Phân tích cấu trúc và hàm lượng của thuốc trị bệnh tiểu đường glibenclamid bằng các phương pháp hóa lý hiện đại

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vnĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC ĐỖ THỊ HẠNH PHÂN TÍCH CẤU TRÚC VÀ HÀM LƯỢNG CỦA THUỐC TRỊ BỆNH TIỂU ĐƯỜNG GLIB

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

ĐỖ THỊ HẠNH

PHÂN TÍCH CẤU TRÚC VÀ HÀM LƯỢNG CỦA THUỐC TRỊ BỆNH TIỂU ĐƯỜNG GLIBENCLAMID BẰNG CÁC PHƯƠNG PHÁP HÓA LÝ HIỆN ĐẠI

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

ĐỖ THỊ HẠNH

PHÂN TÍCH CẤU TRÚC VÀ HÀM LƯỢNG CỦA THUỐC TRỊ BỆNH TIỂU ĐƯỜNG GLIBENCLAMID BẰNG CÁC PHƯƠNG PHÁP HÓA LÝ HIỆN ĐẠI

Chuyên ngành: Hóa phân tích

LỜI CẢM ƠN

Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, em xin chân thành cảm ơn T.S Đặng Thị Tuyết Anh và GS.TS Nguyễn Văn Tuyến đã giao đề tài và tận tình hướng dẫn em trong suốt thời gian thực hiện đề tài

Em xin chân thành cảm ơn các cán bộ phòng Hóa Dược và các em sinh viên phòng Hóa Dược đã giúp đỡ em rất nhiều trong quá trình thực nghiệm và hoàn thành luận văn

Tôi xin cảm ơn các anh chị, các bạn học viên lớp K8Đ- lớp Cao học Hóa

đã trao đổi và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài

Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình tôi, bạn bè tôi - những người đã luôn bên cạnh động viên và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập và thực hiện luận văn này

Thái Nguyên, ngày 12 tháng 10 năm 2016

Học viên

Đỗ Thị Hạnh

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

MỤC LỤC ii

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT iv

DANH MỤC CÁC BẢNG VÀ HÌNH v

DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ vi

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 4

1.1- TỔNG QUAN VỀ GLIBENCLAMIDE 4

1.1.Khái quát về bệnh tiểu đường 4

1.1.1.Phân loại bệnh tiểu đường 4

1.1.2 Các thuốc điều trị bệnh tăng đường huyết 4

1.1.3 Quan niệm của y học cổ truyền về bệnh tiểu đường 6

1.1.4 Các thuốc Đông y điều trị bệnh tiểu đường 6

1.1.5 Thuốc chữa bệnh tiểu đường Glibenclamide 6

1.2- TỔNG QUAN VỀ CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH HÓA LÝ 8

1.2.1 Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) 8

1.2.2 Phương pháp phổ khối lượng (MS) 10

1.2.3 Phương pháp phổ hồng ngoại (IR) 11

1.2.4 Phương pháp xác định độ ẩm ( theo Karl Fischer) 13

CHƯƠNG 2 THỰC NGHIỆM 14

2.1.Hóa chất và thiết bị 14

2.1.1.Hóa chất và dung môi 14

2.1.2 Thiết bị xác định cấu trúc 14

2.1.3 Xác định cấu trúc, định tính phản ứng và kiểm tra độ tinh khiết của các sản phẩm tổng hợp được 15

2.2.Tổng hợp Glibenclamide 15

2.2.1 Tổng hợp 5-chloro-2-methoxybenzoyl chloride 15

2.2.2 Tổng hợp chất trung gian(4) 16

2.2.3 Tổng hơ ̣p Glibenclamide (5) 17

2.2.4 Phân tích hàm lượng sản phẩm glibenclamide (5) 18

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 21

3.1 Phân tích và xác định cấu trúc của Glibenclamide của các sản phẩm trung gian đã tổng hợp được 21

3.1.1 Tổng hợp 5-chloro-2-methoxybenzoyl chloride 22

3.1.2 Phân tích và xác định cấu trúc của hợp chất trung gian 5-chloro-2-methoxy-N-(4-sulfamoylphenethyl)benzamide (4) tổng hợp được 22

3.1.3 Tổng hợp glibenclamide 265

3.2 Phân tích cấu trúc và hàm lượng của glibenclamide bằng các phương pháp hóa lý hiện đại 26

3.2.1.Phân tích cấu trúc của Glibenclamide bằng phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton 1H-NMR 26

3.2.2.Phân tích cấu trúc của Glibenclamide bằng phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân cacbon 13 C-NMR 27

3.2.3 Phân tích cấu trúc của Glibenclamide bằng phương pháp phổ khối lượng 28

3.2.4.Phân tích hàm lượng sản phẩm glibenclamide(4) bằng phương pháp chuẩn độ 28

3.2.5 Phân tích một số chỉ tiêu hóa lý khác của sản phẩm Glibenclamide 29

KẾT LUẬN 32

TÀI LIỆU THAM KHẢO 33

PHỤ LỤC 35

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

13C- NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon-13 (13C Nuclear Magnetic

Resonance)

1H- NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1H Nuclear Magnetic

Resonance)

Spectrometry)

H, C Độ chuyển dịch hóa học của proton và cacbon

DANH MỤC CÁC BẢNG VÀ HÌNH

Hình 1.1 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân của benzyl axetat 9

Hình 1.2 Phổ khối lượng của benzamit (C 6 H 5 CONH 2 ) 11

Hình 1.3 Phổ hồng ngoại của benzyl ancol 12

Hình 3.1: Phổ 1 H-NMR của chất trung gian (4) 24

Hình 3.2: Phổ 13 C-NMR của chất trung gian (4) 25

Hình 3.3: Phổ 1 H-NMR của chất glibenclamide 5 27

Hình 3.4: : Phổ 13 C-NMR của chất glibencalmide (5) 28

Hình 3.5: Phổ EI-MS của glibenclamide (5) 29

DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ

Sơ đồ 3.1 Tổng hợp chung về glibenclamide 22

Sơ đồ 3.1.1 Tổng hợp 5-chloro-2-methoxybenzoyl chloride (2) 22

Sơ đồ 3.1.2 Tổng hợp hợp chất trung gian 4 23

Sơ đồ 3.1.3 Tổng hợp glibenclamide 26

 Mỗi 6 giây có 1 người chết vì bệnh tiểu đường ( tương đương với

5 triệu ca tử vong)

 Cứ 11 người thì có 1 người lớn mắc bệnh tiểu đường ( tương đương với 415 triệu người)

 Trong 7 ca sinh thì có 1 ca bị ảnh hưởng bởi tiểu đường thai kì

 Dự báo đến năm 2040 sẽ có khoảng 642 triệu người mắc bệnh Tại Mỹ ước tính có khoảng 26 triệu người mắc bệnh tiểu đường, khoảng 7 triệu người có bệnh lí trong đó có quá nhiều đường trong máu

Nước Anh cũng có khoảng 3 triệu người mắc và con số này không ngừng tăng lên Tại Đức, theo số liệu mới đây nhất vào ngày Tiểu đường thế giới ( 14/11/2015) thì có hơn 6 triệu người mắc bệnh

Ở Việt Nam, theo Tổ chức Y tế Thế giới ( WHO), tỷ lệ mắc tiểu đường ngày càng gia tăng Bộ Y tế thống kê trong 10 năm qua, số bệnh nhân mắc bệnh tiểu đường ở nước ta tăng 211% và với con số này, Việt Nam nằm trong

số các quốc gia có tốc độ tăng bệnh nhân tiểu đường cao nhất thế giới và tạo

ra gánh nặng kinh tế cho gia đình, xã hội trong quá trình điều trị căn bệnh này

Thống kê từ các cơ sở y tế từ địa phương, toàn quốc hiện có:

 Khoảng 5 triệu bệnh nhân tiểu đường

 60% các bệnh nhân mắc bệnh tiểu đường được chẩn đoán là có biến chứng cực kì nguy hiểm, có thể dẫn tới mù lòa, tàn phế, thậm chí là tử vong

 Mỗi ngày có khoảng 150 người tử vong do các nguyên nhân liên quan đến bệnh tiểu đường ( tương đương với 54.943 trường hợp tử vong của người trưởng thành mỗi năm)

Trong danh sách thuốc thiết yếu của WHO 2007 và trong danh mục thuốc thiết yếu của Bộ Y tế, glibenclamide và metformin là một trong hai thuốc tiểu đường duy nhất sử dụng theo đường uống chữa bệnh tiểu đường tuýp II Glibenclamide và metformin được dùng riêng rẽ hoặc dùng tổ hợp với nhau Glucovance (thuốc tổ hợp của glibenclamide và metformin) dùng để chữa bệnh tiểu đường có đường huyết cao Glibenclamide kích thích tuyến tụy tiết insulin còn metformin làm chậm hấp thụ đường trong ruột non; ngăn cản gan chuyển đường dự trữ vào trong máu và giúp cơ thể sử dụng insulin tự nhiên hiệu quả hơn Vì vậy, sử dụng glucovance rất hiệu quả và ít gây phản ứng phụ Như vậy nếu tổng hợp được glienclamide và metformin thì chúng ta

có thể chủ động sản xuất được hai loại thuốc thiết yếu nhất để chữa bệnh tiểu đường túyp II, làm tăng thêm sự lựa chọn, tăng tính hiệu quả của việc chữa bệnh tiểu đường và chủ động sản xuất thuốc generic chữa bệnh tiểu đường giá

rẻ ở Việt Nam Chiến lược quốc gia phát triển ngành Dược Việt Nam giai đoạn đến năm 2020 và tầm nhìn đến năm 2030 đề ra mục tiêu cụ thể đến năm

2020 là 100% thuốc được cung ứng kịp thời cho nhu cầu phòng bệnh, chữa bệnh; phấn đấu sản xuất được 20% nhu cầu nguyên liệu cho sản xuất thuốc

trong nước, thuốc sản xuất trong nước chiếm 80% tổng giá trị thuốc tiêu thụ trong năm

Glibenclamide là thuốc chống đái tháo đường được sử dụng rất rộng rãi và rất hiệu quả Đây là thuốc nằm trong danh mục thuốc thiết yếu của Bộ

Y tế ban hành Cho đến nay thuốc chữa bệnh tiểu đường này chủ yếu được nhập ngoại Việc đầu tư sản xuất các thuốc “generic” chữa bệnh tiểu đường nói riêng và các thuốc thiết yếu nói chung là việc làm hết sức thiết thực Nó không chỉ tạo điều kiện để người bệnh tiếp cận với thuốc rẻ mà còn tiết kiệm được một lượng lớn ngoại tệ để nhập khẩu thuốc

Vì vậy,chúng tôi đã tiến hành lựa chọn đề tài: “Phân tích cấu trúc và

hàm lượng của thuốc trị bệnh tiểu đường glibenclamid bằng các phương pháp hóa lý hiện đại ” Đây là đề tài có ý nghĩa khoa học và thực tiễn

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1- TỔNG QUAN VỀ GLYBENCLAMIDE

1.1.Khái quát về bệnh tiểu đường

Định nghĩa của Ủy ban chẩn đoán và phân loại bệnh tiểu đường Hoa Kỳ: “ Đái tháo đường, còn gọi là bệnh tiểu đường, là một nhóm bệnh rối loạn chuyển hóa cacbohydrat khi hoóc môn insulin của tụy bị thiếu hay giảm tác động trong cơ thể, biểu hiện bằng mức đường trong máu luôn cao’’

Bệnh tiểu đường [1-8] là một trong những nguyên nhân chính của nhiều bệnh hiểm nghèo, điển hình là bệnh tim mạch vành, tai biến mạch máu não, mù mắt, suy thận, liệt dương, hoại thư v.v

1.1.1.Phân loại bệnh tiểu đường

Bệnh tiểu đường được chia thành hai loại như sau:

Tiểu đường tuýp 1: Tiểu đường túyp 1 là một bệnh tự miễn trong đó hệ

thống miễn dịch của cơ thể phản ứng lại và phá huỷ tế bào  sản xuất insulin của đảo tuỵ Sự thiếu hụt insulin dẫn đến tăng glucose máu và thường dẫn đến các biến chứng mãn tính

Tiểu đường túyp 2: Bệnh tiểu đường túyp 2 được đặc trưng bởi kháng

insulin và giảm tiết chế insulin dẫn đến mất khả năng duy trì mức glucose máu bình thường

Các túyp tăng đường huyết đặc hiệu khác:

- Đái tháo đường thai kỳ

- Thiếu hụt di truyền chức năng tế bào 

- Thiếu hụt di truyền về tác động của insulin

- Bệnh tuyến tụy ngoại tiết

1.1.2 Các thuốc điều trị bệnh tăng đường huyết

Dựa vào tác dụng và cơ chế tác dụng, các thuốc điều trị bệnh tiểu đường được chia thành 3 nhóm chính như sau:

- Insulin và các thuốc kích thích bài tiết insulin

- Các thuốc làm tăng nhạy cảm insulin

- Các thuốc chống tăng đường huyết sau bữa ăn

1.1.2.1 Insulin và các thuốc kích thích bài tiết insulin:

+ Insulin:

Insulin là hormon do tế bào  của tuyến tuỵ tiết xuất, đóng vai trò chủ yếu trong cơ chế điều hoà đường huyết của cơ thể Insulin là một trong những hormon quan trọng của cơ thể, không chỉ tác dụng trên chuyển hoá năng lượng và phát triển cơ thể, mà còn là chất cần thiết cho sự sống Tác dụng của insulin bao gồm các đáp ứng phức tạp mà ảnh hưởng cuối cùng là trên chuyển hoá glucid, lipid và protid

+ Thuốc kích thích bài tiết insulin

Các sulfonylurea

Năm 1942, Janbon đã tình cờ phát hiện tác dụng hạ đường huyết của dẫn suất sulfonamid (1154RP) ở những bệnh nhân điều trị sốt thương hàn Từ phát hiện này, nhiều nghiên cứu về tác dụng hạ đường huyết của các sulfonylurea đã được tiến hành Các nghiên cứu ngày càng làm sáng tỏ cơ chế tác dụng của thuốc Nhiều thuốc thuộc nhóm sulfonylurea đã ra đời, bao gồm các thuốc thế hệ I (tolbutamide, chlorpropamide) và các thuốc thế hệ II (Glyburide, Glypizide) Các thuốc này đang được sử dụng rộng rãi trên lâm sàng, đem lại nhiều kết quả khả quan cho người bệnh

1.1.2.2.Các thuốc làm tăng nhạy cảm insulin

Các thuốc thuộc nhóm biguanide bao gồm: metformin, phenformin và buformin Hiện nay metformin là thuốc đang được sử dụng phổ biến nhất, vì

ít gây tăng axit lactic trong máu hơn Các biguanide là thuốc chống tăng đường huyết, không gây hạ đường huyết Thuốc tác dụng chủ yếu ngoài tuỵ, không có tác dụng kích thích tế bào  tuyến tuỵ bài tiết insulin

1.1.2.3.Thuốc chống tăng đường huyết sau ăn (thuốc ức chế enzym  glucosidase)

-Acarbose:

Acarbose là thuốc ức chế enzym glucosidase của tế bào niêm mạc ruột

Do tác dụng ức chế enzym này, thuốc làm giảm hoặc chậm quá trình hấp thụ tinh bột, dextran và các disaccharide ở ruột non, tránh được tình trạng tăng đường huyết sau ăn Thuốc có tác dụng tốt cho cả 2 tuýp bệnh

1.1.3 Quan niệm của y học cổ truyền về bệnh tiểu đường

Theo quan niệm của Đông y, bệnh thuộc phạm vi chứng tiêu khát với

ba triệu chứng chủ yếu là ăn nhiều, uống nhiều và tiểu nhiều

1.1.4 Các thuốc Đông y điều trị bệnh tiểu đường

Các thuốc Đông y điều trị bệnh tiểu đường chủ yếu là các thuốc có

nguồn gốc từ dược liệu như sinh địa (Rehmania glutinosa Libosch, Scrophulariaceae), cỏ ngọt (Stevia rebaudiana, Asteraceae), mướp đắng

membranaceus, Fabaceae), Huyền sâm (Scrophularia ningpoensis Hemsl,

Scrophulariaceae)

1.1.5 Thuốc chữa bệnh tiểu đường Glibenclamide

Glibenclamide là thuốc chữa bệnh tiểu đường thuộc vào nhóm sulphonylure Các hợp chất thuốc thế hệ một của loại thuốc này được phát hiện từ những năm 1950 như: tolbutamide (1956), acetohexamide (1964), tolazamide (1961), chlopropamide (1959) Các thuốc thuộc thế hệ thứ hai phải kể đến như: glibenclamide (1971), glipizide, glimepiride(1999)

Các thuốc thuộc thế hệ thứ hai có hiệu quả ở liều thấp nhờ sự tăng sự hấp thụ qua màng tế bào beta Sulphonylure được liên kết với thụ thể của nó trong

tế bào beta của tuyến tuỵ Hoạt tính chống bệnh tiểu đường của các chất này phụ thuộc vào ái lực của các thuốc sulphonylure với thụ thể của nó Cơ chế hoạt động của lớp thuốc này chủ yếu được giải thích bới sự kìm hãm của các kênh KATP khởi xướng sự tiết insulin Sự thành công của việc phát hiện ra những chất sulphonylure có ái lực cao và chọn lọc vào thụ thể của sulphonylure như là glibenclamide mất 27 năm sau khi phát hiện ra chất đầu tiên có hoạt tính hạ đường huyết và phải tổng hợp khoảng 12000 dẫn chất của

nó để sàng lọc, nghiên cứu mối quan hệ giữa hoạt tính và cấu trúc

Ngoài glibenclamide, một số thuốc thế hệ thứ hai như đã đề cập ở trên cũng được phát hiện Tiếp đó đã có một số nhóm nghiên cứu tổng hơp các chất trên cơ sở khung sulphonylure để tìm kiếm các chất có hoạt tính sinh học Một số dẫn của nhóm diarylylsulphonylure có hoạt tính chống ung rất mạnh Có rất nhiều nghiên cứu về quan hệ hoạt tính chống ung thư và cấu trúc của lớp chất này Tuy nhiên, hoạt tính chống bệnh đái tháo đường của lớp chất diarylylsulphonylure không thể hiện rõ Ngoài việc nghiên cứu về cấu trúc và hoạt tính của các dẫn chất glibenclamide thì những nghiên cứu về cơ

chế và tìm hiểu sâu sắc về bản chất của thụ thể của nó cũng được nghiên cứu nhiều

Năm 1995, 26 năm sau khi phát hiện glibenclamide có ái lực cao với thụ thể của nó ở tuyến tuỵ người ta đã nhân dòng và phát hiện ra thụ thể của nó là thành phần của protein ABC vận chuyển liên họ Gần đây người ta đã phát hiện rằng thụ thể của nhóm sylphonylure điều tiết hoạt động của protein 38-KDa (Kir 6.2) mà thụ thể đó cùng với protein được tách ra và cùng có chức năng như kênh KATP

Thuốc glibenclamide hầu như chủ yếu được nhập ngoại Việc nghiên cứu tổng hợp thuốc này ở Việt Nam chưa thấy đề cập trong tài liệu.Vì vậy, chúng tôi đã tiến hành đề tài nghiên cứu tổng hợp glibenclamide để làm thuốc chữa bệnh tiểu đường với hi vọng kết quả này sẽ được đưa vào áp dụng trong thực tiễn sản xuất thuốc chữa bệnh tiểu đường để đưa vào sử dụng trong điều trị bệnh tiểu đường ở Việt Nam

1.2- TỔNG QUAN VỀ CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH HÓA LÝ

1.2.1 Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (CHTHN) là phương pháp vật lý hiện đại nghiên cứu cấu trúc của các hợp chất hữu cơ Phương pháp phổ biến được sử dụng là phổ 1H-NMR và 13C-NMR Hạt nhân của nguyên tử 1H và 13C có momen từ Nếu đặt proton trong từ trường không đổi thì momen từ của nó có thể định hướng cùng chiều hay ngược chiều với từ trường Đó là spin hạt nhân có tính chất lượng tử với các số lượng tử +1/2 và -1/2 [9-11]

Độ chuyển dịch hóa học : Do hiệu ứng chắn từ khác nhau nên các hạt

nhân 1H và 13C trong phân tử có tần số cộng hưởng khác nhau Đặc trưng cho các hạt nhân 1H và 13C trong phân tử có độ chuyển dịch hóa học δ; đối với hạt nhân 1H thì:

) ( 10 6 ppm o

x TMS







  

Trong đó: νTMS, νx là tần số cộng hưởng của chất chuẩn TMS và của hạt nhân mẫu đo, νo là tần số cộng hưởng của máy phổ

Đối với các hạt nhân khác thì độ chuyển dịch hóa học được định nghĩa một các tổng quát như sau:

) ( 10 6

ppm o

x chuan







  

nhân mẫu đo, νo là tần số cộng hưởng của máy phổ

Hằng số chắn σ xuất hiện do ảnh hưởng của đám mây electron bao quanh hạt nhân nguyên tử, do đó tùy thuộc vào vị trí của hạt nhân 1H và 13C trong phân tử khác nhau mà mật độ electron bao quanh nó khác nhau dẫn đến chúng có giá trị hằng số chắn σ khác nhau và do đó độ chuyển dịch hóa học của mỗi hạt nhân khác nhau Theo đó proton nào cộng hưởng ở trường yếu hơn sẽ có độ chuyển dịnh hóa học lớn hơn

Dựa vào độ chuyển dịch hóa học  ta biết được loại proton nào có mặt trong chất được khảo sát Giá trị độ chuyển dịch hóa học không có thứ nguyên

mà được tính bằng phần triệu (ppm) Đối với 1H-NMR thì δ có giá trị từ 0-12 ppm, đối với 13C-NMR thì δ có giá trị từ 0-230 ppm

Hình 1.1 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân của benzyl axetat

Hằng số tương tác spin-spin J: Trên phổ NMR, mỗi nhóm hạt nhân

không tương đương sẽ thể hiện bởi một cụm tín hiệu gọi và vân phổ, mỗi vân phổ có thể bao gồm một hoặc nhiều hợp phần Nguyên nhân gây nên sự tách tín hiệu cộng hưởng thành nhiều hợp phần là do tương tác của các hạt nhân có

từ tính ở cạnh nhau Tương tác đó thể hiện qua các electron liên kết Giá trị J

phụ thuộc vào bản chất của hạt nhân tương tác, số liên kết và bản chất các liên kết ngăn giữa các tương tác

Hằng số tương tác spin-spin J được xác định bằng khoảng cách giữa

các hợp phần của một vân phổ Dựa vào hằng số tương tác spin-spin J ta có

thể rút ra kết luận về vị trí trương đối của các hạt nhân có tương tác với nhau

1.2.2 Phương pháp phổ khối lượng (MS)

Nguyên tắc chung của phương pháp phổ khối lượng là phá vỡ phân tử trung hòa thành ion phân tử và các mảnh ion dương có số khối z = m/e Sau

đó phân tách các ion này theo số khối và ghi nhận được phổ khối lượng Dựa vào phổ khối này có thể xác định phân tử khối và cấu tạo phân tử của chất nghiên cứu [9-11]

Để phá vỡ phân tử người ta có nhiều phương pháp: bắn phá bằng dòng electron (EI), phương pháp ion hóa hóa học (CI), phương pháp bắn phá nguyên tử nhanh (FAB)… Dùng dòng eclectron có năng lượng cao để bắn phá phân tử là phương pháp hay được sử dụng nhất Khi bắn phá các phân tử hợp chất hữu cơ trung hòa sẽ trở thành các ion phân tử mang điện tích dương hoặc bị phá vỡ thành các ion và các gốc theo sơ đồ:

(2)

(1) 3e

2

ABC

2e ABC e

có thể phá vỡ thành các mảnh ion dương (+), hoặc các ion gốc, các gốc, hoặc phân tử trung hòa nhỏ hơn, nên người ta thường thực hiện bắn phá các phân

tử ở mức năng lượng 70 eV

B A

B AB ABC

BC A

ABC

AB

Sự phá vỡ này phụ thuộc vào cấu tạo chất, phương pháp bắn phá và năng lượng bắn phá Quá trình này gọi là quá trình ion hóa

Các ion ion dương hình thành đều có khối lượng m và mang điện tích e,

tỉ số m/e được gọi là số khối z Bằng cách nào đó tách các ion có số khối khác nhau ra khỏi nhau và xác định được xác suất có mặt của chúng, rồi vẽ đồ thị biểu diễn mối liên quan giữa xác suất có mặt (hay cường độ I) và số khối z thì

đồ thị này được gọi là phổ khối lượng (Hình 1.3)

Hình 1.2 Phổ khối lượng của benzamit (C6H5CONH2) Như vậy, khi phân tích phổ khối lượng người ta thu được khối lượng phân tử của chất nghiên cứu, từ các pic mảnh ion trên phổ đồ có thể xác định được cấu trúc phân tử và tìm ra qui luật phân mảnh Đây là một trong những thông số quan trọng để qui kết chính xác cấu trúc phân tử của một chất cần nghiên cứu khi kết hợp nhiều phương pháp phổ với nhau

1.2.3 Phương pháp phổ hồng ngoại (IR)

Trong số các phương pháp phân tích cấu trúc, phổ hồng ngoại cho nhiều thông tin quan trọng về cấu trúc của hợp chất

Bức xạ hồng ngoại bao gồm một phần của phổ điện từ, đó là vùng bước sóng khoảng 10-4 đến 10-6 m Nó nằm giữa vi sóng và ánh sáng khả kiến Phần của vùng hồng ngoại được sử dụng nhiều nhất để xác định cấu trúc nằm trong giữa 2,5x10-4 và 16x10-6 m Đại lượng được sử dụng nhiều trong phổ hồng ngoại là số sóng (cm-1), ưu điểm của việc dùng số sóng là là chúng tỷ lệ thuận với năng lượng [9-11]

Khi chiếu các bức xạ hồng ngoại vào phân tử các hợp chất, bức xạ hồng ngoại sẽ kích thích phân tử từ trạng thái dao động cơ bản lên trạng thái dao động cao hơn Có 2 lại dao động khi phân tử bị kích thích là dao động hóa trị

và biến dạng, dao động hóa trị (ν) là dao động làm thay đổi độ dài liên kết, dao động biến dạng (δ) là dao động làm thay đổi góc liên kết

Đường cong biểu diễn cường độ hấp thụ với số sóng của bức xạ hồng ngoại được gọi là phổ hồng ngoại, trên phổ biểu diễn các cực đại hấp thụ ứng với những dao động đặc trưng của nhóm nguyên tử hay liên kết nhất định, (Hình 1.1)

Hình 1.3 Phổ hồng ngoại của benzyl ancol

Căn cứ vào phổ hồng ngoại đo được đối chiếu với các dao động đặc trưng của các liên kết, ta có thể nhận ra sự có mặt của các liên kết trong phân

tử Một phân tử có thể có nhiều dao động khác nhau và phổ hồng ngoại của các phân tử khác nhau thì khác nhau, tương tự như sự khác nhau của các vân

ngón tay Sự chồng khít lên nhau của phổ hồng ngoại thường được làm dẫn chứng cho hai hợp chất giống nhau.

Khi sử dụng phổ hồng ngoại để xác định cấu trúc, thông tin thu được chủ yếu là xác định các nhóm chức hữu cơ và những liên kết đặc trưng Các pic nằm trong vùng từ 4000 – 1600 cm-1 thường được quan tâm đặc biệt, vì vùng này chứa các dải hấp thụ của các nhóm chức, như OH, NH, C=O, C≡N… nên được gọi là vùng nhóm chức Vùng phổ từ 1300 – 626 cm-1 phức tạp hơn và thường được dùng để nhận dạng toàn phân tử hơn là để xác định nhóm chức Chính ở đây các dạng pic thay đổi nhiều nhất từ hợp chất này đến hợp chất khác, vì thế vùng phổ từ 1500 cm-1 được gọi là vùng vân ngón tay

1.2.4 Phương pháp xác định độ ẩm ( theo Karl Fischer)

- Phương pháp chung:

- Chiết phần mẫu thử bằng metanol khô ở 65 oC (nhiệt độ sôi) bằng cách cho hồi lưu để loại nước Để nguội rồi chuẩn độ phần dịch lỏng của dịch chiết được giữ lại trong thiết bị Karl Fischer cho đến khi đạt được điểm kết thúc chuẩn độ theo phương pháp chuẩn độ ampe với hai điện cực chỉ thị

Điểm kết thúc phản ứng thu được bằng phép đo điện đối với iot dư

- Thuốc thử và vật liệu thử

Chỉ sử dụng các thuốc thử tinh khiết phân tích và nước được sử dụng phải là nước cất hoặc nước đã khử khoáng có độ tinh khiết tương đương

CHƯƠNG 2 THỰC NGHIỆM

2.1.Hóa chất và thiết bị

2.1.1.Hóa chất và dung môi

Các hoá chất dùng cho tổng hợp hữu cơ và dung môi được mua của hãng Merck, hãng Sigma Aldrich và hãng Fluka và thuộc loại phân tích dùng cho phân tích

Bột silicagel cho sắc ký cột 100 – 200 mesh (Merck), bản mỏng sắc ký silicagel đế nhôm Art 5554 DC – Alufolien Kiesel 60F254(Merck)

- Phổ hồng ngoại (IR)

Phổ IR của các chất nghiên cứu được ghi trên máy Impact 410 – Nicolet, tại phòng thí nghiệm Phổ hồng ngoại Viện Hóa học – Viện Hàn Lâm Khoa học & Công nghệ Việt Nam, đo ở dạng ép viên với KBr rắn

- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)

Phổ 1H-NMR (500MHz) và 13C-NMR (125MHz) của các chất nghiên cứu được đo trên máy Bruker XL-500 tần số 500MHz với dung môi DMSO

và TMS là chất chuẩn, tại phòng Phổ cộng hưởng từ hạt nhân – Viện Hóa học – Viện Hàn Lâm Khoa học & Công nghệ Việt Nam

- Phổ khối lượng (MS)

Phổ khối của các chất nghiên cứu được ghi trên LC – MSD – Trap – SL tại phòng Cấu trúc, Viện Hóa học – Viện Hàn Lâm Khoa học & Công nghệ Việt Nam

2.1.3 Xác định cấu trúc, định tính phản ứng và kiểm tra độ tinh khiết của các sản phẩm tổng hợp được

Cấu trúc của các sản phẩm phản ứng được xác định nhờ các phương pháp phổ khối lượng (MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR, 13C-NMR,phổ hồng ngoại ( IR)

Các sản phẩm phản ứng được kiểm tra độ sạch bằng các phương pháp sắc kí lớp mỏng, sắc khí lỏng ghép nối khối phổ (LC/MS)

Sắc kí lớp mỏng (SKLM) được sử dụng để định tính chất đầu và sản phẩm Thông thường chất đầu và sản phẩm có giá trị Rf khác nhau, màu sắc

và sự phát quang khác nhau Dùng sắc kí lớp mỏng để biết được phản ứng đã xảy ra hay không xảy ra, phản ứng đã kết thúc hay chưa kết thúc là dựa vào các vết trên bản mỏng, cùng các giá trị Rf tương ứng Giá trị Rf của các chất phụ thuộc vào bản chất và phụ thuộc vào dung môi làm pha động Dựa trên tính chất đó, chúng ta có thể tìm được dung môi hay hỗn hợp dung môi để tách các chất ra xa nhau (Rf khác xa nhau) hay tìm được hệ dung môi cần thiết

để tinh chế các chất

2.2.Tổng hợp Glibenclamide

2.2.1 Tổng hợp 5-chloro-2-methoxybenzoyl chloride

Hoà tan 10g (53,76mmol) 5-chloro-2-methoxybenzoic acid trong 200 ml CHCl3 Hỗn hợp này được làm lạnh xuống 00C, sau đó nhỏ giọt từ từ (12,69g, 107,52 mmol) SOCl2 Sau khi kết thúc nhỏ giọt, phản ứng được khuấy ở nhiệt

độ 250C, trong khoảng 8h Kết thúc phản ứng, hỗn hợp được làm nguội, cất loại dung môi và SOCl2 rồi thêm dần 300ml nước và chiết với CH2Cl2 Pha hữu cơ được rửa với nước cho đến môi trường trung tính, làm khan bằng MgSO4, cất loại dung môi dưới áp suất giảm nhận được sản phẩm thô Sản phẩm thô được làm sạch bằng sắc ký cột silicagel với hệ dung môi rửa giải

Hexan:EtOAc (7:3) thu được 9,4g chất 2 với hiệu suất 85,71%, và làm ngay

bước tiếp theo mà không cần phải tinh chế

2.2.2 Tổng hợp chất trung gian(4)

Hoà tan 10g (49,03mmol) chất 2 và (7,07ml) pyridin trong dung môi

dichloromethan, sau đó làm lạnh đến 00C và cho (9,8g)

4-(2-aminoethyl)benzenesulfonamide (3) vào hỗn hợp phản ứng Phản ứng được

tiến hành khuấy ở nhiệt độ 600C, trong khoảng 8h Khi kết thúc phản ứng, hỗn hợp được thêm 500ml nước rồi chiết với dichloroethan Pha hữu cơ được rửa bằng nước, làm khan bằng MgSO4, cất loại dung môi dưới áp suất giảm

nhận được sảnphẩm thô Sản phẩm thô được làm sạch bằng sắc ký cột silica

gel với hệ dung môi rửa giải Hexan:EtOAc (6:4) thu được 16,2g chất 4 với hiệu suất 90%

1 H-NMR (500MHz, DMSO): δ (ppm) 8,25 (1H, m, N-H); 7,76 (2H, d,

J=8,5Hz, H-9 và H-13); 7,64 (1H, d, J=3Hz, H-18); 7,51-7,48 (1H, dd, J=3Hz

và 9Hz, H-20); 7,45 (2H, d, J=8,5Hz, H-10 và 12); 7,28 (2H, bs, NH2); 7,16 (1H, d, J=9Hz, H-21); 3,81 (3H, s, OMe); 3,55-3,51 (2H, m, H-15); 2,93-2,90 (2H, m, H-14)

13 C-NMR (500MHz, DMSO): δ (ppm) 163,56 (C-9); 155,65 (C-15);

143,58 (C-4); 142,09 (C-1); 131,45 (C-13); 129,45 (C-11); 129,12(C-3 và 5); 125,65 (C-2 và 6); 124,79 (C-12); 124,29 (C-10); 114,13 (C-14); 56,23 (OMe); 54,83 (C-8); 34,55 (C-7)

S O O

H N

16

15 14 13 12

11 10 9 8 7

6 5 4 3

2 1

H N O

Cho 1 g (2,72mmol) chất 4 và (0,11g) Na2CO3 trong 10 ml dung môi aceton, (0,34g) cyclohexyl isocyanat được thêm vào ở 250C, sau đó, phản ứng được khuấy ở nhiệt độ phòng, trong 36h Kết thúc phản ứng hỗn hợp được thêm 50ml nước cất rồi chiết với CHCl3 Pha hữu cơ được làm khan bằng MgSO4, cất loại dung môi dưới áp suất giảm, nhận được sản phẩm thô 5 (1,1g) với hiệu suất 82,11%

Sản phẩm là chất rắn màu trắng, điểm chảy: 169-1700C

1 H-NMR (500MHz, MeOD): δ (ppm) 7,93 (2H, d, J=8,5Hz, H-2 và

H6); 7,83 (1H, d, J=2,5Hz, H-11); 7,52 (2H, d, J=8,5Hz, H-3 và H-5); 7,47 (1H, dd, J=9Hz và 2,5Hz, H-13); 7,11 (1H, d, J=9Hz, H-14); 3,85 (3H, s, OMe); 3,72 (2H, t, J=14Hz, H-8); 3,05 (2H, t, J= 7Hz, H-7); 3,43-3,42( 1H, m); 1,78-1,17 (10H, m, H-1, 2, 3, 4, 5, 6 vùng no)

13 C-NMR (500MHz, MeOD): δ (ppm) 166,6 (C-7); 159,9 (C-16); 157,7

(C-22); 144,1 (C-11); 133,4 (C-8); 131,5 (C-20); 129,9 (C-10 và 12); 128,1 (C-9, 13 và 18); 127,1 (C-19); 124,8 (C-17); 114,8 (C-21); 57,1 (OCH3); 41,8 (C-1); 36,0 (C-15); 34,7 (C-4); 26,7 (C-2); 26,7 (C-6); 26 (C-3); 25,9 (C-5)

b Chuẩnbị mẫu phân tích:

Áp dụng công thức:

% 100 10

40

P1 = 0.4092 P4 = 0.4052 P7 = 0.4021