Phân tích cấu trúc, hàm lượng của một số dẫn xuất artemisinin bằng các phương pháp hóa lý hiện đại

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC ĐÀO PHƯƠNG LAN PHÂN TÍCH CẤU TRÚC, HÀM LƯỢNG CỦA MỘT SỐ DẪN XUẤT ARTEMISININ BẰNG CÁC PHƯƠNG PHÁP HÓA LÝ HIỆN ĐẠI LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌ

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

ĐÀO PHƯƠNG LAN

PHÂN TÍCH CẤU TRÚC, HÀM LƯỢNG

CỦA MỘT SỐ DẪN XUẤT ARTEMISININ BẰNG CÁC

PHƯƠNG PHÁP HÓA LÝ HIỆN ĐẠI

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC

THÁI NGUYÊN - 2016

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

ĐÀO PHƯƠNG LAN

PHÂN TÍCH CẤU TRÚC, HÀM LƯỢNG

CỦA MỘT SỐ DẪN XUẤT ARTEMISININ BẰNG CÁC

PHƯƠNG PHÁP HÓA LÝ HIỆN ĐẠI

Chuyên ngành: Hóa phân tích

Mã số: 60 44 01 18

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC

Người hướng dẫn khoa học: TS PHẠM THẾ CHÍNH

LỜI CẢM ƠN Với lòng biết ơn sâu sắc, em xin chân thành cảm ơn:

Lời đầu tiên, em xin chân thành cảm ơn TS Phạm Thế Chính người thầy

đã giao đề tài, tận tình chỉ bảo và truyền đam mê nghiên cứu cho em trong suốt quá trình hoàn thành luận văn, người thầy đã tận tình hướng dẫn để em hoàn thành luận văn này

Em xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo khoa Hóa học trường Đại học Khoa học - ĐHTN, tập thể các thầy cô, anh chị và các bạn tại khoa Hóa học trường Đại học Khoa học - ĐHTN đã tạo điều kiện giúp đỡ em trong suốt quá trình hoàn thành luận văn

Em xin chân thành cảm ơn TS Đặng Thị Tuyết Anh, TS Phạm Thị Thắm, cô Nguyễn Thị Hạnh, KS Nguyễn Hoàng Phương và các bạn NCS, HVCH phòng Hóa dược Viện Hóa học đã giúp đỡ em rất nhiều về thực nghiệm trong suốt thời gian làm luận văn

Em xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu cùng toàn thể cán bộ giáo viên Trường THPT Hòn Gai – Hạ Long - Quảng Ninh đã tạo điều kiện thuận lợi về thời gian và công việc để em hoàn thành luận văn

Em xin gửi lời cảm ơn đến tất cả các thầy cô đã dạy dỗ em nên người! Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến gia đình, bạn bè đã giúp

đỡ em hoàn thành luận văn

Tác giả luận văn

Đào Phương Lan

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN a MỤC LỤC b DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT e DANH MỤC BẢNG BIỂU f DANH MỤC CÁC HÌNH g DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ h

MỞ ĐẦU 1

Chương 1 TỔNG QUAN 3

1.1 Tổng quan về các phương pháp xác đi ̣nh cấu trúc 3

1.1.1 Phương pháp phổ hồng ngoại (IR) 3

1.1.2 Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) 4

1.1.3 Phương pháp phổ khối lượng (MS) 6

1.2 Tách và phân tích các đồng phân đối quang 8

1.2.1 Phương pháp tách các đồng phân đối quang bằng enzym 8

1.2.2 Tách và phân tích đồng phân đối quang bằng các phương pháp hóa lý hiện đại 8

1.2.3 Phân tích các đối quang nhờ phương pháp NMR 9

1.2.4 Phương pháp sử dụng tác nhân chuyển dịch (Shift reagent) Mosher 9

1.3 Phân tách và xác định cấu trúc của artemisinin 11

1.4 Tổng hợp các dẫn xuất của artemisinin 13

1.5 Mục tiêu của luận văn 16

2.1.1 Phương pháp nghiên cứu 17

2.1.2 Hóa chất và dung môi 17

2.1.3 Định tính phản ứng và kiểm tra độ tinh khiết của các hợp chất bằng sắc kí lớp mỏng 17

2.1.4 Xác nhận cấu trúc 17

2.2 Tổng hợp và phân tích cấu trúc của hydroxyl artemisinin (DHA) 18

2.2.1 Tổng hợp DHA 18

2.2.2 Phân tích cấu trúc của DHA bằng NMR 19

2.2.3 Phân tích tỷ lệ đồng phân α-DHA và β-DHA bằng 1H-NMR 19 2.3 Tổng hợp và phân tích cấu trúc chất NTD.01 20

2.3.1 Tổng hợp chất NTD.01 20

2.3.2 Phân tích cấu trúc của (NTD.01)bằng NMR 20

2.4 Tổng hợp và phân tích cấu trúc chất NTD.031 21

2.4.1 Tổng hợp chất NTD.031 21

2.4.2 Phân tích cấu trúc của (NTD.031) bằng NMR 22

2.4.3 Phân tích tỷ lệ hai đồng phân oxiran bằng 1H-NMR 23

2.5 Tổng hợp và phân tích cấu trúc chất NTD.039 23

2.5.1 Tổng hợp chất NTD.039 23

2.5.2 Phân tích cấu trúc của (NTD.039)bằng NMR 24

2.5.3 Phân tích tỷ lệ hai đồng phân R,S NTD.039 bằng 1H-NMR 24 Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 26

3.1 Mục tiêu của đề tài 26

3.2 Phân tích cấu trúc của DHA 27

3.2.1 Tổng hợp mẫu DHA 27

3.2.2 Phân tích cấu trúc của DHA bằng phương pháp NMR 28

3.2.3 Phân tích tỷ lệ hai đồng phân α và β-DHA 31

3.3 Phân tích cấu trúc của hợp chất NTD.01 33

3.3.1 Tổng hợp NTD.01 33

3.3.2 Phân tích cấu trúc của NTD.01 bằng NMR 33

3.4 Phân tích cấu trúc của hợp chất NTD.031 35

3.4.1 Tổng hợp chất NTD.031 36

3.4.2 Phân tích cấu trúc của NTD.031 36

3.4.3 Phân tích tỷ lệ hai đồng phân oxiran bằng 1H-NMR 38

3.5 Phân tích cấu trúc của hợp chất NTD.039 39

3.5.1 Tổng hợp NTD.039 39

3.5.2 Phân tích cấu trúc của (NTD.039)bằng NMR 40

3.5.3 Phân tích tỷ lệ hai đồng phân R,S NTD 039 bằng 1H-NMR 41 KẾT LUẬN 42

TÀI LIỆU THAM KHẢO 43

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

MS Phương pháp phổ khối lượng

EI Phương pháp bắn phá bằng dòng electron

CI Phương pháp ion hóa hóa học

FAB Phương pháp bắn phá nguyên tử nhanh

GC Phương pháp sắc ký khí

HPLC Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao DHA Dihydroartemisinin

SKLM Sắc kí lớp mỏng

TMS Chất chuẩn tetramethyl silan

NTD.01 Ete allyl của artemisinin

NTD.031 Dẫn xuất epoxit

NTD.039 Dẫn xuất mở vòng epoxit

mCPBA meta-Chloroperoxybenzoic acid

DANH MỤC BẢNG BIỂU

Bảng 3.1 Dữ liệu NMR của DHA 30

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Phổ hồng ngoại của benzyl ancol 3

Hình 1.2 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân của benzyl axetat 5

Hình 1.3 Phổ khối lượng của benzamit (C6H5CONH2) 7

Hình 1.4 Phổ 1H-NMR của hỗn hợp (R,S)-1-phenylbutan-1-ol 10

Hình 1.5 Phổ 1H-NMR của (R)-1-phenylbutan-1-ol và 11

Hình 3.1 Phổ NMR của DHA 28

Hình 3.2 Phổ 1H-NMR so sánh của DHA (P) với artemisinin (A) 29

Hình 3.3 Cấu trúc của hai đồng phân α và β-DHA 30

Hình 3.4 Phổ 1H-NMR của hai đồng phân α và β-DHA 32

Hình 3.5 Phổ 1H-NMR của chất NTD.01 34

Hình 3.6 Phổ 13C-NMR của chất NTD.01 35

Hình 3.7 Phổ 1H-NMR của hợp chất NTD.031 37

Hình 3.8 Phổ 13C-NMR của hợp chất NTD.031 38

Hình 3.9 Phổ 1H-NMR của hợp chất NTD.039 41

DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ

Sơ đồ 1.1 Chuyển hóa artemisininin thành metyl ete và etyl ete 13

Sơ đồ 1.2 Tổng hợp dẫn xuất artesunat 14

Sơ đồ 1.3 Tổng hợp dẫn xuất muối natri của axit artelinic 15

Sơ đồ 1.4 Chuyển hóa dẫn xuất dihydroartemisinin thành hemiaxetal 16

Sơ đồ 3.1 Mục tiêu nghiên cứu của luận văn 26

Sơ đồ 3.2 Tổng hợp mẫu DHA 27

Sơ đồ 3.3 Tổng hợp NTD.01 từ DHA 33

Sơ đồ 3.4 Tổng hợp chất NTD.031 36

Sơ đồ 3.5 Tổng hợp NTD.039 40

MỞ ĐẦU

Phân tích cấu trúc các hợp chất hữu cơ là một trong số các nhiệm vụ quan trọng của Hóa học vì chỉ khi biết chính xác cấu trúc, chúng ta mới có câu trả lời chính xác cho việc định tính, định lượng và phân tích chúng trong các mẫu nghiên cứu thực cũng như trong đời sống và công nghệ Để phân tích cấu trúc của các hợp chất hữu cơ có thể sử du ̣ng các phương pháp phổ như phổ hồ ng ngoại, phổ tử ngoại khả kiến, phổ cộng hưởng từ ha ̣t nhân, phổ khố i lượng Mỗi phương pháp cho phép xác đi ̣nh mô ̣t số thông tin khác nhau của cấu trúc phân tử và hỗ trợ lẫn nhau trong việc xác định cấu trúc các hợp chất hữu cơ

Artemisinin (1) là secquiterpen lacton được phát hiện có hoạt tính kháng

kí sinh trùng sốt rét rất mạnh và đã được dùng để làm thuốc chữa bệnh sốt rét rất hiệu quả Tuy nhiên, việc sử dụng artemisinin trong lâm sàng còn bộc lộ nhiều nhược điểm như độc với hệ thần kinh, dễ gây nhờn thuốc do có thời gian bán hủy thấp Vì vậy người ta nghiên cứu tổng hợp dẫn chất mới của artemisinin

như dihydroartemisinin (2), metyl eter (3) … có hoạt tính cao hơn đã được dùng

trong điều trị bệnh sốt rét Các hợp chất này có ưu điểm là tan tốt trong dầu nên

có thể dùng để tiêm bắp, cả hai hợp chất này đều có hoạt tính cao hơn artemisinin nhưng lại có thời gian bán huỷ nhỏ hơn và gây độc với hệ thần kinh trung ương trong điều trị trường diễn

Các sản phẩm chuyển hóa của artemisinin như DHA, metyl eter… thường nhận được các sản phẩm có trung tâm bất đối mới do sự khử nhóm cacbonyl của lacton ở hai hướng không gian khác nhau Nên việc phân tích cấu trúc và các đồng phân bất đối này rất khó khăn đòi hỏi phải có phương pháp hóa lý hiện đại Do đó đề tài phân tích cấu trúc và đồng phân lập thể của artemisinin rất có ý nghĩa khoa học và thực tiễn nhằm đưa ra phương pháp phân tích hiệu quả nhất để phân tích cấu trúc và lập thể các sản phẩm chuyển hóa artemisinin một cách hiệu quả

Mục tiêu chính của đề tài:

1 Nghiên cứu chuyển hóa một số sản phẩm lập thể của artemisinin

2 Phân tích cấu trúc và đồng phân lập thể của các sản phẩm chuyển hóa bằng các phương pháp phổ NMR

Chương 1 TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về các phương pháp xa ́ c đi ̣nh cấu trúc

1.1.1 Phương pháp phổ hồng ngoại (IR) [1]

Trong số các phương pháp phân tích cấu trúc, phổ hồng ngoại cho nhiều thông tin quan trọng về cấu trúc của hợp chất.Khi chiếu các bức xạ hồng ngoại vào phân tử các hợp chất, bức xạ hồng ngoại sẽ kích thích phân tử từ trạng thái dao động cơ bản lên trạng thái dao động cao hơn Có hai loại dao động khi phân

tử bị kích thích là dao động hóa trị và biến dạng, dao động hóa trị (ν) là dao động làm thay đổi độ dài liên kết, dao động biến dạng (δ) là dao động làm thay đổi góc liên kết

Đường cong biểu diễn cường độ hấp thụ với số sóng của bức xạ hồng ngoại được gọi là phổ hồng ngoại, trên phổ biểu diễn các cực đại hấp thụ ứng với những dao động đặc trưng của nhóm nguyên tử hay liên kết nhất định (Hình 1.1)

Hình 1.1 Phổ hồng ngoại của benzyl ancol

Căn cứ vào phổ hồng ngoại đo được đối chiếu với các dao động đặc trưng của các liên kết, ta có thể nhận ra sự có mặt của các liên kết trong phân tử Một phân tử có thể có nhiều dao động khác nhau và phổ hồng ngoại của các phân

tử khác nhau thì khác nhau, tương tự như sự khác nhau của các vân ngón tay

Sự chồng khít lên nhau của phổ hồng ngoại thường được làm dẫn chứng cho hai hợp chất giống nhau

Khi sử dụng phổ hồng ngoại để xác định cấu trúc, thông tin thu được chủ yếu là xác định các nhóm chức hữu cơ và những liên kết đặc trưng Các pic nằm trong vùng từ 4000 - 1600 cm-1 thường được quan tâm đặc biệt, vì vùng này chứa các dải hấp thụ của các nhóm chức, như OH, NH, C=O, C≡N… nên được gọi là vùng nhóm chức Vùng phổ từ 1300 - 626 cm-1 phức tạp hơn và thường được dùng để nhận dạng toàn phân tử hơn là để xác định nhóm chức Chính ở đây các dạng pic thay đổi nhiều nhất từ hợp chất này đến hợp chất khác, vì thế vùng phổ từ 1500 cm-1 được gọi là vùng vân ngón tay

1.1.2 Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (CHTHN) là phương pháp vật lý hiện đại nghiên cứu cấu trúc của các hợp chất hữu cơ Phương pháp phổ biến được sử dụng là phổ 1H-NMR và 13C-NMR Hạt nhân của nguyên tử 1H và 13C có momen từ Nếu đặt proton trong từ trường không đổi thì moment từ của nó có thể định hướng cùng chiều hay ngược chiều với từ trường Đó là spin hạt nhân

có tính chất lượng tử với các số lượng tử +1/2 và -1/2 [2]

Độ chuyển dịch hóa học : Do hiệu ứng chắn từ khác nhau nên các hạt

nhân 1H và 13C trong phân tử có tần số cộng hưởng khác nhau Đặc trưng cho các hạt nhân 1H và 13C trong phân tử có độ chuyển dịch hóa học δ; đối với hạt nhân 1H thì:

) ( 10 6 ppm

o

x TMS

) ( 10 6 ppm

o

x chuan

có giá trị hằng số chắn σ khác nhau và do đó độ chuyển dịch hóa học của mỗi hạt nhân khác nhau Theo đó proton nào cộng hưởng ở trường yếu hơn sẽ có

độ chuyển dịnh hóa học lớn hơn [3]

Dựa vào độ chuyển dịch hóa học  ta biết được loại proton nào có mặt trong chất được khảo sát Giá trị độ chuyển dịch hóa học không có thứ nguyên

mà được tính bằng phần triệu (ppm) Đối với 1H-NMR thì δ có giá trị từ 0-12 ppm, đối với 13C-NMR thì δ có giá trị từ 0-230 ppm

Hình 1.2 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân của benzyl axetat

Hằng số tương tác spin-spin J: Trên phổ NMR, mỗi nhóm hạt nhân

không tương đương sẽ thể hiện bởi một cụm tín hiệu gọi và vân phổ, mỗi vân

phổ có thể bao gồm một hoặc nhiều hợp phần Nguyên nhân gây nên sự tách tín hiệu cộng hưởng thành nhiều hợp phần là do tương tác của các hạt nhân có

từ tính ở cạnh nhau Tương tác đó thể hiện qua các electron liên kết Giá trị J

phụ thuộc vào bản chất của hạt nhân tương tác, số liên kết và bản chất các liên kết ngăn giữa các tương tác [3]

Hằng số tương tác spin-spin J được xác định bằng khoảng cách giữa các hợp phần của một vân phổ Dựa vào hằng số tương tác spin-spin J ta có thể rút

ra kết luận về vị trí trương đối của các hạt nhân có tương tác với nhau [2]

1.1.3 Phương pháp phổ khối lượng (MS) [1,4]

Nguyên tắc chung của phương pháp phổ khối lượng là phá vỡ phân tử trung hòa thành ion phân tử và các mảnh ion dương có số khối z = m/e Sau

đó phân tách các ion này theo số khối và ghi nhận được phổ khối lượng Dựa vào phổ khối này có thể xác định phân tử khối và cấu tạo phân tử của chất nghiên cứu

Để phá vỡ phân tử người ta có nhiều phương pháp: bắn phá bằng dòng electron (EI), phương pháp ion hóa hóa học (CI), phương pháp bắn phá nguyên

tử nhanh (FAB)… Dùng dòng electron có năng lượng cao để bắn phá phân tử

là phương pháp hay được sử dụng nhất Khi bắn phá các phân tử hợp chất hữu

cơ trung hòa sẽ trở thành các ion phân tử mang điện tích dương hoặc bị phá vỡ thành các ion và các gốc theo sơ đồ:

(2)

(1) 3e

2

ABC

2e ABC

e ABC

> 95%

-Sự hình thành các ion mang điện tích +1 chiếm hơn 95%, còn lại là các

thể phá vỡ thành các mảnh ion dương (+), hoặc các ion gốc, các gốc, hoặc phân

tử trung hòa nhỏ hơn, nên người ta thường thực hiện bắn phá các phân tử ở mức năng lượng 70 eV

B A

B AB ABC

BC A

ABC

AB

Sự phá vỡ này phụ thuộc vào cấu tạo chất, phương pháp bắn phá và năng lượng bắn phá Quá trình này gọi là quá trình ion hóa

Các ion ion dương hình thành đều có khối lượng m và mang điện tích e,

tỉ số m/e được gọi là số khối z Bằng cách nào đó tách các ion có số khối khác nhau ra khỏi nhau và xác định được xác suất có mặt của chúng, rồi vẽ đồ thị biểu diễn mối liên quan giữa xác suất có mặt (hay cường độ I) và số khối z thì

đồ thị này được gọi là phổ khối lượng (Hình 1.3)

Hình 1.3 Phổ khối lượng của benzamit (C 6 H 5 CONH 2 )

Như vậy, khi phân tích phổ khối lượng người ta thu được khối lượng phân tử của chất nghiên cứu, từ các pic mảnh ion trên phổ đồ có thể xác định được cấu trúc phân tử và tìm ra qui luật phân mảnh Đây là một trong những thông số quan trọng để qui kết chính xác cấu trúc phân tử của một chất cần nghiên cứu khi kết hợp nhiều phương pháp phổ với nhau

1.2 Tách và phân tích các đồng phân đối quang [5]

Phân tích các đồng phân đối quang là tách một hỗn hợp raxemic bằng

các phương pháp vật lý và hóa học Thông thường, sự tách được thực hiện sau

khi chuyển từ đồng phân đối quang sang đồng phân “dia”; do các đồng phân

đối quang có các tính chất vật lý và hóa học giống nhau nên chúng không thể

tách khỏi nhau bằng cách trực tiếp Trong khi đó, các đồng phân “dia” có thể

tách được bằng các phương pháp kết tinh chọn lọc, phương pháp sắc ký

1.2.1 Phương pháp tách các đồng phân đối quang bằng enzym

Hầu hết các enzym có tính đặc hiệu với một loại cơ chất nhất định Dựa vào tính chất này, người ta đã sử dụng các enzym để chuyển hóa chọn lọc một

trong hai đối quang trong hỗn hợp Ví dụ phản ứng thủy phân hỗn hợp raxemic

của este bằng enzym pig liver estease Dưới tác dụng của enzym này, chỉ có

đồng phân S được thủy phân, nhờ đó mà người ta tách được hai đồng phân này

ra khỏi nhau

1.2.2 Tách và phân tích đồng phân đối quang bằng các phương pháp hóa lý hiện đại

Các đối quang có thể được tách nhờ các phương pháp sắc ký khí (GC),

sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) có sử dụng các cột chiral Bản chất của các

phương pháp này là các hỗn hợp đối quang tương tác với pha tĩnh (tâm bất đối

trên cột chiral), nghĩa là chỉ một trong các đối quang có tương tác mạnh hơn

với tâm bất đối của cột Đối quang có tương tác yếu sẽ được rửa giải nhanh nhờ pha động, kết quả là hai đối quang được tách ra khỏi nhau Phương pháp này thường được sử dụng để xác định độ chọn lọc đối quang trong của các phản ứng Nếu phản ứng nhận được hỗn hợp có hai đồng phân đối quang A và B

(ee=enantiomer excess, de=diasteroisomer excess), độ chọn lọc đối quang

được xác định theo công thức:

di teroisomerA di teroisomerB







1.2.3 Phân tích các đối quang nhờ phương pháp NMR

Để xác định tỉ lệ các đồng phân lập thể có thể sử dụng nhiều phương pháp khác nhau, nhưng phổ NMR là một phương pháp hữu ích và phổ biến, vì

nó không làm thay đổi tỉ lệ của các đồng phân trong hỗn hợp và chỉ cần lượng nhỏ hỗn hợp hai đồng phân đối quang Các đồng phân khác nhau được xác định

nhờ độ dịch chuyển hóa học và hằng số tương tác spin-spin của những nguyên

tử hydro trong từ trường

Trong phổ NMR, phần lớn hạt nhân của 1H và 13C của hai đồng phân “dia”

sẽ có tín hiệu chuyển dịch hóa học khác nhau Tỉ lệ của các đồng phân có mặt trong hỗn hợp có thể tính toán được bằng sự phân tích các tín hiệu này Nếu trong hỗn

hợp có nhiều hơn hai đồng phân “dia” thì việc xác định tỉ lệ các đồng phân bằng

phổ NMR sẽ gặp khó khăn hơn, đặc biệt là các đồng phân chiếm tỉ lệ nhỏ

1.2.4 Phương pháp sử dụng tác nhân chuyển dịch (Shift reagent) Mosher

Đối với các hợp chất có một tâm bất đối thì hai đối quang của chúng sẽ không phân biệt được bằng phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân, do tín hiệu của chúng không được phân tách trong từ trường Để phân biệt được hai đối quang của các hợp chất có một tâm bất đối, người ta phải chuyển hợp chất

nghiên cứu thành đồng phân dia Cơ sở của phương pháp Mosher là chuyển hợp chất có một tâm bất đối thành đồng phân dia bằng cách thực hiện phản ứng của hợp chất nghiên cứu với axit R-Mosher để tạo thành este hoặc thành amit

Ví dụ, để xác định cấu hình tuyệt đối của hợp chất 1-phenylbutan-1-ol có một

tâm bất đối, Mosher đã tổng hợp este của nó với axit R-Mosher để tạo ra hai đồng phân dia như mô tả trong sơ đồ dưới đây

Hai đồng phân dia này sẽ được phân biệt rõ trên phổ cộng hưởng từ hạt

nhân proton Tín hiệu của proton bậc ba tại trung tâm bất đối của dẫn xuất este

Mosher của (R)-1-phenylbutan-1-ol sẽ dịch chuyển về phía trường cao, trong khi tín hiệu proton bậc ba tại tâm bất đối của dẫn xuất (S)-1-phenylbutan-1-ol sẽ dịch

chuyển về phía trường thấp Như vậy, người ta có thể xác định được cấu hình tuyệt đối của hợp chất 1-phenylbutan-1-ol ban đầu

Hình 1.4 Phổ 1 H-NMR của hỗn hợp (R,S)-1-phenylbutan-1-ol

Hình 1.5 Phổ 1 H-NMR của (R)-1-phenylbutan-1-ol và

(R)-1-phenylbutan-1-ol

Ngoài axit R-Mosher, hiện nay người ta đang nghiên cứu sử dụng một số

tác nhân bổ trợ khác để xác định cấu hình tuyệt đối của một số hợp chất ancol, amin và axit cacboxylic có một tâm bất đối, ví dụ như các tác nhân bổ trợ sau

1.3 Phân tách và xác định cấu trúc của artemisinin

Năm 1967, Chính phủ Trung Quốc đã phát động một chương trình tìm kiếm các thuốc chống sốt rét mới, và các cây thuốc cổ truyền đã được nghiên

cứu một cách hệ thống [6,7] Cây Thanh hao hoa vàng (Artemisia annua L.)

đã được dùng lâu đời trong y học cổ truyền của Trung Quốc để chữa bệnh cúm và bệnh sốt rét Năm 1972, các nhà Hoá học Trung Quốc đã tách được từ

lá cây Thanh Hao hoa vàng một chất ở dạng tinh thể có hoạt tính chống sốt rét cao được gọi là Quinghaosu Nhưng đến năm 1979 chất này mới được xác

định cấu trúc hoá học [9] Đây là một secquilacton, có cầu endoperoxit và có cấu trúc rất phức tạp, nhưng nhờ các phương pháp phổ hiện đại như phổ cộng hưởng từ hạt nhân, phổ khối lượng, phổ hồng ngoại, phổ rơn ghen … nên người ta đã hoàn toàn xác định được cấu trúc của nó, kể cả việc xác định cấu hình tuyệt đối của artemisinin

Vì có hoạt tính chống sốt rét rất mạnh nên các nhà khoa học Trung Quốc

đã nghiên cứu tìm kiếm nó trong các loài Artemisia khác nhau Người ta đã nghiên cứu chiết tách khoảng 30 loài Artemisia khác nhau ở Trung Quốc, nhưng

không loài nào được tìm thấy artemisinin [10] Ở Ấn Độ, Balachandran và cộng

sự cũng không tìm thấy artemisinin trong các loài Artemisia địa phương [9]

Cũng tương tự, các nhà Khoa học Mỹ cũng không phát hiện được artemisinin

từ rất nhiều loài Artemisia mọc ở Mỹ [12]

Ở Việt Nam các nhà khoa học đã phát hiện cây Thanh hao hoa vàng mọc hoang dại ở nhiều tỉnh phía bắc, sau đó nó cũng được gieo trồng đại trà để làm nguyên liệu chiết tách artemisinin Riêng trong năm 1999, toàn bộ lượng artemisinin đã được chiết tách từ cây Thanh hao hoa vàng ở Việt Nam khoảng

ba tấn, trong khi đó, ở Trung Quốc lượng artemisinin sản xuất được khoảng năm tấn hàng năm [13]

1.4 Tổng hợp các dẫn xuất của artemisinin

1.4.1 Các dẫn xuất ete và este của artemisinin

Mặc dù artemisinin đã được dùng trong lâm sàng ở Trung Quốc và một số nước khác kể cả ở Việt Nam để điều trị bệnh sốt rét Tuy nhiên, việc sử dụng nó vẫn còn những hạn chế nhất định như khả năng tan rất kém trong dầu và trong nước Do vậy, khi nghiên cứu tổng hợp các dẫn xuất của nó nhằm cải thiện những nhược điểm đó, các nhà khoa học đã tổng hợp được một số dẫn xuất mới của artemisinin Các kết quả này có thể tóm tắt như ở Sơ đồ 1.1 Ví dụ, người ta đã

khử artemisininin (4) thành dihydroartemisinin (DHA) 5, sau đó chất 5 được phản

ứng với metanol và etanol với xúc tác axit tạo thành metyl ete và etyl ete, tương ứng Các hợp chất này có ưu điểm là tan tốt trong dầu nên có thể dùng để tiêm bắp, cả hai hợp chất này đều có hoạt tính cao hơn artemisinin nhưng lại có thời gian bán huỷ nhỏ hơn và gây độc với hệ thần kinh trung ương trong điều trị trường diễn ở chó và chuột nhắt [27-29] Tuy nhiên, White và các cộng sự, khi nghiên cứu trên các bệnh nhân điều trị bằng cách tiêm metyl ete ở liều cao không phát hiện thấy sự chết của các tế bào thần kinh [38]

Sơ đồ 1.1 Chuyển hóa artemisininin thành metyl ete và etyl ete

Trong những trường hợp điều trị sốt rét ác tính gây ra bởi chủng ký sinh

trùng P falciparum đòi hỏi phải có những dẫn xuất tan tốt trong nước để tiêm

ven giúp cắt cơn nhanh Từ những lý do trên, người ta đã tổng hợp ra dẫn xuất mới artesunat (sơ đồ 1.2)

Sơ đồ 1.2 Tổng hợp dẫn xuất artesunat

Muối natri của axit artesunic tan tốt trong nước, có khả năng loại bỏ nhanh ký sinh trùng và phục hồi lại ý thức của các bệnh nhân hôn mê não [30] Tuy nhiên, thuốc có thời gian bán huỷ rất thấp, vào khoảng 20-30 phút và có tỷ

lệ tái phát rất cao nên người ta phải sử dụng tổ hợp thuốc để điều trị, ví dụ dùng

tổ hợp trong điều trị với mefloquin [31] Mặc dù vậy, artesunat được xem là thuốc được lựa chọn tốt hiện nay trong số các thuốc sốt rét artemisinin thế hệ đầu [32]

Dẫn xuất tiếp theo là muối natri của axit artelinic (sơ đồ 1.3), bền hơn trong môi trường kiềm so với của muối artesunat [33] Nếu so sánh với metyl ete và etyl ete thì chất này không chỉ bền hơn trong dung dịch nước mà còn có thời gian bán huỷ dài hơn (1,5-3h) so với hai dẫn xuất nói trên Thêm vào đó, người ta còn phát hiện thấy chất này ít độc với hệ thần kinh trung ương của chó

và chuột so với metyl ete, etyl ete và artesunat [34] Vì vậy, nó được xem như

là thuốc tốt nhất trong số các dẫn xuất tan tốt trong nước của artemisisnin để điều trị sốt rét ác tính

Sơ đồ 1.3 Tổng hợp dẫn xuất muối natri của axit artelinic

Các dẫn xuất của artemisinin như dihydroartemisinin, metyl ete, etyl ete, artesunat và artelinat trong thực tế có hoạt tính cao hơn rất nhiều so với artemisinin Các dẫn xuất này được xem như là những “prodrug” của dihydroartemisinin bởi vì người ta đã chứng minh được rằng các dẫn xuất này

chuyển về dihydroartemisinin trong in vivo

Tỷ lệ tái phát cao và tỷ lệ điều trị tận gốc thấp của các dẫn xuất dihydroartemisinin nhìn chung là do thời gian bán huỷ rất ngắn của chúng trong plasmit, nguyên nhân chính là do các dẫn xuất này được chuyển hoá rất nhanh

về dihydroartemisinin dưới tác dụng của quá trình hydroxyl hoá bởi cytochrom

P-450 tạo thành hemiaxetal trung gian 10 (sơ đồ 1.4), sau đó chất trung gian

này được phân huỷ tạo thành dihydroartemisinin DHA và andehit

Sơ đồ 1.4.Chuyển hóa dẫn xuất dihydroartemisinin thành hemiaxetal

Mặt khác, DHA được chuyển vị dưới tác dụng của enzym để tạo thành

hydroperoxit 11 và hai chất có chứa đồng thời cả hai nhóm andehit và xeton trong phân tử là chất 13 và 14 Trong đó, chất trung gian 11 có chứa nhóm

hydroperoxit, andehit và xeton, được biết như nhóm có hoạt tính và có độc tính

Trong quá trình thử nghiệm in vitro chất này chuyển hoá thành

deoxyartemisinin 12, là chất không có hoạt tính chống sốt rét, vì cấu trúc của

nó bị mất cầu peroxit

1.5 Mục tiêu của luận văn

Các sản phẩm chuyển hóa của artemisinin như DHA, metyl eter… thường nhận được các sản phẩm có trung tâm bất đối mới do sự khử nhóm cacbonyl của lacton ở hai hướng không gian khác nhau Nên việc phân tích cấu trúc và các đồng phân bất đối này rất khó khăn đòi hỏi phải có phương pháp hóa lý hiện đại Trong luận án này chúng tôi phân tích cấu trúc và đồng phân lập thể của sản phẩm chuyển hóa artemisinin

Chương 2 THỰC NGHIỆM 2.1 Phương pháp nghiên cứu, nguyên liệu và thiết bị

2.1.1 Phương pháp nghiên cứu

Các phương pháp phân tích cấu trúc hiện đại và phương pháp tổng hợp hữu cơ hiện đại được thực hiện tại Phòng thí nghiệm Hoá dược - Viện Hoá học

- Viện Hàn lâm Khoa học & Công nghệ Việt Nam Nhằm mục đích tổng hợp các dẫn xuất của hemiasterlin để nghiên cứu phân tích cấu trúc

2.1.2 Hóa chất và dung môi

Các hóa chất phục vụ cho việc tổng hợp hữu cơ và dung môi được mua của hãng Merck (Đức) và Aldrich (Mỹ) Silicagel cho sắc ký cột là loại 100 -

200 mesh (Merck), bản mỏng sắc ký silica gel là bản nhôm tráng sẵn Art 5554

DC - Alufolien Kiesel 60 F254 (Merck)

2.1.3 Định tính phản ứng và kiểm tra độ tinh khiết của các hợp chất bằng sắc kí lớp mỏng

Sắc kí lớp mỏng (SKLM) được sử dụng để định tính chất đầu và sản phẩm Thông thường chất đầu và sản phẩm có giá trị Rf khác nhau, màu sắc và

sự phát quang khác nhau Dùng sắc kí lớp mỏng để kiểm tra phản ứng Giá trị

Rf của các chất phụ thuộc vào bản chất của các chất và phụ thuộc vào dung môi làm pha động Dựa trên tính chất đó, chúng ta có thể tìm được dung môi hay hỗn hợp dung môi để tách các chất ra xa nhau (Rf khác xa nhau) hay tìm được

hệ dung môi cần thiết để tinh chế các chất

Khoa học & Công nghệ Việt Nam

2.1.4.2 Phổ hồng ngoại (IR)

Phổ IR của các chất nghiên cứu được xác định trên máy Impact Nicolet tại Viện Hoá học - Viện Hàn lâm Khoa học & Công nghệ Việt Nam và máy FT-ICR Mass spectrometer Model 910-MSTQFTMS-7 Tesla tại Khoa Hóa học - Trường Đại học Khoa học Tự nhiên - ĐH Quốc gia Hà Nội Các mẫu nghiên cứu được đo ở dạng ép viên với KBr rắn

410-2.1.4.3 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)

Phổ 1H-NMR (500MHz) và 13C-NMR (125MHz) của các chất nghiên cứu được đo trên máy Bruker XL-500 tần số 500 MHz với dung môi thích hợp

và TMS là chất chuẩn, tại Trung tâm Phân tích cấu trúc - Viện Hoá học - Viện Hàn lâm Khoa học & Công nghệ Việt Nam

2.1.4.4 Phổ khối lượng (MS)

Phổ khối của các chất nghiên cứu được ghi trên máy Hewlett Packard Mass Spectrometer 5989 MS hoặc LC- MSD- Trap- SL tại Trung tâm Phân tích cấu trúc

- Viện Hoá học- Viện Hàn lâm Khoa học & Công nghệ Việt Nam

2.2 Tổng hợp và phân tích cấu trúc của hydroxyl artemisinin (DHA)

2.2.1 Tổng hợp DHA

DHA

Dung dịch của 5,0 gam artemisinin trong 30 mL metanol được làm lạnh

30 phút Tiếp theo hỗn hợp phản ứng được khuấy trộn trong 4h ở nhiệt độ

-33oC Kết thúc phản ứng hỗn hợp được cho thêm 100 mL nước lạnh Lọc hút thu lấy kết tủa trắng, kết tủa này được kết tinh lại 3 lần trong dung môi metanol

và rửa lại hai lần n-hexan nhận được 4,9 gam DHA (98%)

Sản phẩm là tinh thể hình kim màu trắng có điểm chảy …

2.2.2 Phân tích cấu trúc của DHA bằng NMR

25 mg DHA ở trên được cho vào trong ống NMR loại (tubes NMR của Aldrich) dài 20,3 mm, rộng 5 mm sau đó cho 0,8 ml CDCl3 và lắc đều cho mẫu tan hết vào dung môi tạo thành hệ đồng nhất Mẫu được đo trên máy Bruker XL-

500 tần số 500 MHz với TMS là chất chuẩn, tại Trung tâm Phân tích cấu trúc - Viện Hoá học - Viện Hàn lâm Khoa học & Công nghệ Việt Nam

1H-NMR (CDCl3, 500 MHz)δ ppm: 5.60(1H, s, H-12 β-DHA); 5.38 (1H,

s, 12 α-DHA); 5.29 (1H, d, J=2.5 Hz, 10 β-DHA); 474 (1H, d, 9.0Hz;

H-10 α-DHA); 2.59-2.62 (1H, m, H-9); 2.37-2.40 (1H, m, H-4a); 2.26-2.29 (1H,

m, H-4b); 1.86-1.87 (1H, m; H-5a); 1.61-162 (1H, m, H7a); 1.83-1.84 ( 1H, m, H8b); 1.74-1.76 (1H, m, H8a); 1.41-1.43 (1H, m, H8a’); 1.61-162 (1H, m, H7a); 1.36-1.38 (1H, m, H6); 1.43-1.44 (1H, m; H-5b); 1.29 (1H, s, H15) 1.18-

1.20 (1H, m, H5a’); 0.92 (3H, d, J=6.5Hz, H13); 0.90-0.91 (3H, m, H7b); 0.88 (3H, d, J=7.3Hz, H14)

13C-NMR (CDCl3, 125 MHz)δ ppm: 104.3 (3); 96.0 (10); 88.0 ( 12); 81.7 (C-12a’); 53.2 (C-5a’); 45.0 (C-8a’); 37.9 (C-6); 36.9 (C-4); 35.1 (C-7); 31.6 (C-9); 25.3 (C-5); 23.1 (C-8); 20.5 (C-13); 20.0(C-15); 13.5 (C14)

C-2.2.3 Phân tích tỷ lệ đồng phân α-DHA và β-DHA bằng 1 H-NMR

Tỷ lệ hai đồng phân được tính tương đối theo diện tích của các tín hiệu proton của H-12 [42, 43]trên phân tử α và β-DHA theo công thức sau:

Trong đó:

%(αDHA) là phần trăm đồng phân α-DHA

S(αDHA) là diện tích tín hiệu proton H-12 của α-DHA S(βDHA) là diện tích tín hiệu proton H-12 của β-DHA

Dựa theo phổ 1H-NMR ta có kết quả sau:

hệ dung môi rửa giải là n-hexan/etyl axetat nhận được sản phẩm ete hóa

(NTD.01)với hiệu suất 40% (0,9g)

2.3.2 Phân tích cấu trúc của (NTD.01)bằng NMR

35 mg(NTD.01) được cho vào trong ống NMR loại (tubes NMR của

tan hết vào dung môi tạo thành hệ đồng nhất Mẫu được đo trên máy Bruker XL-500 tần số 500 MHz với TMS là chất chuẩn

13C-NMR (CDCl3,125 MHz)δ ppm: 134.6 (C-2”); 116.1 (C-3”); 104.0 (C-3); 101.3 (C10); 87.9 (C-12); 81.1 (C-12a’); 68.7 (C-1”); 52.6 (C-5a’); 44.4 (C-8a’); 37.4 (C-6); 36.4 (C-4); 34.6 (C-7); 30.9 (C-9); 26.2 (C-15); 24.7 (C-5); 24.5 (C-8); 20.3 (C-13); 13.0 (C-14)

2.4 Tổng hợp và phân tích cấu trúc chất NTD.031

2.4.1 Tổng hợp chất NTD.031

Dung dịch của NTD.01 (1,0 g, 3 mmol) trong 20 mL diclometan được cho thêm m CPBA (1.54 g, 9 mmol) Hỗn hợp phản ứng được khuấy ở nhiệt độ phòng 24h Kết thúc phản ứng hỗn hợp được cho thêm nước và chiết 3 lần bằng diclometan mỗi lần 50 mL Dịch hữu cơ được làm khan bằng Na2SO4, dung môi được loại bỏ dưới áp suất thấp nhận được sản phẩm thô Sản phẩm thô được làm

sạch bằng sắc ký cột silica gel với hệ dung môi rửa giải là n-hexan/etyl axetat nhận

được sản phẩm ete hóa (NTD.031)với hiệu suất 90% 0.9g)

2.4.2 Phân tích cấu trúc của (NTD.031) bằng NMR

35 mg (NTD.031) được cho vào trong ống NMR loại (tubes NMR của

Aldrich) dài 20,3 mm, rộng 5 mm sau đó cho 0,8 ml CDCl3 và lắc đều cho mẫu tan hết vào dung môi tạo thành hệ đồng nhất Mẫu được đo trên máy Bruker XL-500 tần số 500 MHz với TMS là chất chuẩn

1H-NMR (CDCl3, 500 MHz)δ ppm: 5.44 (1H, s, H-12 R-oxiran); 5.41 (1H, H-12 s-oxiran); 4.81 (1H, H-10 S-oxiran); 4.80 (1H, s, H-10 R-oxiran); 3.84-3.91 (2H, H-3” s-oxiran); 3.76-3.80 (2H, H-3” R-oxiran); 3.67-3.74 (4H, H1” R,S-oxiran); 3.46-3.49 (1H, H-2” R-oxiran); 3.37-3.49 (1H, H-2” S-oxiran) ; 2.63-2.66 (1H, m, H-9); 2.34-2.40 (1H, m, H-4b); 2.01-2.05 (1H,

(C-2.4.3 Phân tích tỷ lệ hai đồng phân oxiran bằng 1 H-NMR

Vì H-12 của DHA cố định nên lựa chọn làm tín hiệu để tính tỷ lệ hai

đồng phân S và R-oxiran (epoxit) được tính theo công thức sau [1s, 2s]:

Dựa theo phổ 1H-NMR ta có kết quả sau:

gel với hệ dung môi rửa giải là n-hexan/etyl axetat nhận được sản phẩm ete hóa

(NTD.039)với hiệu suất 60% 0.075g)

2.5.2 Phân tích cấu trúc của (NTD.039)bằng NMR

25 mg (NTD.039) được cho vào trong ống NMR loại (tubes NMR của

Aldrich) dài 20,3 mm, rộng 5 mm sau đó cho 0,8 ml CDCl3 và lắc đều cho mẫu tan hết vào dung môi tạo thành hệ đồng nhất Mẫu được đo trên máy Bruker XL-500 tần số 500 MHz với TMS là chất chuẩn

1H-NMR (CDCl3, 500 MHz)δ ppm: 5.44 (1H, s, H-12 R-NTD-039); 5.42 (1H, S-NTD-039 H-12); 4.82 (1H, H-10 S- NTD-039); 4.81 (1H, s, H-10 R-

NTD-039); 3.79-3.69 (4H, m, CH2-O morpholin); 3.68-3.7 3(4H, H1” NTD-039); 3.42-3.48 (1H, H-2” R- NTD-039); 3.37-3.40 (1H, H-2” S- NTD-

R,S-039); 2.67-2.60 (4H, m, CH2-N morpholin); 2.49-2.51 (2H, H-3” s- NTD-039); 2.47-2.49 (2H, H-3” R-NTD-039); 2.62-2.65 (1H, m, H-9); 2.35-2.39 (1H, m,

H-4b); 2.00-2.06 (1H, m, H-4a); 1.84-1.88 (1H, m, H-5b); 1.81-1.84 (1H, m, H-8b); 1.77-1.80 (1H, m, H-8a); 1.63-1.66 (1H, m, H-7b); 1.49-1.50 (1H, m, H-5a); 1.44-1.46 (1H, m, H-8a’); 1.45 (1H, s, H-15); 1.34-1.45 (1H, m, H-6);

1.22-1.26 (1H, m, H-5a’); 0.96 (3H, d, J= 7.5 Hz, H-13); 0.90 (3H, d, J= 6.5

Hz, H-14); 0.90-0.91 (1H,m, H-7a)

2.5.3 Phân tích tỷ lệ hai đồng phân R,S NTD.039 bằng 1 H-NMR

Vì H-12 của DHA cố định nên lựa chọn làm tín hiệu để tính tỷ lệ hai

đồng phân S và R- được tính theo công thức sau [41, 42]:

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Mục tiêu của đề tài

Artemisinin (1) là secquiterpen lacton được phát hiện có hoạt tính kháng

kí sinh trùng sốt rét rất mạnh và đã được dùng để làm thuốc chữa bệnh sốt rét rất hiệu quả Tuy nhiên, việc sử dụng artemisinin trong lâm sàng còn bộc lộ nhiều nhược điểm như độc với hệ thần kinh, dễ gây nhờn thuốc do có thời gian bán hủy thấp Vì vậy người ta chuyển hóa artemisinin thành các dẫn chất mới

của artemisinin như dihydroartemisinin (2), metyl eter (3) … có hoạt tính cao

hơn đã được dùng trong điều trị bệnh sốt rét Các hợp chất này có ưu điểm là tan tốt trong dầu nên có thể dùng để tiêm bắp, cả hai hợp chất này đều có hoạt tính cao hơn artemisinin nhưng lại có thời gian bán huỷ nhỏ hơn và gây độc với

hệ thần kinh trung ương trong điều trị trường diễn

Sơ đồ 3.1 Mục tiêu nghiên cứu của luận văn

Các sản phẩm chuyển hóa của artemisinin như DHA, metyl eter…