lê Văn Trường Huân (2007) đã chỉ ra, môi trường tạo đa chồi từ đoạn thân mang mắt chồi bên của cây chanh dây trồng ngoài tự nhiên là môi trường MS

cơ bản có bổ sung đường sucrose 20g/l + agar 8g/l + BAP 0,5mg/l đã cho hệ

số nhân chồi là 6,57± 0,74 [5]

Nghiên cứu nhằm xây dựng quy trình nuôi cấy in vitro trụ trên lá mầm

hoàn chỉnh của cây cam Vinh và quýt Đường Canh phục vụ công tác chuyển gen, Phan Hữu Tôn và cs (2014) đã xác định, môi trường cho tái sinh chồi tốt nhất đối với giống cam Vinh là MS cơ bản bổ sung sucrose 30g/l + agar 8g/l + vitamin B5 1,0mg/l + BAP 1,5mg/l, quýt Đường Canh là MS + sucrose 30g/l + agar 8g/l + vitamin B5 1,0mg/l + BAP 1,0mg/l, đạt số chồi/mẫu của giống cam Vinh là 4,7 và quýt Đường Canh là 5,5 Môi trường tốt nhất cho tạo rễ của chồi đối với giống cam Vinh là MS cơ bản có bổ sung sucrose 30g/l + agar 8g/l + vitamin B5 5,0mg/l + α-NAA 0,4mg/l + IAA 0,4mg/l cho tỉ lệ chồi phát sinh rễ

là 82,3%, số rễ /chồi là 3,5 và chiều dài rễ là 3,5cm, với quýt Đường Canh là

MS cơ bản có bổ sung sucrose 30g/l + agar 8g/l + vitamin B5 5,0mg/l + α-NAA 0,3mg/l + 0,4mg/l tỉ lệ chồi phát sinh rễ là 86,3%, đạt 3,5 rễ/chồi, chiều dài

chồi là 3,2cm Giá thể tốt nhất cho ra cây in vitro ra ngoài tự nhiên là cát vàng

+ trấu hun với tỉ lệ 1:1, tỉ lệ sống sót sau 6 tuần của cam Vinh là 96,5% và của quýt Đường Canh là 95% [13]

Nghiên cứu môi trường nhân nhanh giống quýt Cleo-Patra, Suneel Sharma và cs (2009) đã chỉ ra, môi nhân nhanh chồi từ đoạn trên trụ lá mầm của quýt Cleo- Patra là môi trường MS cơ bản có bổ sung đường sucrose 30g/l + agar 9g/l + BAP 1,0mg/l đã cho hệ số nhân chồi đạt 2,4 lần; số rễ tối đa được ghi nhận khi nuôi cấy đoạn chồi trong môi trường 1/2MS cơ bản có bổ sung IBA 10mg/l [25]

Adhikarimayum H và cs (2011) nghiên cứu về nhân giống in vitro cây

quýt Megaloxycarpa Lush của Manipur, Ấn Độ Tác giả đã chỉ ra, môi trường

MS cơ bản có bổ sung BAP 0,25mg/l + α-NAA 0,5mg/l là thuận lợi nhất cho

sự tạo chồi của đoạn thân mang mắt chồi bên với hệ số nhân chồi là 4,7 Tiếp đến là môi trường MS cơ bản bổ sung BAP 1,0mg/l + kinetin 0,5mg/l cho

hệ số nhân chồi là 4,4 Chồi non ra rễ tốt nhất là ở môi trường MS cơ bản

có bổ sung α-NAA 2,0mg/l đạt 4,4 rễ/chồi [188]

Nghiên cứu quy trình nhân giống cây chanh thô (Citrus jambhiri Lush), Saini H K và cs (2010) đã chỉ ra, môi trường tối ưu cho sự phát sinh

chồi từ đoạn trên trụ lá mầm là MS cơ bản có bổ sung BAP 0,5mg/l đạt 8,6 chồi/mẫu Môi trường kéo dài chồi tốt nhất đối với chồi chanh thô là MS cơ bản bổ sung BAP 0,5mg/l + GA3 1,0mg/l Chồi sau khi kéo dài, cấy chuyển sang môi trường cho ra rễ tạo cây hoàn chỉnh, môi trường MS cơ bản bổ sung NAA 1,0mg/l + IBA 1,0mg/l chồi ra rễ tốt nhất và được ghi nhận với 77% chồi ra rễ [19]

Nghiên cứu nhân giống cây cam chua (Citrus aurantium L.), Mohammad H

R Mohammad M S và cs (2013) đã chỉ ra, đoạn trên trụ lá mầm phát sinh chồi cao nhất ở môi trường MS cơ bản bổ sung BAP 2,5mg/l + α-NAA 0,05mg/l, với tỉ lệ phát sinh chồi là 90% và số chồi/mẫu đạt được là 4,2 chồi [22]

Nghiên cứu nhân giống cây chanh thô (Citrus jambhiri Lush) qua mô

sẹo, các tác giả Hawkat A S và cs thuộc Khoa Sinh học Đại học Quaid-i-Azam Islamabad, Pakistan (2006) đã ghi nhận, môi trường MS cơ bản có bổ sung BAP 3,0mg/l cho các mô sẹo có nguồn gốc từ đoạn thân trên trụ lá mầm tỉ lệ phát sinh chồi cao nhất (70%), các chồi phát sinh rễ tốt nhất ở môi trường MS

cơ bản bổ sung α-NAA 0,5mg/l với tỉ lệ chồi ra rễ là 70% [23]

Nghiên cứu nhân giống bưởi (Citrusn Grandis (L.) Osbeck), tác giả

Ibrahim M A (2012) đã ghi nhận, môi trường tái sinh chồi trực tiếp từ đoạn thân mang chồi nách là MS cơ bản bổi sung BAP 2,0mg/l + NAA 0,1mg/l với

số chồi/mẫu là 9,33, tiếp là môi trường MS cơ bản bổ sung BAP 4,0mg/l + NAA 0,1mg/l cho số chồi/mẫu là 6,66 Môi trường tái sinh chồi gián tiếp từ mô sẹo tốt nhất là MS cơ bản bổ sung BAP 1,0mg/l + NAA 0,1mg/l cho 6,33 chồi/mẫu, môi trường MS cơ bản bổ sung BAP 2,0mg/l + NAA 0,1mg/l cho 4,33 chồi/mẫu Các chồi ra rễ tốt nhất là MS cơ bản bổ sung NAA 0,2mg/l + BAP 0,1mg/l [21]

Sarker I và cs (2015), khi nghiên cứu nhân giống cây cam quýt (Citrus aurantifollia) đã chỉ ra, môi trường tốt nhất cho tái sinh chồi trực tiếp từ đoạn

gốc thân mang nách lá mầm là MS cơ bản bổ sung BAP 1,5mg/l sau 16 ngày nuôi cấy cho tỉ lệ mẫu phát sinh chồi là 90%, đạt 5 chồi/mẫu Môi trường MS

cơ bản bổ sung BAP 1,5mg/l + NAA 0,5mg/l + GA3 0,5mg/l cho 100% số mẫu phát sinh chồi, đạt 10 chồi/mẫu Môi trường tốt nhất cho chồi ra rễ là MS cơ bản bổ sung NAA 0,5mg/l với 100% chồi phát sinh rễ [20]

Savita và cs (2010), khi nghiên cứu nhân giống cây chanh thô (Citrus jambhiri Lush) đã xác định, môi trường tốt nhất cho sự phát sinh chồi từ mô

sẹo có nguồn gốc từ đoạn trụ trên nách lá mầm là MS cơ bản bổ sung BAP 3,0mg/l + NAA 0,5mg/l với 72% mẫu phát sinh chồi, đạt 5,83 chồi/mẫu tiếp là môi trường MS cơ bản bổ sung kinetin 3,0mg/l + NAA 2,0mg/l với tỉ lệ phát sinh chồi là 64%, đạt 4,83 chồi/mẫu Môi trường tốt nhất cho chồi hình thành rễ

là MS cơ bản bổ sung NAA 0,5mg/l với tỉ lệ ra rễ là 71% [24]

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu, hoá chất, thiết bị và địa điểm nghiên cứu

Hóa chất pha môi trường MS cơ bản, chất điều hòa sinh trưởng, chất dùng

để khử trùng Các loại hóa chất đều nhập từ cộng hòa Đức và Trung Quốc

Bảng 2.1 Thành phần cơ bản của môi trường MS

8 MnSO 4 4H 2 O 22.30 18 Nicotinic Acid 0.50

9 ZnSO 4 7H 2 O 8.60 19 Myo- inositol 100.00

Thiết bị

Bình tam giác 250ml, bông, giấy làm nút, giấy thấm Bộ đồ cấy (dao cấy, que cấy, đĩa cấy), nồi hấp, buồng cấy vô trùng (Biological Safety Cabinets) của hãng Nuarie (Mĩ)

2.1.3 Địa điểm nghiên cứu

Đề tài được thực hiện từ tháng 1 năm 2016 tại Phòng Công nghệ tế bào thuộc Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Nhóm phương pháp nuôi cấy in vitro

2.2.1.1 Phương pháp pha môi trường nuôi cấy

Sau khi xác định công thức môi trường cần pha, tính dung tích môi trường cần dùng cho mỗi công thức và tính thể tích các hóa chất cần sử du ̣ng trong môi trường nuôi cấy tiến hành pha môi trường Ví dụ: pha một lít môi trường nghiên cứu ảnh hưởng chất khử trùng đến sự nảy mầm của hạt gồm MS

cơ bản + sucrose 30g/l + agar 9g/l Môi trường sau khi pha được đun nóng

70oC-80oC Độ pH môi trường nuôi cấy 5,6- 5,8 Chia đều hỗn hợp dung dịch nuôi cấy cho các bình tam giác, mỗi bình 50ml môi trường Sau đó nút bông

và làm nắp bằng giấy, đậy kín Khử trùng trong nồi khử trùng ở nhiệt độ 120oC, áp suất 1-1,2atm, trong thời gian 20 phút Sau khi hấp khử trùng xong để môi trường 2-3 ngày thì bắt đầu sử du ̣ng

- Khử trùng bằng nước Javen 60% ở các mức thời gian 10 phút, 15 phút,

20 phút, 25 phút, 30 phút Rửa lại bằng nước cất 3 lần, mỗi lần 1 phút

Hạt sau khi được khử trùng tiến hành cấy vào môi trường MS cơ bản

Để thấy được ảnh hưởng của loại mẫu cấy đến khả năng nảy mầm sau khử trùng, chúng tôi tiến hành các nghiên cứu trên mẫu cấy như sau: (1) mẫu hạt đã khử trùng để nguyên không bóc vỏ; (2) mẫu hạt đã khử trùng bóc vỏ giữ nguyên phôi nhũ; (3) mẫu hạt đã khử trùng bóc vỏ và cắt 1/3 phôi nhũ phía đối diện với phôi Mỗi loại mẫu cấy, ở mỗi thời gian khử trùng cấy 5 bình, mỗi bình 8 hạt Đánh giá kết quả sau 2 tuần, 4 tuần, 6 tuần Chỉ tiêu theo dõi: Tỉ lệ mẫu nhiễm (%); Tỉ lệ mẫu nảy mầm không bị nhiễm (%), màu sắc thân và lá

2.2.1.3 Phương pháp nghiên cứu môi trường nuôi cấy

Ảnh hưởng riêng rẽ của chất kích thích sinh trưởng thuộc nhóm auxin và cytokinin tới khả năng phát sinh chồi của giống quýt Bắc Kạn

Để tìm được môi trường nhân giống phù hợp đối với giống quýt Bắc Kạn, chúng tôi tiến hành thăm dò ảnh hưởng của BAP và kinetin đến khả năng nhân chồi của cây quýt Bắc Kạn Các đoạn gốc thân mang nách lá mầm thu được từ việc cấy hạt đã khử trùng, được cấy trên môi trường MS cơ bản có bổ sung aga 9g/l + sucrose 30g/l + nước dừa 50ml/l+ BAP (nồng độ 2,0mg/l, 2,5mg/l, 3,0mg/l, 3,5mg/l, 4,0mg/l) hoặc kinetin (nồng độ 2,0mg/l, 2,5mg/l, 3,0mg/l, 3,5mg/l, 4,0mg/l) Mỗi công thức tiến hành trên 5 bình, mỗi bình cấy 6 mẫu, các công thức bố trí ngẫu nhiên và lặp lại 3 lần Đối chứng là môi trường

MS cơ bản, bổ sung aga 9g/l + sucrose 30g/l + nước dừa 50ml/l Đánh giá kết quả sau 4 tuần, 6 tuần, 8 tuần nuôi cấy Các chỉ tiêu theo dõi: số mẫu ra chồi, số chồi/mẫu, màu sắc thân và lá của chồi Kết quả của thí nghiệm này sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo

Ảnh hưởng tổ hợp giữa nhóm auxin và cytokinin đến khả năng phát sinh chồi của quýt Bắc Kạn

Từ kết quả nồng độ BAP và kinetin tốt nhất cho sự hình thành chồi, chúng tôi tiếp tục nghiên cứu ảnh hưởng của tổ hợp chất kích thích sinh trưởng thuộc nhóm cytokinin và nhóm auxin đến sự hình thành chồi của giống quýt

Bắc Kạn Dùng nồng độ BAP và kinetin tối ưu ở thí nghiệm trên kết hợp với IBA nồng độ 0,5mg/l, 1,0mg/l, 1,5mg/l, 2,0mg/l, 2,5mg/l Đối chứng là môi trường MS cơ bản không bổ sung chất kích thích sinh trưởng Mỗi công thức pha 5 bình, mỗi bình cấy 6 mẫu, các công thức bố trí ngẫu nhiên và lặp lại 3 lần Theo dõi, đánh giá kết quả sau 4 tuần, 6 tuần, 8 tuần Chỉ tiêu theo dõi: tỉ lệ

phát sinh chồi; số chồi/mẫu, chất lượng chồi

Phương pháp nghiên cứu môi trường ra rễ (tạo cây hoàn chỉnh)

Những chồi tạo ra trên môi trường nhân chồi có kích thước 1,5cm - 2,0cm, được cấy chuyển sang môi trường tạo rễ gồm MS cơ bản bổ sung agar 9g/l + sucrose 30g/l + nước dừa 50ml/l + α-NAA với nồng độ 0,3mg/l, 0,5mg/l, 0,7mg/l, 0,9mg/l, 1,2mg/l Với mỗi nồng độ cấy 30 mẫu tiến hành trên 5 bình, các cong thức bố trí ngẫu nhiên và lặp lại 3 lần Kết quả được đánh giá sau 4 tuần, 6 tuần, 8 tuần Chỉ tiêu theo dõi: Tỉ lệ chồi phát sinh rễ, số rễ/mẫu, chiều dài rễ, chất lượng rễ

2.2.2 Phương pháp đưa cây ra vườn ươm

Các cây được cấy ở môi trường tạo rễ, khi đã có bộ rễ dài, khoẻ, lá xanh, đẹp, chiều cao đạt 4-5cm thì đưa ra môi trường tự nhiên

Các cây đưa ra môi trường ngoài với giá thể khác nhau để xác định giá thể phù hợp nhất

Cây được trồng trong bầu với 3 loại giá thể:

CT1: Đất phù sa

CT2: Đất phù sa + trấu hun (tỉ lệ 1:1)

CT3: Trấu hun