Các phương pháp nghiên cứu gen bệnh ĐH KHTN Cao Học chú thích rõ ràng

Các phương pháp nghiên cứu gene bệnh ĐH KHTN Cao Học chú thích rõ ràng Tài liệu đề cương cao học môn Sinh Học Phân Tử trong lĩnh vực chăm sóc sức khỏe. QUY TRÌNH NGHIÊN CỨU BỆNH DI TRUYỂN ĐƠN GEN Ở NGƯỜI 1.Xác định vị trí gen trên bộ gen 2.Nghiên cứu gen bệnh in vitro 3.Nghiên cứu gen bệnh in vivo

NGHIÊN CỨU GEN BỆNH Ở NGƯỜI

1 Bệnh di truyền đơn gen (monogenic disorder)

Cystic fibrosis, thalassemia, hemophilia, Duchene dystrophy syndrome

2 Bệnh di truyền đa gen (polygenic disorder)

Cao huyết áp, bệnh tim mạch, tiểu đường, Parkinson…

1

1 gen thay đổ i là b ệ nh li ề n

Bệnh di truyền đơn gen (monogenic disorder)

-Chỉ cần một thay đổi trên một gen gây ra triệu chứng bệnh

-Có thể ở dạng lặn hoặc trội

-Gen có thể ở dạng tự dưỡng hoặc liên kết với giới tính

-OMIM: database về các bệnh di truyền ở người

-Đa số bệnh di truyền đơn gen thuộc loại bệnh hiếm gặp

-Nghiên cứu bệnh di truyền đơn gen là cơ sở để nghiên cứu bệnh di truyền đa gen

C ả 2 c ặ p allele m ớ i gây b ệ nh

Ch ỉ càn 1 bên là đ c

QUY TRÌNH NGHIÊN CỨU BỆNH DI TRUYỂN

ĐƠN GEN Ở NGƯỜI

1.Xác định vị trí gen trên bộ gen

2.Nghiên cứu gen bệnh in vitro

3.Nghiên cứu gen bệnh in vivo

3

B Ằ NG PH ƯƠ NG PHÁP TRUY Ề N TH Ố NG

QUY TRÌNH NGHIÊN CỨU GEN BỆNH Ở NGƯỜI

1 Xác định vị trí gen bệnh trên bộ gen

-Phương pháp độc lập bản đồ gen

-Phương pháp phụ thuộc bản đồ gen

QUY TRÌNH NGHIÊN CỨU GEN BỆNH Ở NGƯỜI

1 Xác định vị trí gen bệnh trên bộ gen

SUBTRACTION CLONING

-Phát hiện đột biến mất gen

B Ẹ NH DNA NG ƯỜ I BT

C ấ t nh ỏ , tr ộ n l ẫ n b ằ ng ez c ắ t gi ớ i h ạ n

c ắ t c ơ h ọ c nhi ề u

bi ế n tinh r ồ i h ồ i tính

DNA ng bt

SUBTRACTION CLONING ĐỂ XÁC ĐỊNH GEN GÂY BỆNH DMD

-Bộ gen người bình thường được phân cắt với enzyme MboI để tạo thành các

đoạn nhỏ

-Bộ gen người mắc bệnh loạn dưỡng cơ Duchene (với hàm lượng cao gấp 500 lần hàm lượng bộ gen người bình thường) được phân nhỏ bằng lực cơ học

-Biến tính hai loại DNA bộ gen này và cho tái bắt cặp với nhau

-Nối các DNA vào vector được cắt trước bằng BamHI  chỉ có các DNA từ bộ gen

người bình thường không có bản sao trên DNA bộ gen bệnh được nối vào vector

 tập hợp các dòng DNA chứa vùng bị đột biến mất gen

-các bước kế tiếp là lai các dòng DNA này với người bệnh và người binh thường

để xác định vị trí trên bộ gen  xác định NST X là nơi chứa vùng gen đột biến  phân lập được vùng DNA khoảng 200 kb và sử dụng các kỹ thuật đi bộ trên NST, zoo blot để xác định gen

7

C ắ t th ườ ng xuyên h ơ n -> c ắ t thành nhi ề u đ o ạ n nh ỏ

Ch ỉ c ắ t 1 ch ỗ , và t ươ ng thích đầ u v ớ i Mbo1

QUY TRÌNH NGHIÊN CỨU GEN BỆNH Ở NGƯỜI

1 Xác định vị trí gen bệnh trên bộ gen

Phương pháp phụ thuộc bản đồ gen

Phân tích phả

hệ

Sàng lọc Markers liên

kết

Định vị Markers Định vị gene

khi không làm đượ c ph ươ ng pháp độ c l ậ p gen

là ch ỉ th ị di truy ề n nh ư gen bi ể u

hi ệ n ki ể u hình, VNTR, SNP

Ý NGHĨA CỦA VIỆC LẬP BẢN ĐỒ GEN

sắc thể

*Định vị gen trên bộ gen

*Phân tích kiểu gen

*Phân tích kiểu hình gây bệnh

Gen bệnh

QUY TRÌNH NGHIÊN CỨU GEN BỆNH Ở NGƯỜI

Các loại bản đồ gen: tập hợp các kỹ thuật sinh học nhằm cung cấp

các thông tin để xác định vi trí của gen trên bộ gen

Bản đồ di truyền tế bào

Bản đồ di truyền liên kết

Trình tự nucleotide bộ gen người

xem gen n ằ m trên nst nào

xem liên k ế t bao nhiêu %, bao nhiêu cmorgan

QUY TRÌNH NGHIÊN CỨU GEN BỆNH Ở NGƯỜI

Chức năng các loại bản đồ trong phát hiện gen bệnh:

Bản đồ di truyền tế bào: xác định NST chứa gen bệnh

Bản đồ di truyền liên kết: xác định khoảng cách di truyền giữa gen bệnh và các marker

Bản đồ vật l{: xác định vị trí vật l{ của gen bệnh trên bộ gen

11

các k ỹ thu ậ t cho phép bi ế t đượ c gen m ụ c tiêu n ằ m trên NST nào, có ý ngh ĩ a: xem NST đ ó có ch ỉ th ị di truy ề n nào, có di truy ề n liên k ế t v ớ i b ệ nh hay không?

nh ư v ậ y mình bi ế t đượ c s ự liên k ế t và kho ả ng cách gi ữ a ch ỉ th ị di truy ề n và gen m ụ c tiêu, bi ế t đượ c kho ả ng cách là nh ờ b ả n đồ v ậ t lý.

CÁC LOẠI BẢN ĐỒ DI TRUYỀN TẾ BÀO

1 Xác định gen nằm trên NST

-Bản đồ lai sinh dưỡng (somatic cell hybridization)

2 So sánh các NST để tìm sự bất thường

-Nhuộm NST (Chromosome banding)

-Tô màu NST (Chromosome painting)

-Bản đồ CGH (Comparative Genomic Hybridization)

-Digital karyotyping

3 Xác định vị trí gen trên NST

-Lai tại chỗ huznh quang (FISH)

Trên t ế bào

13

SOMATIC CELL HYBRIDIZATION

lai t ế bào sinh d ưỡ ng

nguyên bào s ợ i ng ườ i

t ạ o tb lai, ch ứ a nst c ủ a chu ộ t và ng NST ng b ị m ấ t đ i 1 cách ng ẫ u nhiên, còn chu ộ t thì v ẫ n gi ữ l ạ i nguyên v ẹ n.

B ổ sung s ả n ph ẩ m cho tb sinh

tr ưở ng

tb chu ộ t b ị lo ạ i enzyme TK

tb ng c ũ ng b ị lo ạ i HGPRT; c ả 2 ez này ch ị u trách nhi ệ m

t ổ ng h ợ p nên DNA cho tb sinh tr ưở ng

Không b ổ sung n ữ a -> ch ỉ có tb lai m ớ i s ố ng

NST ng và ch phân bi ệ t r ấ t rõ ràng, -> phát hi ệ n đượ c NST còn sót l ạ i là NST s ố m ấ y mà không b ị l ẫ n v ớ i chu ộ t

t ă ng c ườ ng 2 tb hòa màng vào nhau

ph ả i có tính ch ấ t gì đ ó đặ c tr ư ng để phát hi ệ n, ví d ụ gen t ạ o ánh sáng

gen m ụ c tiêu n ằ m trên NST s ố 4

NGUYÊN LÝ CỦA BẢN ĐỒ DI TRUYỀN LIÊN KẾT

-Được dùng để xác định khoảng cách giữa các gen trên NST

-Sử dụng một chỉ thị di truyền với vị trí đã biết để xác định vị trí gen quan tâm

-Sử dụng tần số tái tổ hợp để tính khoảng cách giữa các gen: 1%

TTH = 1 cM

-Không cho biết vị trí chính xác (đến nucleotide) của gen đích trên

bộ gen

-Tần số TTH = số lượng cá thể con TTH/Tổng số cá thể con x 100

N ế u kho ả ng cách đủ xa thì s ẽ x ả y ra hi ệ n t ượ ng hoán v ị or tái t ổ h ợ p (tth là b ố và m ẹ không có ki ể u hình đ ó)

17

NGUYÊN LÝ CỦA BẢN ĐỒ DI TRUYỀN LIÊN KẾT

Ở sinh vật bậc thấp đơn bội:

chúng

Ở sinh vật bậc thấp nhị bội:

di truyền  khoảng cách di truyền giữa chúng

Ở sinh vật bậc cao:

chúng

17

Cách tính t ầ n s ố TTH khác nhau ở các lo ạ i sinh v ậ t khoác nhau

K ỹ thu ậ t th ố ng kê

PHƯƠNG PHÁP TÍNH TẦN SỐ TTH Ở NGƯỜI

PHƯƠNG PHÁP LOD SCORE

cho phép tính t ầ n s ố TTH ở ng mà không c ầ n dùng lai phân tích ( ng thì sao mà lai phan tích đượ c)

d ễ b ị sai s ố , do đ ó nhi ề u nhóm cùng công b ố 1 k ế t qu ả thì m ớ i tinh c ậ y cao h ơ n.

khoảng cách giữa hai gen, tính bằng cM  12,5% = 12,5 cM

liên k ế t v ớ i nhóm máu đ ã bi ế t n ằ m trên 1 NST r ồ i, gi ờ xem xem chúng cách nhau cM

ki ể u hình không tái t ổ h ợ p

CÁC KIỂU BẢN ĐỒ VẬT LÝ

1 Kỹ thuật lập bản đồ cắt giới hạn (Restriction map)

21

Là các k ỹ thu ậ t SHPT

TÌM VỊ TRÍ GEN ĐÍCH BẰNG KỸ THUẬT CHROMOSOME WALKING

Gen đích liên kết với 1 hay nhiều chỉ thị di truyền  khoảng cách giữa chúng được xác định  từ vị trí của chỉ thị di truyền trên bộ gen để “đi bộ trên NST” tới gen đích

Tiến hành:

1.Lập thư viện bộ gen

2.Dùng chỉ thị di truyền làm mẫu dò  phát hiện dòng DNA trong thư viện bộ gen có chứa trình tự nucleotide của chỉ thị di truyền  giải trình tự nucleotide hoặc phân tích bằng enzyme cắt giới hạn dòng DNA này để tìm ra gen đích

3.Nếu chưa tìm thấy gen đích trong dòng DNA đầu tiên  sử dụng một đoạn DNA ngắn ở đầu 3’ của dòng DNA đầu tiên làm mẫu dò thứ hai  phát hiện dòng DNA trong thư viện bộ gen có chứa trình tự nucleotide của mẫu dò thứ hai  giải trình tự nucleotide hoặc phân tích bằng enzyme cắt giới hạn dòng DNA thứ hai này để tìm ra gen đích

4.Nếu vẫn chưa tìm ra gen đích trong dòng DNA thứ hai thì lặp lại các bước như trên

KỸ THUẬT ĐI BỘ TRÊN NST – CHROMOSOME WALKING

23

Ch ỉ th ị di truy ề n 1 Chỉ th ị di truy ề n 2

Khi đ i h ế t mình thu đượ c trình t ự c ủ a đ o ạ n lai

XÁC ĐỊNH GEN TRONG VÙNG ĐI BỘ/NHẢY

Ở độ ng v ậ t b ậ c cao có nh ữ ng vùng vô cùng b ả o t ồ n gi ữ a các loài

Xem có ph ả i là exon hay không

EST là nh ữ ng đ o ạ n DNA ng ắ n, đế n t ừ các cDNA ở trong c ơ th ể ng ườ i

Nh ả y b ằ ng cách đ óng vòng nó l ạ i, r ồ i phân tích ti ế p theo Nh ư v ậ y s ẽ b ỏ qua đượ c 1 đ o ạ n r ấ t l ớ n mà không ph ả i đ i b ộ t ừ t ừ

LIÊN KẾT CÁC LOẠI BẢN ĐỒ: DI TRUYỀN TẾ BÀO + LIÊN KẾT + VẬT LÝ

TRONG XÁC ĐỊNH GEN BỆNH

thuộc NST nào

Khoảng cách gen bệnh và chỉ thị di truyền trên NST

XÁC ĐỊNH VỊ TRÍ GEN GÂY BỆNH CYSTIC FIBROSIS

-Bệnh di truyền đơn gen, gen lặn nằm trên NST thường

-Protein CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator): chịu trách nhiệm vận chuyển Cl - qua màng tế bào

-Đột biến thường gặp trên gen mã hóa protein CFTR là F508

-Protein CFTR bị đột biến không còn khả năng đến gắn vào màng tế bào  chức năng vận chuyển Cl - bị ảnh hưởng

-Tế bào giữ nước bên trong để cân bằng nồng độ Cl -

-Ở bề mặt phổi, tuyến tụy, tuyến mồ hôi không có nước để tẩy rửa các chất nhờn như bình thường  chất nhờn kết tụ  thay đổi chức năng bình

thường của các cơ quan  bệnh

NGHIÊN CỨU GEN CF – PHÂN TÍCH PHẢ HỆ

Bệnh di truyền lặn NST thường

27

Sàng l ọ c đượ c marker liên k ế t (slide ti ế p) Không theo gi ớ i tính

Xác đị nh kho ả ng cách di truy ề n

NGHIÊN CỨU GEN CF – SÀNG LỌC MARKER LIÊN KẾT

NGHIÊN CỨU GEN CF – XÁC ĐỊNH NST CHỨA MARKER

29

mà liên k ế t ch ặ t ch ẽ

NGHIÊN CỨU GEN CF – XÁC ĐỊNH NST CHỨA MARKER

n ằ m trên NST s ố 7

31

NGHIÊN CỨU GEN CF – ĐI BỘ TRÊN NST

EcoR I restriction fragment

(frag RI)

EcoR I genomic DNA library

frag RI

L ậ p b ả n đồ c ắ t gi ớ i h ạ n,

Cắt frag RI bằng các RE khác nhau

Điện di trên gel agarose

NGHIÊN CỨU GEN CF – ĐI BỘ TRÊN NST

33

Tiến hành lai Southern Blot với mẫu dò cho MET

NGHIÊN CỨU GEN CF – ĐI BỘ TRÊN NST

Bản đồ RE cho frag RI

Phân lập đoạn Sal I – EcoR I fragment (2.5kb) và sử dụng

nó như mẫu dò tiếp theo trong Sal I genomic library

NGHIÊN CỨU GEN CF – ĐI BỘ TRÊN NST

35

Dùng Sal I – EcoR I fragment (2.5kb) làm mẫu dò

 Xác định Sal I restriction fragment (fragment S)

NGHIÊN CỨU GEN CF – ĐI BỘ TRÊN NST

Tiến trình tiếp tục cho đến khi “đi” đến D7S8

NGHIÊN CỨU GEN CF – ĐI BỘ TRÊN NST

37

 CpG island: là vùng có tần số xuất hiện CpG cao nhưng lại

không bị methyl hóa trên bộ gene, nó thường gắn liền với đầu 5' của hầu hết các house-keeping gene và nhiều tissue-specific gene

 Thông thường đảo CpG nằm chồng lên vùng promoter và kéo dài khoảng 1000 base về phía vùng phiên mã

NGHIÊN CỨU GEN CF – XÁC ĐỊNH GEN BẰNG ĐẢO CpG

XÁC ĐỊNH GEN CFTR TRONG VÙNG TRÌNH TỰ TỪ MET ĐẾN D7S8

1 Đảo CpG

2 Zoo blot

39

NGHIÊN CỨU GEN CFTR

-4 probe bảo tồn ở động vật có vú (Zoo blot) được sử dụng để sàng lọc gen CFTR  1 probe cho tín hiệu Northern blot dương tính

-Sử dụng probe này sàng lọc trong thư viện cDNA chứa gen CFTR

 sử dụng cDNA này để sàng lọc gen CFTR từ vùng gen nằm giữa met và D7S8

-Người ta cũng sử dụng kỹ thuật giải trình tự để tìm ra trình tự

nucleotide của gen CFTR để làm cơ sở cho các phân tích về sau

-Xác nhận gen CF trong dòng DNA bằng phương pháp đột biến mất chức năng và bổ trợ trên dòng tế bào hoặc mô hình chuột

 Quan sát kiểu hình

41

NGHIÊN CỨU GEN CF – KẾT QUẢ

-Gen mã hóa CFTR nằm trên cánh dài của NST số 7

ở vị trí 7q31.2

-Vị trí chính xác trên bộ gen là từ nucleotide

116.907.253 đến nucleotide 117.095.955

KHI BỘ GEN NGƯỜI ĐÃ ĐƯỢC GIẢI TRÌNH TỰ NUCLEOTIDE

 Xác định gen bệnh như thế nào?

43

DỰ ÁN BỘ GENE NGƯỜI

Human Genome Project - HGP

CẦN THIẾT HIỂU BIẾT

VỀ BỘ GENE NGƯỜI

Nghiên c ứ u gen b ệ nh b ằ ng ph ươ ng pháp hi ệ n đạ i tr ở nên nhanh chóng h ơ n nh ờ d ự án gi ả i trình t ự b ộ gen ng ườ i.

LỊCH SỬ DỰ ÁN

Dự án nghiên cứu khoa học

quốc tế với mục đích chính

là xác định trình tự của các

cặp nucleotide trên DNA

• 1990, Bộ Năng lượng Hoa Kz (DOE) và Viện y tế Quốc gia (NIH) k{ kết biên bản ghi nhớ kế hoạch phối hợp

• Kinh phí 3 tỉ USD, dự kiến 15 năm

• Đa quốc gia: Hoa Kz, Anh, Pháp, Australia, Nhật Bản

• Hoàn thành một phần vào năm 2003

45

•

• 10/1990, những nỗ lực đầu tiên của HGP chủ yếu tập trung vào việc phát triển & tự động hóa các phương pháp dòng hóa & giải trình tự DNA; xây dựng các bản đồ di truyền & vật lý một cách chi tiết

• 1993 hoàn chỉnh bản đồ vật lý của các cặp NST; cùng lúc kĩ thuật giải trình tự tự động hóa ra đời, tạo điều kiện cho việc giải trình tự quy mô lớn trở nên dễ dàng

• 1995: là bước ngoặc quan trọng của HGP chuyển từ lập bản đồ (sắp xếp gene trên NST) sang giải trình tự

• 5/1998, Celera Genomics (Perkin-Elmer Corporation) ra đời với

chiến lược “Whole genome shotgun” => Việc tạo các phần mềm định

vị nhanh các trình tự chồng lấp trong hỗn hợp các đoạn nhỏ DNA, ráp thành trình tự liên tục

LỊCH SỬ DỰ ÁN

• Cơ bản đã được hoàn thành và công bố trong tháng 4 năm

2003, sớm hơn 2 năm so với dự định

• Hiện nay khoảng 92% bản đồ gen đã được hoàn thành

• Một số vùng chưa hoàn thành là xác định trình tự

– Vùng trung tâm của mỗi chromosome – centromeres

– Phần cuối của chromosome – telomere

– Vị trí chứa các họ gia đình đa gene

MỤC TIÊU

Xác định sự cấu thành về mặt di truyền của loài

người

• Dự đoán, xác định số lượng và vị trí gene

• Dự đoán gene mã hóa protein, chức năng

• Dự đoán các gene gây bệnh, phát triển phương

Ý nghĩa

• Xác định khoảng ba tỷ đơn vị hóa học di truyền của con người

• Truy cập vào cơ sở dữ liệu chung về bộ

gen, có thể biết thông tin về gen mục tiêu cần nghiên cứu bao gồm:

– cấu trúc và chức năng protein

– mối quan hệ tiến hóa sinh vật

– các đột biến

– khả năng tương tác các gen

– các bệnh liên quan đến cấu trúc gen

– …

49

• Mở đường cho các nghiên cứu tiếp theo để

xác định các biến thể di truyền làm tăng nguy

cơ các bệnh

• Tìm kiếm các nguồn gốc di truyền của bệnh và phát triển các phương pháp điều trị mới

• Phân tích sự giống và khác nhau giữa các

chuỗi DNA từ các sinh vật mở ra những hướng mới trong việc nghiên cứu l{ thuyết tiến hóa

Ý nghĩa

Sử dụng cùng kỹ thuật giải trình tự

phát triển bởi Sanger và những người khác

bằng việc phá vỡ DNA bộ gen thành những mảnh nhỏ ngẫu nhiên, chứa các đoạn chồng lấp lên nhau,

BAC Genomic DNA

PLasmid

PLasmid

Tạo một bản đồ vật lí thô

toàn bộ bộ gen trước khi

giải trình tự DNA

Việc xây dựng một bản

đồ đòi hỏi phải cắt các

NST thành những đoạn lớn

và xác định vị trí của các

đoạn DNA lớn này trước

khi tiến hành giải trình tự

tất cả các đoạn

BAC to BAC Sequencing

Shotgun sequencing

đi ngay vào giải mã, bỏ qua thành lập 1 bản đồ vật lí

Do đó, phương pháp này tỏ ra nhanh hơn nhiều so với phương pháp BAC to BAC

WGS sequencing

53

Các trình tự này được

chuyển vào 1 chương

trình máy tính có tên

PHRAP để tìm kiếm

những trình tự chung

cho việc nối kết

các đoạn với nhau

Các thuật toán vi tính sẽ lắp ráp hàng triệu các đoạn đã được

giải trình tự tạo thành một đoạn dài liên tục tương ứng với mỗi NST

BAC to BAC Sequencing WGS sequencing

BAC to BAC sequencing

Độ chính xác cao,

ít bị sai khi kết nối

Do đã có bản đồ vật lí

định hướng, nên trường

hợp lắp ráp các đoạn

ngẫu nhiên ít xảy ra

Nhược điểm:

tốn thời gian,

chi phí cao

WGS sequencing Nhanh hơn, Chi phí thấp

Nguy cơ lỗi nhiều hơn do lắp ráp sai

55

VẤN ĐỀ CỦA CÁC TRÌNH TỰ LẶP LẠI

57 CÁCH GIẢI QUYẾT

KHI BỘ GEN NGƯỜI ĐÃ ĐƯỢC GIẢI TRÌNH TỰ NUCLEOTIDE

 Xác định gen bệnh như thế nào?

KHI BỘ GEN NGƯỜI ĐÃ ĐƯỢC GIẢI TRÌNH TỰ NUCLEOTIDE

 Xác định gen bệnh như thế nào?

1 Tin Sinh học

Phân tích trình tự nucleotide  dự đoán chức năng của gen thông qua sản phẩm protein

Phân tích dựa vào so sánh trình tự nucleotide của gen mới với trình tự nucleotide của gen

đã biết chức năng

59