Nghiên cứu phân tích cấu trúc và hình thái tinh thể celecoxib trong các điều kiện kết tinh khác nhau

44 Bảng 3.3: Số liệu độ dịch chuyển hóa học ppm phân tích phổ 13C-NMR của các chất tổng hợp được và Celecoxib chuẩn... Do đó dạng tinh thể solvat hóa này không thể được sử dụng làm nguyê

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC –––––––––––––––––––––––––

NGUYỄN MẠNH HÙNG

NGHIÊN CỨU PHÂN TÍCH CẤU TRÚC

VÀ HÌNH THÁI TINH THỂ CELECOXIB TRONG CÁC ĐIỀU KIỆN KẾT TINH KHÁC NHAU

Chuyên ngành: Hóa phân tích

LỜI CẢM ƠN

Để luận văn này đạt kết quả tốt đẹp, tôi đã nhận được sự hỗ trợ, giúp đỡ của nhiều cơ quan, tổ chức, cá nhân Với tình cảm sâu sắc, chân thành, cho phép tôi được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến tất cả các cá nhân và cơ quan đã tạo điều kiện giúp đỡ trong quá trình học tập và nghiên cứu đề tài

Trước hết tôi xin gửi tới các thầy cô khoa anh chị tại Viện Hóa Học lời chào trân trọng, lời chúc sức khỏe và lời cảm ơn sâu sắc Với sự quan tâm, dạy dỗ, chỉ bảo tận tình chu đáo của thầy cô anh chị, đến nay tôi đã có thể hoàn thành luận văn,

đề tài:“Nghiên cứu phân tích cấu trúc và hình thái tinh thể celecoxib trong các điều kiện kết tinh khác nhau.”

Đặc biệt tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất tới thầy giáo– PGS.TS Ngô Quốc Anh đã quan tâm giúp đỡ, hướng dẫn tôi hoàn thành tốt luận văn này trong thời gian qua

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đến Thạc sĩ Nguyễn Lê Anh, thạc sĩ Nguyễn Thúy Hằng, các Khoa Phòng ban chức năng của Viện Hóa Học đã trực tiếp và gián tiếp giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu đề tài

Với điều kiện thời gian cũng như kinh nghiệm còn hạn chế của một học viên, luận văn này không thể tránh được những thiếu sót Tôi rất mong nhận được sự chỉ bảo, đóng góp ý kiến của các thầy cô để tôi có điều kiện bổ sung, nâng cao ý thức của mình, phục vụ tốt hơn công tác sau này

Xin chân thành cảm ơn!

Tác giả luận văn

Nguyễn Mạnh Hùng

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN a MỤC LỤC b DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT d DANH MỤC BẢNG e DANH MỤC HÌNH f DANH MỤC PHỤ LỤC g

MỞ ĐẦU 1

Chương 1: TỔNG QUAN 2

1.1 Tổng quan về celecoxib 2

1.1.1 Công thức cấu tạo và tính chất 2

1.1.2 Tác dụng dược lý và cơ chế tác dụng 3

1.1.3 Tác dụng phụ 6

1.1.4 Chống chỉ định 7

1.1.5 Chỉ định, liều dùng và cách dùng 8

1.1.6 Dạng thuốc và biệt dược 8

1.2 Phương pháp tinh chế 9

1.2.1 Kết tinh 9

1.2.2 Một số phương pháp kết tinh celecoxib 9

1.3 Phương pháp xác định cấu trúc 11

1.3.1 Phương pháp cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) 11

1.3.2 Phương pháp phân tích nhiệt (TGA) 16

1.3.3 Phân tích nhiệt trọng lượng (TGA) 17

1.3.4 Phương pháp phổ hồng ngoại (IR) 19

1.3.5 Phương pháp khối phổ (MS) 23

1.3.6 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) 31

1.3.7 Phương pháp nhiễu xạ tia X ( X – ray) 37

Chương 2: THỰC NGHIỆM 38

2.1 Nguyên liệu 38

2.2 Thiết bị thí nghiệm 39

2.3 Phương pháp nghiên cứu 40

2.3.1 Tinh chế 40

2.3.2 Kiểm tra độ tinh khiết và khẳng định cấu trúc 40

2.3.3 Kết quả 41

2.4 Phương pháp thực hiện 41

2.4.1 Kết tinh làm sạch celecoxib thô 41

2.4.2 Chuẩn bị các dạng tinh thể 41

2.4.3 Xác định đặc tính của các dạng tinh thể 41

Chương 3: KẾT QUẢ THẢO LUẬN 42

3.1 Khẳng định cấu trúc 42

3.1.1 Về phổ hồng ngoại (IR) 42

3.1.2 Về phổ khối lượng 42

3.1.3 Về phổ 1H-NMR và phổ 13C- NMR của các sản phẩm tổng hợp 43

3.1.4 Xác định dạng tinh thể bởi phân tích nhiệt vi sai 46

3.1.5 Xác định dạng tinh thể qua phân tích X-Ray 47

3.1.6 Xác định dạng tinh thể qua kính hiển vi điện tử 49

KẾT LUẬN 50

TÀI LIỆU THAM KHẢO 51 PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

COA : Certificate Of Analysis

COX : Cyclooxygenase

CTPT : Công thức phân tử

Et3N : Triethylamin

HPLC : Sắc ký lỏng hiệu lăng cao

(High – Performance Liquid Chromatography)

IC50 : Nồng độ ức chế 50%

IR : Phổ hồng ngoại (Infrared spectroscopy)

KLPT : Khối lượng phân tử

MS : Phổ khối (Mass spectrometry)

MTBE : Metyl tert-butyl ether

NMR : Phổ cộng hưởng từ hạt nhân

Nuclear Magnetic NSAIDs : Các thuốc giảm đau hạ sốt chống viêm không steroid

(Non Steroidal Anti-inflammatory Drugs)

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1: Phân loại thuốc chống viêm không steroid 5

Bảng 1.2: Tác dụng ức chế cyclooxygenase của celecoxib, IC50(μM) 6

Bảng 1.3: Một số các thông số dược động học của celecoxib 6

Bảng 1.4: Ảnh hưởng của Celecoxib và các NSAID trên tim mạch 7

Bảng 1.5: Tính chất của một số pha động trong sắc ký lỏng 33

Bảng 2.1: Danh sách các nguyên liệu, hóa chất, dung môi sử dụng 38

Bảng 3.1: Số liệu phân tích phổ khối lượng của các chất tổng hợp được 43

Bảng 3.2: Số liệu phân tích phổ 1H-NMR của các chất tổng hợp được và Celecoxib chuẩn 44

Bảng 3.3: Số liệu độ dịch chuyển hóa học (ppm) phân tích phổ 13C-NMR của các chất tổng hợp được và Celecoxib chuẩn 45

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1: Công thức cấu tạo của celecoxib 2

Hình 1.2: Cơ chế tác dụng của cyclooxygenase 4

Hình 1.3: Một số thuốc chống viêm không steroid 5

Hình 1.4: Sơ đồ cấu tạo của một thiết bị TGA (a) Một hệ TGA của hãng Orton (b) 18

Hình 1.5: Mẫu phân tích TGA của CaC2O4.H2O: 18

Hình 1.6: 19

Hình 1.7 21

Hình 1.8 22

Hình 1.9 24

Hình 1.10 25

Hình 1.11: Schematic of a MALDI-TOF Mass Spectrometer 26

Hình 1.12 27

Hình 1.13 30

Hình 1.14 30

Hình 1.15: Độ nhớt của hỗn hợp nước và dung môi hữu cơ ở 25oC 34

Hình 1.16 Thời gian lưu của cấu tử phân tích 35

Hình 1.17 37

Hình 3.1 44

Hình 3.2 Phổ DSC của celecoxib dạng III 46

Hình 3.3 Phổ DSC của mẫu 1,2,3 46

Hình 3.4 Phổ X-ray của celecoxib dạng III 47

Hình 3.5 Phổ X-ray của celecoxib mẫu 1 48

Hình 3.6 Phổ X-ray của celecoxib mẫu 2 48

Hình 3.7 Phổ X-ray của celecoxib mẫu 3 48

Hình 3.8 Hình ảnh tinh thể quan sát qua kính hiển vi điện tử 49

DANH MỤC PHỤ LỤC

Phụ lục 1: Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C –NMR của diceton

Phụ lục 2: Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H- NMR của diceton

Phụ lục 3: Phổ hồng ngoại của diceton

Phụ lục 4: Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C- NMR của celecoxib chuẩnPhụ lục 5: Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C- NMR của celecoxib (mẫu 1)Phụ lục 6: Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H - NMR của celecoxib(mẫu 2)Phụ lục 7: Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H- NMR của celecoxib (mẫu 3)Phụ lục 8: Phổ HPLC của celecoxib chuẩn

Phụ lục 9: Phổ HPLC của celecoxib mẫu 1

Phụ lục 10: Phổ HPLC của celecoxib mẫu 2

Phụ lục 11: Phổ HPLC của celecoxib mẫu cuối

Phụ lục 12: Phổ hồng ngoại của celecoxib chuẩn

Phụ lục 13: Phổ hồng ngoại của celecoxib

Phụ lục 14: Phổ khối lượng của celecoxib chuẩn

Phụ lục 15: Phổ khối lượng của celecoxib

MỞ ĐẦU

Các thuốc chống viêm không steroid (NSAIDs) là một trong những nhóm thuốc được dùng phổ biến nhất với ước tính khoảng 33 triệu người dùng trong một ngày trên toàn thế giới Tuy vậy, hạn chế lớn nhất của nhóm thuốc này là tác dụng phụ trên hệ tiêu hóa Có tới khoảng một phần ba số bệnh nhân sử dụng nhóm thuốc này có triệu chứng viêm loét dạ dày, tá tràng [15]

Nhiều giải pháp để hạn chế tác dụng phụ này như dùng kèm thuốc bảo vệ niêm mạc (ví dụ như thuốc kháng thụ thể H2, ức chế bơm proton…), tạo dạng bào chế giảm kích ứng niêm mạc… đã được sử dụng nhưng các giải pháp này đều có những hạn chế nhất định

Việc tìm ra hai đồng dạng (isoform) COX-1và COX-2 của men COX (cyclooxygenase) tham gia tổng hợp các prostaglandin (PG) từ acid arachidonic đã

mở ra hướng mới để khắc phục tác dụng phụ trên đường tiêu hóa của các NSAID [14],[32],[1] Các thuốc ức chế chọn lọc COX-2 là dẫn chất của diaryl như celecoxib, valdecoxib, parecoxib, etoricoxib, rofecoxib, lumiracoxib làm giảm PG gây viêm song vẫn duy trì quá trình tổng hợp các PG bảo vệ đường tiêu hóa [6],[1] Tuy nhiên,

do sự gia tăng nguy cơ huyết khối và nhồi máu cơ tim của nhóm thuốc này nên hiện nay chỉ còn celecoxib, parecoxib và etoricoxib được lưu hành trên thị trường, trong

đó celecoxib là thuốc được sử dụng rộng rãi nhất [8], tính riêng năm 2008, doanh số toàn cầu của thuốc này đã đạt 5,5 tỷ đô la

Việt Nam là một nước nhiệt đới, có khí hậu nóng ẩm và mưa nhiều, các bệnh thấp khớp, viêm xương khớp… chiếm tỉ lệ khá cao nên nhu cầu về các NSAID nói chung và celecoxib nói riêng khá lớn Celecoxib sử dụng tại Việt Nam, kể cả sản xuất trong nước vẫn phải nhập nguyên liệu từ nước ngoài nên giá thành cao hơn các thuốc chống viêm khác, làm hạn chế khả năng tuân thủ điều trị của bệnh nhân khi dùng lâu dài Vì vậy, việc nghiên cứu sản xuất nguyên liệu celecoxib tại Việt Nam

để người bệnh có cơ hội được sử dụng celecoxib generic từ nguyên liệu trong nước với giá thành hợp lý hơn là rất cần thiết Do đó, đề tài Nghiên cứu phân tích cấu trúc

và hình thái tinh thể celecoxib trong các điều kiện kết tinh khác nhau là thiết thực

Chương 1 TỔNG QUAN

1.1 Tổng quan về celecoxib

1.1.1 Công thức cấu tạo và tính chất [9], [25], [31], [33]

- CTPT: C17H14F3N3O2S

- Trọng lượng phân tử: 381,08 g/mol

- Công thức cấu tạo:

Hình 1.1: Công thức cấu tạo của celecoxib

- Tên khoa học: yl]benzensulfonamid

4-[5-(4-methylphenyl)-3-(trifluoromethyl)-1H-pyrazol-1 Cảm quan: Dạng bột kết tinh trắng hoặc vàng nhạt

- Nhiệt độ nóng chảy trong khoảng 157-159oC [31], 159-162oC [20], 162,3oC [24]

160,5 Độ tan: Celecoxib rất ít tan trong nước, độ tan trong nước là 3160,5 7µg/ml ở pH

= 7,0 và nhiệt độ 40oC, tan tốt trong methanol, chloroform và aceton Celecoxib ở dạng vô định hình thì dễ tan hơn dạng kết tinh

- pKa: Celecoxib thể hiện tính acid yếu với pKa = 11,1 do đó độ tan của celecoxib sẽ thay đổi theo pH của môi trường hòa tan

- Tính bất đối: Celecoxib không chứa trung tâm bất đối

1.1.2 Tác dụng dược lý và cơ chế tác dụng

1.1.2.1 Vài nét về viêm và cơ chế chống viêm của NSAIDs

* Viêm và vai trò sinh lý của cyclooxygenase

+ Viêm là phản ứng tại chỗ của cơ thể do các mô bị kích thích hoặc tổn thương

Đó là một phản ứng phức tạp của các mô liên kết và tuần hoàn mao mạch ở nơi bị tác động, được biểu hiện bằng các triệu chứng sưng, nóng, đỏ, đau và rối loạn chức phận Viêm có thể do nhiều nguyên nhân gây ra như nhiễm khuẩn, thiếu máu cục bộ, phản ứng kháng nguyên-kháng thể, hóa chất, nhiệt độ và tác nhân cơ học…

+ Khi bị tổn thương, màng tế bào giải phóng ra phospholipid màng Dưới tác dụng của phospholipase A2, chất này bị chuyển thành acid arachidonic Tiếp theo

đó dưới tác dụng của cyclooxygenase (COX), acid này bị chuyển hóa thành các prostaglandin Tác dụng của prostaglandin tùy thuộc vào vị trí tác dụng Khi được tạo ra tại nơi viêm, prostaglandin làm tăng tình trạng viêm cục bộ và làm tăng sự mẫn cảm với đau Ngược lại, đối với màng nhày của dạ dày và ruột, prostaglandin

có tác dụng bảo vệ và tăng tưới máu màng nhày [1]

Tổ chức bình thường

Prostaglandin

I2 (Nội mô mạch máu)

Prostaglandin

I2 (Thận) (-)

(-)

* Phân loại các thuốc chống viêm không steroid (NSAIDs)

Theo tác dụng, cấu trúc hóa học các NSAIDs được chia thành các nhóm sau:

Bảng 1.1: Phân loại thuốc chống viêm không steroid [1]

Nhóm indol Indomethacin (2), Sulindac

Nhóm acid enolic Piroxicam, Meloxicam Nhóm acid propionic Ibuprofen (3),Naproxen (4)

Nhóm dẫn xuất acid phenylacetic Diclofenac Nhóm dẫn xuất acid heteroarylacetic Tolmetin, Ketorolac Loại ức chế

COX-2 cao hơn trên COX-1 tới 350 lần Tính chọn lọc và một số các thông số dược động học của celecoxib được trình bày lần lượt ở bảng 1.2 và bảng 1.3

Bảng 1.2:Tác dụng ức chế cyclooxygenase của celecoxib, IC 50 (μM) [18]

IC50(COX-2) IC50(COX-1) IC50(COX-1)/IC50(COX-2)

Indomethacin 0,03 0,02 0,7

Bảng 1.3: Một số các thông số dược động học của celecoxib [7],[18]

Cmax(ng/ml) Tmax(giờ) T1/2(giờ)

Nhiều nghiên cứu cũng cho thấy rằng ngoài tác dụng chống viêm thì celecoxib còn có tác dụng giảm đau, chống ung thư [13],[21],[26], giảm tỷ lệ xuất hiện và số lượng các khối u [3]

1.1.3 Tác dụng phụ

- Viêm loét dạ dày tá tràng: Tác dụng phụ của celecoxib trên đường tiêu hóa giảm một cách đáng kể so với các thuốc chống viêm trước đó (ví dụ như naproxen, ibuprofen và diclofenac)[10],[19],[23],[30] Nghiên cứu thử nghiệm lâm sàng có đối chứng trên 5285 bệnh nhân dùng celecoxib (Celebrex) liều 200mg/ngày hoặc cao hơn với thời gian từ một đến sáu tháng cho thấy chỉ có hai bệnh nhân bị chảy máu đường tiêu hóa sau khi dùng thuốc 14-22 ngày [3]

- Trên tim mạch : So với các NSAID khác tác dụng phụ của nhóm coxib trên đường tiêu hóa giảm nhưng trên tim mạch thì hay gặp hơn [2]

Trelle, S và cộng sự đã tiến hành 21 thử nghiệm trên 116429 bệnh nhân sử dụng celecoxib và các NSAID khác để so sánh ảnh hưởng trên tim mạch Kết quả được thể hiện ở bảng 1.4

Bảng 1.4: Ảnh hưởng của Celecoxib và các NSAID trên tim mạch [12]

NSAID

Tỉ lệ bệnh nhân có ảnh hưởng đến tim mạch (%)

Nhồi máu cơ tim Đột quỵ Tử vong do ảnh hưởng

- Nghiên cứu CLASS (Celecoxib Long-term Arthritis Safety Study):Nghiên

cứu độ an toàn khi sử dụng celecoxib liều cao dài ngày trong điều trị viêm xương khớp hoặc thấp khớp Nghiên cứu thực hiện trên 7968 bệnh nhân Các bệnh nhân được điều trị bằng celecoxib với liều 400mg/2 lần/ngày (lớn hơn từ 2 – 4 lần so với liều điều trị thông thường; n=3987), ibuprofen 800mg/3 lần/ngày (n=1985) hoặc diclofenac 75mg/2 lần/ngày (là liều điều trị thông thường; n=1996) trong thời gian 6 tháng Kết quả cho thấy không có sự khác biệt có ý nghĩa về tỷ lệ biến chứng loét ở các liều điều trị trong ba nhóm thuốc trên Phân tích cụ thể các chỉ tiêu cho thấy tỷ

lệ biến chứng loét và các triệu chứng loét ở nhóm dùng celecoxib thì thấp hơn nhóm dùng ibuprofen nói chung và thấp hơn cả những bệnh nhân điều trị ibuprofen mà không kèm với aspirin [29]

- Đau cấp tính, điều trị đau thống kinh nguyên phát

- Trị liệu bổ sung trong polip tuyến trong gia đình (familial adenonatous polyposis)

* Liều lượng và cách dùng

- Thoái hóa khớp: liều duy nhất 200mg/ ngày hoặc 100mg x 2 lần/ ngày

- Viêm khớp dạng thấp: 100-200mg x 2 lần/ ngày

- Viêm cột sống dính khớp: 200mg/ ngày hoặc 100mg x 2 lần/ ngày

- Đau cấp tính và đau bụng kinh nguyên phát: khởi đầu với liều 400mg, dùng tiếp theo với liều 200mg, nếu cần thiết trong ngày đầu tiên Trong các ngày tiếp theo, liều đề nghị là 200mg x 2 lần/ ngày, khi cần

- Trị liệu bổ sung trong polip tuyến trong gia đình: 400mg x 2 lần/ ngày, uống trong khi ăn

1.1.6 Dạng thuốc và biệt dược

- Dạng thuốc: Viên nang 100mg, 200mg

- Biệt dược: Có thể kể tên một số biệt dược chính là:

+ Celebrex (Pfizer, Mỹ)

+ Celedol (Ipca, Ấn Độ)

+ Cefalox (Dược phẩm OPV, Việt Nam)

+ Celcoxx (Getz Pharm, Pakistan)

+ Cilexid (MEDIPLANTEX, Việt Nam)

Ðiều quan trọng là phải biết chọn và thử dung môi hòa tan: các chất phân cực

dễ tan trong dung môi phân cực, các chất không phân cực dễ tan trong dung môi không phân cực

Các dung môi phân cực như: nước, alcol, ete, este, acid axetic

Các dung môi không phân cực như: benzen, hexan, xyclohexan, CCl4, Cacbon diSunfua

- Có thể dùng hỗn hợp dung môi (hệ dung môi 2, 3 cấu tử)

- Các dung môi được chọn phải thỏa mãn một số tính chất sau:

+ Dung môi sử dụng phải tan tốt chất hòa tan tại nhiệt độ sôi của dung môi và rất ít tan ở nhiệt độ thường và lạnh

+ Không phản ứng hóa học với chất tan

+ Các tạp chất không tan với dung môi được chọn ở nhiệt độ cao hoặc hòa tan tốt ở nhiệt độ thường và lạnh

+ Dung môi chọn phải dễ dàng bay hơi khỏi bề mặt tinh thể

+ Nhiệt độ sôi của dung môi phải thấp hơn nhiệt độ nóng chảy của chất rắn khoảng 10 - 15%

1.2.2 Một số phương pháp kết tinh celecoxib

Có nhiều phương pháp kết tinh làm sạch Celecoxib Trong đó phương pháp

sử dụng hệ dung môi diclorometan/hexan để kết tinh celecoxib có một số nhược điểm Đầu tiên, quá trình kết tinh cần tới một thể tích lớn dung môi (trung bình 20 lần thể tích mỗi loại diclorometan hoặc hexan cho mỗi gram celecoxib), dẫn đến giảm hiệu quả kinh tế và không thân thiện môi trường khi nâng cấp lên qui mô công

nghiệp Mặt khác sử dụng diclorometan không tốt cho môi trường và sức khỏe con người, còn hexan lại dễ gây cháy nổ

Một số qui trình kết tinh celecoxib sử dụng hệ dung môi isopropanol/nước [17] Trong một số trường hợp, người ta còn dùng các dung môi amit như dimetylacetamit và dimetylformamit [20] trong quá trình tinh chế/kết tinh Sản phẩm thu được là các tinh thể celecoxib dạng I bị solvat hóa với các dung môi amide Việc loại bỏ tồn dư các dung môi này khỏi tinh thể thường rất khó khăn và đòi hỏi nhiệt độ cao Do đó dạng tinh thể solvat hóa này không thể được sử dụng làm nguyên liệu thuốc vì chúng còn chứa nhiều tồn dư dung môi hữu cơ, vốn được kiểm soát hết sức nghiêm ngặt đối với các hoạt chất có tính chất dược dụng, thành phần chính của các dạng thuốc điều trị cho con người

Quá trình kết tinh celecoxib sử dụng một số dung môi hydrocarbon như tetradecane hay n-decane Nhìn chung các qui trình này đều phức tạp và không có lợi về năng lượng vì đây đều là các dung môi có nhiệt độ sôi cao, quá trình kết tinh tiêu tốn nhiều dung môi, và phải tiến hành ở nhiệt độ cao (từ 100 đến 165oC), trong một khoảng thời gian dài dẫn đến sinh ra nhiều tạp chất, sản phẩm phụ Do vậy những qui trình như vậy rất khó có thể nâng cấp lên qui mô công nghiệp

n-Tóm lại, chủng loại dung môi, thể tích dung môi sử dụng, và phương pháp tinh chế/kết tinh đóng vai trò quan trọng đối với việc hình thành chọn lọc một dạng tinh thể nào đó của celecoxib Những nghiên cứu công nghệ nhằm cải tiến, hoàn thiện qui trình kết tinh celecoxib, đặc biệt là thu được chọn lọc dạng tinh thể III có

độ bền động học cao, giúp cải thiện độ tơi mịn, đặc tính trơn chảy và đặc tính chịu nén của nguyên liệu celecoxib khi bào chế các dạng viên nén hay viên nang có nghĩa thực tiễn và khoa học to lớn

1.3 Phương pháp xác định cấu trúc

1.3.1 Phương pháp cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)

1.3.1.1 Giới thiệu chung về phổ cộng hưởng từ hạt nhân

1.3.1.1.1./ Khái niệm

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân viết tắt là NMR (Nuclear Magnetic Resonance ),

là một phương pháp phân tích hiện đại, được sử dụng rộng rãi trong hóa học

1.3.1.1.2./ Spin hạt nhân và điều kiện cộng hưởng

+ Spin hạt nhân

Hạt nhân nguyên tử gồm các proton và nơtron Số lượng tử spin của proton cũng như của nơtron đều bằng 1/2 Tuỳ thuộc vào các nucleon đó có cặp đôi hay không mà hạt nhân của nguyên tử có thể được đặc trưng bởi số lượng tử spin hạt nhân I bằng không hoặc khác không Nếu spin của tất cả các nucleon đều cặp đôi thì

số lượng tử spin hạt nhân bằng không (I=0) Nếu ở hạt nhân có một spin không cặp đôi thì I=1/2, nếu có nhiều spin không cặp đôi thì I ≥ 1

Những hạt nhân không có spin I= 0 thì không gay ra momen từ ( µ=0) tức là không có từ tính Người ta nói hạt nhân đó không có từ tính và không có cộng hưởng từ hạt nhân Những hạt nhân có I ≠ 0 gây ra moat momen từ µ ≠ 0 Hạt nhân

đó có hoạt động từ và có cộng hưởng từ hạt nhân

+ Điều kiện cộng hưởng

Để có được phổ cộng hưởng từ hạt nhân ta cần đặt mẫu nghiên cứu vào một

từ trường mạnh, có cường độ B0 và tác dụng lên mẫu một tần số  thỏa mãn phương trình (2) Trong các điều kiện này sẽ xảy ra các hiện tượng là có sự chuyển các hạt nhân từ mức năng lượng này lên một một mức năng lượng cao hơn lúc này xảy ra cộng hưởng từ hạt nhân

1.3.1.1.3 Phổ kế cộng hưởng từ proton

+ phổ kế cộng hưởng từ hạt nhân sóng liên tục

Bộ phận chính của phổ kế này là một nam châm điện hay nam châm siêu dẫn

có từ trường B0 đồng nhất, một bộ phận phát từ trường vô tuyến để tạo tần số B1 và một cuộn từ cảm để nhận tín hiệu

Dung môi thường dùng là những chất không chứa hạt nhân từ proton như CCl4, CDCl3, thường dùng TMS để làm chất chuẩn

+ Phổ kế cộng hưởng từ proton biến đổi Flourier

Phổ kế loại này có từ trường B1 tác động không liên tục lên hạt nhân nguyên tử được đặt trong từ trường B0 Tín hiệu cao tần được điều phức bằng các xung vuông

và hẹp Sau các xung /2 và  nhận được tín hiệu cảm ứng tự do (FID) Phổ kí nhận được dưới dạng đường cong của hàm số phụ thuộc thời gian f(t) Trên phổ đo được thời gian phục hồi ngang T2và thời gian phục hồi dọc T1.

Ưu điểm của phổ kế biến đổi Flourier là có độ nhạy cao và có tỉ số tín hiệu/nhiễu lớn và có thể tu được nhiều thông số từ phổ kí

1- Máy phát tín hiệu cao tần

2- Tạo dãy xung theo các chương trình định sẵn

3- Điều phức biên độ cao tần theo xung vuông

4- Đầu đo tạo từ trường không liên tục

5- Thu tín hiệu tích lũy ghi các điểm phổ của cảm ứng tự do

6- Biến đổi Flourier

Bhd = B0(1-)

 gọi là hằng số chắn, có giá trị khác nhau đối với mỗi hạt nhân nguyên tử trong phân tử

Hiệu số A-B ~ B - A ta không thể đo giá trị tuyệt đối hằng số chắn của mỗi hạt nhân, nhưng có thể đo được hiệu trên Người ta nhận thấy rằng hằng số chắn của hợp chất (CH3)4Si (TMS) là lớn nhất nên đã dùng nó làm chất chuẩn để

X là tần số cộng hưởng của một proton (Hz), 0 là tần số cộng hưởng của máy

đo (MHz)  không có thứ nguyên, người ta kí hiệu 10-6 là ppm

Độ dịch chuyển hóa học của 1H – NMR nằm trong khoảng 0-12ppm

2 Các yếu tố ảnh hưởng đến độ dịch chuyển hoá học

2.1 Các yếu tố nội phân tử ảnh hưởng đến độ dịch chuyển hoá học

a Sự chắn tại chỗ

Trước hết ta xét trường hợp proton Trong phân tử proton ít nhiều đều được bao quanh bởi electron Dưới tác dụng của từ trường B0, electron sẽ chuyển động thành một dòng điện vòng quanh proton Dòng điện vòng này làm phát sinh một từ trường cảm ứng mà đường sức của nó được vẽ bằng các nét đứt Ở vùng gần hạt nhân, từ trường cảm ứng này ngược chiều với từ trường B0, nó chóng lại từ trường sinh ra nó và làm cho từ trường hiệu dụng Hhd quanh proton giảm đi so với B0 (Bhd <

B0 ) Như thế electron đã che chắn cho proton Người ta gọi nó là sự chắn màn electon tại chỗ hay sự chắn tại chỗ Vì sự chắn tại chỗ làm giảm cường độ từ trường tác động tới hạt nhân, do đó nếu hạt nhân được chắn màn nhiều thì để cho nó đi vào cộng hưởng cần phải tăng cường độ từ trường

Sự chắn này phụ thuộc mật độ electron xung quanh hạt nhân đang xét nên nó

có liên quan trực tiếp đến độ âm điện của các nguyên tử hoặc nhóm nguyên tử đính với hạt nhân đó Ngoài sự phụ thuộc vào mật độ electron sự chắn còn phụ thuộc hình dạng và kích thước electron

b Sự chắn từ xa

Không phải lúc nào trật tự về độ dịch chuyển hóa học cũng tương ứng với trật

tự về độ âm điện Chẳng hạn, proton của benzen cho tính hiệu ở trường yếu hơn proton của etilen và proton của acetilen mặc dù độ âm điện của Csp2 nhỏ hơn của

Csp Thêm nữa tín hiệu của proton ở benzene thể hiện ở trường yếu hơn ở CH2Cl2 và

ở H2O mặc dù mật độ electron xung quanh hạt nhân này không tương ứng với sự thay đổi về độ dịch chuyển hóa học như thế Những nguyên tử hoặc nhóm nguyên

tử ở bên cạnh proton, đặc biệt là những nhóm không no, nhóm vòng thơm, hoặc các nguyên tử có chứa cặp electron không liên kết có thể là nguồn gốc của những dòng điện vòng mạnh hơn và tạo ra xung quanh proton các từ trường có hiệu suất lớn hơn

từ trường của các electron hóa trị của chính proton đó Chính vì thế những nhóm nguyên tử bên cạnh proton cũng có tác dụng “che chắn” đối với proton Đó là sự chắn từ xa hay còn gọi là sự chắn bất đẳng hướng bởi vì ở hướng này thì bị chắn còn ở hướng kia thì bị phản chắn

1.3.1.3 các yếu tố ngoại phân tử ảnh hưởng đến độ dịch chuyển hóa học

a liên kết Hidro

Liên kết hidro gây ra sự thay đổi đáng kể độ dịch chuyển hóa học của proton ở các nhóm OH, NH, và đôi khi cả nhóm SH Như đã biết, liên kết hidro phụ thuôc nhiều vào bản chất dung môi, nồng độ và nhiệt độ Chính vì vậy, độ chuyển dịch hóa học của các proton axit biến đổi trong một khoảng rộng do đó để tìm tín hiệu của các proton axit chúng cần xét xem chúng có tạo liên kết hidro hay không, mức

độ liên kết hidro như thế nào

b Sự trao đổi proton

Proton liên kết với các dị tố như O, N, không những có khả năng tạo liên kết hidro mà còn có khả năng trao đổi với proton của các tiểu phân xung quanh Sự trao đổi proton cũng thể hiện rõ trên phổ NMR

Thí dụ: khi đo phổ của CH3COOH trong nước người ta không nhân được tín hiệu của proton COOH và proton của nước một cách riêng rẽ mà nhận được tín hiệu

chung cho chúng Đó là do tốc độ ion hóa nhanh đến mức mà sự trao đổi xảy ra khi proton ở vào trạng thái cộng hưởng

CH3COOH + H2O  CH3COO- + H3O+

c Ảnh hưởng của dung môi

Khi thay dung môi CCl4 bằng CDCl3, độ chuyển dịch hóa học của proton liên kết với cacbon chỉ thay đổi 0.1ppm còn khi chuyển sang các dung môi phân cực hơn như CD3OD, CD3COCD3 thì dộ dịch chuyển thay đổi 0.3ppm, nói chung là khi thay đổi dung môi thì độ dịch chuyển hóa học có sự thay đổi theo Các dung môi dùng trong phương pháp NMR đều đã được Đơtơri hóa Tuy nhiên những proton còn sót lại thường vẫn cho tin hiệu trên phổ Ngoài ra vết nước trên dung môi cũng gây ra tín hiệu trên phổ 1H NMR

d Ảnh hưởng của nhiệt độ

Vị trí tín hiệu của các proton liên kết với cacbon thường rất ít bị ảnh hưởng bởi nhiệt độ, chỉ có các proton trong các nhóm OH, NH,SH phụ thuộc nhiều vào sự thay đổi nhiệt độ Vì khi nhiệt độ tăng làm đứt các liên kết hidro, do đó làm cho tín hiệu của các proton của các nhóm đó chuyển dịch về phía trường mạnh

3 Hạt nhân tương đương về độ dịch chuyển hóa học

Như đã biết độ dịch chuyển hóa học của mỗi hạt nhận không những phụ thuộc vào cấu tạo hóa học mà còn phụ thuộc vào vị trí không gian của nó trong phân tử

Để xét xem một hợp chất cho mấy tín hiệu NMR, cần phải biết trong nguyên tử của

nó có bao nhiêu nhóm hạt nhân giống nhau về cấu tạo hóa học và về vị trí không gian mà ta tạm gọi là các hạt nhân tương đương

B Tương tác spin- spin

Hằng số tương tác spin-spin

Đối với mỗi hạt nhân hoặc một nhóm hạt nhân, người ta nhận được một tín hiệu đặc trưng chỉ có một đỉnh nhưng cũng có khi gồm một nhóm 2, 3, 4, 5 đỉnh khác nhau Ví dụ phổ cộng hưởng từ proton của etanol có các tín hiệu đặc trưng cho nhóm OH (1 đỉnh), nhóm CH2 (4 đỉnh), CH3 (3đỉnh) Nguyên nhân của sự xuất hiên nhiều đỉnh trên là do mỗi hạt nhân có I=1/2 đã sinh ra hai từ trường riêng biệt Hai

từ trường này tác dụng lên hạt nhân bên cạnh làm phân tách mức năng lượng chính của nó thành hai mức năng lượng khác nhau Trường hợp 2, 3 hạt nhân cùng tác động từ trường riêng của minh lên cùng một hạt nhân khác thì năng lượng cộng hưởng của hạt nhân đó bị phân tách thành nhiều mức năng lượng khác nhau mà mỗi mức năng lượng cộng hưởng này cho một đỉnh trên phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton

1.3.2 Phương pháp phân tích nhiệt (TGA)

1.3.2.1 Khái niệm

Phân tích nhiệt là phương pháp phân tích mà trong đó, các tính chất vật lý, hoá học của mẫu, đo một cách liên tục như là những hàm của nhiệt độ (nhiệt độ đ-ược thay đổi có quy luật) Trên cơ sở lý thuyết về nhiệt động học, từ sự thay đổi các tính chất đó ta có thể xác định được các thông số yêu cầu của việc phân tích Các tính chất được xác định như: Nhiệt độ chuyển pha, khối lượng mất đi, biến đổi về kích thước

Trong phần này ta đi tìm hiểu các phương pháp chính sau:

- Phân tích nhiệt vi sai (DTA)

- Quét nhiệt vi sai (DSC)

- Phân tích nhiệt trọng lượng (TGA)

Dựa vào phương pháp này ta có thể: Kiểm nghiệm sản phẩm, phân tích thành phần…

1.3.2.2 Cơ sở vật lý của phương pháp

Kỹ thuật phân tích nhiệt dựa trên nguyên lý về nhiệt động học

Khi có độ chênh lệch về độ lớn, nhiệt độ sẽ chuyển từ nơi này sang nơi khác

và khi đó làm cho các đại lượng vật lý khác như năng lượng chuyển pha, độ nhớt, entropy, … cũng thay đổi

1.3.3 Phân tích nhiệt trọng lượng (TGA)

1/ Cơ sở và tính năng của phương pháp

* Phương pháp này dựa trên cơ sở xác định khối lượng của mẫu vật chất bị mất đi (hay nhận vào) trong quá trình chuyển pha như một hàm của nhiệt độ TGA cho ta xác định khối lượng chất bị mất đi trong quá trình chuyển pha Đường phổ TGA đặc trưng cho một hợp chất hoặc một hệ do thứ tự của các phản ứng hoá học xuất hiện tại một khoảng nhiệt độ xác định là một hàm của cấu trúc phân tử

Các đường dữ liệu liên quan tới nhiệt động học và động năng của dạng phản ứng hoá học, cơ chế phản ứng…

* Các thông tin ta nhận được dùng để xác định thành phần khối lượng các chất có mặt trong mẫu Ngoài ra ta xác định được thành phần dung môi, chất phụ gia…

Nhiệt độ của lò được thay đổi liên tục và điều khiển bởi cặp nhiệt

Khối lượng thay đổi được đo so với tín hiệu vào ban đầu

Hình 1.4: Sơ đồ cấu tạo của một thiết bị TGA (a)

Một hệ TGA của hãng Orton (b)

3/ Hoạt động và phân tích kết quả

Ban đầu, cân ở vị trí cân bằng Thiết bị điều khiển làm tăng nhiêt độ, trong quá trình đó các quá trình lý, hoá xẩy ra làm thay đổi khối lượng của mẫu, nhờ đó các sensor khối lượng chuyển tín hiệu về máy tính và chuyển đổi thành phần trăm khối lượng của vật liệu bị mất đi

VD:

Hình 1.5: Mẫu phân tích TGA của CaC 2 O 4 H 2 O:

1.3.4 Phương pháp phổ hồng ngoại (IR)

- Nếu ta chiếu mẫu chất hữu cơ một sóng điện từ với các bước sóng khác nhau

và sau đó xác định xem bước sóng nào bị hấp thu, bước sóng nào không thì chúng

ta sẽ có được một phổ hấp thụ của mẫu đó

- Kết quả được biễu diễn bằng đồ thị của hàm số năng lượng sóng điện từ đi qua phụ thuộc vào bước sóng.Trục hoành biễu diễn bước sóng với đường nằm ngang ở trên đơn vị là µm; đường nằm ngang ở dưới đơn vị là số sóng (cm-1), trục tung là hệ số hấp thụ sóng điện từ có đơn vị là %

- Vùng bức xạ hồng ngoại (IR) là một vùng phổ bức xạ điện từ rộng nằm giữa vùng trông thấy và vùng vi ba; vùng này có thể chia thành 3 vùng nhỏ:

Điều kiện hấp thụ bức xạ hồng ngoại:

Để có thể hấp thụ bức xạ hồng ngoại, phân tử đó phải đáp ứng các yêu cầu sau:

- Độ dài sóng chính xác của bức xạ: một phân tử hấp thụ bức xạ hồng ngoại chỉ khi nào tần số dao động tự nhiên của một phần phân tử (tức là các nguyên tử hay các nhóm nguyên tử tạo thành phân tử đó) cũng là tần số của bức xạ tới

- Một phân tử chỉ hấp thụ bức xạ hồng ngoại khi nào sự hấp thụ đó gây nên sự biến thiên momen lưỡng cực của chúng

Tương quan giữa phổ dao động và cấu trúc phân tử

Các nhóm chức, nhóm nguyên tử và liên kết trong phân tử có các đám phổ hấp thụ hồng ngoại đặc trưng khác nhau

Hình 1.7

Mặc dù phương pháp phổ dao động là một trong những phương pháp hữu hiệu nhất để xác định các chất về định tính cũng như định lượng, được ứng dụng rộng rãi trong nghiên cứu khoa học cũng như trong kiểm tra công nghiệp, phương pháp này cũng có những hạn chế nhất định:

- Bằng phương pháp phổ hồng ngoại không cho biết phân tử lượng (trừ trường hợp đặc biệt)

- Nói chung phổ hồng ngoại không cung cấp thông tin về các vị trí tương đối của các nhóm chức khác nhau trên một phân tử

- Chỉ riêng phổ hồng ngoại thì đôi khi chưa thể biết đó là chất nguyên chất hay chất hỗn hợp vì có trường hợp 2 chất có phổ hồng ngoại giống nhau

1.3.4.2 Ứng dụng

Nhận biết các chất - Trước khi ghi phổ hồng ngoại, nói chung ta đã có thể có nhiều thông tin về hợp chất hoặc hỗn hợp cần nghiên cứu, như: trạng thái vật lý, dạng bên ngoài, độ tan, điểm nóng chảy, điểm cháy

Nếu có thể thì cần biết chắc mẫu là chất nguyên chất hay hỗn hợp Sau khi ghi phổ hồng ngại, nếu chất nghiên cứu là hợp chất hữu cơ thì trước tiên nghiên cứu vùng dao động co giãn của H để xác định xem mẫu thuộc loại hợp chất vòng thơm hay mạch thẳng hoặc cả hai Sau đó nghiên cứu các vùng tần số nhóm để xác định

có hay không có các nhóm chức

Trong nhiều trường hựp việc đọc phổ (giải phổ) và tìm các tần số đặc trưng không đủ để nhận biết một cách toàn diện về chất nghiên cứu, nhưng có lẽ là có thể suy đoán được kiểu hoặc loại hợp chất

Xác định độ tinh khiết

Phân tích định lượng

Ví dụ:

Hình 1.8

1.3.5 Phương pháp khối phổ (MS)

1.3.5.1 Khái niệm

• Khối phổ là phương pháp nghiên cứu các chất, bằng cách đo chính xác khối lượng phân tử chất đó, dựa trên điện tích của ion; dùng thiết bị chuyên dụng là khối phổ kế

• Kĩ thuật này có nhiều ứng dụng, thường được kết hợp với một số sinh học phân tử khác như:

1.3.5.3 Phương pháp ion hoá bằng va chạm điện tử

• Trong buồng ion hoá, các điện tử phát ra từ cathode làm bằng vonfram hoặc reni, bay về anode với vận tốc lớn

• Các phân tử chất nghiên cứu ở trạng thái hơi sẽ va chạm với điện tử trong buồng ion hoá, có thể nhận năng lượng điện tử và bị ion hoá

1.3.5.4 Ion hoá bằng trường điện từ

• Tại buồng ion hoá đặt các “mũi nhọn” là bộ phận phát từ trường dưới dạng dây dẫn mảnh (2.5 µm) hay các lưỡi mảnh

• Đặt điện áp vào các “mũi nhọn” cho một trường điện từ có gradien 107-1010 V/cm

• Các điện tử sẽ bị bứt khỏi phân tử chất nghiên cứu do hiệu ứng đường hầm nên không gây sự kích thích,vẫn giữ nguyên ở trạng thái cơ bản, do đó các vạch phổ

sẽ rất mảnh

Dựa vào bộ phận phân tích mà người ta chia các loại máy khối phổ như sau:

• Bộ phận tích từ

• Bộ phận tích tứ cực

• Bộ phận tích theo thời gian

• Bộ phận tích cộng hưởng ion cyclotron

Theo tính năng bộ ghi, người ta chia các máy khối phổ thành hai loại:

+ Máy khối phổ ký ghi bằng kính ảnh Tín hiệu phổ được ghi bằng kính ảnh ở dạng vạch có độ đen khác nhau

+ Máy khối phổ kế: các tín hiệu của chùm ion được ghi dưới dạng xung điện bằng các dao động ký điện tử nhiều kênh, hoặc đưa vào máy tính điện tử,tín hiệu sẽ được đưa ra dưới dạng bảng số hoặc đồ thị thích hợp

Ngày nay trong phân tích khối phổ người ta dùng các máy khối phổ kế

1.3.5.7 Nguyên lý hoạt động của máy khối phổ

• Mẫu chất cần phân tích sẽ được chuyển thành trạng thái hơi, sau đó mới bắt đầu quá trình đo khối phổ

• Để đo được đặc tính của các phân tử cụ thể, máy khối phổ sẽ chuyển chúng thành các ion, kiểm soát chuyển động của chúng bởi các điện từ trường bên ngoài

• Quá trình được thực hiện trong môi trường chân không

• Trong khi áp suất khí quyển vào khoảng 760 mmHg, áp suất môi trường xử

lý ion thường từ 10-5 đến 10-8 mmHg (thấp hơn một phần tỉ của áp suất khí quyển)

• Ion sau khi được tạo thành sẽ được phân tách bằng cách gia tốc và tập trung chúng thành một dòng tia mà sau đó sẽ bị uốn cong bởi một từ trường ngoài

• Các ion sau đó sẽ được thu nhận bằng đầu dò điện tử và thông tin tạo ra sẽ được phân tích và lưu trữ trong một máy vi tính

Hình 1.10

1.3.5.8 Ứng dụng của máy khối phổ trong phân tích protein

• Protein được tinh chế rồi cắt bằng enzyme pepsin Enzyme pepsin cắt polypeptide tại những điểm nhất định trên chuỗi (giống enzyme giới hạn ở acid nucleic)

• Ta có thể dự đoán được các mảnh (fragments) polypeptide sau khi bị cắt

• Đưa mẫu đã xử lý pepsin vào đĩa và cho máy chạy Laser ion hoá các fragments làm cho chúng tích điện dương và bật ra bay vào ống

• Ống này có chiều dài nhất định, 4 phía gắn 2 loại điện cực (+) và (-)

• ống có thể xoay tròn, do đó các cực điện đổi chiều liên tục làm cho các mảnh polypeptide không bám được vào thành mà bay theo chiều xoắn ốc

• Vận tốc bay của 1fragment phụ thuộc 2 yếu tố

Hình 1.11: Schematic of a MALDI-TOF Mass Spectrometer

Phân tích kết quả:

• Vì protein bao gồm 20 amino acid có khối lượng khác nhau do đó khối lượng của một trình tự đủ nhỏ cũng nói lên được trình tự của nó (Giả sử Valin có khối

lượng là 3, methionin là 5 thì một fragment có khối lượng là 8 sẽ có trình tự Valin – Methionin hoặc Methionin – Valin)

1.3.5.9 Sự kết hợp các phương pháp sinh học phân tử khác_ ứng dụng

• Phương pháp Sắc ký khí kết hợp với Khối phổ (viết tắt là GC-MS hoặc GCMS) là một phương pháp mạnh mẽ với độ nhạy cao được sử dụng trong các nghiên cứu về thành phần các chất trong không khí

• Bản chất GC-MS là sự kết hợp của Sắc ký khí (Gas Chromatography) và Khối phổ (Mass Spectometry) Ngưỡng phát hiện của phương pháp này là 1 picogram (0.000000000001 gram)

Cấu tạo của GC-MS

– Sắc ký khí (GC): phân tách hỗn hợp hóa chất thành một mạch theo

từng chất tinh khiết

Khối phổ (MS): ) xác định định tính và định lượng

Hình 1.12

A.Cửa tiêm mẫu (injection port): 1 microliter dung môi chứa hỗn hợp các chất

sẽ được tiêm vào hệ thống tại cửa này Mẫu sau đó được dẫn qua hệ thống bởi khí trơ, thường là helium Nhiệt độ ở cửa tiêm mẫu được nâng lên 3000C để mẫu trở thành dạng khí

B Vỏ ngoài (oven): Phần vỏ của hệ thống GC chính là một lò nung đặc biệt Nhiệt độ của lò này dao động từ 400C cho tới 3200C

C Cột (column): Bên trong hệ thống GC là một cuộn ống nhỏ hình trụ có chiều dài 30 mét với mặt trong được tráng bằng một loại polymer đặc biệt Các chất trong hỗn hợp được phân tách bằng cách chạy dọc theo cột này