Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của vi khuẩn escherichia coli gây tiêu chảy ở lợn con dưới 2 tháng tuổi nuôi tại huyện hữu lũng tỉnh lạng sơn và biện pháp điều trị

coli từ các mẫu phân lợn bị bệnh phù đầu ở 2 tỉnh Bắc Giang và Thái Nguyên, đã thông báo có 100% mẫu phân của lợn bị tiêu chảy và phù đầu phân lập được vi khuẩn E.. Xuất phát từ những v

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

–––––––––––––––––––

HOÀNG THỊ NHUNG

NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA

VI KHUẨN ESCHERICHIA COLI (E COLI) GÂY TIÊU CHẢY

Ở LỢN CON DƯỚI 2 THÁNG TUỔI TẠI HUYỆN HỮU LŨNG

TỈNH LẠNG SƠN VÀ BIỆN PHÁP ĐIỀU TRỊ

LUẬN VĂN THẠC SĨ THÚ Y

THÁI NGUYÊN - 2016

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

–––––––––––––––––––

HOÀNG THỊ NHUNG

NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA

VI KHUẨN ESCHERICHIA COLI (E COLI) GÂY TIÊU CHẢY

Ở LỢN CON DƯỚI 2 THÁNG TUỔI TẠI HUYỆN HỮU LŨNG

TỈNH LẠNG SƠN VÀ BIỆN PHÁP ĐIỀU TRỊ

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan rằng số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là trung thực và chưa hề được sử dụng để bảo vệ một học vị nào

Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn này đã được cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn đều đã được chỉ rõ nguồn gốc

Tác giả

Hoàng Thị Nhung

Giảng viên hướng dẫn khoa học: GS TS Nguyễn Quang Tuyên đã trực tiếp

hướng dẫn, chỉ bảo tôi hết sức tận tình trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành Luận văn

Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban Giám hiệu, Phòng Đào tạo, Ban chủ nhiệm khoa và các thầy cô giáo Khoa Chăn nuôi Thú y- Trường Đại học Nông lâm - Đại học Thái Nguyên đã tạo điều kiện và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập

Tôi cũng xin trân trọng cảm ơn các hộ gia đình nuôi lợn, các thú y viên tại một

số xã huyện Hữu Lũng tỉnh Lạng Sơn và các đồng nghiệp trong ngành đã giúp tôi trong quá trình thực hiện đề tài

Cuối cùng tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc về sự ủng hộ, động viên, giúp đỡ của gia đình, bạn bè và đồng nghiệp trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu và hoàn thành tốt luận văn này

Hữu Lũng, tháng 9 năm 2016

Tác giả

Hoàng Thị Nhung

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC CÁC BẢNG vi

DANH MỤC CÁC HÌNH vii

MỞ ĐẦU 1

1 Tính cấp thiết của đề tài 1

2 Mục tiêu nghiên cứu 2

3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 3

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 Một số hiểu biết chung về hội chứng tiêu chảy 4

1.1.1 Khái niệm về hội chứng tiêu chảy 4

1.1.2 Đặc điểm sinh lý tiêu hóa của lợn con 4

1.1.3 Một số nguyên nhân gây tiêu chảy ở lợn 6

1.1.4 Bệnh lý lâm sàng của hội chứng tiêu chảy 9

1.1.5 Một số đặc điểm dịch tễ hội chứng tiêu chảy 10

1.1.6 Biện pháp phòng trị tiêu chảy cho lợn 10

1.2 Một số nghiên cứu về vi khuẩn E coli gây bệnh đường tiêu hoá 12

1.2.1 Đặc điểm hình thái, cấu trúc của vi khuẩn E coli 13

1.2.2 Đặc tính nuôi cấy, sinh vật, hoá học 15

1.2.3 Đặc tính gây bệnh của vi khuẩn E coli 16

1.2.4 Khả năng mẫn cảm với kháng sinh của vi khuẩn E coli 18

1.3 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước về vai trò của vi khuẩn E coli trong hội chứng tiêu chảy 19

1.3.1 Những nghiên cứu trong nước 19

1.3.2 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 20

Chương 2: ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG, NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23

2.1 Đối tượng 23

2.1.1 Địa điểm nghiên cứu 23

2.1.2 Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 9/2015 đến tháng 9/2016 23

2.2 Nội dung 23

2.2.1 Nghiên cứu một số đặc điểm dịch tễ của hội chứng tiêu chảy ở lợn con dưới 2 tháng tuổi tại một số xã của huyện Hữu Lũng 23

2.2.2 Phân lập và xác định một số đặc điểm sinh học của vi khuẩn E coli phân lập được 23

2.2.3 Thử nghiệm phác đồ điều trị bệnh tiêu chảy ở lợn con 24

2.3 Nguyên vật liệu 24

2.3.1 Mẫu bệnh phẩm 24

2.3.2 Các loại môi trường, hoá chất 24

2.3.3 Động vật thí nghiệm 24

2.4 Phương pháp nghiên cứu 24

2.4.1 Phương pháp nghiên cứu dịch tễ 24

2.4.2 Thu thập mẫu và phân lập vi khuẩn 27

2.4.3 Phương pháp xác định đặc tính sinh hoá của vi khuẩn E coli 30

2.4.4 Xác định số lượng vi khuẩn E coli trong 1 gam phân lợn tiêu chảy và lợn bình thường 32

2.4.5 Phương pháp xác định serotype kháng nguyên O của các chủng vi khuẩn E coli phân lập được 33

2.4.6 Phương pháp xác định khả năng mẫn cảm với kháng sinh của các chủng vi khuẩn E coli phân lập được 33

2.4.7 Xác định các yếu tố gây bệnh (độc tố và yếu tố bám dính) của vi khuẩn E coli bằng phản ứng PCR (Polymerase Chain Reaction) 35

2.4.8 Xây dựng phác đồ điều trị tiêu chảy ở lợn con dưới 2 tháng tuổi 36

2.4.9 Phương pháp xử lý số liệu 36

Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 37

3.1 Kết quả nghiên cứu một số đặc điểm dịch tễ hội chứng tiêu chảy ở lợn con dưới 2 tháng tuổi tại huyện Hữu Lũng 37

3.1.1 Tỷ lệ lợn con dưới 2 tháng tuổi mắc tiêu chảy và chết tại một số xã của

huyện Hữu Lũng 37

3.1.2 Tỷ lệ lợn con dưới 2 tháng tuổi mắc tiêu chảy và chết theo mùa vụ tại một số xã của huyện Hữu Lũng 39

3.1.3 Tỷ lệ lợn con dưới 2 tháng tuổi mắc tiêu chảy và chết theo phương thức chăn nuôi tại một số xã của huyện Hữu Lũng 43

3.1.4 Tỷ lệ lợn con dưới 2 tháng tuổi mắc tiêu chảy và chết theo lứa tuổi tại một số xã của huyện Hữu Lũng 46

3.2 Kết quả nghiên cứu xác định vai trò của vi khuẩn E coli trong hội chứng tiêu chảy ở lợn con dưới 2 tháng tuổi 51

3.2.1 Kết quả xác định số lượng vi khuẩn E coli có trong phân của lợn tiêu chảy và lợn bình thường 51

3.2.2 Kết quả phân lập vi khuẩn E coli từ các mẫu phân và phủ tạng lợn con tiêu chảy tại huyện Hữu Lũng 54

3.2.3 Kết quả giám định một số đặc tính sinh học của các chủng vi khuẩn E coli phân lập được 55

3.2.4 Kết quả xác định serotype kháng nguyên O của các chủng vi khuẩn E coli phân lập được 56

3.2.5 Kết quả kiểm tra độc lực của một số chủng vi khuẩn E coli trên chuột bạch 58

3.2.6 Kết quả xác định các yếu tố gây bệnh (độc tố và yếu tố bám dính) của vi khuẩn E coli phân lập được 59

3.2.7 Kết quả xác định khả năng mẫn cảm với kháng sinh của các chủng vi khuẩn E coli phân lập được 63

3.2 Kết quả thử nghiệm phác đồ điều trị bệnh tiêu chảy ở lợn con dưới 2 tháng tuổi ở huyện Hữu Lũng 66

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 71

1 Kết luận 71

2 Đề nghị 72

TÀI LIỆU THAM KHẢO 73

MỘT SỐ HÌNH ẢNH MINH HỌA CHO ĐỀ TÀI 82

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1 Tiêu chuẩn đánh giá mức độ mẫn cảm và kháng kháng sinh theo

NCCLS (1999) 34

Bảng 3.1 Tỷ lệ lợn con tiêu chảy và chết do tiêu chảy tại một số xã 37

Bảng 3.2 So sánh nguy cơ mắc tiêu chảy ở lợn giữa các xã 39

Bảng 3.3 Tỷ lệ lợn con mắc tiêu chảy và chết theo mùa vụ 40

Bảng 3.4 So sánh nguy cơ lợn mắc tiêu chảy giữa các mùa 42

Bảng 3.5 Tỷ lệ lợn con tiêu chảy và chết do tiêu chảy theo phương thức chăn nuôi 43

Bảng 3.6 So sánh nguy cơ lợn tiêu chảy theo phương thức chăn nuôi 45

Bảng 3.7 Tỷ lệ lợn con mắc tiêu chảy và chết theo lứa tuổi 46

Bảng 3.8 So sánh nguy cơ mắc tiêu chảy giữa các lứa tuổi lợn 49

Bảng 3.9 Tổng hợp các triệu chứng ở lợn con mắc tiêu chảy 49

Bảng 3.10 Kết quả xác định số lượng vi khuẩn E coli có trong 1 gam phân của lợn bị tiêu chảy và lợn khỏe mạnh bình thường 52

Bảng 3.11 Kết quả phân lập vi khuẩn E coli từ các mẫu phân và phủ tạng lợn con tiêu chảy (n=189) 54

Bảng 3.12 Kết quả giám định một số đặc tính sinh học của các chủng vi khuẩn E coli phân lập được 55

Bảng 3.13 Kết quả xác định serotype kháng nguyên O của các chủng vi khuẩn E coli phân lập được 56

Bảng 3.14 Kết quả kiểm tra độc lực của một số chủng vi khuẩn E coli trên chuột bạch 59

Bảng 3.15 Kết quả xác định tỷ lệ các chủng vi khuẩn E coli mang gen quy định sinh tổng hợp các yếu tố gây bệnh 60

Bảng 3.16 Kết quả xác định tính mẫn cảm với kháng sinh của các chủng vi khuẩn E coli phân lập được 63

Bảng 3.17 Kết quả điều trị thực nghiệm phác đồ điều trị bệnh tiêu chảy cho lợn con 67

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 3.1 Biểu đồ về tỷ lệ lợn con tiêu chảy và chết do tiêu chảy tại một số xã

huyện Hữu Lũng, tỉnh Lạng Sơn 38

Hình 3.2 Biểu đồ tỷ lệ lợn con mắc tiêu chảy và chết do tiêu chảy theo mùa vụ 41

Hình 3.3 Biểu đồ tỷ lệ lợn con tiêu chảy và chết do tiêu chảy theo phương thức chăn nuôi 45

Hình 3.4 Biểu đồ tỷ lệ lợn con mắc tiêu chảy và chết theo lứa tuổi 48

Hình 3.5 Kết quả xác định gen yếu tố bám dính 62

Hình 3.6 Kết quả xác định gen độc tố 62

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài

Hữu Lũng là huyện chăn nuôi khá phát triển đem lại nguồn thu nhập cao cho nhiều hộ gia đình Theo báo cáo thống kê chăn nuôi năm 2015 của Chi cục thống kê tổng đàn lợn của huyện có 58.610 con; trong đó, đàn lợn nái là 6.627con

và đàn lợn thịt là 53.958 con Trên địa bàn huyện có 50 gia trại chăn nuôi lợn tập trung với quy mô trang trại 20 nái và 100 lợn thịt trở lên Đây thực sự là một bước tiến mới trong chăn nuôi lợn của huyện, góp phần phát triển chăn nuôi lợn bền vững, tạo ra sản phẩm an toàn có sức cạnh tranh cao trên thị trường

Tuy nhiên, song song với sự phát triển chăn nuôi thì tình hình dịch bệnh cũng đang diễn biến hết sức phức tạp, hàng năm làm chết nhiều đầu lợn của tỉnh Theo báo cáo dịch tễ của Trạm Thú y Hữu Lũng năm 2013 có 18.971 con lợn bị ốm và 1.628 con chết; năm 2014 có 28.852 con lợn bị ốm và 2.145 con chết, năm 2015

có 31.519 c o n l ợ n b ị ố m gây thiệt hại lớn về kinh tế Ngoài những bệnh truyền nhiễm nguy hiểm như dịch tả, tai xanh, lở mồm long móng…thì hội chứng tiêu chảy ở lợn con dưới 2 tháng tuổi cũng thường gặp trên địa bàn huyện, trong đó vi

khuẩn Escherichia coli (E coli) được đánh giá là nguyên nhân gây bệnh phổ biến

và quan trọng nhất

Theo Cù Hữu Phú và cs (1999) [40] khi tiến hành phân lập vi khuẩn E coli

từ các mẫu phân của lợn từ 35 ngày đến 4 tháng tuổi bị tiêu chảy đã xác định

được 60/70 mẫu có vi khuẩn E coli, chiếm tỷ lệ 85,71% Lý Thị Liên Khai (2001) [27] cũng phân lập được 42 mẫu phân có vi khuẩn E coli trong tổng số 50

mẫu phân lợn con bị tiêu chảy, chiếm tỷ lệ 84% Trịnh Quang Tuyên và cs

(2004) [62] khi tiến hành phân lập vi khuẩn E coli từ các mẫu phân của lợn bị tiêu chảy, đã xác định được 259/325 mẫu có vi khuẩn E coli chiếm tỷ lệ 79,69% Trong khi

đó, Nguyễn Thị Kim Lan (2004) [28] phân lập E coli từ các mẫu phân lợn bị bệnh

phù đầu ở 2 tỉnh Bắc Giang và Thái Nguyên, đã thông báo có 100% mẫu phân

của lợn bị tiêu chảy và phù đầu phân lập được vi khuẩn E coli

Bệnh tiêu chảy ở lợn con theo mẹ xảy ra quanh năm, nhưng cao nhất từ tháng 5 đến tháng 8 (Hoàng Văn Tuấn và cs 1998) [60] Trong năm, lợn nuôi ở

mùa xuân và mùa hè mắc tiêu chảy cao hơn so với hai mùa còn lại (Nguyễn Thị Kim Lan và cs, 2006) [29] Đặc biệt lợn con thường bị tiêu chảy khi thời tiết thay đổi đột ngột (lạnh, ẩm, mưa phùn…) kết hợp với điều kiện chăm sóc nuôi dưỡng không đảm bảo vệ sinh; lợn bị ảnh hưởng bởi các yếu tố stress; lợn con sinh

ra không được bú sữa kịp thời hoặc do sữa đầu của lợn mẹ thiếu, không đảm bảo chất lượng dinh dưỡng

Tổng hợp báo cáo dịch tễ hàng năm của Trạm thú y huyện, cho thấy bệnh tiêu chảy ở lợn hai năm 2014 và 2015 xảy ra phổ biến chiếm tỷ lệ 70% so với tổng

số các ca bệnh thường gặp ở lợn, riêng năm 2014 số lợn mắc bệnh tiêu chảy là 22.416 con/28.852 con mắc các ca bệnh thông thường (chiếm tỷ lệ 77%), năm

2015 số lợn mắc bệnh tiêu chảy là 23.580 con/31.519 con mắc bệnh thông thường (chiếm tỷ lệ 74%) Khi áp dụng các phác đồ điều trị bệnh tiêu chảy ở lợn do tính kháng thuốc của vi khuẩn cao nên kết quả điều trị rất thấp

Vì vậy, việc nghiên cứu vi khuẩn E coli, tỷ lệ nhiễm và một số đặc tính

sinh học cũng như vai trò gây bệnh của chúng là việc làm cần thiết, để từ đó có

cơ sở xây dựng biện pháp phòng, trị bệnh đạt hiệu quả cao, góp phần thúc đẩy chăn nuôi nói chung, chăn nuôi lợn nói riêng phát triển bền vững, tạo ra sản phẩm an toàn vệ sinh thực phẩm, có sức cạnh tranh cao trên thị trường

Xuất phát từ những vấn đề trên, tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên

cứu một số đặc điểm sinh học của vi khuẩn Escherichia coli gây tiêu chảy ở lợn con dưới 2 tháng tuổi nuôi tại huyện Hữu Lũng tỉnh Lạng Sơn và biện pháp điều trị” nhằm có những hiểu biết sâu hơn và giảm thiểu thiệt hại do tiêu chảy gây

ra cho lợn con, góp phần tăng thu nhập cho người chăn nuôi

2 Mục tiêu nghiên cứu

- Nghiên cứu đặc điểm dịch tễ của hội chứng tiêu chảy ở lợn con dưới 2 tháng tuổi tại một số xã thuộc huyện Hữu Lũng

- Phân lập và xác định một số đặc điểm sinh học và các yêu tố gây bệnh của

vi khuẩn E coli gây bệnh tiêu chảy ở lợn con dưới hai tháng tuổi tại một số xã

thuộc huyện Hữu Lũng

- Xây dựng và đề xuất phác đồ điều trị bệnh tiêu chảy ở lợn con đạt hiệu quả cao

3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

3.1 Ý nghĩa khoa học

Bổ sung thêm những hiểu biết khoa học cơ bản về đặc điểm dịch tễ học của

vi khuẩn E coli gây bệnh tiêu chảy ở lợn con dưới 2 tháng tuổi tại huyện Hữu Lũng

tỉnh Lạng Sơn

Kết quả nghiên cứu của đề tài sẽ là cơ sở khoa học phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo như phục vụ cho công tác bào chế các chế phẩm sinh học phòng bệnh (vắc xin, kháng thể…), đồng thời đóng góp thêm tư liệu tham khảo cho nghiên cứu và giảng dạy, cho cán bộ thú y cơ sở và người chăn nuôi

3.2 Ý nghĩa thực tiễn

Kết quả nghiên cứu phác đồ điều trị bệnh tiêu chảy ở lợn con có hiệu quả cao sẽ giúp cho thú y cơ sở, người chăn nuôi trong phòng, trị bệnh góp phần giảm thiệt hại và tăng thu nhập trong chăn nuôi lợn

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Một số hiểu biết chung về hội chứng tiêu chảy

1.1.1 Khái niệm về hội chứng tiêu chảy

Tiêu chảy là thuật ngữ để chỉ hiện tượng đại tiện phân lỏng, được mô tả phân lỏng, nhiều nước hoặc có máu, mủ

Tiêu chảy là biểu hiện lâm sàng của quá trình bệnh lý ở đường tiêu hóa,

là hiện tượng con vật đi ỉa nhanh, nhiều lần trong ngày, phân có nhiều nước do rối loạn chức năng tiêu hóa, ruột tăng cường co bóp và tiết dịch (Phạm Ngọc Thạch, 1996) [51] Hoặc chỉ phản ánh đơn thuần sự thay đổi tạm thời của phân gia súc bình thường khi gia súc đang thích ứng với những thay đổi trong khẩu phần ăn Tiêu chảy xảy ra ở nhiều bệnh và bản thân nó không phải là bệnh đặc thù (Arche H., 2000) [1]

Tuỳ theo đặc điểm, tính chất, diễn biến bệnh, hoặc loài gia súc, hoặc nguyên nhân chính gây bệnh mà hội chứng tiêu chảy được gọi bằng tên khác nhau như bệnh xảy ra đối với gia súc non theo mẹ, gọi là bệnh lợn con ỉa phân trắng, hay

bê nghé ỉa phân trắng,… còn ở gia súc sau cai sữa là chứng khó tiêu, chứng rối loạn tiêu hoá, hoặc hội chứng rối loạn tiêu hoá Nếu xét về nguyên nhân chính

gây bệnh thì có các tên gọi như bệnh Colibacillosis do vi khuẩn E coli gây ra, bệnh phó thương hàn lợn do vi khuẩn samonella cholerae suis gây ra, bệnh viêm

dạ dày ruột truyền nhiễm (TGE) do Coronavirus gây ra …

Thực chất tiêu chảy là một phản ứng tự vệ của cơ thể nhưng khi cơ thể tiêu chảy nhiều lần trong ngày (5 đến 6 lần trở lên) và nước trong phân từ 75% trở lên gọi là hiện tượng tiêu chảy Tiêu chảy do nhiều nguyên nhân gây ra đồ ng thời nên gọi là hội chứng tiêu chảy Cho dù do bất cứ nguyên nhân nào dẫn đến tiêu chảy thì hậu quả nghiêm trọng là mất nước, mất chất điện giải và kiệt sức, những gia súc khỏi thường bị còi cọc, thiếu máu, chậm lớn Đặc biệt khi gia súc bị tiêu chảy nặng kèm theo hiện tượng viêm nhiễm, tổn thương thực thể đường tiêu hóa dẫn đến gia súc có thể bị chết với tỷ lệ cao nên gây thiệt hại lớn về kinh tế

1.1.2 Đặc điểm sinh lý tiêu hóa của lợn con

1.1.2.1 Đă ̣c điểm tiêu hóa của lợn con

Ở gia súc non sau khi sinh ra, chức năng của các cơ quan trong cơ thể nhất là

cơ quan tiêu hóa chưa hoàn chỉnh, nồng độ HCl và các men tiêu hóa chưa đảm

nhiệm đầy đủ chức năng tiêu hóa, rất dễ gây rối loạn trao đổi chất, hậu quả dễ nhận biết là rối loạn tiêu hóa, gây ra tiêu chảy, còi cọc, thiếu máu, chậm lớn Trong dịch vị của gia súc non chưa có đủ axit HCl tự do nên không hoạt hóa được men pepsin vì vậy không tiêu hóa hết sữa mẹ, trong khi đó sữa mẹ lại là môi trường phát triển tốt của nhiều loại vi khuẩn

Cù Xuân Dần và cs (1996) [7] cho rằng trong dịch vị của lợn con dưới 1 tháng tuổi không có HCl tự do, vì lúc này axit tiết ra ít và nhanh chóng liên kết với dịch nhầy Do vậy, vi sinh vật có điều kiện phát triển và gây bệnh viêm dạ dày, viêm ruột ở lợn con

Ở lợn con có giai đoạn không có HCl trong dạ dày, đây đượ c coi là giai đoạn thích ứng cần thiết tự nhiên Chính nhờ sự thích ứng này, cơ thể lợn con mới có khả năng hấp thu được kháng thể miễn dịch qua sữa đầu Trong giai đoạn này thì dịch vị lại không có hoạt tính phân giải protein mà chỉ có hoạt tính làm vón sữa đầu và vữa nên alblumin và globulin được chuyển xuống ruột và thẩm thấu vào máu , nhưng khi lợn trên 15 ngày tuổi tình trạng thiếu HCl ở dạ dày không còn là sự cần thiết sinh lý bình thường nữa Việc tập ăn cho lợn con sớm và cai sữa sớm đã rút ngắn được giai đoạn thiếu HCl, hoạt hóa hoạt động tiết dịch, giúp tăng khả năng tạo các đáp ứng miễn dịch của cơ thể

1.1.2.2 Khả năng đáp ứng miễn dịch của lợn con

Là khả năng của cơ thể đáp ứng lại các kích thích của mầm bệnh khi xâm nhập vào cơ thể Ở gia súc non, mầ m bệnh có nhiều thuận lợi khi xâm nhập vào cơ thể Trong hệ thống tiêu hóa của lợn con lượng enzym tiêu hóa và lượng HCl tiết ra còn ít nên chưa đủ để đáp ứng cho quá trình tiêu hóa, gây rối loạn trao đổi chất, tiêu

hóa kém, hấp thu kém Chính vì vậy, ở giai đoạn này mầm bệnh như salmonella,

E coli dễ dàng xâm nhập vào cơ thể qua đường tiêu hóa và gây bệnh cho lợn con

Ngoài ra, ở gia súc non các yếu tố miễn dịch không đặc hiệu như bổ thể, protein liên kết, lysozym được tổng hợp còn ít, phản ứng của đại thực bào rất yếu, vì thế

ở gia súc non không những chưa có kháng thể đặc hiệu mà kháng thể không đặc hiệu cũng rất yếu Chính vì vậy lợn con bú sữa đầu là rất cần thiết để tăng sức bảo vệ cơ thể chống lại mầm bệnh

Theo Lê Văn Dương (2010) [11] do cấu tạo đặc biệt của gia súc non nên tiêu chảy thường xảy ra ở giai đoạn lợn con tập ăn và cai sữa Bên cạnh đó còn một yếu

tố quan trọng nữa là sự phát triển của hệ vi sinh trong đường ruột của gia súc non,

việc cân bằng hệ vi sinh vật có lợi trong đường ruột như thế nào để khắc phục, hạn chế sự loạn khuẩn trong quá trình phát triển và trưởng thành của cơ thể gia súc non

là rất quan trọng Để nuôi dưỡng tốt và hạn chế được hội chứng tiêu chảy ở lợn con cần được tiêm phòng cho mẹ và tạo cho gia súc non điều kiện sống tốt, tránh các yếu tố bất lợi tác động vào cơ thể như chế độ ăn, khẩu phần thức ăn không đảm bảo dinh dưỡng, ăn không đúng giờ, thời tiết thay đổi đột ngột, chế độ chăm sóc không thích hợp sẽ tạo điều kiện cho mầm bệnh xâm nhập vào cơ thể gây bệnh

1.1.3 Một số nguyên nhân gây tiêu chảy ở lợn

Theo Lê Minh Chí (1995) [5], Phạm Ngọc Thạch (1996) [51] tiêu chảy là một hiện tượng bệnh lý có liên quan đến nhiều yếu tố, có yếu tố là nguyên nhân nguyên phát, có yếu tố là nguyên nhân thứ phát Vì vậy việc phân biệt rạch ròi giữa các nguyên nhân gây tiêu chảy là rất khó khăn

Phạm Sỹ Lăng (2009) [31] tiêu chảy ở lợn là biểu hiện lâm sàng của nhiều tác nhân gây bệnh khác nhau như vi rút, vi khuẩn, ký sinh trùng, thời tiết, môi trường ngoại cảnh, độc tố

1.1.3.1 Do môi trường ngoại cảnh

Môi trường ngoại cảnh bao gồm các yếu tố như ẩm độ, nhiệt độ, thức ăn, nước uống, các điều kiện về chăm sóc nuôi dưỡng, vệ sinh chuồng trại, sự di chuyển…

Môi trường ngoại cảnh là một trong 3 yếu tố cơ bản gây bệnh dịch, mối quan

hệ giữa Cơ thể - Mầm bệnh - Môi trường là nguyên nhân của sự không ổn định sức khoẻ, đưa đến phát sinh bệnh (Nguyễn Như Thanh, 2001) [53]

Khi gặp điều kiện ngoại cảnh không thuận lợi, thay đổi đột ngột về thức

ăn, vitamin, protein, thời tiết, vận chuyển… làm giảm sức đề kháng của con vật, vi khuẩn thường trực sẽ tăng độ độc và gây bệnh (Bùi Quý Huy, 2003) [25]

Như vậy, nguyên nhân môi trường ngoại cảnh gây bệnh tiêu chảy không mang tính đặc hiệu mà mang tính tổng hợp Thời tiết lạnh và ẩm gây rối loạn hệ thống điều hoà trao đổi nhiệt của cơ thể lợn, dẫn đến rối loạn quá trình trao đổi chất, làm giảm sức đề kháng của cơ thể, từ đó các mầm bệnh trong đường tiêu hoá

có thời cơ tăng cường độc lực và gây bệnh

1.1.3.2 Nguyên nhân do vi sinh vật

Vi sinh vật bao gồm các loại vi khuẩn, vi rút, nấm mốc chúng vừa là nguyên nhân nguyên phát, cũng vừa là nguyên nhân thứ phát gây tiêu chảy

* Tiêu chảy do vi khuẩn

Trong đường tiêu hoá của gia súc có hệ vi khuẩn gọi là hệ vi khuẩn đường ruột, được chia thành 2 loại, trong đó vi khuẩn có lợi lên men phân giải các chất dinh dưỡng, giúp cho quá trình tiêu hoá được thuận lợi và vi khuẩn có hại, khi có điều kiện thì sẽ phát triển nhanh và gây bệnh cho vật chủ

Theo Lê Văn Tạo (1997) [50] cho biết họ vi khuẩn đường ruột gồm những vi khuẩn cộng sinh thường trực trong đường ruột Những vi khuẩn này muốn

từ vi khuẩn cộng sinh trở thành gây bệnh phải có 3 điều kiện:

- Trên cơ thể vật chủ có cấu trúc giúp cho vi khuẩn thực hiện được chức năng bám dính

- Vi khuẩn phải có khả năng sản sinh các yếu tố gây bệnh, đặc biệt là sản

sinh độc tố, trong đó quan trọng nhất là độc tố đường ruột Enterotoxin

- Có khả năng xâm nhập vào lớp tế bào biểu mô của niêm mạc ruột, từ đó phát triển nhân lên

Một số vi khuẩn thuộc họ vi khuẩn đường ruột là E coli, Salmonella spp., Shigella, Klebsiella, Cl perfringens… là những vi khuẩn quan trọng gây ra rối loạn

tiêu hoá, viêm ruột tiêu chảy ở người và nhiều loại động vật

Theo Đào Trọng Đạt và cs (1996) [13] cho biết chiếm tỷ lệ cao nhất

trong số các vi khuẩn đường ruột gây tiêu chảy là E coli (45,6%) Cũng theo tác giả, vi khuẩn yếm khí Cl perfringens gây bệnh khi có điều kiện thuận lợi và khi

gây bệnh nặng cho lợn con theo mẹ trong khoảng 1 tuần tuổi đến cai sữa

Theo Phạm Sỹ Lăng (2009) [32] cho biết bệnh tiêu chảy ở lợn do vi khuẩn chủ yếu có những bệnh sau:

Theo Phạm Ngọc Thạch (1996) [51] vi rút cũng là tác nhân gây bệnh tiêu chảy

ở gia súc Sự xuất hiện của vi rút đã làm tổn thương niêm mạc ruột, làm suy giảm sức

đề kháng của cơ thể và thường gây ỉa chảy ở dạng cấp tính với tỷ lệ chết cao

Archie H (2000) [1] cho biết Rotavirus và Coronavirus là những vi rút gây

tiêu chảy quan trọng ở gia súc non mới sinh như nghé, dê, cừu con, lợn con, ngựa con và đặc biệt là bê do những vi rút này có khả năng phá huỷ màng ruột và gây tiêu chảy nặng

Các nghiên cứu trong nước của Lê Minh Chí (1995) [5] và Nguyễn Như Pho

(2003) [40] cũng đã cho thấy Rotavirus và Coronavirus gây bệnh tiêu chảy chủ

yếu cho lợn con trong giai đoạn theo mẹ, với các triệu chứng tiêu chảy cấp tính, nôn mửa, mất nước với tỷ lệ mắc bệnh và tỷ lệ chết cao

* Tiêu chảy do nấm mốc:

Thức ăn khi chế biến hoặc bảo quản không đúng kỹ thuật dễ bị nấm mốc Một số

loài như: Aspergillus, Penicillium, Fusarium…có khả năng sản sinh nhiều loại độc tố,

nhưng quan trọng nhất là nhóm độc tố Aflatoxin (Aflatoxin B1, B2, G1, G2, M1)

Độc tố Aflatoxin gây độc cho người và gia súc, gây bệnh nguy hiểm nhất cho con người là ung thư gan, huỷ hoại gan, độc cho thận, sinh dục và thần kinh

Aflatoxin gây độc cho nhiều loài gia súc, gia cầm, mẫn cảm nhất là vịt, gà, lợn và các gia súc khác Lợn khi nhiễm độc thường bỏ ăn, thiếu máu, vàng da, ỉa chảy, ỉa chảy ra máu Nếu trong khẩu phần có 500 - 700g Aflatoxin/kg thức ăn sẽ làm cho lợn con chậm lớn, còi cọc, giảm sức đề kháng với các bệnh truyền nhiễm khác (Lê Thị Tài, 1997) [48]

1.1.3.3 Tiêu chảy do ký sinh trùng

Có nhiều loại ký sinh trùng gây bệnh tiêu chảy ở lợn như cầu trùng

(Eimeria), Isospora suis, Crytosporidium hoặc một số loài giun tròn lớp Nematoda ( Ascaris suum, Trichuris suis, Strongyloides, Haemonchus, Mecistocirrus…)

Bệnh do Isospora, Crytosporidium thường tập trung vào giai đoạn lợn con

từ 5 đến 25 ngày tuổi, còn ở lợn trên 2 tháng tuổi do cơ thể đã tạo được miễn dịch đối với bệnh cầu trùng, nên lợn chỉ mang mầm bệnh mà ít khi xuất hiện triệu chứng tiêu chảy (Nguyễn Như Pho, 2003) [40]

Cầu trùng và một số loại giun tròn (giun đũa, giun tóc, giun lươn) là một trong những nguyên nhân gây tiêu chảy ở lợn sau cai sữa nuôi trong các hộ gia đình tại Thái Nguyên (Nguyễn Thị Kim Lan và cs., 2006) [29]

Giun sán ở đường tiêu hóa có vai trò rõ rệt trong hội chứng tiêu chảy ở lợn

từ sau cai sữa Ở lợn bình thường và lợn bị tiêu chảy đều nhiễm các loại giun đũa, giun lươn, giun tóc và sán lá ruột, nhưng ở lợn tiêu chảy nhiễm tỷ lệ cao hơn và nặng hơn (Nguyễn Thị Kim Lan và cs., 2009) [30]

Cầu trùng một số loại giun tròn là một trong những nguyên nhân gây tiêu chảy

ở lợn sau cai sữa nuôi trong các hộ gia đình tại Hà Nội (Thân Thị Đang,2010) [12] Qua nghiên cứu tác giả nhận xét lợn nuôi bình thường nhiễm cầu trùng

là 35,54%, giun đũa là 31,82%, giun lươn là 41,32%, giun tóc là 23,14% Lợn chủ yếu nhiễm nhẹ, không có lợn nào nhiễm nặng Trong khi đó, lợn tiêu chảy nhiễm cầu trùng là 56,93%, giun đũa là 35,77%, giun lươn là 60,58%, giun tóc là 28,47% Tỷ lệ nhiễm nặng biến động từ 7,83- 13,46%

Đặc điểm chủ yếu của tiêu chảy do ký sinh trùng là con vật mắc bệnh bị tiêu chảy nhưng không liên tục, có sự xen kẽ giữa tiêu chảy và phân bình thường,

cơ thể thiếu máu, da nhợt nhạt, gia súc kém ăn, thể trạng sa sút

1.1.4 Bệnh lý lâm sàng của hội chứng tiêu chảy

1.1.4.1 Cơ chế sinh bệnh

Cơ chế sinh bệnh của hội chứng tiêu chảy là quá trình rối loạn chức phận

bộ máy tiêu hoá và nhiễm khuẩn Hai quá trình này có thể diễn ra đồng thời hoặc cũng có thể quá trình này trước, quá trình này sau và ngược lại, song không thể phân biệt được từng quá trình

Vũ Văn Ngữ và cs (1975) [36], Trịnh Văn Thịnh (1985) [56] cho rằng do một tác nhân bất lợi nào đó, trạng thái cân bằng của khu hệ vi khuẩn đường ruột bị phá vỡ, tất cả hoặc chỉ một loài nào đó sinh sản quá nhiều sẽ gây hiện tượng loạn khuẩn, gây ra sự biến động ở nhóm vi khuẩn đường ruột, cũng như ở nhóm vi khuẩn vãng lai, các vi khuẩn gây bệnh có cơ hội tăng mạnh cả về số lượng và độc lực, các vi khuẩn có lợi cho quá trình tiêu hóa do không cạnh tranh nổi nên giảm đi, cuối cùng loạn khuẩn xảy ra, hấp thu bị rối loạn gây tiêu chảy

1.1.4.2 Bệnh lý, lâm sàng của hội chứng tiêu chảy

Bệnh lý, lâm sàng của hội chứng tiêu chảy ở gia súc là sự biến đổi về chức năng, tình trạng mất nước và chất điện giải, trạng thái trúng độc của cơ thể bệnh

Khi nghiên cứu về tiêu chảy ở lợn do vi khuẩn E coli, Nguyễn Như Pho (2003) [40] cho rằng ruột của lợn tiêu chảy do vi khuẩn E coli chỉ xung

huyết, không thấy xuất huyết, không có loét hoặc hoại tử như trong bệnh phó thương hàn

Hiện tượng trúng độc xảy ra do thức ăn lên men phân giải sinh độc tố, hệ vi khuẩn đường ruột sinh sôi, sản sinh ra nhiều độc tố Các độc tố đó cùng với các sản phẩm của viêm, tổ chức phân huỷ, ngấm vào máu, tác động vào gan làm chức năng gan rối loạn, gia súc bị trúng độc, đồng thời tác động cản trở quá trình tiêu hoá tiếp tục gây tiêu chảy nặng hơn, tăng nguy cơ nhiễm độc máu và gây tử vong

1.1.4.3 Hậu quả trong hội chứng tiêu chảy

Hậu quả trực tiếp và nặng nề của hiện tượng tiêu chảy là sự mất nước và mất các chất điện giải của cơ thể, kéo theo hàng loạt các biến đổi bệnh lý (Lê Minh Chí, 1995) [5]

Ở lợn hiện tượng tiêu chảy thường có quá trình nhiễm khuẩn Khi tiêu chảy

do nhiễm khuẩn, các triệu chứng trầm trọng hơn và hậu quả để lại nặng nề hơn Bệnh có thể lây lan và kế phát nhiều bệnh khác, gây thiệt hại cho ngành chăn nuôi

Như vậy, với mỗi một nguyên nhân gây tiêu chảy khác nhau thì cũng để lại những hậu quả khác nhau

1.1.5 Một số đặc điểm dịch tễ hội chứng tiêu chảy

Hội chứng tiêu chảy ở gia súc do nhiều nguyên nhân gây ra, vì vậy sự xuất hiện của bệnh phụ thuộc vào sự xuất hiện các nguyên nhân và sự tương tác giữa nguyên nhân với cơ thể gia súc Các yếu tố như mùa vụ, tuổi gia súc, chuồng trại, thức ăn, điều kiện chăm sóc nuôi dưỡng đều có ảnh hưởng đến bệnh tiêu chảy ở gia súc

1.1.6 Biện pháp phòng trị tiêu chảy cho lợn

1.1.6.1 Phòng bệnh

Phòng bệnh là biện pháp chủ động không để bệnh xảy ra, các biện pháp phòng bệnh đều xoay quanh các vấn đề về môi trường, vật chủ và mầm bệnh

Các tác giả Trịnh Văn Thịnh (1985) [56], Đào Trọng Đạt và cs (1985) [13]

đề xuất biện pháp phòng bệnh là giữ ẩm và sưởi cho lợn sơ sinh vào mùa đông,

dọn phân, rác thải trong chuồng đem ủ nhiệt sinh vật, định kỳ tẩy uế tiêu độc chuồng trại và dụng cụ chăn nuôi

Phạm Khắc Hiếu và Trần Thị Lộc (1998) [20] cho rằng để phòng bệnh tiêu chảy, trước hết cần hạn chế, loại trừ các yếu tố stress sẽ mang lại hiệu quả tích cực, đồng thời khắc phục những yếu tố khí hậu, thời tiết bất lợi để tránh rối loạn tiêu hoá, giữ ổn định trạng thái cân bằng giữa cơ thể và môi trường Lợn con đẻ ra phải được sưởi ấm ở nhiệt độ 370C trong 7 ngày, sau đó giảm nhiệt độ dần, nhưng không được thấp hơn 300C

Vi khuẩn đường ruột, đặc biệt là E coli được đánh giá là nguyên nhân gây

bệnh phổ biến và quan trọng nhất trong hội chứng tiêu chảy ở lợn con dưới 2 tháng tuổi, nhiều tác giả đã tập trung nghiên cứu chế tạo và sử dụng vắc xin phòng bệnh nhằm kích thích cơ thể chủ động sản sinh kháng thể chống lại mầm bệnh

Nguyễn Thị Nội (1985) [38] dựa trên kết quả xác định tần suất các

serotype O của E coli gây bệnh phân trắng lợn con để chọn các serotype O có tần

suất xuất hiện cao để chế vắc xin

Nguyễn Thị Nội và cs (1989) [39] đã tiến hành nghiên cứu một loại vắc xin

đa giá SALCO gồm các chủng vi khuẩn Salmonella, E coli và Streptococcus để

phòng tiêu chảy cho lợn con

Lê Văn Tạo (1997) [50] đã chọn chủng vi khuẩn E coli mang kháng

nguyên K88 kết hợp với ít nhất 2 yếu tố gây bệnh khác nhau là Ent và Hly dùng để sản xuất vắc xin cho uống và tiêm nhằm phòng bệnh lợn con phân trắng

Đặng Xuân Bình và cs (2008) [3] đã nghiên cứu, chế tạo vắc xin từ các

chủng E coli độc có mang yếu tố gây bệnh phòng bệnh phân trắng lợn con trên

thực địa

Nguyễn Ngọc Hải (2010) [16 ] nghiên cứu, chế tạo vắc xin từ 7 gốc E coli

phân lập từ các mẫu phân heo con tiêu chảy có kết quả rõ nhất, để phòng tiêu chảy cho heo con theo mẹ; Đã kết luận vắc xin chuồng thực nghiệm tạo được đáp

ứng miễn dịch tốt, hiệu quả phòng ngừa tiêu chảy do E coli tương đương với vắc xin phòng bệnh E coli của Mỹ

Việc sử dụng vắc xin phòng bệnh tiêu chảy cho lợn (đặc biệt là lợn con) đến hiện nay vẫn đang được các nhà khoa học tiếp tục nghiên cứu và thử nghiệm

Ngoài sử dụng vắc xin một số tác giả đã đi sâu nghiên cứu các chế phẩm dùng để phòng bệnh tiêu chảy Đây là biện pháp vừa giúp tăng khả năng

đề kháng, vừa khống chế sự phát triển quá mức của một số loài vi khuẩn có hại cho

cơ thể gia súc

Tạ Thị Vịnh và cs (2002) [64] đã sử dụng chế phẩm VITOM 1.1 (chứa

Bacillus subtilis chủng VKPMV - 7092) để phòng và trị bệnh tiêu chảy cho lợn

con từ sơ sinh đến 3 tuần tuổi

Trần Thị Hạnh và cs (2004) [18] đã chế tạo sinh phẩm E coli - sữa và

Cl perfringens - toxoid dùng phòng bệnh tiêu chảy cho lợn con

Phan Thanh Phượng và cs (2008a) [45] đã nghiên cứu thành công và đưa

kháng thể E coli dạng bột từ lòng đỏ trứng gà đã được miễn dịch các chủng

1.1.6.2 Điều trị bệnh

Theo Lê Minh Chí (1995) [5] cho rằng trên thực tế lâm sàng, điều trị mất nước là điều trị bắt buộc và là điều kiện để hạ thấp mức độ thiệt hại do bệnh tiêu chảy gây ra

Theo Phạm Ngọc Thạch (1996) [51] để triều trị hội chứng tiêu chảy gia súc, nên tập trung vào 3 khâu là:

- Loại trừ những sai sót trong nuôi dưỡng như: Loại bỏ thức ăn kém phẩm chất (ôi, mốc…), giảm thức ăn xanh chứa nhiều nước, chăm sóc nuôi dưỡng tốt, loại bỏ thức ăn không tiêu hoá được, đang lên men trong đường ruột

- Khắc phục rối loạn tiêu hoá và chống nhiễm khuẩn

- Điều trị hiện tượng mất nước và chất điện giải

1.2 Một số nghiên cứu về vi khuẩn E coli gây bệnh đường tiêu hoá

Vi khuẩn Escherichia coli (E coli) thuộc họ Enterobacteriaceae, nhóm Escherichiae, giống Escherichiae, loài Escherichia coli Trước đây được gọi là

Bacterium coli commune hay Bacillus coli communis, lần đầu tiên phân lập được từ

phân trẻ em bị tiêu chảy năm 1885 và được đặt theo tên của người bác sỹ nhi khoa Đức Theodor Escherich (1857 - 1911) (Nguyễn Vĩnh Phước, 1974, [42]., Nguyễn Như Thanh và cs, 1997, Lê Văn Tạo, 1997) [52, 50 ]

Trong điều kiện bình thường, E coli khu trú thường xuyên ở phần sau của

ruột, ít khi có ở dạ dày hay đoạn đầu ruột non của động vật Khi gặp điều kiện thuận lợi, chúng phát triển nhanh về số lượng, độc lực, gây loạn khuẩn, bội nhiễm đường tiêu hoá và trở thành nguyên nhân gây bệnh tiêu chảy (Nguyễn Vĩnh Phước, 1978) [43]

Vi khuẩn E coli thuộc họ Enterobacteriaceae, là họ vi khuẩn thường trực

ở trong ruột, chiếm tới 80% các vi khuẩn hiếu khí, vừa là vi khuẩn cộng sinh thường trực đường tiêu hoá, vừa là vi khuẩn gây nhiều bệnh ở đường ruột và ở các cơ quan khác (Lê Văn Tạo, 1997) [50]

1.2.1 Đặc điểm hình thái, cấu trúc của vi khuẩn E coli

1.2.1.1 Đặc điểm hình thái

Vi khuẩn E coli là trực khuẩn hình gậy ngắn hai đầu tròn, có kích thước 2 -

3m x 0,3- 0,6m; Ở môi trường nuôi cấy, trong canh khuẩn già, xuất hiện những trực khuẩn dài 4 - 8m Trong cơ thể người và động vật, vi khuẩn thường có hình trực khuẩn, đứng riêng lẻ, đôi khi xếp thành chuỗi ngắn Phần lớn

vi khuẩn E coli có khả năng di động do có lông ở xung quanh thân, không sinh nha

bào, có thể có giáp mô Vi khuẩn bắt màu gram âm, có thể bắt màu đều hoặc sẫm

ở hai đầu, khoảng giữa nhạt hơn Nếu lấy vi khuẩn từ khuẩn lạc nhầy để nhuộm, có thể thấy giáp mô, nhưng khi soi tươi thì thường không nhìn thấy được (Nguyễn Quang Tuyên, 2008) [63]

1.2.1.2 Đặc điểm cấu trúc

Vi khuẩn E coli được chia làm serrotype khác nhau dựa vào cấu trúc

kháng nguyên thân O, giáp mô K, lông H và kháng nguyên bám dính F Bằng phản ứng ngưng kết, các nhà khoa học đã tìm ra được 250 serotype O, 89 serotype K,

56 serotype H và một số serotype F (Fairbrother J M., 1992) [71]

Khi xác định serotype đầy đủ của một chủng vi khuẩn E coli thì phải xác

định đủ cả 3 loại kháng nguyên nói trên

- Kháng nguyên O (Kháng nguyên thân - Ohne Hauch) được coi như là một yếu tố độc lực có thể tìm thấy ở thành tế bào và có liên hệ trực tiếp với hệ thống miễn dịch Kháng nguyên O khi gặp kháng huyết thanh tương ứng sẽ xảy ra phản ứng ngưng kết Ngưng kết kháng nguyên O tạo thành những hạt nhỏ, khó tan

- Kháng nguyên H (kháng nguyên lông - Hauch) là thành phần lông vi khuẩn, có bản chất protein, kém bền vững hơn so với kháng nguyên O

Kháng nguyên H không phải là yếu tố độc lực của vi khuẩn, nhưng có khả năng tạo miễn dịch mạnh Phản ứng miễn dịch xảy ra nhanh hơn so với kháng nguyên O

Kháng nguyên H của vi khuẩn E coli không có vai trò bám dính, không có

tính độc và cũng không có ý nghĩa trong đáp ứng miễn dịch phòng vệ nên ít được quan tâm nghiên cứu, nhưng nó có ý nghĩa rất to lớn trong xác định giống loài của

vi khuẩn (Orskov F., 1978) [82]

- Kháng nguyên K (Kháng nguyên vỏ bỏ - Capsular), còn được gọi là kháng nguyên bề mặt (OMP - Outer membrane protein) hoặc kháng nguyên vỏ bọc (Capsular) Vai trò của kháng nguyên K chưa được thống nhất Có rất nhiều ý kiến cho rằng, nó không có ý nghĩa về độc lực của vi khuẩn, vì thấy rằng độc lực

của chủng E coli có kháng nguyên K cũng giống độc lực của chủng không có

kháng nguyên K (Orskov F., 1978) [82] Tuy nhiên, có ý kiến khác cho rằng, nó có

ý nghĩa về độc lực vì nó tham gia bảo vệ vi khuẩn trước những yếu tố phòng vệ của vật chủ Tuy vậy, phần lớn các ý kiến đều thống nhất kháng nguyên K có hai nhiệm vụ sau:

+ Hỗ trợ trong phản ứng ngưng kết của kháng nguyên O, nên thường ghi

liền công thức serotype của vi khuẩn là Ox: Ky như E coli O139: K88, O149:

K88, O138:K81, O138:K82, O157:K17…

+ Tạo thành hàng rào bảo vệ vi khuẩn chống lại tác động của ngoại cảnh

và hiện tượng thực bào, yếu tố phòng vệ của vật chủ

Tóm lại, dựa vào kháng nguyên O, E coli được chia làm nhiều nhóm; căn

cứ vào cấu tạo kháng nguyên O, K, H, E coli lại chia làm nhiều type, mỗi type đều

được ghi thứ tự các yếu tố kháng nguyên O, K, H

- Kháng nguyên F (kháng nguyên Fimbriae - kháng nguyên bám dính)

Hầu hết các chủng E coli gây bệnh đều sản sinh ra một hoặc nhiều kháng

nguyên bám dính Các chủng không gây bệnh thì không có kháng nguyên bám dính Kháng nguyên bám dính giúp vi khuẩn bám vào các thụ thể đặc hiệu trên bề mặt tế bào biểu mô ruột và trên lớp màng nhày để xâm nhập và gây bệnh, đồng thời chống lại khả năng đào thải vi khuẩn của nhu động ruột

Một số loại kháng nguyên bám dính của vi khuẩn E coli thuộc nhóm ETEC (Enterotoxigenic Escherichia coli) gây bệnh chủ yếu cho lợn là F4

(K88), F5 (K99), F6 (987P), F18 và F41 (Cater G.R và cs., 1995) [69]

1.2.2 Đặc tính nuôi cấy, sinh vật, hoá học

1.2.2.1 Đặc tính nuôi cấy

Theo Nguyễn Như Thanh và cs (1997) [52], Nguyễn Quang Tuyên

(2008) [58] vi khuẩn E coli là trực khuẩn hiếu khí và yếm khí tuỳ tiện, có thể sinh

trưởng ở phổ nhiệt độ khá rộng (từ 5- 400C), nhiệt độ thích hợp là 370C và phổ pH rộng (pH từ 5,5- 8,0), pH thích hợp nhất từ (7,2 - 7,4)

Vi khuẩn E coli phát triển dễ dàng trên các môi trường nuôi cấy thông

thường Khi nuôi cấy trên các môi trường, để trong tủ ấm ở 370C và sau 24 giờ vi khuẩn sẽ phát triển như sau:

+ Môi trường thạch thường: Hình thành những khuẩn lạc tròn, ướt, bóng láng không trong suốt, màu tro trắng nhạt, hơi lồi, đường kính từ 2- 3mm Nuôi lâu, khuẩn lạc có màu nâu nhạt và mọc rộng ra, có thể quan sát thấy cả những khuẩn lạc dạng R (Rough) và M (Mucons)

+ Môi trường nước thịt: Phát triển rất tốt, môi trường đục đều có lắng cặn màu tro nhạt ở dưới đáy, đôi khi có màu xám nhạt, canh trùng có mùi phân hôi thối

+ Môi trường MacConkey: Khuẩn lạc có màu hồng cánh sen, tròn nhỏ, hơi lồi, không trầy, rìa gọn, không làm chuyển màu môi trường

+ Môi trường thạch máu: Khuẩn lạc to, ướt, lồi, viền không gọn, màu xám nhạt, một số chủng có khả năng và gây ra hiện tượng tan máu

+ Môi trường Simmon citrat: Khuẩn lạc không màu trên nền xanh lục

+ Môi trường Endo: Khuẩn lạc màu đỏ

+ Trong môi trường EMB: Khuẩn lạc màu tím đen

+ Trong môi trường SS: Khuẩn lạc màu đỏ

1.2.2.2 Đặc tính sinh hoá

Phản ứng lên men đường: Vi khuẩn E coli lên men sinh hơi các loại đường

lactose, frutose, glucose, levulose, galactose, xylose, manitol, lên men không chắc

chắn các loại đường duncitol, saccarose và salixin Hầu hết các chủng vi khuẩn E coil đều lên men đường Lactose nhanh và sinh hơi, đây là đặc điểm quan trọng

để dựa vào đó phân biệt vi khuẩn E coli và Salmonella Một số phản ứng sinh

hoá khác: Phản ứng Indol và MR dương tính, phản ứng H2S, VP âm tính (Nguyễn Quang Tuyên, 2008) [63]

1.2.3 Đặc tính gây bệnh của vi khuẩn E coli

1.2.3.1 Cơ chế gây bệnh của vi khuẩn E coli

Để có thể gây bệnh, trước hết vi khuẩn E coli phải bám dính vào tế bào

nhung mao ruột bằng các yếu tố bám dính như kháng nguyên F Sau đó, nhờ các yếu tố xâm nhập (Invasion), vi khuẩn sẽ xâm nhập vào tế bào biểu mô của thành ruột Ở đó, vi khuẩn phát triển, nhân lên, phá huỷ lớp tế bào biểu mô, gây viêm ruột, đồng thời sản sinh độc tố đường ruột Enterotoxin Độc tố đường ruột tác động vào quá trình trao đổi muối, nước làm rối loạn chu trình này Nước từ cơ thể tập trung vào lòng ruột làm căng ruột, cùng với khí do lên men ở ruột gây nên một tác dụng cơ học, làm nhu động ruột tăng, đẩy nước và chất chứa ra ngoài, gây nên hiện tượng tiêu chảy Sau khi đã phát triển ở thành ruột, vi khuẩn vào hệ lâm

ba, đến hệ tuần hoàn, gây nhiễm trùng máu Trong máu, vi khuẩn chống lại hiện tượng thực bào, gây dung huyết, làm cho cơ thể thiếu máu Từ hệ tuần hoàn, vi khuẩn đến các cơ quan, tổ chức Ở đây, vi khuẩn lại phát triển nhân lên lần thứ hai, phá huỷ tế bào tổ chức, gây viêm và sản sinh độc tố gồm Enterotoxin và Verotoxin,

phá huỷ tế bào tổ chức gây tụ huyết và xuất huyết (Lê Văn Dương, 2010) [11]

Sau khi đã phát triển ở thành ruột, vi khuẩn vào hệ lâm ba, đến hệ tuần hoàn, gây nhiễm trùng máu Trong máu, vi khuẩn chống lại hiện tượng thực bào, gây dung huyết, làm cho cơ thể thiếu máu Từ hệ tuần hoàn, vi khuẩn đến các tổ chức cơ quan Ở đây, vi khuẩn lại phát triển nhân lên lần thứ hai, phá huỷ tế bào tổ chức, gây viêm và sản sinh độc tố gồm Enterotoxin và Verotoxin, phá huỷ tế bào tổ chức, gây tụ huyết và xuất huyết

1.2.3.2 Các yếu tố gây bệnh của vi khuẩn E coli

Các yếu tố gây bệnh của E coli bao gồm khả năng kháng khuẩn, yếu tố bám

dính, khả năng xâm nhập, yếu tố gây dung huyết và khả năng sản xuất độc tố Các chủng

E coli không có các yếu tố trên thì không có khả năng gây bệnh Dựa vào các yếu tố gây bệnh nói trên, người ta đã phân loại vi khuẩn E coli thành các loại sau: Enterotoxigenic

E coli (ETEC), Enteropathgenic E coli (EPEC), Adherence Eteropathogenic E coli (AEEC) và Verotoxingenic E coli (VTEC) (Lê Văn Tạo, 1997) [50]

- Yếu tố kháng khuẩn:

Nhiều chủng E coli có khả năng sản sinh ra chất kháng khuẩn có tác dụng ức

chế hoặc tiêu diệt các loại vi khuẩn khác gọi là ColicinV Vì vậy, yếu tố này cũng

được coi là một trong các yếu tố độc lực của vi khuẩn E coli gây bệnh

- Yếu tố bám dính:

Jones G W and Rutter J M (1974) [76] cho biết khả năng bám dính của vi khuẩn là yếu tố gây bệnh quan trọng để thực hiện bước đầu tiên của quá trình gây bệnh đường ruột, đó là một quá trình liên kết vững chắc giữa bề mặt tế bào vi khuẩn

và tế bào vật chủ

Theo Vũ Khắc Hùng và cs (2005) [24] qua phản ứng PCR trong số 220

chủng E coli phân lập từ lợn con từ 1-14 ngày tuổi bị tiêu chảy có 82 chủng mang

kháng nguyên bám dính

Phạm Thế Sơn và Phạm Khắc Hiếu (2008) [47] khi nghiên cứu về đặc tính

của vi khuẩn E coli, Salmonella, Cl perfringens gây bệnh lợn con tiêu chảy ở Hưng Yên và Hà Nội đã có kết luận: số chủng E coli mang kháng nguyên bám dính

F4 (K88) là 78%, F5 (K99) là 22% Số chủng mang F4 ở Hưng Yên là 80% và Hà Nội là 76%

- Yếu tố xâm nhập của vi khuẩn E coli:

Sau khi bám dính, vi khuẩn sẽ thực hiện quá trình xâm nhập vào sâu bên

trong các lớp tế bào Tại đây, vi khuẩn E coli nhân lên với tốc độ lớn đồng thời sản

sinh ra độc tố đường ruột, gây phản ứng niêm mạc và đầu độc cơ thể

Theo Giannella R A và cs (1976) [73] khả năng xâm nhập của vi khuẩn là một khái niệm dùng để chỉ quá trình mà nhờ đó vi khuẩn đường ruột qua được hàng rào bảo vệ của lớp mucosa trên bề mặt niêm mạc để xâm nhập vào tế bào biểu mô (Epithel), đồng thời sản sinh và phát triển trong lớp tế bào này Trong khi đó, những

vi khuẩn khác không có khả năng xâm nhập, không thể qua được hàng rào bảo vệ

của lớp mucosa hoặc khi qua được lớp hàng rào này sẽ bị bắt bởi tế bào đại thực bào của tổ chức hạ niêm mạc

- Độc tố của vi khuẩn E coli:

Vi khuẩn E coli sản sinh nhiều loại độc tố như Enterotoxin, Verotoxin,

Neurotoxin Mỗi loại độc tố gắn với một thể bệnh mà chúng gây ra

+ Nhóm độc tố đường ruột (Enterotoxin) gồm 2 loại:

Độc tố chịu nhiệt (Heat Stable Toxin - ST) chịu được nhiệt độ 1000C trong vòng 15 phút Độc tố ST chia thành 2 nhóm là STa và STb dựa trên đặctính sinh học và khả năng hoà tan trong methanol Sta kích thích sản sinh cGMP mức cao trong tế bào, ngăn trở hệ thống chuyển Na+ và Cl-; làm giảm khả năng hấp thu chất điện giải và nước ruột STb kích thích vòng nucleotid phân tiết dịch độc lập ở ruột, nhưng phương thức tác dụng của STb vẫn chưa được hiểu rõ

Độc tố không chịu nhiệt (Heat Labile Toxin - LT) bị vô hoạt ở nhiệt độ 600C trong vòng 15 phút LT cũng có hai nhóm phụ là LT1 và LT2, nhưng chỉ có LT1 bị trung hoà bởi Anticholerae toxin LT là một trong những yếu tố quan trọng gây triệu chứng tiêu chảy Cả hai loại độc tố ST và LT đều bền vững ở nhiệt độ âm, thậm chí

cả ở nhiệt độ (-200C)

- Vai trò gây bệnh của các loại kháng nguyên:

Mặc dù các vi khuẩn E coli có nhiều loại kháng nguyên, trong đó, có loại tạo

miễn dịch phòng vệ cho vật chủ, có loại không tạo miễn dịch phòng vệ cho vật chủ nhưng đều tham gia vào quá trình gây bệnh bằng cách tạo điều kiện cho vi khuẩn xâm nhập vào tế bào vật chủ và tham gia vào quá trình kháng lại các yếu tố phòng

vệ tự nhiên của vật chủ Các kháng nguyên tham gia quá trình trên phải kể đến là kháng nguyên O, kháng nguyên K, kháng nguyên F

- Yếu tố dung huyết (Hly):

Dung huyết là một trong những yếu tố quan trọng để vi khuẩn E coli gây tiêu chảy Đó là do các chủng E coli có khả năng sản sinh ra men Haemolyzin để

phá hủy hồng cầu của vật chủ, giải phóng Fe+++ dùng cho quá trình phát triển của

vi khuẩn Có 4 kiểu dung huyết của vi khuẩn E coli là: α - haemolysin, β -

haemolysin, γ - haaemolysin, δ - haemolysin, nhưng quan trọng nhất là kiểu α - haemolysin và β - haemolysin (dẫn theo Lê Văn Dương, 2010) [11]

1.2.4 Khả năng mẫn cảm với kháng sinh của vi khuẩn E coli

Để trị bệnh đường ruột, người ta sử dụng nhiều loại kháng sinh Kháng sinh còn được trộn vào thức ăn với tỷ lệ thấp để phòng bệnh và kích thích tăng

trọng Vì vậy, khả năng kháng kháng sinh của vi khuẩn đường ruột nói chung và

vi khuẩn E coli nói riêng đang ngày một tăng, làm cho hiệu quả điều trị giảm, thậm

chí nhiều loại kháng sinh còn bị vô hiệu hoá hoàn toàn

Sở dĩ khả năng kháng kháng sinh của vi khuẩn nói chung và E coli nói

riêng tăng nhanh, lan rộng vì gen sản sinh yếu tố kháng kháng sinh nằm trong plasmid R (Resistance) Plasmid này có thể di truyền dọc và di truyền ngang cho tất cả quần thể vi khuẩn thích hợp (Falkow, 1975) [72]

1.3 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước về vai trò của vi khuẩn E coli

trong hội chứng tiêu chảy

1.3.1 Những nghiên cứu trong nước

Hội chứng tiêu chảy có ở hầu hết các nước trên thế giới cũng như ở Việt Nam, gây thiệt hại đáng kể cho ngành chăn nuôi Trong chăn nuôi gia súc hội chứng tiêu chảy xảy ra ở mọi lứa tuổi, các mùa trong năm, thường tỷ lệ mắc tiêu chảy cao

- Nguyễn Thị Kim Lan và cs., (2006) [29], Nguyễn Nguyệt Cầm (2008) [4]

đã phân lập được vi khuẩn E coli trong 89,1% số mẫu phân của lợn con bị tiêu chảy

tại trung tâm nghiên cứu lợn Thụy Phương 100% mẫu phủ tạng của lợn tiêu chảy

đều phân lập được vi khuẩn E coli Các chủng vi khuẩn E coli được kiểm tra đặc

biệt mẫn cảm với amikacin và certiofur, tỷ lệ 100% Một số loại kháng sinh khác như cephalothin, apramycin và ampicillin cũng có tỷ lệ mẫn cảm cao, lân lượt là 94,1%, 90,2% và 82,4% Tất cả các chủng được thử đều kháng lại tetracylin (100%)

và một số loại kháng sinh thông thường như: spectinomycin (96,1%), sulfamethoxazole/trimethoprim (94,1%), neomycin (76,5%), streptomycin (70,6%)

và enrofloxacin (66,7%)

- Lê Thị Hoài (2008) [23] cho biết, bệnh tiêu chảy ở lợn từ sơ sinh đến 60 ngày tuổi tại tỉnh Hưng Yên có một số đặc điểm dịch tễ đặc trưng cơ bản là:

- Tỷ lệ lợn mắc tiêu chảy là 30,30% và tỷ lệ chết do tiêu chảy là 5,07%

- Tỷ lệ lợn mắc bệnh và chết do tiêu chảy có sự sai khác giữa các mùa trong năm.Cao nhất vào mùa Đông và thấp nhất vào mùa Thu

- Phương thức chăn nuôi khác nhau ảnh hưởng đến tỷ lệ lợn mắc và chết do tiêu chảy Chăn nuôi theo phương thức công nghiệp có tỷ lệ lợn mắc bệnh và chết

do tiêu chảy là thấp nhất

- Tỷ lệ lợn mắc tiêu chảy giảm dần theo tuổi, cao nhất là ở lợn từ sơ sinh đến

7 ngày tuổi E coli

Vi khuẩn phân lập được từ 100% ở lợn tiêu chảy và 96,9% ở lợn bình

thường 100% mẫu bệnh phẩm đều phân lập được vi khuẩn E coli

Trần Trung Mỹ (2010) [33] đã nghiên cứu về tỷ lệ nhiễm tiêu chảy do E coli

ở lợn con dưới 2 tháng tuổi ở Thái Nguyên và cho biết: Tỷ lệ lợn mắc tiêu chảy là 27.81% và tỷ lệ chết do tiêu chảy là 5,12%

Lâm Thị Thu Hương và Đường Chi Mai (2011) [26] cho biết tỷ lệ mẫu phân

tiêu chảy chỉ nhiễm E coli chiếm 44,76%, tỷ lệ mẫu nhiễm ghép rotavirus và E coli chiếm 5,24%; trong đó có 8,57% mẫu phân tiêu chảy nhiễm E coli mang kháng

nguyên K88

Theo Nguyễn Chí Dũng (2013) [10] bệnh tiêu chảy ở lợn con xuất hiện phổ biến ở tất cả 3 huyện thuộc tỉnh Vĩnh Phúc với tỷ lệ khá cao (26,76%) Tỷ lệ chết là 5,03% trong tổng số con điều tra Cụ thể:

- Tỷ lệ lợn bị tiêu chảy ở lứa tuổi khác nhau có xu hướng giảm dần theo ngày tuổi: Từ 1- 7; 8- 21; 22- 28 ngày tương ứng là 33,75%; 24,27%; 21,26%

- Tháng có nhiệt độ thấp và độ ẩm cao (12, 1, 2) tỷ lệ mắc tiêu chảy cao (26,98% đến 38,18%)

- Kiểu chuồng sàn hạn chế được tỷ lệ lợn con mắc bệnh tiêu chảy (23,58%)

so với chuồng nền (28,88%)

- Lợn con bị tiêu chảy có bệnh tích điển hình như ruột bị viêm, xuất huyết (95,45% ở ruột non; 100% ở ruột già) Dạ dày chứa đầy sữa không tiêu, niêm mạc phủ đầy dịch nhờn, xung huyết (68,18%) Hạch lâm ba màng treo ruột bị sưng, tụ huyết (63,63%)

Theo Hoàng Phú Hiệp (2014) [19] vi khuẩn E coli là một trong những tác

nhân hàng đầu gây ra ngộ độc thực phẩm Trong sinh hoạt hàng ngày, không ngoại

trừ trường hợp con người bị nhiễm vi khuẩn E coli thông qua tiếp xúc hay phơi

nhiễm với phân người, động vật và gia cầm

1.3.2 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Tại Hàn Quốc, Byun J.W và cs (2013) [68] đã sử dụng phương pháp PCR

để xác định yếu tố bám dính F18 của enterotoxigenic (ETEC) và độc tố (STEC) từ

các chủng Escherichia coli phân lập ở lợn con bị tiêu chảy và phù đầu Kết quả cho thấy, có 94 chủng E coli dương tính với F18, trong đó có 70 chủng E coli F18ac (43 STEC /ETEC, 4 STEC và 23 ETEC), 15 chủng E coli F18ab (18 STEC) và 9

chủng biến thể F18new (1 STEC /ETEC, 7 STEC, 1 ETEC)

Kempf I và cs (2013) [77] cho biết colistin thường được dùng để phòng và

điều trị bệnh do E coli gây ra ở lợn và gia cầm Ở một số trường hợp đã thấy sự kháng lại colistin của vi khuẩn E coli Tuy nhiên, ở châu Âu, tỷ lệ kháng colistin của vi khuẩn E coli phân lập từ hệ vi sinh vật đường tiêu hóa của động vật khỏe mạnh vẫn <1% Vì vậy, Colistin dùng trong việc khống chế bệnh do E coli cho vật

nuôi vẫn đạt hiệu quả tốt

Wang X và cs (2013) [85] cho biết năm 2011, dịch tiêu chảy ở lợn con 1 - 7 ngày tuổi xảy ra tại Changchun, Trung Quốc làm cho nhiều lợn nhiễm bệnh và chết

Nguyên nhân là do lợn con bị nhiễm ghép 2 loại vi khuẩn Clostridium perfringens type

A và Escherichia coli (K88, 987P) Các nhà khoa học đã thử nghiệm tiêm vaccine bất

hoạt của 2 loại vi khuẩn trên cho một số nái và cho biết, tỷ lệ tiêu chảy ở lợn con của nái được tiêm vaccine thấp hơn nhiều so với nái không tiêm (8% so với 95%)

Lu D và cs (2014) [78] đã tạo ra lợn biến đổi gen nhân bản vô tính có khả năng sản xuất hàm lượng Lysozyme tái tổ hợp (rhLZ) cao trong sữa và con lai F1 của chúng Nồng độ rhLS trung bình trong sữa của nái F1 là 116,34 ± 24,46 mg/lít, cao hơn 1.500 lần so với lợn bình thường Thí nghiệm so sánh các đàn lợn con theo

mẹ của nái F1 với nái thường cho thấy: Lợn con ăn sữa của nái F1 (với hàm lượ ng

rhLZ cao) có khả năng ức chế rất tốt sự phát triển của vi khuẩn E coli đường ruột,

đồng thời không ảnh hưởng đến khả năng sinh trưởng và tăng trọng của lợn con

Năm 2011 - 2012, Hering J và cs (2014) [74] đã thu thập mẫu (phân, bệnh phẩm và bụi chuồng nuôi) tại 48 trang trại lợn trên toàn nước Đức để xác định tỷ lệ

nhiễm E coli và số chủng E coli kháng cefotaxim Kết quả cho thấy: 61% số mẫu phân, 54% số mẫu bệnh phẩm và 11% mẫu bụi dương tính với E coli >85% số trang trại kiểm tra có ít nhất 1 chủng E coli kháng cefotaxim

Boonyasiri A và cs (2014) [67] cho biết có 76,7% số mẫu phân lợn và 40%

số mẫu phân gà khỏe mạnh được thu thập tại một số khu vực nghiên cứu tại Thái

Lan dương tính với vi khuẩn E coli

Năm 2013, Randall L P và cs (2014) [83] đã thu thập mẫu manh trang từ

637 lợn để kiểm tra tỷ lệ ESBL (extended-spectrum β-lactamase) E coli tại Anh và

cho biết có 23,4% số mẫu kiểm tra dương tính

Theo Wyrsch E và cs (2015) [86] E coli được coi là mối đe dọa hàng đầu

đến ngành chăn nuôi lợn trên toàn thế giới Các serotype O8, O9, O45, O101, O138, O139, O141, O149 và O157 được biết đến là tác nhân hàng đầu gây tiêu chảy ở lợn dưới 4 tuần tuổi

Sự phát triển nhanh chóng của các chủng vi khuẩn kháng thuốc kháng sinh

đã được quan tâm trên toàn thế giới Trong nghiên cứu của Zhang S H và cs

(2015) [84] cho biết các chủng E coli phân lập được kháng ít nhất với 5 loại kháng

sinh là tetracycline, sulfonamide, quinolone, β-lactamase và streptomycin

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG, NGUYÊN VẬT LIỆU

VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng

- Vi khuẩn E coli phân lập được từ lợn con tiêu chảy và bình thường tại

huyện Hữu Lũng, tỉnh Lạng Sơn

2.1.1 Địa điểm nghiên cứu

- Địa điểm nghiên cứu: Các hộ gia đình chăn nuôi lợn tại các xã Đồng Tân, Minh Sơn, Tân Thành thuộc huyện Hữu Lũng

- Địa điểm xét nghiệm mẫu Bộ môn Công nghệ Vi sinh, Viện Khoa học

Sự sống, Đại học Thái Nguyên

2.1.2 Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 9/2015 đến tháng 9/2016

2.2 Nội dung

2.2.1 Nghiên cứu một số đặc điểm dịch tễ của hội chứng tiêu chảy ở lợn con dưới 2 tháng tuổi tại một số xã của huyện Hữu Lũng

2.2.1.1 Tỷ lệ lợn con tiêu chảy và chết do tiêu chảy tại một số xã

2.2.1.2 Tỷ lệ lợn con tiêu chảy và chết do tiêu chảy theo phương thức chăn nuôi

2.2.1.3 Tỷ lệ lợn tiêu chảy và chết do tiêu chảy theo lứa tuổi

2.2.1.4 Tỷ lệ lợn con tiêu chảy và chết do tiêu chảy theo mùa vụ trong năm

2.2.1.5 Triệu chứng, bệnh tích của lợn con bị bệnh tiêu chảy

2.2.2 Phân lập và xác định một số đặc điểm sinh học của vi khuẩn E coli phân lập được

2.2.2.1 Phân lập, xác định tỷ lệ nhiễm vi khuẩn E coli từ các mẫu bệnh phẩm

và phân lợn tiêu chảy

2.2.2.2 Xác định số lượng vi khuẩn E coli trong phân lợn tiêu chảy và lợn bình thường 2.2.2.3 Giám định đặc tính sinh hoá của các chủng vi khuẩn E coli phân lập được

2.2.2.4 Xác định serotype của các chủng vi khuẩn E coli phân lập được

2.2.2.5 Xác định độc lực của các chủng vi khuẩn E coli phân lập được trên chuột bạch

2.2.2.6 Xác định tính mẫn cảm với kháng sinh của các chủng vi khuẩn E coli phân lập được

2.2.2.7 Xác định các yếu tố gây bệnh (độc tố và yếu tố bám dính) của vi khuẩn E coli phân lập được

2.2.3 Thử nghiệm phác đồ điều trị bệnh tiêu chảy ở lợn con

Căn cứ vào kết quả xác định tính mẫn cảm với kháng sinh của các

chủng vi khuẩn E coli phân lập được, chúng tôi lựa chọn 3 loại thuốc kháng sinh

mẫn cảm cao, đang được phép lưu hành tại Việt Nam Kết hợp với các loại thuốc chống mất nước, trợ sức, xây dựng lấy 3 phác đồ và tiến hành thử nghiệm điều trị

2.3.2 Các loại môi trường, hoá chất

- Các loại môi trường dùng cho phân lập, nuôi cấy vi khuẩn đường ruột bao gồm: Thạch máu, thạch MacConkey, thạch ISI, thạch DHL, thạch Brilliant Geen, nước thịt BHI, nước thịt thường, nước thịt pepton, thạch Simmons citrate và các loại môi trường đường Glucoze, Lactoze, Mannitol…

- Các loại giấy tẩm kháng sinh

- Kháng huyết thanh chuẩn dùng định type vi khuẩn phân lập

- Các hoá chất và dụng cụ phòng thí nghiệm khác dùng trong nghiên cứu

vi khuẩn

2.3.3 Động vật thí nghiệm

Chuột bạch khỏe mạnh, có trọng lượng trung bình từ 18 - 20g/con

2.4 Phương pháp nghiên cứu

2.4.1 Phương pháp nghiên cứu dịch tễ

Sử dụng phương pháp nghiên cứu dịch tễ học mô tả (Descriptive study) dịch tế học phân tích (Analytic study) và dịch tễ học thực nghiệm của Nguyễn Như Thanh (2001) [53]

Chúng tôi dùng phương pháp nghiên cứu cắt ngang tìm căn nguyên của bệnh

So sánh tần suất của hội chứng tiêu chảy giữa các nhóm khác nhau Các cá thể trong

cùng nhóm, cũng như các yếu tố nguy cơ, các thông tin khác đều được tiến hành trong cùng thời điểm nghiên cứu

2.4.1.1 Chọn mẫu điều tra

Chọn mẫu theo phương pháp ngẫu nhiên, mẫu chùm nhiều bậc Chọn ngẫu nhiên mỗi xã 3 thôn, mỗi thôn ngẫu nhiên chọn 3 hộ; trong thôn điều tra các hộ chăn nuôi lợn nái sinh sản và lợn con dưới 2 tháng tuổi

Số lần điều tra: 4 lần theo các mùa (mùa thu, mùa đông trong năm 2015; mùa xuân, mùa hè trong năm 2016)

2.4.1.2 Phương pháp

Trực tiếp quan sát để phát hiện lợn tiêu chảy Những lợn phân lỏng được coi

là bị tiêu chảy (loại trừ những lợn bị bệnh truyền nhiễm có triệu chứng tiêu chảy)

Phỏng vấn chủ hộ chăn nuôi về những thông tin cần thiết

Thông tin điều tra được ghi vào các phiếu điều tra

2.4.1.3 Nội dung điều tra, theo dõi

Số lợn con mắc tiêu chảy và chết do tiêu chảy tại các hộ, các trang trại chăn nuôi Các triệu chứng thường gặp ở lợn con mắc tiêu chảy

Các triệu chứng, bệnh tích ở lợn mắc tiêu chảy khi tiến hành mổ khám, lấy mẫu bệnh phẩm

Phương thức chăn nuôi và việc thực hiện vệ sinh chuồng trại

2.4.1.4 Các phương pháp đo lường trong dịch tễ

Số lợn tiêu chảy

- Tỷ lệ lợn mắc tiêu chảy (%) = x 100

Tổng số lợn điều tra

Số lợn tiêu chảy theo độ tuổi

- Tỷ lệ tiêu chảy theo độ tuổi (%) = x 100 Tổng số lợn theo độ tuổi được điều tra

Số lợn chết do tiêu chảy

- Tỷ lệ chết do tiêu chảy (%) = x 100 Tổng số lợn mắc tiêu chảy

2.4.1.5 Phương pháp phân tích dịch tễ

Để so sánh nguy cơ mắc bệnh tiêu chảy và chết do bệnh tiêu chảy ở lợn theo lứa tuổi, mùa vụ, phương thức chăn nuôi, chúng tôi dùng chỉ tiêu nguy cơ tương đối (Relative Risk - RR)

Theo Nguyễn Như Thanh (2001), [53] nguy cơ tương đối, biểu thị bằng các nguy cơ so sánh và được định nghĩa là nguy cơ phát triển một bệnh trong số các cá thể có cảm nhiễm (có tiếp xúc) với yếu tố nguy cơ nghi ngờ, được so sánh với nguy

cơ phát triển bệnh đó, trong số các cá thể không cảm nhiễm (không tiếp xúc) với yếu tố nguy cơ đó

Để so sánh một yếu tố nguy cơ với các nhóm bệnh và nhóm đối chứng liệu dịch tễ học được thể hiện ở bảng sau:

a: Số gia súc được chọn là có bệnh, có tiếp xúc với yếu tố nguy cơ

b: Số gia súc không có bệnh, nhưng tiếp xúc với yếu tố nguy cơ

c: Số gia súc có bệnh nhưng không có tiếp xúc

d: Số gia súc không có bệnh và cũng không có tiếp xúc

Nguy cơ tương đối được tính theo công thức sau:

 

//

O

Ie RR

Ie là tỷ lệ mắc bệnh ở nhóm có cảm nhiễm với yếu tố nguy cơ

Io là tỷ lệ mắc bệnh ở nhóm không cảm nhiễm với yếu tố nguy cơ

Đánh giá kết quả:

+ Nếu RR > 1 nói lên sự liên quan giữa bệnh và cảm nhiễm với yếu tố nguy

cơ, trị số RR càng lớn thì sự kết hợp giữa bệnh và cảm nhiễm càng mạnh

+ RR = 1 nói lên bệnh và cảm nhiễm không có liên quan gì đến nhau

+ RR < 1 nói lên một kết hợp âm tính

* Dùng khi bình phương (2) so sánh tần suất bệnh:

Bằng công thức của Nguyễn Văn Thiện và cs (2002) [55]

   

2 2

- Mẫu chất chứa đếm số lượng vi khuẩn: Mỗi con lợn lấy 3 - 6 mẫu ở các vị trí khác nhau của ruột, mỗi mẫu là 1 gram chất chứa ở trong ruột lợn ngay khi vừa

2.4.2.2 Phân lập và giám định vi khuẩn

Các phương pháp nuôi cấy và giám định vi khuẩn được thực hiện theo quy trình nghiên cứu thường quy của Bộ môn Công nghệ Vi sinh, Viện Khoa học Sự sống, Đại học Thái Nguyên

Mẫu là phân hoặc chất chứa trong ruột của lợn có triệu chứng tiêu chảy được ria cấy lên các môi trường thạch máu, thạch MacConkey và thạch DHL bồi dưỡng ở

tủ ấm 370C trong 24 giờ Trên các đĩa thạch sau 18 - 24 giờ nuôi cấy ở 370C

Cách xử lý bệnh phẩm: Cắt tổ chức bệnh phẩm ở phía trong, dùng que cấy vô trùng ngoáy vào phía trong của tổ chức bệnh phẩm rồi ria cấy trực tiếp lên thạch đĩa hoặc nghiền bệnh phẩm thành huyễn dịch với nước sinh lý theo tỷ lệ 1/10 rồi dùng que cấy vô trùng nhúng vào huyễn dịch và ria cấy trên thạch máu, thạch thường, thạch MacConkey, bồi dưỡng tủ ấm 370C trong 24 giờ Trên môi trường thạch

MacConkey khuẩn lạc của vi khuẩn E coli có màu hồng, tròn, nhỏ, rìa gọn hơi lồi,

không nhầy, đường kính khuẩn lạc 1,5 - 2 mm Sau đó chọn những khuẩn lạc thuần điển hình, đứng riêng rẽ để cấy chuyển sang thạch máu và nước thịt giữ giống để tiến hành giám định đặc tính sinh hóa

Căn cứ vào màu sắc, hình dạng khuẩn lạc trên các môi trường mà có thể xác định và phân loại vi khuẩn đường ruột Những khuẩn lạc điển hình của vi

khuẩn E coli được phết kính kiểm tra hình thái và tiến hành giám định bằng các

đặc tính sinh vật, hoá học của vi khuẩn Xác định là thuần khiết thì dùng trong việc xác định serotype và giữ giống để tiến hành các thí nghiệm khác

Sơ đồ quy trình phân lập và xác định các yếu tố gây bệnh của

vi khuẩn E coli (Bộ môn Công nghệ Vi sinh, Viện Khoa học Sự sống, Đại học

Kiểm tra hình thái

phiến kính

Xác định các yếu tố gây bệnh Xác định độc lực

Cấy thuần

Thạch máu, tủ ấm

37oC/24-48h

Bệnh phẩm (Phân, phủ tạng của lợn con bị tiêu chảy)

2.4.3 Phương pháp xác định đặc tính sinh hoá của vi khuẩn E coli

Các phản ứng sinh hoá học dùng để xác định vi khuẩn E coli bao gồm: 2.4.3.1 Phản ứng sinh Indol

Nguyên tắc: phát hiện các vi sinh vật có enzym tryptophanase chuyển hóa trypton tạo thành indol

- Cấy vi khuẩn vào nước trypton, ủ 370C/24 h

- Nhỏ vài giọt thuốc thử Kovacs, phản ứng dương tính: có vòng màu đỏ cánh sen nổi lên trên (do Indol kết hợp với p-dimethylaminobenzal dehyde trong thuốc thử Kovacs), nếu không có màu hoặc màu vàng: phản ứng âm tính

- Với các chủng sinh Indol chậm: thử sau 48 h

- Dương tính: màu đỏ cánh sen

- Cấy vi khuẩn vào môi trường MR - VP Ủ 37 0C/24 - 48 h

- Nhỏ 6 giọt thuốc thử A (5% α naphtol) và 2 giọt thuốc thử B( KOH 40%) Lắc nhẹ

- Cấy vi khuẩn vào môi trường Citrat Simmons, ủ 35 - 370C/24 h

- Phản ứng dương tính: môi trường đổi từ màu xanh lá cây sang màu xanh nước biển

- Phản ứng âm tính: môi trường không đổi màu

2.4.3.4 Phản ứng MR

Nguyên tắc: phát hiện các vi khuẩn lên men glucose tạo sản phẩm acid bền

- VK có phản ứng MR dương tính: pH môi trường ngày càng giảm

- VK có phản ứng MR âm tính: pH môi trường tăng dần (các sản phẩm có tính acid tạo thành lại chuyển hóa tạo thành các sản phẩm trung tính)

- Cấy vi khuẩn vào canh thang MR - VP Ủ 370C từ 2 - 5 ngày

- Nhỏ vài giọt đỏ methyl 0,02%, đọc kết quả ngay Phản ứng (+) có màu đỏ,

âm tính màu vàng

2.4.3.5 Phản ứng lên men sinh hơi đường, sinh H2S

Đặc tính lên men đường sucrose, lactose, manitol, sinh H2S

* Môi trường

Chuẩn bị môi trường TSI hay Kligler (theo hướng dẫn của nhà sản xuất) Thạch nghiêng chế từ Kligler hoặc TSI Thạch màu đỏ và có 2 phần: phần thạch đứng bên dưới để kiểm tra khả năng lên men đường glucoza, sinh hơi, sinh H2S, phần thạch nghiêng để kiểm tra khả năng lên men đường lactoza

* Tiến hành

Lấy khuẩn lạc nghi ngờ cấy thẳng (chính giữa phần thạch đứng) xuống đáy ống nghiệm, rút dần que lên và tiếp tục cấy trên bề mặt nghiêng, nuôi cấy ở 37 0C trong điều kiện hiếu khí, sau 24h kiểm tra

* Đọc kết quả

- Lên men đường lactoza:

+ Dương tính: Mặt nghiêng màu vàng;

+ Âm tính: Mặt nghiêng màu hồng

- Lên men đường glucose:

+ Dương tính: Phần thạch đứng màu vàng;

+ Âm tính: Phần thạch đứng màu hồng

- Khả năng sinh H2S:

+ Dương tính: đáy ống nghiệm có màu đen;

+ Âm tính: đáy ống nghiệm không có màu đen