Protein trị liệu ĐH KHTN tài liệu cao học chú thích rõ ràng

Protein trị liệu ĐH KHTN tài liệu ôn thi chú thích rõ ràng. Tài liệu ôn thi môn SHPT trong lĩnh vực chăm sóc sức khỏe trường HKTN cao học. Lịch sử nghiên cứu protein trị liệu 2  1922: Insulin được tinh chế lần đầu tiên từ bò và lợn và được dùng để điều trị bệnh tiểu đường type 1.  1982: Insulin người được sản xuất bằng công nghệ DNA tái tổ hợp.  1986: Interferonα (IFNα) và muromonabCD3 (chất ức chế miễn dịch) được sản xuất.  1989: Erythropoietin, nhân tố tăng trưởng bạch cầu hạt (GCSF) và nhân tố tăng trưởng đại thực bào (GMCSF) được chấp thuận.  1993: Interferonβ được sản xuất để điều trị đa xơ cứng (multiple sclerosis), dornaseα được thương mại hóa để điều trị xơ cứng hóa túi nang (cystic fibrosis).  1997: Kháng thể rituximab và daclizumab được tạo thành.  2000: PEG – interferon α2b được sản xuất và thương mại hóa.  2002: PEG – interferon α2a được sản xuất và thương mại hóa.  2006: Insulin có thể uống được được tạo thành 3 PROTEIN TRỊ LIỆU Protein có vai trò quan trọng và đa dạng trong hoạt động sống của cơ thể . Số gen người ước tính từ 25.000 đến 40.000 gen với các cơ chế splicing và biến đổi sau dịch mã  Số lượng protein trong cơ thể rất lớn. Một cách cụ thể thì bản thân gen bệnh không trực tiếp gây bệnh nhưng chính sản phẩm protein của nó trực tiếp gây ra kiểu hình bệnh. Đến nay đã có hơn 130 protein trị liệu đã được cơ quan FDA cấp giấy phép lưu hành.

1

PROTEIN TRỊ LIỆU

THERAPEUTIC PROTEIN

2

Lịch sử nghiên cứu protein trị liệu

2

 1922: Insulin được tinh chế lần đầu tiên từ bò và lợn và được dùng để điều trị

bệnh tiểu đường type 1

 1982: Insulin người được sản xuất bằng công nghệ DNA tái tổ hợp

 1986: Interferon-α (IFN-α) và muromonab-CD3 (chất ức chế miễn dịch)

được sản xuất

 1989: Erythropoietin, nhân tố tăng trưởng bạch cầu hạt (G-CSF) và nhân tố

tăng trưởng đại thực bào (GM-CSF) được chấp thuận

 1993: Interferon-β được sản xuất để điều trị đa xơ cứng (multiple sclerosis), dornase-α được thương mại hóa để điều trị xơ cứng hóa túi nang (cystic

fibrosis)

 1997: Kháng thể rituximab và daclizumab được tạo thành

 2000: PEG – interferon α2b được sản xuất và thương mại hóa

 2002: PEG – interferon α2a được sản xuất và thương mại hóa

 2006: Insulin có thể uống được được tạo thành

viêm th ầ n kinh -> ứ c ch ế d ẫ n truy ề n th ầ n kinh

gi ả m ti ế t ch ấ t nh ầ y

ch ố ng th ả i ghép

t ă ng th ờ i gian bán th ả i

3

PROTEIN TRỊ LIỆU

-Protein có vai trò quan trọng và đa dạng trong hoạt động sống của cơ thể

-Số gen người ước tính từ 25.000 đến 40.000 gen với các cơ chế splicing và biến đổi sau dịch mã  Số lượng protein trong cơ thể rất lớn

-Một cách cụ thể thì bản thân gen bệnh không trực tiếp gây bệnh nhưng chính sản phẩm protein của nó trực tiếp gây ra kiểu hình bệnh

-Đến nay đã có hơn 130 protein trị liệu đã được cơ quan FDA cấp giấy phép lưu hành

4

ƯU ĐIỂM CỦA PROTEIN TRỊ LIỆU

1 Độ phức tạp cao trong chức năng protein

2 Độ đặc hiệu cao  ít phản ứng phụ  nhắm trúng đích

3 Do protein có bản chất nội sinh  ít gây miễn dịch

4 Thay thế liệu pháp gen

2 Có nguồn gốc từ công nghệ tái tổ hợp DNA

-Ví dụ: hormon, interferon, protein tăng hồng cầu, bạch cầu, insulin……

-Nhiều hệ thống biểu hiện: vi khuẩn, nấm men, động vật

Ưu điểm

-Thu nhận các protein không thu nhận được từ động vật

-Chi phí rẻ hơn rất nhiều so với protein thu nhận từ động vật

-Không có nguy cơ lây nhiễm

-Có thể tạo ra được protein từ mọi gen bất kz

-Tạo ra protein tái tổ hợp có những đặc tính mới

6

PHÂN LOẠI CÁC PROTEIN TRỊ LIỆU

1 Nhóm 1: Enzyme và các protein điều hòa

2 Nhóm 2: Protein nhắm trúng đích

3 Nhóm 3: Protein vaccine

4 Nhóm 4: Protein chẩn đoán

7

PROTEIN TRỊ LIỆU NHÓM 1: ENZYME VÀ CÁC PROTEIN ĐIỀU HÒA

Phân nhóm Ia  Thay thế protein bị thiếu hụt trong cơ thể bằng protein từ bên ngoài

Ví dụ: Yếu tố đông máu VIII trong bệnh Hemophilia A, các enzyme trong bệnh Cystic Fibrosis

là không có hoàn toàn luôn

8

PROTEIN TRỊ LIỆU NHÓM 1: ENZYME VÀ CÁC PROTEIN ĐIỀU HÒA

Phân nhóm Ib  Tăng cường mức độ và thời gian hoạt động của protein

Ví dụ: Erythropoietin để tăng hồng cầu, G-CSF để tăng bạch cầu

9

PROTEIN TRỊ LIỆU NHÓM 1: ENZYME VÀ CÁC PROTEIN ĐIỀU HÒA

Phân nhóm Ic  Thêm một chức năng của protein mà bình thường cơ thể không sản sinh

Ví dụ: Collagenase điều trị vết thương, DNase I trong bệnh Cystic fibrosis

10

PROTEIN TRỊ LIỆU NHÓM 2: PROTEIN NHẮM TRÚNG ĐÍCH

Phân nhóm IIa  sử dụng kháng thể hoặc immuniadhesin để tiêu diệt phân tử đích hoặc

tế bào đích bằng cơ chế miễn dịch của cơ thể

Ví dụ: Etanercept để điều trị các bệnh tự miễn, Rituximab trong điều trị bệnh ung thư bạch cầu B non-Hodgkin

nh ư lupus ban đỏ

11

PROTEIN TRỊ LIỆU NHÓM 2: PROTEIN NHẮM TRÚNG ĐÍCH

Phân nhóm IIb  Các protein vận chuyển đặc hiệu mục tiêu

Ví dụ: Gemtuzumab trong bệnh bạch cầu cấp dòng tủy, VP22 trong bệnh u xương ác tính

12

PROTEIN TRỊ LIỆU NHÓM 3: PROTEIN VACCINE

Phân nhóm IIIa  Sử dụng chính protein làm vaccine phòng bệnh ngoại nhiễm

Ví dụ: HBsAg để phòng ngừa nhiễm HBV, capsid protein làm vaccine phòng ngừa HPV

13

PROTEIN TRỊ LIỆU NHÓM 3: PROTEIN VACCINE

Phân nhóm IIIb  Protein làm tăng tính khoan dung miễn dịch

Ví dụ: Anti-Rhesus D antigen

14

PROTEIN TRỊ LIỆU NHÓM 3: PROTEIN VACCINE

Phân nhóm IIIc  Vaccine kháng ung thư

Ví dụ: Vaccine cho bệnh ung thư bạch huyết Non- Hodgkin

15

PROTEIN TRỊ LIỆU NHÓM 4: PROTEIN CHẨN ĐOÁN

-Được xếp vào protein trị liệu do đóng vai trò quan trọng trong điều trị

-Ví du: GHRH trong bệnh rối loạn nội tiết, antigen để phát hiện kháng thể kháng virus

2 Kháng thể trung hòa hoạt tính do cơ thể tạo ra

3 Các cơ chế biến đổi sau dịch mã phải hoàn toàn chính xác

4 Giá thành còn cao

Triển vọng:

1 Kết hợp với thuốc phân tử nhỏ  hiệu quả điều trị cao hơn

2 Các công nghệ đang phát triển  giá thành sẽ rẻ hơn

3 Quan tâm ngày càng lớn của xã hội

Interferon

Resourse :ISICR (International Society Interferon and Cytokine reaseach)

LỊCH SỬ PHÁT HIỆN INTERFERON

INTERFERON

là m ộ t phân t ử tín hi ệ u, có nh ữ ng th ụ th ể trên màng t ế bào ti ế p nh ậ n để kích ho ạ t quá trình sinh mi ễ n d ị ch, th ườ ng đ áp ứ ng ở

mi ễ n d ị ch s ơ c ấ p

INTERFERON VÀ MIỄN DỊCH

kích ho ạ t

ứ c ch ế s ự xâm nh ậ p sâu c ủ a vk

IL-PHÂN LOẠI INTERFERON

Review ARTICLE

Front Cell Infect Microbiol., 28 April 2014 | doi: 10.3389/fcimb.2014.00050

PHÂN LOẠI INTERFERON

24

INTERFERON VÀ HCV

 Tóm tắt các mức can thiệp của HCV đến bộ máy kháng virus của vật chủ:

1 Phá vỡ con đường cảm nhận

virus thông qua protease 4A – qua trung gian phân cắt các phân tử adaptor MAVS và TRIF

Interferon therapy of hepatitis C: Molecular insights

into success and failure

11·www.smw.ch

25

ĐỀ KHÁNG INTERFERON CỦA HCV

Điều trị HCV

• Viêm gan C là bệnh truyền nhiễm

do Hepatitis C virus (HCV) gây nên

• Bệnh thường không có triệu

• HCV được phát hiện 1989

VIÊM GAN SIÊU VI C

HCV VÀ HCC

Dịch tễ học

 Tình hình nhiễm HCV trên thế giới:

Theo ước tính của Tổ chức y tế thế giới (3/2011), tỉ lệ nhiễm HCV trên thế giới 2,2

%, khoảng 170 triệu người, 3-4 triệu người mới nhiễm bệnh mỗi năm

29

Dịch tễ học (tt)

 Tình hình nhiễm HCV ở Việt Nam:

Theo thống kê của Bộ Y tế, có 2 triệu người đang mắc viêm gan siêu vi (VGSV) C, trong

đó tỷ lệ tử vong chiếm gần 6%

Khoảng 85% trường hợp nhiễm HCV biến chuyển thành viêm gan C mạn, khoảng 20- 25% sẽ chuyển qua giai đoạn xơ gan, ung thư gan

30

Sự cần thiết phải điều trị HCV

 HCV là nguyên nhân của:

 20% viêm gan cấp tính

 70% viêm gan mãn (hiện diện virus/máu + gan > 6tháng)

 40% xơ gan giai đoạn cuối

 60% ung thư tế bào gan

 30% trường hợp phải ghép gan

31

Tại sao cần điều trị HCV?

 Hiện tại không có thuốc chủng ngừa VGSV C

 Điều trị VGSV C mãn tính có nhiều tiến bộ trong vòng 20 năm qua, có thể điều trị được và điều trị khỏi hoàn toàn  nên điều trị khi phát hiện

32

Lưu ý:

Có 6 genotype HCV chính:1, 2, 3, 4, 5, 6

Việt Nam thường gặp HCV với type 1, 6 và 2 hoặc 3

 Genotype: tiên đoán được khả năng đáp ứng

điều trị và xác định được thời gian điều trị

Nồng độ HCV RNA/máu: giúp tiên đoán khả

năng đáp ứng điều trị

34

Điều trị HCV tối ưu

 Phác đồ điều trị chuẩn hiện nay:

tại Việt Nam là Pegasys®) hoặc Peg-interferon alfa-2b (tên thương mại hiện có tại Việt Nam

là Peg-Intron)

Ribavirin (RBV)

35

 Rapid virologic response (RVR) : kết quả PCR RNA HCV huyết

thanh âm tính tại tuần thứ 4

 Early virilogic response (EVR) :

o Complete EVR (cEVR): kết quả PCR RNA HCV huyết thanh

âm tính tại tuần thứ 12

o Partial EVR (pEVR): giảm lượng RNA HCV hơn 2 log tại tuần

thứ 12

 End of treatment virologic response (ETVR) : kết quả PCR RNA

HCV huyết thanh âm tính khi dừng điều trị

 Virologic breakthrough : RNA HCV hiện diện lại trong huyết

thanh khi vẫn đang điều trị

 Sustained virologic response (SVR) : kết quả PCR RNA HCV

huyết thanh âm tính sau 6 tháng hoàn tất điều trị

 Virologic relapse : kết quả PCR RNA HCV huyết thanh âm tính

khi hoàn tất điều trị nhưng RNA HCV hiện diện lại sau đó

 Nonresponse : tồn tại RNA HCV trong suốt quá trình điều trị

Đánh giá đáp ứng điều trị HCV

HCV: Hepatitis C virus; IFN-α: Interferon-α; SVR: Sustained virologic response; α: Peginterferon-α

pegIFN-Lịch sử phát triển của IFN trong điều trị HCV

PEGASYS ®

 Hãng sản xuất: Hoffmann la Roche

 Chứa IFN-α-2a tái tổ hợp sản xuất trên E.coli, gắn

gốc PEG 40kDa, trọng lượng phân tử khoảng 60kDa

 Thuốc được FDA cho phép sử dụng rộng rãi vào 10/2002

 Giá thành đắt:

Pegasys 180mcg 4,4 triệu đồng/lọ

Pegasys 135mcg 3,4 triệu đồng/lọ

38

PEG-INTRON

 Hãng sản xuất: Schering-Plough

 Chứa IFN-α-2b tái tổ hợp sản xuất trên E.coli, gắn

gốc PEG 12kDa, trọng lượng phân tử khoảng 31kDa

 Thuốc được FDA cho phép sử dụng rộng rãi vào 1/2001

 Giá thành đắt:

Peg-Intron 50mcg 2 triệu đồng/lọ

Peg-Intron 80mcg 3,2 triệu đồng/lọ

39

 Sản xuất IFN trong các tế bào người

 Sản xuất IFN tái tổ hợp (TTH) trong các hệ

Sản xuất IFN tái tổ hợp trong

Sản xuất rhIFN-α2b

Quy trình sản xuất rhIFN-α-2b – Tạo dòng tế bào mang gen

P Srivastava, P Bhattacharaya, G Pandey, and K J Mukherjee, "Overexpression and

purification of recombinant human interferon alpha2b in Escherichia coli," Protein Expr

Purif, vol 41, pp 313-22, Jun 2005 42

Quy trình sản xuất rhIFN-α-2b

quy mô lớn

43

• Protein sau khi tái gấp cuộn được kiểm tra cấu hình tự nhiên bằng điện di Native-PAGE, so sánh với protein chuẩn

• Protein tinh sạch được kiểm tra hoạt tính trên

tế bào nuôi cấy và chuột thí nghiệm

44

Quy trình sản xuất rhIFN-α-2b

quy mô lớn

Tinh sạch và tái hoạt tính IFN

SDS-PAGE kiểm tra protein

 Ưu điểm:

- Đặc điểm di truyền của vi khuẩn đã được hiểu rõ

- Dễ thao tác, môi trường nuôi cấy đơn giản, rẻ tiền

- Vi khuẩn sinh sản nhanh và tạo protein với lượng lớn

 Nhược điểm:

- Tạo IFN ở dạng thể vùi, không được glycosyl hóa

- IFN chưa có hoạt tính, tốn nhiều chi phí tái gấp cuộn, năng suất sau gấp cuộn thấp

- Protein tạo ra có thể nhiễm nội độc tố

 Một số hướng cải tiến:

- Kích thích tế bào tạo protein dạng tan bằng cách thay đổi nhiệt độ nuôi cấy, gắn tín hiệu tiết cho protein

Phương pháp biến đổi/phân phối

 Phân phối lipid: liposome, các

hạt nano lipid rắn, mixen lipid

ngược, vi ống lipid

 Polymer vi hạt/hạt nano:

mixen polymer, hydrogel, vi

hạt, polymer phân hủy sinh học,

dẫn xuất của cellulose, màng

xốp và dendrimer

Lipid drug delivery

47

PEG-hóa

PEG-hóa là gắn kết một hoặc nhiều phân tử

PEG vào một phân tử khác, chẳng hạn như là

một protein có tính trị liệu  tối ưu hóa dược động học nhưng vẫn giữ nguyên hoạt tính

Polymer này không độc hại, không tích điện, không gây miễn dịch, không có tính kháng nguyên, hòa tan cao trong nước, làm tăng chu kỳ

bán hủy in vivo, tăng tính kháng protease, tăng

tính ổn định và được FDA chấp thuận

48

Cấu trúc PEG

PEG-hóa (tt)

49

PEG-hóa (tt)

 Mức độ tối ưu hóa

dược động học có tính

chuyên biệt cho từng

loại thuốc và thay đổi

50

PEG-hóa Interferon

Các cách gắn PEG:

1 PEG acyl hóa:

 Hoạt tính axit alkyl: phản

Đặc tính hóa sinh và sinh học của PEG interferon alfa-2b (12KD) và PEG interferon alfa-2a (40KD)

54

Đặc điểm của PEG-hóa trong PEG interferon alfa-2b (12KD) và PEG interferon alfa-2a (40KD)

55

So sánh dược động học của PEG interferon với interferon thông thường (không biến đổi)

(80ml/h) 56

Liều sử dụng PEG- IFN và RBV

(người lớn)

57

(Điều trị trong 48 tuần)

SVR cao hơn genotype 1

Đăc biệt Pt có EVR gần như đạt được SVR

Peginterferon alfa -2b và Ribavirin

genotype 6

The end