Nghiên cứu một số đặc tính sinh vật học của vi khuẩn escherichia coli, listeria monocytogenes và salmonella spp nhiễm trên thịt lợn tiêu thụ tại địa bàn thành phố lạng sơn, đề xuất biện pháp phòng chống

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM HÀ VĂN QUANG NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC TÍNH SINH VẬT HỌC CỦA VI KHUẨN ESCHERICHIA COLI, LISTERIA MONOCYTOGENES VÀ SALMONELLA SPP.. ĐẠI HỌC THÁ

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

HÀ VĂN QUANG

NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC TÍNH SINH VẬT HỌC

CỦA VI KHUẨN ESCHERICHIA COLI, LISTERIA

MONOCYTOGENES VÀ SALMONELLA SPP NHIỄM

TRÊN THỊT LỢN TIÊU THỤ TẠI ĐỊA BÀN THÀNH PHỐ LẠNG SƠN, ĐỀ XUẤT BIỆN PHÁP PHÒNG CHỐNG

LUẬN VĂN THẠC SĨ THÚ Y

THÁI NGUYÊN - 2016

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

HÀ VĂN QUANG

NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC TÍNH SINH VẬT HỌC

CỦA VI KHUẨN ESCHERICHIA COLI, LISTERIA

MONOCYTOGENES VÀ SALMONELLA SPP NHIỄM

TRÊN THỊT LỢN TIÊU THỤ TẠI ĐỊA BÀN THÀNH PHỐ LẠNG SƠN, ĐỀ XUẤT BIỆN PHÁP PHÒNG CHỐNG

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu do cá nhân tôi trực tiếp thực hiện cùng với các đồng nghiệp tại Bộ môn Vệ sinh - Viện Thú y Quốc gia Mẫu vật thu thập tại chợ khu vực thành phố Lạng Sơn; các số liệu và kết quả nghiên cứu trình bày trong Luận văn là trung thực, chính xác, chưa được công bố trong bất cứ công trình nào khác

Tôi xin cam đoan mọi thông tin trích dẫn trong Luận văn đều được chỉ rõ nguồn gốc Mọi sự giúp đỡ để hoàn thành Luận văn đều đã được cảm ơn

Thái Nguyên, tháng 9 năm 2016

TÁC GIẢ

Hà Văn Quang

LỜI CẢM ƠN

Trong thời gian thực tập và thực hiện đề tài này, tôi đã nhận được sự quan tâm, chỉ bảo, hướng dẫn, giúp đỡ tận tình của các thầy cô giáo, đồng nghiệp, bạn bè và sự động viên khích lệ của gia đình Nhân dịp này tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới:

Thầy giáo PGS TS Đặng Xuân Bình đã trực tiếp hướng dẫn, chỉ bảo tôi hết

sức tận tình trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành Luận văn

Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban Giám hiệu, Phòng Đào tạo, Ban chủ nhiệm khoa

và các thầy cô giáo Khoa Chăn nuôi Thú y - Trường Đại học Nông lâm - Đại học Thái Nguyên đã tạo điều kiện và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập

Tôi cũng xin trân trọng cảm ơn các chủ quầy bán thịt lợn tại chợ Đông Kinh, chợ Kỳ Lừa và chợ Giếng Vuông đã tạo điều kiện cho tôi lấy mẫu thực hiện đề tài

Xin trân trọng cảm ơn bộ môn Vệ sinh - Viện Thú y Quốc gia đã giúp tôi trong quá trình xét nghiệm mẫu và thực hiện đề tài

Cuối cùng Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc về sự ủng hộ, động viên, giúp

đỡ của gia đình, bạn bè và đồng nghiệp trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu và hoàn thành tốt Luận văn này

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VIẾT TẮT vii

DANH MỤC BẢNG BIỂU viii

DANH MỤC HÌNH, ĐỒ THỊ x

MỞ ĐẦU 1

1 Tính cấp thiết của đề tài 1

2 Mục tiêu nghiên cứu 2

3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 2

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Cơ sở khoa học của đề tài 3

1.1.1 Ngộ độc thực phẩm (NĐTP) 3

1.1.2 Thịt tươi và các dạng hư hỏng của thịt 6

1.1.3 Đặc điểm sinh học của vi khuẩn E coli 8

1.1.4 Đặc điểm sinh học của vi khuẩn Salmonella 11

1.1.5 Đặc điểm sinh học của vi khuẩn L monocytogenes gây ô nhiễm thịt 14

1.2 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước 16

1.2.1 Tình hình nghiên cứu trong nước 16

1.2.2 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 19

Chương 2: ĐỐI TƯỢNG, PHẠM VI, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25

2.1 Đối tượng và vật liệu nghiên cứu 25

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 25

2.1.2 Vật liệu, hóa chất và dụng cụ nghiên cứu 25

2.2 Địa điểm, thời gian nghiên cứu 25

2.3 Nội dung nghiên cứu 26

2.3.1 Khảo sát tình hình giết mổ và tiêu thụ thịt lợn tại 3 khu chợ nghiên cứu trên địa bàn TP Lạng Sơn 26

2.3.2 Nghiên cứu về chỉ tiêu tổng số vi khuẩn hiếu khí nhiễm trên thịt lợn tươi 26

2.3.3 Khảo sát chỉ tiêu vi khuẩn E coli, Salmonella spp và Listeria monocytogenes nhiễm trên thịt lợn bán tại chợ 26

2.3.4 Xác định mức độ nhiễm vi khuẩn E coli, Salmonella spp., L monocytogenes trên thịt lợn theo thời gian lấy mẫu 26

2.3.5 Giám định một số đặc tính sinh vật, hóa học của vi khuẩn E coli, Salmonella spp., L monocytogenes phân lập được 26

2.3.6 Xác định độc lực của các chủng vi khuẩn E coli, Salmonella spp., L monocytogenes phân lập được 26

2.3.7 Xác định yếu tố gây bệnh của các chủng E coli, Salmonella spp., L monocytogenes phân lập được 26

2.3.8 Xác định tính mẫn cảm với một số loại kháng sinh và hóa dược của các chủng E coli, Salmonella spp., L monocytogenes phân lập được 26

2.3.9 Đề xuất một số biện pháp khống chế 26

2.4 Phương pháp nghiên cứu 26

2.4.1 Phương pháp điều tra 26

2.4.2 Phương pháp lấy mẫu 26

2.4.3 Phương pháp xác định chỉ tiêu tổng số vi khuẩn hiếu khí có trong thịt tươi 27

2.4.4 Phương pháp xác định chỉ tiêu vi khuẩn E coli trong thịt lợn 27

2.4.5 Phương pháp phát hiện Salmonella 27

2.4.6 Các phương pháp phát hiện Listeria monocytogenes 30

2.4.7 Phương pháp xác định độc lực của vi khuẩn E coli, Salmonella và Listeria phân lập được 31

2.4.8 Phương pháp xác định tính mẫn cảm với một số loại kháng sinh của vi khuẩn E coli, Salmonella và Listeria phân lập được 31

2.4.9 Phương pháp xác định độc tố đường ruột (Enterotoxin) bằng phương pháp

khuếch tán trong da thỏ 32

2.5 Phương pháp xử lý số liệu 33

Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 34

3.1 Khảo sát tình hình giết mổ và tiêu thụ thịt lợn tại 3 khu chợ nghiên cứu trên địa bàn TP Lạng Sơn 34

3.2 Nghiên cứu về chỉ tiêu tổng số vi khuẩn hiếu khí nhiễm trên thịt lợn tươi 35

3.3 Khảo sát chỉ tiêu vi khuẩn E coli, Salmonella spp và L monocytogenes nhiễm trên thịt lợn bán tại chợ 38

3.3.1 Xác định chỉ tiêu vi khuẩn E coli, Salmonella spp., Listeria monocytogenes trên thịt lợn bán tại các chợ nghiên cứu 38

3.3.2 Xác định chỉ tiêu vi khuẩn E coli, Salmonella spp., Listeria monocytogenes nhiễm trên thịt lợn theo thời gian lấy mẫu trong ngày 40

3.4 Xác định mức độ nhiễm vi khuẩn Escherichia coli, Salmonella spp., Listeria monocytogenes trên thịt lợn tại các chợ nghiên cứu 43

3.4.1 Xác định mức độ ô nhiễm của vi khuẩn E coli trên thịt lợn 43

3.4.2 Xác định mức độ ô nhiễm của vi khuẩn Salmonella spp trên thịt lợn 45

3.4.3 Xác định mức độ ô nhiễm của vi khuẩn L monocytogenes trên thịt lợn 47

3.5 Giám định một số đặc tính sinh vật, hóa học của vi khuẩn Escherichia coli, Salmonella spp., L monocytogenes phân lập được 49

3.5.1 Giám định một số đặc tính sinh vật, hóa học của các chủng vi khuẩn Escherichia coli phân lập được 49

3.5.2 Giám định một số đặc tính sinh vật, hóa học của vi khuẩn Salmonella spp phân lập được 50

3.5.3 Giám định một số đặc tính sinh vật, hóa học của vi khuẩn Listeria monocytogenes phân lập được 51

3.6 Xác định độc lực của các chủng vi khuẩn E coli, Salmonella spp., L monocytogenes phân lập được 52

3.7 Xác định yếu tố gây bệnh của các chủng E coli, Salmonella spp.,

L monocytogenes phân lập được 54

3.7.1 Xác định khả năng sản sinh độc tố đường ruột (Enterotoxin) của vi khuẩn E coli, Salmonella spp bằng “Phản ứng khuếch tán trong da thỏ” 54

3.7.2 Xác định ADN mang gen mã hóa yếu tố gây bệnh Listeriolysin (hly A) của vi khuẩn Listeria monocytogenes bằng phản ứng PCR 55

3.8 Xác định tính mẫn cảm với một số loại kháng sinh và hóa dược của các chủng E coli, Salmonella spp., L monocytogenes phân lập được 56

3.8.1 Xác định tính mẫn cảm với một số loại kháng sinh và hóa dược của các chủng E coli phân lập được 57

3.8.2 Xác định tính mẫn cảm với một số loại kháng sinh và hóa dược của các chủng Salmonella spp phân lập được 59

3.8.3 Xác định tính mẫn cảm với một số loại kháng sinh và hóa dược của các chủng L monocytogenes phân lập được 61

3.9 Đề xuất một số biện pháp khống chế tình trạng ô nhiễm vi sinh vật trong thịt lợn bán tại chợ trên địa bàn thành phố Lạng Sơn 63

3.9.1 Trong hoạt động giết mổ tại các cơ sở giết mổ lợn 63

3.9.2 Các giải pháp quản lý 63

3.9.3 Các giải pháp kinh tế - xã hội 63

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 65

1 Kết luận 65

2 Đề nghị 66

TÀI LIỆU THAM KHẢO 67

PHỤ LỤC ẢNH 77

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VIẾT TẮT

DANH MỤC BẢNG BIỂU

Bảng 1.1: Đánh giá kết quả cảm quan thịt (Nguyễn Vĩnh Phước, 1976 7

Bảng 1.2 Độc lực của các chủng E coli (Sabra A., 2002) 10

Bảng 1.3 Đặc điểm sinh hóa của một số loài Listeria (TCVN 7700-1:2007 15

Bảng 2.1 Bảng phân biệt các loài Listeria 30

Bảng 3.1 Thời gian hoạt động, ình hình tiêu thụ thịt lợn tại 3 khu chợ lớntrên địa bàn TP Lạng Sơn 34

Bảng 3.2 Kết quả xác định chỉ tiêu tổng số VKHK nhiễm trên thịt lợn 36

Bảng 3.3 Tình hình nhiễm khuẩn E coli, Salmonella spp., Listeria monocytogenes trên thịt lợn 38

Bảng 3.4 Nhiễm khuẩn E coli, Salmonella spp., Listeria monocytogenestrên thịt lợn theo thời gian lấy mẫu trong ngày 41

Bảng 3.5 Mức độ nhiễm E coli trên thịt lợn 43

Bảng 3.6 Mức độ nhiễm Salmonella spp trên thịt lợn 45

Bảng 3.7 Mức độ nhiễm Listeria monocytogenes trên thịt lợn 47

Bảng 3.8 Đặc tính sinh vật, hóa học của vi khuẩn E coli phân lập được 49

Bảng 3.9 Đặc tính sinh vật, hóa học của các chủng vi khuẩn Salmonella spp phân lập được 51

Bảng 3.10 Đặc tính sinh vật, hóa học của các chủng vi khuẩn L monocytogenes phân lập được 52

Bảng 3.11 Độc lực của vi khuẩn E coli, Salmonella spp và Listeria monocytogenes phân lập được 53

Bảng 3.12 Khả năng sản sinh độc tố đường ruột (Enterotoxin) của vi khuẩn E coli, Salmonella spp 54

Bảng 3.13 Xác định ADN mang gen mã hóa sản sinh Listeriolysin (hly A) của vi khuẩn Listeria monocytogenes phân lập được 55

Bảng 3.14 Kết quả thử tính mẫn cảm với một số loại kháng sinh và hóa dược của các chủng vi khuẩn E coli phân lập được 57

Bảng 3.15 Kết quả tính mẫn cảm với một số loại kháng sinh và hóa dược của

các chủng Salmonella phân lập được 59

Bảng 3.16 Kết quả tính mẫn cảm với một số loại kháng sinh và hóa dược của

các chủng L monocytogenes phân lập được 61

DANH MỤC HÌNH, ĐỒ THỊ

Hình 3.1 Biểu đồ về chỉ tiêu tổng số VKHK nhiễm trên thịt lợn 36

monocytogenes trên thịt lợn 39

monocytogenes trên thịt lợn theo thời gian lấy mẫu trong ngày 42

dung huyết Listeriolysin của vi khuẩn L monocytogenes 56

số chủng vi khuẩn E coli phân lập được 58

chủng Salmonella phân lập được 60

Hình 3.10 Biểu đồ tính mẫn cảm với một sô loại kháng sinh và hóa dược của

các chủng L monocytogenes phân lập được 62

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài

Trong những năm gần đây vấn đề bảo đảm chất lượng và an toàn thực phẩm đang là mối quan tâm hàng đầu của nhiều quốc gia trên thế giới Sự phát triển kinh tế mạnh mẽ song song với quá trình đô thị hóa, cùng với sự mở rộng giao thương quốc

tế nên hàng hóa từ một nước có thể nhập và được tiêu dùng ở nhiều nước khác nhau trên thế giới Với phương tiện giao thông hiện đại, thế giới như được thu nhỏ lại Do vậy sự mất an toàn vệ sinh thực phẩm (ATVSTP) ở nơi này có thể lan truyền sang nơi khác rất nhanh ATVSTP là vấn đề bức xúc hàng đầu và đóng vai trò quan trọng trong đời sống cộng đồng, đặc biệt trong giai đoạn hiện nay thực phẩm an toàn có đóng góp to lớn đối với việc cải thiện sức khỏe và nâng cao chất lượng cuộc sống con người cũng như về lâu dài đối với sự phát triển của giống nòi

Theo báo cáo của Tổ chức Y tế thế giới (WHO-2000) hơn 1/3 dân số các nước phát triển vẫn bị ảnh hưởng của những bệnh do thực phẩm gây ra mỗi năm Đối với các nước nghèo, các nước đang phát triển lại càng trầm trọng hơn nhiều, con số tử vong do ngộ độc thực phẩm hàng năm khá cao tới hơn 2,2 triệu người, trong đó hầu hết là trẻ em

Vệ sinh thực phẩm hiện nay đang là thách thức mới đối với sức khỏe cộng đồng

ở Việt Nam Trong vòng 5 năm (2006 - 2010) tổng số có 944 đợt ngộ độc thực phẩm, với 33.168 người bệnh và 259 người chết (tài liệu Viện Dinh dưỡng Quốc gia và UNICEF, 2011) Tuy nhiên, thông tin về nguồn gốc vi sinh vật của những ổ dịch này rất hạn chế (dẫn theo Nguyễn Viết Không và cs., 2012) [17]

Các vụ ngộ độc thực phẩm trên thế giới có xu hướng ngày càng tăng, Tại Mỹ, mỗi năm có khoảng 76 triệu ca bệnh do thực phẩm, gồm 325.000 ca nhập viện và 5.000 người chết, gây thiệt hại khoảng 10 - 83 tỷ đô la (Nyachuba D G.,2010) [77]

Cynthia A Roberts (2001) [59] cho biết, có một số vi sinh vật có khả năng gây

ngộ độc thực phẩm cấp tính nguy hiểm với tỉ lệ tử vong cao như: L monocytogenes,

Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Vibrio cholera, Salmonella, Campylobacterer, Yersinia enterocolitica…

Thực tế hiện nay, thực phẩm có nguồn gốc từ động vật đặc biệt là thịt lợn bán ở một số chợ, cửa hàng lại không đảm bảo chất lượng (thịt bị nhiễm bụi bẩn, vi khuẩn do quá trình giết mổ, vận chuyển và bày bán ở chợ) Điều đó cũng lý giải vì sao mà hàng năm có rất nhiều vụ ngộ độc thực phẩm xảy ra Một trong những nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm là do vi sinh vật và các độc tố của chúng nhiễm trong thịt, trong đó có vi

khuẩn E coli, Listeria và Salmonella và độc tố đường ruột Enterotoxin là một trong

những nguyên nhân hàng đầu gây ngộ độc thực phẩm

Xuất phát từ những yêu cầu cấp thiết trên, chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề tài:

“Nghiên cứu một số đặc tính sinh vật học của vi khuẩn Escherichia coli, Listeria monocytogenes và Salmonella spp nhiễm trên thịt lợn tiêu thụ tại địa bàn thành phố Lạng Sơn, đề xuất biện pháp phòng chống”

2 Mục tiêu nghiên cứu

- Xác định mức độ nhiễm các vi khuẩn E coli, Salmonella spp., L

monocytogenes trên thịt lợn tiêu thụ ở TP Lạng Sơn và một số đặc điểm sinh học của

chúng (đặc tính sinh vật hóa học, định type vi khuẩn, độc lực vi khuẩn, độc tố vi

khuẩn E coli, Salmonella spp và L monocytogenes);

- Đề xuất biện pháp phòng chống ngộ độc thực phẩm do vi khuẩn gây ra

3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

- Ý nghĩa khoa học: Cung cấp các dữ liệu khoa học về vi khuẩn E coli,

Salmonella spp và L monocytogenes nhiễm trên thịt lợn tươi bán tại một số chợ

thuộc địa bàn TP Lạng Sơn

- Ý nghĩa thực tiễn: Xác định tình hình giết mổ, kiểm tra vệ sinh thú y đối với sản

phẩm thịt lợn tươi tại TP Lạng Sơn; tình hình ô nhiễm vi khuẩn E coli, Salmonella spp

và L monocytogenes trong thịt lợn tươi tại TP Lạng Sơn Từ đó có cơ sở đề xuất biện

pháp phòng chống hiệu quả các nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm do nhiễm khuẩn

E coli, Salmonella spp và L monocytogenes trong thịt

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Cơ sở khoa học của đề tài

1.1.1 Ngộ độc thực phẩm (NĐTP)

1.1.1.1 Khái niệm ngộ độc thực phẩm

Ngộ độc thực phẩm (Intoxincation) hay còn gọi là trúng độc thức ăn do ăn phải những thức ăn có chứa chất độc, thường xảy ra một cách đột ngột hàng loạt (nhưng không phải là các bệnh dịch), có những triệu chứng của một bệnh cấp tính Bệnh thường có biểu hiện nôn mửa, ỉa chảy (trừ nhiễm độc tố của vi khuẩn độc thịt thì lại bị táo bón) và các triệu chứng khác đặc hiệu cho mỗi loại ngộ độc (Đào Thị

Thanh Thủy, 2012) [31] Trong đó có ngộ độc thực phẩm do nhiễm vi khuẩn L

monocytogenes và Salmonella

Theo thống kê từ Cục Vệ sinh an toàn thực phẩm - Bộ Y tế (2009) [3], (2010) [4], (2011) [5], (2012) [6], (2013) [7], (2014) [8] (2015) [9]: năm 2009 cả nước đã xảy ra 152 vụ ngộ độc thực phẩm với 5.212 người mắc và 35 người chết Năm 2010,

số vụ ngộ độc trên cả nước tăng lên 175 vụ với 5.664 người mắc và 51 người chết Năm 2011, số vụ NĐTP có xu hướng giảm nhẹ còn 148 vụ với 4.700 người mắc và

27 người chết Tuy nhiên đến năm 2012, tình trạng NĐTP có xu hướng tăng trở lại,

cả nước xảy ra 168 vụ NĐTP với 5.541 người mắc và 34 người chết Năm 2013, xảy

ra 160 vụ NĐTP trên cả nước với 5.238 người mắc và 28 người tử vong So với năm

2013, trong năm 2014 số người mắc và đi viện do NĐTP giảm, nhưng số vụ tăng hơn 13% với 189 vụ ghi nhận hơn 5.000 người mắc và 43 người tử vong Trong năm

2015, toàn quốc ghi nhận 171 vụ ngộ độc thực phẩm với 4.965 người mắc và 23 trường hợp tử vong Tình trạng mất an toàn thực phẩm ngày càng cao, nhất là ở các bếp ăn tập thể như trường học, bệnh viện, khu công nghiệp, nơi tập trung đông người

1.1.1.2 Nguyên nhân gây ô nhiễm và ngộ độc thực phẩm

Ngộ độc thực phẩm xảy ra khi con người ăn phải thức ăn, thức uống nhiễm bẩn, bảo quản không đúng cách hoặc bị nhiễm trùng, virus, ký sinh trùng, nấm mốc

hay hóa chất độc hại Nhiễm độc thực phẩm có thể chia làm hai loại: Nhiễm độc do hóa chất và nhiễm độc do các yếu tố sinh vật (Đỗ Bích Duệ, 2012) [10]

Cuiwei Zhao và cs (2001) [58] cho biết, ngộ độc thực phẩm do thực phẩm bị

ô nhiễm vi sinh vật và độc tố của nó hiện nay đang là mối quan tâm hàng đầu của con người thậm chí cả các quốc gia phát triển như Mỹ (Hoa Kỳ), Anh, Nhật Bản, Trung Quốc…

1.1.1.3 Ngộ độc thực phẩm do vi sinh vật

Wall et al (1998) [94] cho biết, trong thời gian từ năm 1992-1996, tại Anh và

xứ Wales đã xảy ra 2.877 ca ngộ độc mà nguyên nhân là do vi sinh vật, làm cho 26.711 người bị bệnh, trong đó có 9.160 người phải nằm viện và 52 người tử vong

Theo Nyachuba D G (2010) [77], ước tính thiệt hại kinh tế ở Mỹ do bệnh ngộ độc thực phẩm gây ra hàng năm khoảng 10 - 83 tỷ đô la Mỹ

Adeyanju G T và Ishola O (2014) [45] cho biết, Salmonella spp và Escherichia

coli trong thịt gia cầm là hai loại vi khuẩn đóng vai trò quan trọng nhất gây bệnh truyền

qua thực phẩm ảnh hưởng lớn đến sức khỏe con người trên toàn thế giới

1.1.1.4 Ô nhiễm thịt về chỉ tiêu tổng số vi khuẩn hiếu khí

Thuật ngữ "vi khuẩn hiếu khí" (VKHK) trong vệ sinh thực phẩm được hiểu là bao gồm cả VKHK và vi khuẩn kỵ khí tùy tiện Sự phân chia vi khuẩn thành hai nhóm dựa trên cơ sở nhiệt độ phát triển giữa chúng Theo Cuiwei Zhao và cs (2001) [58]

hệ vi sinh vật có mặt trong thịt được chia thành hai nhóm dựa theo nhiệt độ của chúng Nhóm vi khuẩn ưa lạnh sinh trưởng và phát triển ở nhiệt độ thấp hơn Wall et al

nhiều so với nhóm ưa nhiệt Wall et al (1998) [94] cho rằng vi khuẩn ưa lạnh có thể

số tác giả khác lại cho rằng nhiệt độ tối ưu đối với sự sinh trưởng và phát triển của vi

Hệ VKHK ở thịt thay đổi theo thời gian và điều kiện bảo quản Vi khuẩn ưa nhiệt có thể nhiễm vào thân thịt ngay sau khi giết mổ Do đó những thực phẩm có

(Cuiwei Zhao và cs, 2001) [58]

1.1.1.5 Ngộ độc thực phẩm do E coli

Ngộ độc thực phẩm do E coli là một bệnh rất phổ biến trên toàn cầu Tuy nhiên điều kiện gây ra NĐTP do các serotype E coli lại phụ thuộc nhiều vào mức

độ đời sống kinh tế, xã hội, tập quán sinh hoạt, thói quen ăn uống của con người,

do đó hiện nay tỷ lệ mắc bệnh do E coli cao ở các nước chậm hoặc đang phát

triển, nơi đời sống kinh tế, xã hội của dân cư còn thấp kém chiếm tỷ lệ cao (Cox

L A và cs., 2008) [56]

Vi khuẩn E coli thuộc nhóm trực khuẩn đường ruột họ Enterobacteriaceae, có

nhiều trong tự nhiên, trong đường ruột của người và gia súc Trong đường ruột, chúng

hiện diện nhiều ở đại tràng nên còn gọi là vi khuẩn đại tràng Vi khuẩn E coli nhiễm

vào môi trường đất, nước… từ phân của động vật và chúng gây bệnh khi gặp điều kiện thuận lợi

Theo Adeyanju G T và Ishola O (2014) [45], E coli trong thịt gia cầm là loại

vi khuẩn đóng vai trò quan trọng nhất gây bệnh truyền qua thực phẩm ảnh hưởng lớn đến sức khỏe con người trên toàn thế giới

Meloni D et al (2013) [73], đã thu thập 171 mẫu thịt các lò giết mổ lợn tại

Sardinia, Italia và xác định được 33% số mẫu dương tính với L monocytogenes

Priyanka singh và Alka Prakash (2008) [81], đã nghiên cứu sự ô nhiễm

Escherichia coli, Staphylococcus aureus và L monocytogenes trong các sản phẩm

sữa bán tại các cửa hàng trong khu vực Agra, Ấn Độ Trong số 116 mẫu vi khuẩn

phân lập từ phô mai, 15 mẫu dương tính với E coli, 12 mẫu dương tính với S aureus

và hai mẫu dương tính với L monocytogenes Trong 58 mẫu phân lập từ kem sữa có

5 mẫu dương tính với E coli, 11 mẫu dương tính với L monocytogenes và không mẫu nào dương tính với S aureus

1.1.1.7 Ngộ độc thực phẩm do Salmonella spp

Yu T et al (2014) [92] cho biết: Salmonella là một trong các bệnh do thực phẩm

thường xuyên nhất xảy ra trên toàn thế giới, đặc biệt là ở các nước đang phát triển

Vi khuẩn Salmonella sống trong phủ tạng của gia cầm, gia súc và vấy nhiễm

vào thịt khi giết mổ Chúng cũng có mặt ở phân và dễ dàng xâm nhập vào trứng gia

cầm qua những lỗ nhỏ li ti ở vỏ Salmonella là một trong những thủ phạm chính gây

ngộ độc thực phẩm (Đào Thị Thanh Thủy, 2012) [31]

Theo báo cáo của Trung tâm kiểm soát dịch bệnh Hoa Kỳ (CDC), hàng năm ở

Mỹ có khoảng 76 triệu ca ngộ độc thực phẩm, trong đó có 325.000 trường hợp phải

nhập viện và 5.000 ca tử vong Trong đó, vi khuẩn Salmonella được cho là một trong

những nguyên nhân hàng đầu được xác nhận bởi các phân tích trong phòng thí nghiệm (Centers for Disease Control và Prevention, 2006) [53]

Fox Maggie (2009) [65] cho biết, tại Hoa Kỳ, Salmonella là thủ phạm của 15% các trường hợp NĐTP Salmonella có mặt ở nhiều loại thực phẩm, đặc biệt là thịt gia

cầm, phomat và trứng

Ngày 9/7/2008, tại Mỹ đã có trên 1.000 người bị ngã bệnh vì vi khuẩn

Salmonella, được xem là con số lớn nhất trong 10 năm trước đó tại Hoa Kỳ vì ngộ độc

thực phẩm Các loại thực phẩm bị nghi nhiễm khuẩn là cà chua, ớt đỏ và ngô tươi Tốc

độ nhiễm trung bình là 25 - 40 ca mỗi ngày, lan tràn trong 41 tiểu bang Tại Canada cũng có 4 trường hợp (dẫn theo Dương Quốc Tiến, 2015) [33]

1.1.2 Thịt tươi và các dạng hư hỏng của thịt

1.1.2.1 Thịt tươi

Theo Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 7046 : 2009 [41]: Thịt tươi là thịt của gia

súc, gia cầm, chim và thú nuôi khỏe mạnh sau khi giết mổ ở dạng nguyên con, mảnh,

cơ quan kiểm tra thú y có thẩm quyền cho phép sử dụng làm thực phẩm

Thành phần hóa học của thịt rất khác nhau, phụ thuộc vào các yếu tố giống, loài, lứa tuổi, độ béo gầy và điều kiện chăm sóc, nuôi dưỡng Nhưng nhìn chung thành phần hóa học của thịt bao gồm:

Bảng 1.1: Đánh giá kết quả cảm quan thịt (Nguyễn Vĩnh Phước, 1976 [25])

hồi

Rắn chắc, đàn hồi cao, ấn ngón tay vào thịt tạo vết lõm, nhấc tay

ở những điều kiện không thích hợp sẽ bị biến chất bởi các enzyme có sẵn trong thịt

và vi sinh vật dẫn đến ôi thiu, hư hỏng về trạng thái cảm quan, hình thành những chất

dày Ví dụ Salmonella nhiễm trong chocolate hay L monocitogenes nhiễm trong

phomat vẫn có thể tồn tại dưới tác dụng của môi trường axit trong dạ dày

1.1.3 Đặc điểm sinh học của vi khuẩn E coli

Trực khuẩn ruột già E coli còn có tên gọi Bacterium coli commune (vi khuẩn

thường trú trong ruột già) được Escherich phân lập từ phân trẻ em năm 1885 (Dẫn theo Nguyễn Thị Bích Thanh, 2015) [28]

Giống: Escherichia Loài Escherichia coli, Migula 1895

1.1.3.2 Hình thái và tính chất bắt mầu

E coli là trực khuẩn Gram âm, hình que ngắn, kích thước trung bình từ 0,5 x 1

- 3 μm hai đầu tròn, di động bằng tiên mao quanh tế bào, đứng riêng lẻ, đôi khi xếp thành chuỗi ngắn, không tạo bào tử, loại có độc lực thì có vỏ bao capsule, loại không

có động lực thì không có vỏ bao capsule (dẫn theo Đỗ Bích Duệ, 2012) [10]

1.1.3.3 Tính chất nuôi cấy

E coli phát triển dễ dàng trên các môi trường nuôi cấy thông thường, có thể

- Môi trường nước thịt: Phát triển tốt, môi trường đục, cặn màu tro lắng xuống

đáy, có mùi Indol (mùi phân thối) do phản ứng Indol dương tính

- Môi trường thạch thường: Vi khuẩn phát triển, sau 24h tạo thành những khuẩn

lạc dạng S, hơi hồng, tròn trơn nhẵn, đường kính 2 - 3mm, màu xám nhạt Nuôi lâu khuẩn lạc trở thành mầu tro nhạt, mọc rộng ra, có thể quan sát thấy cả khuẩn lạc dạng

R (nhám, xù xì) và khuẩn lạc dạng M (nhầy)

- Môi trường thạch MacConkey: Hình thành khuẩn lạc dạng S, màu đỏ cánh sen

(do lên men đường lactoza, sản sinh axit), xung quanh có vùng mờ sương (do lên men đường lactoza sinh hơi)

- Môi trường thạch Brilliant green: Khuẩn lạc dạng S màu vàng chanh

- Môi trường thạch máu: Khuẩn lạc dạng S hoặc dạng M (nhầy), có thể dung

huyết hoặc không

- Môi trường thạch Deoxycholate citrate: Vi khuẩn E coli không mọc được do

không sử dụng được nguồn cacbon citrate

- Môi trường thạch Triple Sugar Iron (TSI): vi khuẩn phát triển nhưng không

E coli lên men đường latoza, maltoza, mannit, mannoza, sorbitol, xyloza,

saccaroza (26 - 70%) Hầu hết E coli đều lên men sinh hơi đường lactoza

- Nghiệm pháp IMVIC xác định vi khuẩn: Indol, MR, VP, Citrate

1.1.3.4 Sức đề kháng

E coli không chịu được nhiệt độ Đun ở 550C/1h, 600C/30 phút, đun sôi 1000C

E coli bị chết ngay

Các chất sát trùng thông thường như axit phenic, formol 0,3% diệt vi khuẩn sau

5 phút, ở ngoài môi trường vi khuẩn có thể tồn tại đến 4 tháng

1.1.3.5 Tính gây bệnh

Trong đường tiêu hóa, E coli chiếm khoảng 80% các vi khuẩn hiếu khí Đồng thời, E coli cũng là vi khuẩn gây bệnh quan trọng, nó đứng đầu trong các vi khuẩn

gây ỉa chảy, viêm đường tiết niệu, viêm đường mật; đứng hàng đầu trong các căn

nguyên gây nhiễm khuẩn huyết E coli có thể gây nhiều bệnh khác như viêm phổi,

viêm màng não, nhiễm khuẩn vết thương (Lê Huy Chính, 2007) [2]

Bảng 1.2 Độc lực của các chủng E coli (Sabra A., 2002 [84])

E coli (EAEC) Chỉ tìm thấy ở người

Bệnh do vi khuẩn E coli gây ra là một bệnh truyền nhiễm cấp tính Vi khuẩn E

coli gây bệnh ở người như tiêu chảy, NĐTP do ăn phải thịt nhiễm khuẩn và độc tố

gây bệnh Các triệu chứng điển hình và thể bệnh do E coli gây ra là viêm dạ dày ruột,

viêm đường tiết niệu sinh dục, viêm màng não, nhiễm trùng máu, nhiễm độc huyết, bại huyết

Vi khuẩn E coli có khả năng sản sinh hai loại độc tố: Độc tố chịu nhiệt (Heat Stable Toxin-ST) và độc tố không chịu nhiệt (Heat Labile Toxin - LT) Chủng E

coli sản sinh độc tố là nguyên nhân gây tiêu chảy ở người

Các Serotype E coli có khả năng gây ngộ độc thực phẩm gồm O26, O56, O86, O111,

O119, O125, O126, O127, O157 H7 (Hoàng Thu Thủy, 1991) [31]

1.1.4 Đặc điểm sinh học của vi khuẩn Salmonella

Salmonella được phát hiện lần đầu tiên năm 1885 bởi Salmon và Smith là Salmonella choleraesuis Năm 1934 chính thức được đặt tên Salmonella (Quinn P J

et al, 1994) [82] Đến nay đã phát hiện hơn 2.000 serotype Salmonella khác nhau, có

khả năng gây bệnh, gây ô nhiễm thực phẩm cho cả người và động vật Gây bệnh ở

người: S typhi (gây bệnh thương hàn), S paratyphi và S schottmuelleri (gây bệnh phó thương hàn) S enteritidis, S typhimurium gây ngộ độc thực phẩm

Giống: Salmonella lignieres, 1900 Loài Salmonella bongori Loài Salmonella Enterica

1.1.4.2 Hình thái và tính chất bắt màu

Trực khuẩn Salmonella có dạng hình gậy ngắn, kích thước 0,4 - 0,6 x 1 - 3

µm, không có giáp mô, không sản sinh nha bào, di động được do có lông, tỷ lệ 7 - 12

lông (trừ S pullorum và S gallinarum là không có lông), vi khuẩn bắt màu Gram âm

(Cuiwei Zhao et al, 2001) [58]

1.1.4.3 Tính chất nuôi cấy

Đào Thị Thanh Thủy (2012) [31] cho biết: Salmonella sống hiếu khí hoặc yếm

khí tuỳ tiện, dễ mọc trên các môi trường nuôi cấy thông thường Nhiệt độ thích hợp

- Môi trường nước thịt: Sau 24h/370C, vi khuẩn phát triển làm đục đều môi trường, trên mặt tạo màng mỏng, đáy lắng cặn

- Môi trường thạch thường: Hình thành những khuẩn lạc dạng S, trơn, tròn

sáng, bóng, màu trắng đục

- Môi trường thạch nghiêng Triple Sugar Iron agar (TSI agar): Sinh H2S ở phần thạch nghiêng

- Môi trường Xylose, Lysine Deoxycholate agar (XLD agar): Vi khuẩn phát

- Môi trường MacConkey agar: Khuẩn lạc dạng S, màu trắng

- Môi trường Brilliant green agar: Khuẩn lạc dạng S, màu đỏ

- Chuyển hoá đường: Mỗi loài Salmonella có khả năng lên men một số loại

đường và không đổi Salmonella lên men sinh hơi sản sinh axit đường glucoza, mannoza, sorbitol, mannit Tất cả các loài Salmonella đều không lên men đường

lactoza và saccaroza

- Phản ứng đỏ metyl MR dương tính

- Phản ứng sản sinh Indol âm tính

- Phản ứng phân giải Citrate dương tính

- Phản ứng phân giải ure âm tính

1.1.4.4 Đặc tính sinh hóa

Theo Nguyễn Quang Tuyên (2008) [42] đặc tính chung của Salmonella là không lên men đường lactose Mỗi loài Salmonella có khả năng lên men một số đường nhất định và không đổi Phần lớn các loài Salmonella lên men có sinh hơi đường glucoza, mannit, mantoza, galactoza, levuloza, arabinoza Một số loài như S

abortus equi, S abortus bovis, S abortus ovis, S typhi, S typhisuis, S cholerae suis,

S gallinarum, S enteritidis cũng lên men các đường nhưng không sinh hơi Riêng S pullorum không lên men mantoza, S cholerae suis không men arabinoza Tất cả các

vi khuẩn Salmonella đều không lên men lactoza, saccaroza

Salmonella có những đặc tính sinh hóa chủ yếu mà dựa vào đó người ta có thể

định hướng phân biệt với các vi khuẩn đường ruột khác Các chủng Salmonella sinh acid do lên men glucose, mannitol, dulcitol nhưng không lên men lactose (trừ S

arizona) và sucrose, không có khả năng tách amine từ trytophan Chúng không sinh

và tách carboxyl (de-carboxylate) từ ornithine và lysine Chúng kém chịu nhiệt nhưng chịu đuợc một số hóa chất như brilliant green, sodium lauryl sulfite, selenite, sodium tetrathionate Những chất này được dùng để chọn lọc chúng từ mẫu thực phẩm và

nước (Đào Thị Thanh Thủy, 2012) [31]

1.1.4.5 Sức đề kháng

Salmonella tồn tại trong đường tiêu hoá của cả động vật máu nóng và máu lạnh

(các loài cá, động vật thủy sản), trong môi trường tự nhiên, phân, đất, nước thải, đặc biệt trong thực phẩm có nguồn gốc động vật như bột thịt xương, bột trứng, bột cá… tồn tại

được 9 tháng hoặc lâu hơn Salmonella sống trong thịt ướp muối 29% được 4 - 8 tháng

vi khuẩn (Đào Thị Xuân, 2014) [44]

- Ánh sáng mặt trời diệt khuẩn trong môi trường nước, sau 5h ở nước trong và 9h ở nước đục

- Các chất sát trùng thông thường diệt vi khuẩn dễ dàng: Axit phenic 5%, formol 0,5% diệt khuẩn sau 15 - 20 phút (Nguyễn Quang Tuyên, 2008) [42]

1.1.4.6 Độc tố và cơ chế gây bệnh

Salmonella gây bệnh cho người và vật nuôi (gia súc, gia cầm và loài chim)

Bình thường vi khuẩn có thể được phát hiện trong đường ruột của người và gia súc khoẻ mạnh (lợn nái…) Khi sức đề kháng của vật chủ giảm sút sẽ tạo điều kiện thuận

lợi cho Salmonella tác động gây bệnh

Ngoài yếu tố gây bệnh giúp vi khuẩn Salmonella bám dính, xâm nhập tế bào Đối với vi khuẩn Salmonella chúng sản sinh ra ít nhất 3 loại độc tố chính đó là độc tố

đường ruột (Enterotoxin), nội độc tố (Endotoxin) và độc tố tế bào (Cytotoxin) Trong

đó độc tố đường ruột (Enterotoxin) có vai trò trong ngộ độc thực phẩm (Đào Thị Thanh

Thủy, 2012) [31]

Lê Huy Chính (2007) [2] cho biết: NĐTP xảy ra do ăn phải thức ăn bị nhiễm

Salmonella, thường do thức ăn không được bảo quản trong tủ lạnh Các loài Salmonella gây nhiễm độc thức ăn thường gặp ở nước ta là Salmonella typhimurium

và Salmon ella enteritidis

1.1.5 Đặc điểm sinh học của vi khuẩn L monocytogenes gây ô nhiễm thịt

Listeria được phát hiện lần đầu tiên vào năm 1924 bởi Joseph Lister và sau

này tên Listeria được đặt theo tên nhà khoa học này Hiện nay, đã phát hiện được 10 loài vi khuẩn Listeria, trong đó có L monocytogenes Năm 1981, L monocytogenes

được xác định là nguyên nhân chính gây ngộ độc thực phẩm liên quan đến 41 trường hợp mắc bệnh và 18 ca tử vong, chủ yếu ở phụ nữ mang thai và trẻ em

Giống: Listeria Loài Listeria monocytogenas

Walter Chaim và David A Eschenbach (2014) [95] cho biết, trong các loài

Listeria trên chỉ có loài L monocytogenes là tác nhân gây bệnh cho con người 1.1.5.2 Hình thái và tính chất bắt màu

Vũ Thị Huyền (2012) [16] cho biết: L monocytogenes là vi khuẩn gram dương thuộc chi Listeria Vi khuẩn này có hình que, không bào tử, yếm khí, kích thước khoảng

0,5 x 1,5µm Vi khuẩn L monocytogenes có kháng nguyên thân O và kháng nguyên lông

H, được chia thành 7 loại huyết thanh (từ I đến VII)

Elliot T Ryser và Elmer H Marth (2007) [62] cho biết: L monocytogenes là

phát triển trong tế bào

Theo Walter Chaim và David A Eschenbach (2014) [95], Listeria spp là vi khuẩn

hình que mảnh, kích thước khoảng 0,5 x 1 - 2 µm Phản ứng catalase dương tính Sau khi nhuộm Gram ta thấy những tế bào hình que riêng lẻ hoặc những tế bào nối với nhau thành một chuỗi tế bào

1.1.5.3 Đặc tính sinh hóa

Tùy từng loài hay từng kiểu huyết thanh mà Listeria spp có các biểu hiện sinh

hóa khác nhau, các đặc điểm sinh hóa chung được thể hiện như sau:

Bảng 1.3 Đặc điểm sinh hóa của một số loài Listeria (TCVN 7700-1:2007 [39])

lên men như L ivanovii Lomdiniesis

biến đổi nitrate

1.1.5.4 Sức đề kháng

Vi khuẩn L monocytogenes sống rất dai và khác với đa số vi khuẩn khác L

monocytogenes có thể tăng trưởng chậm trong tủ lạnh ở nhiệt độ 40C Hiện nay

các nhà khoa học cho rằng con đường nhiễm L monocytogenes phổ biến nhất là

qua thực phẩm

Lado B và Yousef A E (2007) [69] cho biết: L monocytogenes phát triển được

thực phẩm được bảo quản trong tủ lạnh

1.1.5.5 Độc tố

Theo Walter Chaim và David A Eschenbach (2014) [95] các yếu tố độc lực của

L monocytogenes bao gồm: listeriolysin O (LLO), protein ACTA, Phospholipases,

metalloprotease, Protein P60, Protease CLP và ATPases

Ellin Doyle M (2001) [63] cho biết: nhiệt độ và độ pH có ảnh hưởng lớn đến

các yếu tố độc lực của vi khuẩn Listeria Listeria có thể tồn tại ở nhiệt độ thấp (4 -

cho Listeria giảm hoặc không sản sinh yếu tố độc lực listeriolysin O (LLO)

1.1.5.6 Phân bố

Vi khuẩn L monocytogenes được tìm thấy ở rất nhiều nơi trong tự nhiên nhu đất,

nước, thảm thực vật mục nát, trong các động vật hoang dã, rau xanh, các loại sản phẩm chế biến từ sữa, thịt cá tươi sống và các sản phẩm của thịt cá… Một số loại thực phẩm

như ngô, xà lách, chocolate, tôm và gạo đã được báo cáo có nhiễm vi khuẩn L

monocytogenes (Vũ Thị Huyền, 2012 [16])

1.2 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước

1.2.1 Tình hình nghiên cứu trong nước

1.2.1.1 Tình hình nghiên cứu trong nước về E coli

Phùng Văn Mịch (2008) [22] cho biết, số mẫu thịt lợn sau giết mổ đạt chỉ tiêu

vi khuẩn E coli là 45,0%

Nguyễn Thị Thanh Thủy và cs (2011) [32] khi nghiên cứu xác định tỷ lệ vi

khuẩn Verotoxigenic E coli (VTEC) trong mẫu thịt tại chợ, lò mổ trên địa bàn Hà Nội cho biết: tỷ lệ Verotoxigenic E coli phân lập được trong 30 mẫu thịt gà tại chợ

là 30% (9/30), không có mẫu nào tại lò mổ dương tính

Một nghiên cứu của tác giả Trần Thị Hương Giang, Huỳnh Thị Mỹ Lệ (2012) [12]: Qua kiểm tra 90 mẫu thịt (lợn, bò, gà) lấy tại 11 chợ ở một số huyện ngoại thành

Hà Nội (huyện Gia Lâm, Đông Anh và Sóc Sơn) cho thấy, tỷ lệ mẫu thịt bò và thịt

lợn không đạt TCVS ở chỉ tiêu E coli là 53,33%, cao nhất là thịt gà (60,0%) 100%

chủng phân lập được có độc lực cao, gây chết chuột bạch trong vòng 24 - 72 giờ

Phạm Thị Ngọc Lan và cs (2012) [23] đã khảo sát tình hình vệ sinh an toàn của một số thực phẩm chế biến và tiêu thụ ở thành phố Huế với 1.035 mẫu được kiểm tra, bao gồm: 543 mẫu thực phẩm các loại, 492 mẫu bàn tay và vật dụng Kết quả có

936 mẫu dương tính với E coli, trong đó, có 110 mẫu thực phẩm, 107 mẫu vật dụng

và bàn tay không đạt chỉ tiêu E coli

Cầm Ngọc Hoàng và cs (2014) [15] cho biết: Có tới 90,24% số mẫu thịt bị ô

nhiễm do Salmonella, tiếp theo là E coli (76,83%) và thấp nhất S aureus (68,29%)

Nguyễn Thị Bích Thanh (2015) [28] đã điều tra tình hình nhiễm vi khuẩn E

coli trên thịt gà tươi bán tại chợ khu vực Hà Đông, Hà Nội và cho biết 70,8% số mẫu

điều tra ô nhiễm vi khuẩn E coli; trong đó có 22,5% số mẫu không đạt tiêu chuẩn vệ

sinh thú y

1.2.1.2 Tình tình nghiên cứu trong nước về Salmonella

Lê Văn Tạo và Nguyễn Thị Vui (1994) [27] khi tiến hành phân lập, xác định

serotype của vi khuẩn Salmonella gây bệnh ở lợn cho biết: 50% là S cholerae suis; 12,5% S enteritidis; 6,5% S typhimurium và còn lại là các serotype khác

Vũ Bình Minh, Cù Hữu Phú (1999) [21] đã phân lập được Salmonella ở 80%

các trường hợp lợn bị tiêu chảy

Hà Thị Anh Đào (2005) [11] cho biết đã tìm thấy cả 3 loại vi khuẩn gây bệnh

nguy hiểm Salmonella, E coli và Campylobacter jejuni trên thịt gà Trong đó, tỷ lệ nhiễm E coli trên thịt gà là 50%

Le Bas C và cs (2006) [70] tiến hành khảo sát tỷ lệ nhiễm Salmonella spp ở

lợn tại các cơ sở giết mổ nhỏ lẻ tại Hà Nội, Việt Nam Kết quả cho thấy trên 50% số mẫu thân thịt và 62% số mẫu nước sử dụng giết mổ dương tính Các tác giả cũng cho biết vi khuẩn có thể tồn tại trong đất và nước lên đến vài tuần, thậm chí 6 tháng trong các mẫu nước thu thập từ các bể chứa nước trong lò mổ

Đỗ Văn Hiê ̣p (2007) [14] khảo sát 148 điểm giết mổ lợn và trâu bò ta ̣i huyê ̣n

thức thủ công với các dụng cụ thô sơ; 89,2% hô ̣ giết mổ dùng nước giếng khoan không qua xử lý; 100% số hô ̣ giết mổ không quan tâm đến viê ̣c khử trùng tiêu đô ̣c nơi giết mổ và dụng cu ̣ giết mổ Hoạt động giết mổ như vậy đã gây ô nhiễm vi sinh

vật trầm trọng vào thân thịt Trong đó có 36,5% mẫu nhiễm Salmonella

Tỷ lệ nhiễm Salmonella ở các mẫu lau hậu môn, manh tràng; nền chuồng chờ

giết mổ; lau sàn giết mổ và mẫu lau thân thịt lần lượt là 59,72%; 48,26%; 37,50% và 60,00% (Phạm Thị Ngọc và cs., 2013) [23]

Dương Quốc Tiến (2015) [33] cho biết, tỷ lệ nhiễm vi khuẩn Salmonella trên

thịt lợn tại TP Thái Nguyên là 38,33%; tất cả số mẫu nhiễm khuẩn này đều không đạt tiêu chuẩn vệ sinh thú y

1.2.1.3 Tình tình nghiên cứu trong nước về Listeria

Lê Huy Chính (2007) [2] cho biết, bệnh do Listeria chia làm hai loại:

- Thai nhi, sơ sinh và phụ nữ có thai: Listeria lây truyền qua rau thai hoặc trong

khi sinh, dẫn tới đẻ non hoặc nhiễm khuẩn huyết hay viêm màng não cấp sau sinh từ

tuần 1 đến tuần thứ 4 Mẹ bị nhiễm Listeria thường là không triệu chứng hoặc bệnh

giống như cúm

- Người lớn bị suy giảm miễn dịch nhiễm L monocytogenes biểu hiện nhiễm

khuẩn huyết hoặc viêm màng não Các bệnh này thường gặp ở các bệnh nhân bị ung thư hoặc ghép thận

Đỗ Ngọc Ánh (2011) [1] cho biết: Vi khuẩn L monocytogenes là vi sinh vật

gây ngộ độc thực phẩm nguy hiểm, chúng có thể phát triển trong những điều kiện

Lê Thị Lành (2015) [19] công bố: Vàng nano dạng cầu (GNP) và vàng nano dạng thanh (GNR) đều có khả năng ức chế được sự phát triển của vi khuẩn, trong đó vàng nano dạng thanh (GNR) có khả năng kháng khuẩn tốt hơn, đặc biệt là đối với 2

loại vi khuẩn L monocytogenes và S aureus thì GNR có khả năng ức chế tốt hơn so

với kháng sinh kanamycin

Dương Quốc Tiến (2015) [33] đã nghiên cứu tình hình nhiễm khuẩn

L.monocytogenes trên thịt lợn tươi tại khu vực TP Thái Nguyên thấy 21,7% số mẫu

dương tính và 15,83% số mẫu không đạt quy chuẩn Việt Nam về chỉ tiêu vi khuẩn L

monocytogenes

1.2.2 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Biggerstaff G K (2014) [51] cho biết: mỗi năm bệnh do thực phẩm (FBD) ảnh hưởng đến khoảng 1 trong 6 người Mỹ, kết quả là 128.000 người phải nhập viện

và 3.000 ca tử vong

Crim S M et al (2014) [57] cho biết: bệnh ngộ độc thực phẩm luôn là một vấn

đề lớn tại Hoa Kỳ Trong năm 2013, có 19.056 người bị ngộ độc, 4.200 trường hợp phải nằm viện điều trị và có 80 trường hợp tử vong

Từ 8/2012 đến 3/2013, Schoder D et al (2014) [86] đã thu thập 600 mẫu sản phẩm động vật nhập khẩu tại sân bay quốc tế Vienna - Áo để kiểm tra sự ô nhiễm vi

sinh vật Kết quả cho thấy có 2,5% số mẫu dương tính với L monocytogenes, 1,3% dương tính với E coli và 1,2% với Salmonella spp

Vally H et al (2014) [91] tiến hành xác định tỷ lệ bệnh lây truyền qua thực phẩm

trong năm 2010 tại Australia Các tác giả đã kết luận: 98% số ca nhiễm Clostridium

perfringens là truyền qua thực phẩm, tương tự với L monocytogenes là 98%, Salmonella

spp là 72% và Campylobacter spp là 77%

1.2.2.1 Tình tình nghiên cứu trên thế giới về E coli

Nimri L et al (2014) [76] đã đánh giá tình hình nhiễm khuẩn trên bánh mỳ kẹp

thịt (sandwiches) tại miền bắc Jordan Kết quả cho thấy 28,3% số mẫu dương tính với E

coli; 25,5% dương tính với Salmonella spp.; 15,9% dương tính với Citrobacter freundii

và 8,3% dương tính với S aureus Tỷ lệ nhiễm khuẩn cao hơn ở các mẫu sandwiches gà

Đa số các loài vi khuẩn phân lập được có hiện tượng kháng kháng sinh, đặc biệt là với tetracycline và streptomycin

Năm 2012 - 2013, Dan S D et al (2015) [60] đã nghiên cứu sự kháng thuốc của một số loại vi khuẩn phân lập từ thịt gà bán lẻ tại Romania Kết quả cho thấy: tỷ

lệ vi khuẩn kháng đa thuốc khá cao (23%); các loại thuốc kháng gồm quinolone/fluoroquinolones, tetracycline và sulfonamides

Odwar J A et al (2014) [79] đã nghiên cứu khả năng kháng kháng sinh của

các chủng vi khuẩn Coliform và E coli tại Nairobi, Kenya Tác giả cho biết 75% số

chủng kháng lại ít nhất 1/12 loại kháng sinh thử nghiệm; trong đó, tỷ lệ kháng tetracycline là cao nhất (60,3%)

Bai X et al (2015) [48] đã nghiên cứu tỷ lệ lưu hành của STEC (E coli sản sinh

độc tố shiga) trong thịt tươi (lợn, bò, cừu, gà và vịt) bán lẻ tại 2 địa phương thuộc Trung

Quốc Kết quả cho thấy có 166/853 mẫu dương tính với E coli Trong đó, 63 chủng

STEC đã được phân lập từ 58 mẫu thịt các loại dương tính (14 mẫu thịt lợn; 21 mẫu thịt bò; 26 mẫu thịt cừu, 1 mẫu thịt gà và 1/13 mẫu thịt vịt) Các chủng STEC này tồn tại trong thịt tươi có khả năng gây NĐTP và gây bệnh cho con người

Shekarforoush S S et al (2015) [87] đã sử dụng tinh dầu chiết suất từ Oregano (lá Kinh giới cay) kết hợp chitosan (một polysacarit mạch thẳng, được sản xuất từ quá trình xử lý vỏ các loài giáp xác với dung dịch kiềm NaOH) để khống chế sự gia

tăng số lượng vi khuẩn E coli và L monocytogenes trên thịt gà tươi cho kết quả tốt

1.2.2.2 Tình tình nghiên cứu trên thế giới về Salmonella

Năm 1885, Daniel E Salmon nhà bác học thú y ở Mỹ lần đầu tiên phát hiện

Salmonella từ ruột của một con lợn và đặt tên là S cholerae suis Vi khuẩn Salmonella

sau này mới được biết là nguyên nhân gây bệnh ở người (dẫn theo Cuiwei Zhao et al, 2001) [58]

Năm 1933, Hô ̣i nghi ̣ các nhà vi sinh vâ ̣t ho ̣c quốc tế chính thức đă ̣t tên cho vi

kháng nguyên đầu tiên đặt tên là bảng phân loại Kauffmann - White Từ đó đến nay

khoa học đã xác định được khoảng trên 2.500 serotype Salmonella và chia làm 67

nhóm huyết thanh dựa vào cấu trúc kháng nguyên O (Hyg J., 1934) [66]

Từ 7/2007 đến 8/2008 Yu T et al (2014) [92] đã thu thập 638 mẫu thực phẩm (bao gồm thịt, hải sản, rau, thịt nấu chín) tại tỉnh Hà Nam của Trung Quốc để xác định

sự ô nhiễm của vi khuẩn Salmonella Kết quả cho thấy có 9,7% số mẫu dương tính

Korsak N et al (2003) [68] cho biết: Tỷ lệ nhiễm cao của Salmonella đối với thân

thịt cho thấy sự ô nhiễm trong các giai đoạn sau của chuỗi giết mổ là rất cao, điều này có thể do sự khu trú của vi khuẩn trong môi trường, sự lây nhiễm chéo đối với các sản phẩm thịt chưa chế biến hoặc chế biến chưa đủ

Từ tháng 11/2008 đến tháng 7/2010 Jamali H et al (2014) [67] thu thập 471 mẫu ruột vịt và ngỗng (291 mẫu ruột vịt và 180 ruột ngỗng) Kết quả cho thấy có 58

mẫu dương tính với Listeria spp., 107 mẫu dương tính Salmonella spp và 80 mẫu dương tính với Yersinia spp Tác giả còn cho biết 48,3% số chủng Listeria, 63,6%

số chủng Salmonella phân lập được đã kháng lại tetracycline

Adeyanju G T và Ishola O (2014) [45] đã thu thập 53 mẫu thịt gà và 46 mẫu

thịt gà tây từ các điểm bán lẻ thuộc Nigeria để đánh giá tỷ lệ nhiễm E coli và

Salmonella spp Kết quả cho thấy có 32,1% số mẫu thịt gà và 34,8% số mẫu thịt gà

tây dương tính với Salmonella spp.; 43,4% số mẫu thịt gà và 39,1% số mẫu thịt gà tây nhiễm vi khuẩn E coli

Nimri L và cs (2014) [76] đã tiến hành đánh giá tình hình nhiễm khuẩn trên bánh mỳ kẹp thịt (sandwiches) tại miền bắc Jordan Kết quả cho thấy 28,3% số mẫu

dương tính với E coli (28,3%); 25,5% dương tính với Salmonella spp.; 15,9% dương tính với Citrobacter freundii và 8,3% dương tính với S aureus

Năm 2012 - 2013, Dan S D và cs (2014) [60] đã nghiên cứu sự kháng thuốc

của một số loại vi khuẩn (Campylobacter jejuni, Salmonella spp., L monocytogenes

và Escherichia coli) phân lập từ thịt gà bán lẻ tại Romania Kết quả cho thấy: tỷ lệ vi

khuẩn kháng đa thuốc khá cao (23%); các loại thuốc kháng gồm tetracycline, quinolone/fluoroquinolones và sulfonamides

Năm 2015, Donado-Godoy P và cs (2015) [61] tiến hành thử tính kháng thuốc

của các chủng vi khuẩn Salmonella và E coli phân lập được từ thịt gà bán lẻ tại

Colombia Kết quả cho thấy, gần 98% các chủng thử nghiệm có hiện tượng kháng đa thuốc (ceftiofur, enrofloxacin, acid nalidixic và tetracycline)

Bardon J và cs (2016) [49] cho biết: từ giữa năm 2010 và năm 2015, Viện Thú y nhà nước ở Olomouc thực hiện kiểm tra vi sinh trong tổng số 52.735 mẫu thịt

và sản phẩm thịt để phát hiện Salmonella spp Các mẫu được thu thập ở Moravia và một phần Đông Bohemia Kết quả cho thấy Salmonella spp đã được phát hiện trong

2,4% số mẫu kiểm tra Thịt gia cầm có tỷ lệ nhiễm khuẩn cao nhất (21,9%)

1.2.2.3 Tình hình nghiên cứu trên thế giới về L monocytogenes

Theo Sutherland P S et al (2003) [89], L monocytogenes có thể phát triển

được ở cả điều kiện môi trường yếm khí và hiếu khí Tuy nhiên, trong môi trường

yếm khí L monocytogenes phát triển tốt hơn

Từ 1998 đến 2003, Ochiai Y et al (2010) [78] đã thu thập 379 mẫu thịt tại các

quầy bán lẻ ở Tokyo Kết quả cho thấy có 28% số mẫu dương tính với vi khuẩn L

monocytogenes

Meyer C et al (2011) [75] thu thập 985 mẫu thịt bò và thịt lợn để xác định tỷ

lệ nhiễm khuẩn Listeria spp Kết quả cho thấy 14% mẫu dương tính với vi khuẩn

Listeria spp và 4% dương tính với L monocytogenes

Akya A et al (2013) [46] thu thập 185 mẫu sữa, 187 mẫu thịt và 158 mẫu thức

ăn đã chế biến tại Kermanshah, Iran để xác định tỷ lệ ô nhiễm của thực phẩm với

Listeria spp Kết quả cho thấy 12,5% số mẫu dương tính, trong đó tỷ lệ nhiễm cao

nhất là thịt (27,2%) và thấp nhất là sữa (3,8%) Tuy nhiên, chỉ có 3 mẫu (0,6%) nhiễm

Syne S M và cs (2013) [90] tiến hành một đánh giá về vi khuẩn trong không khí và các sản phẩm thực phẩm ở các giai đoạn khác nhau trong quá trình chế biến tại một nhà máy sản xuất thịt ăn ngay (xúc xích hun khói thịt gà và thịt xông khói) ở Trinidad, West Indies Tác giả cho biết: 16,7% (4/24) số mẫu thịt đã nấu chín nhiễm

S aureus; 50% (10/20) số mẫu hỗn hợp trước khi nấu nhiễm Listeria spp (4 mẫu

nhiễm L monocytogenes)

Theo Ohshima C et al (2014) [80], L monocytogenes là vi khuẩn gây bệnh

Listeriosis, là bệnh gây tỷ lệ tử vong cao hơn các nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm

khác

Jamali H et al (2014) [67] cho biết một số loại vi khuẩn đã kháng lại tetracycline

như: Listeria spp là 48,3%, Salmonella spp là 63,6%, Yersinia spp là 51,3%

Từ 20/5 - 28/6/2013, Choi M J et al (2014) [54] đã xác định được 5 trường

hợp nhiễm khuẩn Listeria spp do ăn pho-mat tại 4 tiểu bang của Hoa Kỳ (Minnesota,

Illinois, Indiana và Ohio) Có 1/5 bệnh nhân đang mang thai Sau thời gian điều trị có một bệnh nhân tử vong và 1 bệnh nhân bị sảy thai

Theo Barlik M et al (2014) [50] Listeriosis là một bệnh do ngộ độc thực phẩm

gây ra Bệnh rất nguy hiểm với phụ nữ mang thai do tỷ lệ mắc bệnh rất cao, chiếm đến 1/3 số trường hợp mắc bệnh Phụ nữ mang thai mắc bệnh có thể bị sảy thai hoặc

đẻ non và có nguy cơ lớn xảy ra các biến chứng cho thai nhi như nhiễm trùng huyết, viêm màng não hoặc viêm phổi

Martin B et al (2014) [72] cho biết: L monocytogenes là một mối quan tâm

lớn cho ngành công nghiệp chế biến thịt vì có nhiều ổ dịch listeriosis có liên quan đến việc tiêu thụ sản phẩm từ thịt Thu thập 106 mẫu từ các bề mặt tiếp xúc với thực phẩm tại các nhà máy chế biến thịt ở Tây Ban Nha, có 36,8% thuộc serotype 1/2a; 34% thuộc serotype 1/2c; 17,9% thuộc sereotype 1/2b và 11,3% thuộc serotype 4b

Từ năm 2007 đến năm 2009, Linke K et al (2014) [71] xét nghiệm 467 mẫu đất

và 68 mẫu nước được thu thập tại 12 vùng sinh thái ở Áo để xác định sự lưu hành của

Listeria spp Kết quả cho thấy: 30% mẫu đất và 26% mẫu nước điều tra dương tính với Listeria Các loài thường gặp là Listeria seeligeri, L innocua và L ivanovii L

monocytogenes được xác định có mặt trong 6% mẫu đất thu thập tại các khu vực miền

núi và đồng đồng bằng

Bukvički D et al (2014) [52] đã nghiên cứu và cho biết sử dụng tinh dầu

Satureja horvatii có khả năng ức chế sự phát triển của L monocytogenes trong thịt

lợn mà không làm thay đổi màu sắc và mùi vị của thịt

Cielecka - Piontek J et al (2014) [55] tiến hành thử nghiệm khả năng kháng khuẩn của hỗn hợp meropenem (MEM) và clavulanate potassium Kết quả cho thấy

hỗn hợp có khả năng chống lại vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus

aureus và L monocytogenes

Từ 7/2011 đến 9/2013, Althaus D et al (2014) [47] đã xác định có 93 chủng

L monocytogenes phân lập được từ các bệnh nhân tại Thụy Sĩ Phần lớn các chủng

phân lập được thuộc serotype 1/2a (58 chủng), 28 chủng thuộc serotype 4b, 5 chủng thuộc serotype 1/2b và 2 chủng thuộc serotype 1/2c

Năm 2012 - 2013, Dan S D và cs (2015) [60] đã thu thập 144 mẫu thịt gà tại các quầy bán lẻ thuộc Romania để kiểm tra mức độ ô nhiễm vi sinh vật Kết quả cho

thấy: có 7 mẫu nhiễm Campylobacter jejuni (9,72%); 3 mẫu nhiễm Salmonella spp (4,17%); 11 mẫu nhiễm L monocytogenes (15,28%) và 12 mẫu nhiễm E coli

(16,67%)

Shekarforoush S S và cs (2015) [87] đã sử dụng tinh dầu chiết suất từ Oregano (lá Kinh giới cay) kết hợp chitosan (một polysacarit mạch thẳng, được sản xuất từ quá trình xử lý vỏ các loài giáp xác với dung dịch kiềm NaOH) để khống chế

sự gia tăng số lượng vi khuẩn E coli và L monocytogenes trên thịt gà tươi cho kết

quả tốt

Robertson K và cs (2016) [83] chi biết: Từ 2007 - 2012, tại Hoa kỳ đã xảy ra

163 vụ ngộ độc thực phẩm ghi nhận 4.132 người bị ngộ độc, 772 trường hợp nhập

viện và 19 trường hợp tử vong E coli được được nhận định là nguyên nhân chính của các trường hợp ngộ độc (chiếm 55%), sau đó là Salmonella enterica (34%) và L

monocytogenes (7%)

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG, PHẠM VI, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng và vật liệu nghiên cứu

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

- Thịt lợn tươi bán tại chợ Đông Kinh, chợ Kỳ Lừa và chợ Giếng Vuông trên địa bàn TP Lạng Sơn, tỉnh Lạng Sơn

- Vi khuẩn E coli, Listeria spp và Salmonella spp phân lập được trong thịt lợn

tươi bán tại chợ trên địa bàn thành phố Lạng Sơn

2.1.2 Vật liệu, hóa chất và dụng cụ nghiên cứu

- Các mẫu thịt lợn tươi lấy tại 3 khu chợ trên địa bàn TP Lạng Sơn

- Môi trường được sử dụng là những môi trường chế biến sẵn ở dạng tổng hợp, khi dùng pha theo công thức hướng dẫn để nuôi cấy, phân lập và giám định vi khuẩn

E coli, L monocytogenes và Salmonella spp trong thịt lợn tươi

- Nước muối sinh lý 0,9 % dùng để pha loãng mẫu

- Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm: Tủ lạnh, nồi hấp ướt, tủ ấm, buồng cấy vô trùng, pipetman, ống durham, bình tam giác các loại, đĩa petri, cân, que cấy, bông cồn, giá đựng, ống nghiệm đựng mẫu, túi nilon, cối, chày sứ và các dụng cụ thí nghiệm khác

- Khoanh giấy kháng sinh

- Chuột bạch khỏe khối lượng 18 - 20 g/con

2.2 Địa điểm, thời gian nghiên cứu

* Địa điểm nghiên cứu:

- Mẫu thịt lợn tươi được thu thập tại một số chợ trên địa bàn thành phố Lạng Sơn (Chợ Đông Kinh, chợ Kỳ Lừa, chợ Giếng Vuông)

- Địa điểm xét nghiệm mẫu: Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên, Viện Thú

y Quốc gia

* Thời gian nghiên cứu: từ 8/2015 đến 6/2016

2.3 Nội dung nghiên cứu

2.3.1 Khảo sát tình hình giết mổ và tiêu thụ thịt lợn tại 3 khu chợ nghiên cứu trên địa bàn TP Lạng Sơn

2.3.2 Nghiên cứu về chỉ tiêu tổng số vi khuẩn hiếu khí nhiễm trên thịt lợn tươi 2.3.3 Khảo sát chỉ tiêu vi khuẩn E coli, Salmonella spp và L monocytogenes nhiễm trên thịt lợn bán tại chợ

2.3.4 Xác định mức độ nhiễm vi khuẩn E coli, Salmonella spp., L monocytogenes trên thịt lợn theo thời gian lấy mẫu

2.3.5 Giám định một số đặc tính sinh vật, hóa học của vi khuẩn E coli, Salmonella spp., L monocytogenes phân lập được

2.3.6 Xác định độc lực của các chủng vi khuẩn E coli, Salmonella spp., L monocytogenes phân lập được

2.3.7 Xác định yếu tố gây bệnh của các chủng E coli, Salmonella spp., L monocytogenes phân lập được

2.3.8 Xác định tính mẫn cảm với một số loại kháng sinh và hóa dược của các chủng E coli, Salmonella spp., L monocytogenes phân lập được

2.3.9 Đề xuất một số biện pháp khống chế

2.4 Phương pháp nghiên cứu

2.4.1 Phương pháp điều tra

- Sử dụng phương pháp thống kê sinh học

- Lập phiếu điều tra, thiết lập bảng biểu thu thập số liệu về thực trạng hoạt động giết mổ

2.4.2 Phương pháp lấy mẫu

- Thu thập mẫu thịt theo phương pháp ngẫu nhiên từ các quầy bán thịt ở 3 khu chợ nghiên cứu

- Sử dụng phương pháp lấy mẫu được tiêu chuẩn hoá theo Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 7925:2008 [40]

- Phương pháp xét nghiệm mẫu theo TCVN 4833-2:2002 [37] và TCVN 4835 : 2002 [38]

thịt/mẫu; cho mẫu vào túi nilon vô trùng và ghi nhãn có các thông tin cần thiết

2.4.3 Phương pháp xác định chỉ tiêu tổng số vi khuẩn hiếu khí có trong thịt tươi

Xác định chỉ tiêu tổng số VKHK trong thịt tươi áp dụng theo TCVN 5667:1992 [36]

Tổng số vi khuẩn hiếu khí trong 1g thịt được tính theo công thức sau:

N: Số khuẩn lạc trong 1 gram mẫu kiểm tra, N biểu thị kết quả dưới dạng thập

C: Số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa đã chọn

d: Hệ số của đậm độ pha loãng đã chọn thứ nhất

2.4.4 Phương pháp phát hiện Salmonella

Phương pháp phát hiện Salmonella theo Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN

5153:1990 [34]

2.4.5.1 Phương pháp xác định chỉ tiêu Salmonella

Bước 1: Tăng sinh

Bước 2: Tăng sinh chọn lọc

Bước 3: Phân lập và nhận diện

Bước 4: Khẳng định bằng các phản ứng sinh hóa

Bước 5: Các thử nghiệm kháng nguyên

2.4.5.2 Phương pháp xác định gen độc tố đường ruột Enterotoxin của chủng Salmonella phân lập được

*Phương pháp tách DNA tổng số

Nguyên lý:

Để thu nhận DNA tinh sạch cần loại bỏ những thành phần tạp nhiễm, mà quan trọng nhất là protein Sự tách chiết DNA dựa theo nguyên tắc hòa tan khác nhau của các phân tử khác nhau (nucleic acid/protein) trong hai pha không hòa tan (phenol, chloroform/nước) Mục đích là thu được các phân tử nucleic acid ở trạng thái nguyên vẹn tối đa, không bị phân hủy bởi các tác nhân cơ học hay hóa học Các nucleic acid cần được tách chiết trong điều kiện nhiệt độ thấp để ức chế hoạt động của các enzyme nội bào (DNase và RNase)

Sau công đoạn tách chiết, nucleic acid tinh sạch nằm trong một thể tích dung dịch lớn Sự tủa kết hợp với ly tâm cho phép thu nhận nucleic acid dưới dạng cặn tủa

dễ bảo quản và khi cần có thể hòa lại trong nước theo nồng độ mong muốn

Tiến hành:

- Ly tâm dịch khuẩn nuôi qua đêm với tốc độ 8000 v/p trong 7 phút, thu cặn loại bỏ dịch

- Bổ sung 1540 μl extraction buffer vào mỗi mẫu

- Bổ sung 600 μl CI (Chloroform isoamylalcohol), spin down, ly tâm 12000

- Lặp lại bước trên

- Kết tủa DNA bằng 350 μl Isopropanol ủ ở nhiệt độ phòng 1 giờ

cặn

- Để khô tự nhiên, sau đó bổ sung 25 μl nước khử ion