Phân lập, tuyển chọn các chủng vi khuẩn từ chượp mắm có khả năng sinh tổng hợp ectoines

Phương pháp nuôi cấy hai pha nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NaCl đến khả năng sinh tổng hợp ectoines của chủng tuyển chọn .... Nghiên khả năng sinh trưởng và sinh tổng hợp ectoines của

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS ĐOÀN VĂN THƢỢC

LỜI CẢM ƠN

Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc lời cảm ơn chân thành đến Thầy giáo hướng dẫn PGS.TS Đoàn Văn Thược, người Thầy kính mến luôn tận tình hướng dẫn, dạy bảo tôi trong quá trình học tập và thực hiện luận văn

Em xin chân thành cảm ơn TS Trần Hữu Phong, đã dạy dỗ, tận tình chỉ bảo, luôn quan tâm động viên khuyến khích và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài luận văn

Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô thuộc Bộ môn Công nghệ Sinh học

- Vi sinh- Trường Đại Học Sư Phạm Hà Nội đã giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi có thể hoàn thành luận văn

Tôi xin gửi lời cảm ơn đến các anh chị em, bạn bè cùng làm việc với tôi tại phòng thí nghiệm CNSH-Vi sinh đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn này

Cuối cùng tôi xin bày tỏ lòng biết ơn và thương yêu tới gia đình, bạn bè

đã động viên, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian qua

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, tháng 6 năm 2017

Học viên

Lý Thị Nghĩa

CÁC TỪ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN

AsD : L-aspartate-beta-semialdehyde dehydrogenase

CDW (cell dry weight) :Khối lượng tế bào khô

EctA : Diaminobutyric acid acetyltransferase

EctB : Transaminase acid L-2,4-diaminobutyric

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH

MỞ ĐẦU 1

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Sơ lược về chượp mắm 3

1.2 Ectoines và con đường sinh tổng hợp ectoines 4

1.2.1 Sự tích lũy ectoines 4

1.2.2 Con đường sinh tổng hợp ectoines 6

1.3 Các nhóm vi sinh vật sinh tổng hợp ectoines 8

1.4 Sản xuất và ứng dụng của ectoines 16

1.4.1 Sản xuất ectoines 16

1.4.2 Ứng dụng của ectoines 19

Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23

2.1 Đối tượng nghiên cứu 23

2.2 Địa điểm, thời gian, môi trường nghiên cứu 23

2.3 Phương pháp nghiên cứu 24

2.3.1 Phương pháp phân lập 24

2.3.2 Phương pháp tuyển chọn vi khuẩn 24

2.3.3 Phương pháp giữ giống vi khuẩn 25

2.3.4 Phương pháp ho t h chủng vi huẩn tuyển chọn 25

2.3.5 Phương pháp nghiên cứu đặc điểm hình thái tế bào 25

2.3.6 Phương pháp đông hô 26

2.3.7 Phương pháp định lo i vi khuẩn bằng kỹ thuật di truyền phân tử 26

2.3.8 Phương pháp lên men thu sinh hối tế bào 26

2.3.9 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng củ điều kiện nuôi cấy và dinh dưỡng đến khả năng sinh trưởng và phát triển của chủng tuyển chọn 27 2.3.9.1 ghiên cứu ảnh hưởng củ pH đến sự sinh trưởng và phát triển của chủng tuyển chọn 27 2.3.9.2 ghiên cứu ảnh hưởng củ nhiệt độ đến sự sinh trưởng củ chủng tuyển chọn 27

2.3.9.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ muối đến sự sinh trưởng và tích lũy ectoines của chủng tuyển chọn 28 2.3.9.4 Phương pháp nuôi cấy hai pha nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NaCl đến khả năng sinh tổng hợp ectoines của chủng tuyển chọn 28 2.3.9.5 Nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn itơ đến sự sinh trưởng và phát triển của chủng tuyển chọn 28 2.3.9.6 Nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn C cbon đến sự sinh trưởng và phát triển của chủng tuyển chọn 29 2.3.9.7 Nghiên khả năng sinh trưởng và sinh tổng hợp ectoines của chủng tuyển chọn sử dụng nguồn cacbon và nguồn nito tốt nhất ở các nồng độ NaCl khác nhau…

29

2.3.9.8 Nuôi cấy hai pha ghiên cứu khả năng sinh trưởng và sinh tổng hợp ectoines của chủng tuyển chọn sử dụng môi trường dinh dưỡng khác nhau 29 2.3.10 Phương pháp phân tích hàm lượng ectoines trong tế bào vi khuẩn 30 2.3.11 Nghiên cứu sản xuất ectoines từ chủng tuyển chọn sử dụng nồi lên men 10L…… 30

Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 33

3.1 Kết quả phân lập và tuyển chọn các chủng vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp ectoines 33 3.2 Nghiên cứu đặc điểm sinh học và định loại chủng vi khuẩn tuyển chọn 35 3.2.1 Hình thái khuẩn lạc, hình thái tế bào 35

3.2.2 Kết quả tách chiết ADN tổng số và và PCR đo n trình tự gen 16S

rDNA… 38

3.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện môi trường và các yếu tố dinh dưỡng đến khả năng sinh trưởng, phát triển và tích lũy ectoines của các chủng tuyển chọn 41

3.3.1 Ảnh hưởng củ pH đến sự sinh trưởng và phát triển của các chủng vi khuẩn tuyển chọn 41

3.3.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự sinh trưởng và phát triển của chủng tuyển chọn 42

3.3.3 Ảnh hưởng của nồng độ Cl đến sự sinh trưởng, phát triển và khả năng tích lũy ectoine của các chủng vi khuẩn tuyển chọn 43

3.3.4 Nuôi cấy hai pha nghiên ảnh hưởng của nồng độ Cl đến khả năng sinh tổng hợp ectoines của chủng tuyển chọn 45

3.4 Ảnh hưởng của nguồn Nito đến khả năng sinh trưởng và phát triển của các chủng Salinivibrio sp M7 47

3.5 Ảnh hưởng của nguồn cacbon đến khả năng sinh trưởng và phát triển của của chủng Salinivibirio sp M7 tuyển chọn 48

3.6 Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NaCl đến khả năng sinh trưởng và sinh tổng hợp ectoines của chủng Salinivibrio sp.M7 sử dụng nguồn cacbon glucose và nguồn nito cao nấm men 48

3.7 Nuôi cấy hai pha nghiên cứu khả năng sinh trưởng và sinh tổng hợp ectoines của chủng tuyển chọn sử dụng môi trường khác nhau ở mỗi pha ở nồng các nồng độ NaCl khác nhau 50

3.8 Nghiên cứu lên men sản xuất ectoines sử dụng chủng Salinivibrio sp M7 50

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 52

TÀI LIỆU THAM KHẢO 53

PHỤ LỤC : GIẢI TRÌNH TỰ GEN 16S rDNA 1

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1: Vi sinh vật sản xuất ectoines: các chủng và điều kiện 9 Bảng 2.1 Công thức của các loại môi trường sử dụng trong nghiên cứu 23 Bảng 3.1 Khả năng sinh trưởng và hàm lượng ectoine tích lũy trong tế bào của

18 chủng vi khuẩn có khả năng phát triển trong dải muối rộng 34

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Chượp mắm giai đoạn đang lên men 3

Hình 1.2 Cấu trúc hóa học của ectoines 6

Hình 1.3 Con đường sinh tổng hợp ectoines ở vi khuẩn 6

Hình 1.4 Sơ đồ chung quy trình công nghiệp sản xuất ectoine 17

Hình 1.5 Một số sản phẩm trong y tế sử dụng ectoine trên thị trường 22

Hình 1.5 Đồ thị đường chuẩn xác định hàm lượng ectoine bằng sắc kí lỏng 31

Hình 1.6 Đồ thị đường chuẩn xác định hàm lượng Hydroxyectoine 32

bằng sắc kí lỏng 32

Hình 3.1 Nuôi cấy các chủng tuyển chọn trên các nồng độ muối khác nhau 33

Hình 3.2 Hình thái khuẩn lạc (A), hình thái tế bào dưới kính hiển vi thường (B) và kính hiển vi điện tử (C) của chủng M7 35

Hình 3.3 Hình thái khuẩn lạc (A), hình thái tế bào dưới kính hiển vi thường (B) của chủng M92 36

Hình 3.4 Hình thái khuẩn lạc (A), hình thái tế bào dưới kính hiển vi thường (B) và kính hiển vi điện tử (C) của chủng M312 36

Hình 3.5 Hình thái khuẩn lạc (A), hình thái tế bào dưới kính hiển vi thường (B) và kính hiển vi điện tử (C) của chủng M313 37

Hình 3.6 Hình thái khuẩn lạc (A), hình thái tế bào dưới kính hiển vi thường (B) và kính hiển vi điện tử (C) của chủng M316 37

Hình 3.7 Hình thái khuẩn lạc (A), hình thái tế bào dưới kính hiển vi thường (B) và kính hiển vi điện tử (C) của chủng M7 38

Hình 3.8 Kết quả điện di (A)DNA tổng số và (B) sản phẩm của phản ứng PCR.39 Hình 3.9 Cây phát sinh chủng loại của các chủng vi khuẩn tuyển chọn 40

Hình 3.10 Ảnh hưởng của pH đến sự sinh trưởng, phát triển của 5 chủng tuyển chọn 41

Hình 3.11 Biểu đồ ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự sinh trưởng và phát triển của

5 chủng tuyển chọn 42

Hình 3.12 Ảnh hưởng của nồng độ NaCl đến sự sinh trưởng và phát

triển(A),sinh tổng hợp ectoine(B) của các chủng vi khuẩn tuyển chọn 44

Hình 3.13 Khả năng sinh trưởng (A), sinh tổng hợp ectoine (B) và H-ectoine

Hình 3.16 Ảnh hưởng của nồng độ NaCl đến khả năng sinh trưởng, phát triển 49

và sinh tổng hợp ectoines của chủng Salinivibrio sp.M7 49

Hình 3.17 Nuôi cấy hai pha ảnh hưởng của nồng độ NaCl đến khả năng sinh

trưởng, phát triển và sinh tổng hợp ectoines của chủng Salinivibriosp M7Error! Bookmark not defined.

Hình 3.18 Động thái quá trình lên men sản xuất ectoine của chủng Salinivibrio sp

M7 51

MỞ ĐẦU

Các vi sinh vật sống trong môi trường có nồng độ muối cao cần có cơ chế thích nghi đặc biệt để cân bằng áp suất thẩm thấu và tránh mất nước Một trong những cơ chế đó là tổng hợp các hợp chất tương thích Hợp chất tương thích là các hợp chất hữu cơ có trọng lượng phân tử thấp, có thể tích lũy ở nồng độ cao trong tế bào Ectoines (ectoine và dẫn xuất hydroxyl của nó, hydroxyectoine) được biết đến như là các hợp chất tương thích phổ biến nhất, nó được tích lũy bên trong tế bào ở nhiều vi khuẩn ưa mặn và chịu mặn để cân bằng áp suất thẩm thấu (Robert, 2005) Bên cạnh chức năng chủ yếu giúp tế bào cân bằng áp suất thấu, rất nhiều nghiên cứu trên thế giới đã chứng minh rằng các hợp chất tương thích nói chung và đặc biệt là ectoines nói riêng có khả năng bảo vệ enzyme, DNA, và tế bào chống lại các điều kiện môi trường bất lợi như tia UV, nhiệt độ cao, nhiệt độ thấp, khô hạn và pH bất lợi (Lippert và Galinski 1992; Van-Thuoc

và cs, 2013) Một số nghiên cứu đã chứng minh ectoines giúp bảo vệ da chống lại tia cực tím Do đó, ectoine và dẫn xuất của nó được sử dụng để bổ sung vào trong

mỹ phẩm giúp tăng khả năng giữ ẩm và bảo vệ làn da Trên thế giới, ectoines hiện đang được sản xuất để dùng trong công nghệ sinh học, dược phẩm và trong

mỹ phẩm (Kunte và cs, 2014; Pastor và cs, 2010) Tuy nhiên khả năng và mức

độ ứng dụng ectiones hiện nay còn thấp do giá thành của ectoines còn cao

Nước ta có bờ biển dài, môi trường mặn phong phú và đa dạng, có nhiều sản phẩm truyền thống từ các sinh vật biển, do đó mức độ đa dạng các vi sinh vật

ưa mặn rất cao Trong đó, mắm là nguồn nguyên liệu giàu tiềm năng có chứa các

vi sinh vật ưa mặn, chịu mặn Mắm được chế biến theo phương pháp lên men thủy sản theo công thức 3 nguyên liệu: 1 muối, để có thể sinh trưởng trong điều kiện muối cao này, các vi sinh vật phải có cơ chế thích nghi đặc biệt nhằm cân bằng áp suất thẩm thấu và tránh mất nước Như vậy trong giai đoạn đầu khi lên men (chượp), nhiều khả năng trong đó sẽ có các chủng vi khuẩn ưa mặn và chịu mặn sinh tổng hợp ectoines để cân bằng áp suất thẩm thấu Tuy nhiên, ở Việt

Nam chưa có công trình nào nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp ectoines của các chủng vi khuẩn nói chung và các chủng vi khuẩn trong chượp mắm nói riêng Do vậy, việc nghiên cứu tìm kiếm chủng vi sinh vật từ chượp mắm có khả năng sinh tổng hợp ectoines là hướng nghiên cứu mới Nghiên cứu này không chỉ tìm ra chủng vi sinh vật từ chượp mắm có khả năng sinh tổng hợp ectoines,

mà còn có thể tìm ra chủng có khả năng sản xuất ectoines cao hướng đến phát triển sản xuất ở quy mô công nghiệp

Xuất phát từ các lý do trên chúng tôi quyết định tiến hành thực hiện đề tài:

“Phân lập, tuyển chọn các chủng vi khuẩn từ chƣợp mắm có khả năng sinh tổng hợp ectoines”

Mục tiêu của đề tài: Phân lập tuyển chọn, nghiên cứu đánh giá khả năng

sinh tổng hợp ectoines của 1-2 chủng vi khuẩn phân lập được từ chượp mắm

Nội dung nghiên cứu:

- Phân lập, tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp ectoines

- Nghiên cứu đặc điểm sinh học và định loại chủng vi khuẩn tuyển chọn bằng phương pháp giải trình tự gen 16S rDNA

- Nghiên cứu xác định điều kiện nuôi cấy (nhiệt độ, pH, nồng độ NaCl)

và các yếu tố dinh dưỡng (nguồn cacbon, nitơ) phù hợp cho sự sinh trưởng và sinh tổng hợp ectoines của chủng tuyển chọn

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Sơ lược về chượp mắm

Chượp mắm là một khâu quan trọng trong quá trình sản xuất mắm tôm và nước mắm Đó là sản phẩm chế biến dở dang của mắm truyền thống ở nước ta Chượp mắm được sơ chế bằng phương pháp lên men trong các thùng, chum gồm khoảng 70% nguyên liệu (cá, tôm, tép ) đang phân hủy dở dang và khoảng 30% muối (Hình 1.1) Giai đoạn này kéo dài khoảng 6 tháng đến 1 năm và trong sản phẩm còn chứa rất nhiều vi sinh vật chịu mặn và ưa mặn

Thành phần chính của chượp mắm là axit amin, muối, ngoài ra còn có muối khoáng và vitamin Biến đổi hóa sinh trong chượp mắm là do hệ enzyme protease của thịt cá, tôm và vi sinh vật Cá và tôm bắt đầu mềm và chuyển sang vữa nát, protein bị thủy phân thành các peptit, pepton rồi axit amin Hoạt tính protease ở đây chủ yếu có ở trong ruột cá, tôm và từ các vi sinh vật ưa mặn có trong cá ,tôm, nước và trong muối,… Có nhiều vi sinh vật ưa mặn sẽ quen dần với môi trường sẽ phát triển mạnh ở môi trường muối thấp, trong số đó có những

vi khuẩn có hoạt lực protease cao như vi khuẩn gây thối Vì vậy khi ướp chượp người ta thường cho muối dần dần và kết hợp với đánh khuấy để rút ngắn thời gian sản xuất

Hình 1.1 Chượp mắm gi i đo n đ ng lên men

Vi sinh vật trong chượp mắm nguồn gốc có từ nguyên liệu, dụng cụ, thiết

bị, môi trường (không khí, nước) Khi vi sinh vật xâm nhập vào chượp sẽ tham gia vào quá trình thủy phân protein nhưng rất yếu vì bị ức chế bởi nồng độ muối cao Tham gia tích cực vào việc hình thành hương vị của nước mắm, chủ yếu là các vi sinh vật kị khí có khả năng sinh hương (Phan Thị Thanh Quế, 2005).Tại

Việt Nam, một số nghiên cứu đã tiến hành phân lập các chủng vi sinh vật Bacillus

sp và Clostridium sp có khả năng phân giải protein Các chủng Staphylococcus intermedius và Vibrio costicola có khả năng tạo hương (Lê Thị Thanh Loan và cs,

2003)

Trong chượp mắm thường thấy một lượng lớn vi sinh vật, các vi khuẩn

thường gặp là Micrococus, trực khuẩn gram âm, nhóm sinh axit lactic,…Các vi

sinh vật gây thối có hoạt lực protease cao là những vi khuẩn ưa nóng Trong giai đoạn chượp các vi sinh vật phát triển làm cho chượp ban đầu đục và sủi bọt, cá và tôm thay đổi màu sắc dần

1.2 Ectoines và con đường sinh tổng hợp ectoines

1.2.1 Sự tích lũy ectoines

Các vi sinh vật sống ở nồng độ muối cao sử dụng các chiến lược khác nhau

để cân bằng áp suất thẩm thấu Có thể là tích lũy các chất vô cơ, chủ yếu là KCl, cách này thường gặp ở các vi sinh vật cổ cực ưa mặn, vi khuẩn kị khí ưa mặn

trung bình như Haloanaerobiales và vi khuẩn cực ưa mặn như Salinibacter ruber

(Roberts, 2000) Cách thứ hai chính là tích lũy các hợp chất tương thích, đó là các hợp chất hữu cơ dễ tan, có khối lượng phân tử thấp, phần lớn không tích điện hoặc là phân tử lưỡng tính được tổng hợp bên trong tế bào.Các hợp chất tương thích bao gồm đường, polyol, phosphodiesters, các dẫn xuất axit glyceric, các axit amin và các chất dẫn xuất của nó, ectoines và betaines (Roberts, 2005) Hợp chất tương thích giúp cân bằng áp suất thẩm thấu và không làm ảnh hưởng tới các quá trình trao đổi chất của tế bào (Oren,1999) Mức độ tích lũy các hợp chất tương thích được quyết định bởi áp suất thẩm thấu của môi trường Khi áp suất thẩm

thấucao thì hàm lượng hợp chất tương thích được tích lũy sẽ tăng, ngược lại khi

áp suất thẩm thấu đột ngột giảm mạnh, các tế bào có thể khôi phục lại sự cân bằng này bằng cách giải phóng các hợp chất tương thích thông qua hệ thống các kênh vận chuyển (Morbach và Kramer, 2002)

Vi sinh vật có thể tích lũy các hợp chất tương thích bằng cách tự tổng hợp hoặc hấp thu từ môi trườngthông qua các kênh vận chuyển Tích lũy các chất này giúp các vi sinh vật duy trì áp suất thẩm thấu, thể tích tế bào, và nồng độ các chất, đây là những điều kiện quan trọng để tế bào có thể tồn tại và tăng sinh Hiện nay các nghiên cứu được tập trung vào ectoines (bao gồm ectoine và hydroxyectoine), chúng được biết đến như là hợp tương thích phổ biến nhất, được tích lũy bên trong tế bào ở nhiều vi khuẩn ưa mặn và chịu mặn để cân bằng

áp suất thẩm (Roberts 2005; Lentzen và Schwarz 2006) Ngoài vai trò cân bằng thẩm thấu, ectoines còn được chú ý trong công nghệ sinh học như là các chất bảo vệ cho các enzyme, DNA và cả tế bào chống lại các điều kiện bất lợi (Welsh, 2000)

Ectoine (1,4,5,6-tetrahydro-2-methyl-4-pyrimidinecarboxylic acid) là một axit amin dị vòng, một dẫn chất pyrimidin được hydro hóa một phần (Galinski

và cs, 1985) (Hình 1.2) Ectoine được phát hiện đầu tiên từ chủng vi khuẩn ưa

mặn Ectothiorhodospira halochloris (Galinski và cs,1985) Vi khuẩn này có thể

phát triển ở nồng độ NaCl lên đến 5 M, để có thể sinh trưởng trong điều kiện này, sự tích lũy của hợp chất tương thích trở thành bắt buộc đối với sự sống còn của tế bào Trong khi đó hydroxyectoine (1,4,5,6-tetrahydro-2-metyl-5-hydroxy-

4-pyrimidinecarboxylic) (Hình 1.2) được phát hiện lần đầu tiên từ Streptomyces

parvulus (Inbar và Lapidot 1988)

Hình 1.2 Cấu trúc hóa học của ectoines

1.2.2 Con đường sinh tổng hợp ectoines

Hình 1.3 Con đường sinh tổng hợp ectoines ở vi khuẩn

Quá trình sinh tổng hợp ectoine bắt đầu bằng sự phosphoryl hóa của aspartate, bước đầu tiên là sự chuyển hóa L-aspartate thành L-aspartate phosphate nhờ xúc tác của aspartate kinase (Ask); bước tiếp theo là sự tổng hợp của L-aspartate-beta-semialdehyde từ L-aspartate-phosphate, xúc tác bởi L-aspartate-beta-semialdehyde dehydrogenase (AsD) Từ quá trình trung gian này, con đường cụ thể để tổng hợp ectoine xảy ra trong ba phản ứng liên tiếp Như trình bày trong hình 1.3: đầu tiên aspartate semialdehyde được chuyển thành L-

diaminobutyrate (DA) nhờ xúc tác của enzyme transaminase acid

L-2,4-diaminobutyric (EctB); sau đó DA được acetyl hóa thành

Nγ-acetyl-L-2,4diaminobutyrate (NADA) bởi enzyme L-2,4-diaminobutyric acid

acetyltransferase (EctA); bước cuối cùng là sự tạo vòng của NADA để hình thành ectoine do hoạt động của enzyme L-ectoine synthase (EctC) Chuỗi gen

ectABC tham gia quá trình tổng hợp ectoine đã được phân lập từ Chromohalobacter salexigens (Canovas và cs, 1997), từ Marinococcus halophilus (Louis và Galinski 1997), và từ Halomonas elongata (Goller và cs,

1998)

Sự tổng hợp hydroxyectoine có thể từ một trong hai con đường, trực tiếp từ ectoine hoặc thông qua một con đường khác, chuyển axit Nγ-acetyldiaminobutyric thành hydroxyectoine mà không có sự tham gia của

ectoine (Vargas và cs 2008) Gen ectoine hydroxylase (ectD) tham gia chuyển ectoine thành hydroxyectoine trong C salexigens đã được phân lập và mô tả

Tuy nhiên, gen tham gia sinh tổng hợp hydroxyectoine từ NADA chưa được phân lập Sự hình thành hydroxyectoine từ NADA đã được đề xuất từ kết quả

của các nghiên cứu trước đây được thực hiện với H elongata Ở các chủng đột biến, khi gen diaminobutyric acid acetyltransferase (ectA) bị ức chế thì không

thể tổng hợp ectoine hoặc hydroxyectoine; trong khi chủng đột biến khác, gen

tổng hợp ectoine (ectC) bị ức chế thì vẫn có thể tổng hợp cả hai (Canovas và

cs,1999) Các kết quả này cho thấy rằng hydroxyectoine có thể được tổng hợp qua hai bước, một bước liên quan đến hydroxyl hóa NADA để tạo ra 3-hydroxyl-Nγ-acetyldiaminobutyrate, sau đó được chuyển thành hydroxyectoine nhờ hydroxyectoine synthase Ngoài ra, kết quả cho thấy không chỉ hydroxyectoine có thể được tổng hợp trực tiếp từ ectoine mà còn có thể xảy ra phản ứng thuận nghịch hydroxyectoine chuyển thành ectoine (hình 1.3)

1.3 Các nhóm vi sinh vật sinh tổng hợp ectoines

Mặc dù cũng được tìm thấy trong một số lớp β-, δ-, và ε-Proteobacteria,

Firmicutes, và một số Plantomycete, khả năng sinh tổng hợp ectoines thường

thấy phổ biến nhất trong lớp α, γ-Proteobacteria và Actinobacteridae

Ectoine được tổng hợp trong pha sinh trưởng của nhóm vi khuẩn quang

hợp thuộc chi Halorhodospira Các vi khuẩn hóa dị dưỡng thuộc lớp proteobacteria gồm các chi Halomonas, Chromohalobacter, Vibrio,

γ-Pseudomonas và Marinobacter cũng có khả năng sinh tổng hợp ectoine

(Roberts, 2005) Các xạ khuẩn thuộc chi Brevibacterium và Streptomyces đã

được ghi nhận về khả năng sinh tổng hợp ectoine Sinh tổng hợp ectoine diễn ra

khá phổ biến ở nhóm Firmicutes bao gồm một số loài thuộc chi Bacillus và các chi khác như Virgibacillus, Salibacillus hoặc Halobacillus (Kuhlmann và Bremer,

2002; Malin và Lapidot, 1996) (bảng 1.1)

Hydroxyectoine đã được phát hiện đầu tiên trong vi khuẩn sản xuất

actinomycin D có tên Streptomyces parvulus (Inbar và Lapidot, 1988) Hợp chất

tương thích này phổ biến trong các vi khuẩn ưa mặn gram dương cũng như

nhóm chịu mặn bao gồm Nocardiopsis sp, Streptomyces griseolus,

Brevibacterium linens hoặc M halophilus (Frings và cs, 1995 Severin và cs,

1992), tuy nhiên chúng thường được tổng hợp với lượng thấp hơn cùng với ectoine Mặc dù có tính chất hóa học gần giống với ectoine, nhưng hydroxyectoine có các đặc tính bảo vệ bổ sung nhờ bản chất hydroxyl hoá của

nó Vì vậy, trong khi ectoine có chức năng chủ yếu như một hợp chất giúp cân bằng áp suất thẩm thấu, thì hydroxyectoine còn có vai trò quan trọng trong việc bảo vệ tế bào khỏi ảnh hưởng của nhiệt độ Tính chất này đã được sử dụng trong các quy trình công nghiệp nhằm kích thích khả năng sản xuất hydroxyectoine

(Frings và cs,1995; Schiraldi và cs, 2006) Ví dụ, Halomonas elongata,

Chromohalobacter salexigens và Streptomyces griseus tích lũy hydroxyectoine

để thích nghi với sự thay đổi nhiệt độ Khi tiến hành gây đột biến C salexigens loại bỏ gen ectD Ở 37 OC, khả năng tổng hợp ectoine của chủng dại và chủng

đột biến ectD là giống nhau.Ở nhiệt độ này, mức độ tổng hợp hydroxyectoine

của chủng đột biến ectD giảm 2,6 lần so với chủng dại Ở 45OC, hàm lượng ectoine tổng hợp của chủng dại giảm xuống 1,6 lần, và hàm lượng

hydroxyectoine tăng gấp 2,1 lần Đối với chủng đột biến ectD hàm lượng

ectoine tổng hợp giảm nhẹ (1,4 lần) và hydroxyectoine giảm đáng kể 6,6 lần

Trong trường hợp này, chủng đột biến ectD chỉ có thể tổng hợp được 15% tổng

số hydroxyectoine so với chủng dại Điều đó chứng minh rằng hydroxyectoine hoạt động như một chất bảo vệ tế bào chống lại điều kiện nhiệt độ cao (Garcia-Estepa và cs, 2006)

Bảng 1.1: Vi sinh vật sản xuất ectoines: các chủng và điều kiện

thích

Nồng độ muối

Nguồn cơ chất chính

Tài liệu tham khảo

MSG + cao nấm men

Onraedt

và cs (2005)

Brevibacterium

L-glutamate Bernard

và cs (1993)

Glucose + cao nấm men + Polypeptone

Nagata

và Wang (2001)

Kocuria varians

CCM3316

Ectoine, betaine, trehalose, hydroxyectoine

1.71 M Cao nấm men

Severin

và cs (1992)

Nesterenkonia

halobia

DSM 20541T

Ectoine, betaine, trehalose, hydroxyectoine

1.71 M Cao nấm men

Severin

và cs (1992)

Nocardiopsis sp

A5-1

Ectoine, hydroxyectoine, trehalose

1.71 M Glucose

Severin

và cs (1992)

Streptomyces

coelicolor A3 (2)

Ectoine, hydroxyectoine 0.5 M Glucose

0.86 M Cao nấm men

Severin

và cs (1992)

Glucose + sesquicarbonate + axit amin và vitamins

Na-Kuhlmann

và Bremer (2002)

Bacillus

agaradhaerens

DSM 8721T

Glutamate, ectoine

hydroxyectoine, β-glutamate

cs (2007)

Tăng gradient 0.4-3 M

Glucose + vitamins

Saum và Muller (2008)

Halobacillus

trueperi

DSM 10404T

Glutamate, ectoine, hydroxyectoine, N-ε-acetyl lysine

2.5 M

Glucose + vitamins + các nguyên tố

vi lượng, axit amin

Severin và

cs (1992) Hydroxyectoine,

ectoine, Glutamate 1.71 M

Glucose + Pepton cá

Frings và

cs (1995)

Salimicrobium

albus

DSM 20748T

Ectoine, alanine, hydroxyectoine 1.71 M Glucose

0.68 M (sucrose)

Glucose + urea + axit amin

và vitamins

Kuhlmann

và Bremer (2002)

Sporosarcina

psycrophila

DSM 3T

Ectoine, glutamate 1 M

Glucose + axit amin và vitamins

Kuhlmann

và Bremer (2002)

Virgibacillus

marismortui

DSM 12325T

Glutamate, ectoine, hydroxyectoine

1 M

Glucose + axit amin và vitamins

Kuhlmann

và Bremer (2002)

Virgibacillus

salexigens

DSM 11438

Ectoine, glutamate 3.4 M

Glucose + axit amin và vitamins

Kuhlmann

và Bremer (2002)

Canovas

và cs

DSM 3043T glutamate,

glutamine

(1997)

Ectoine, hydroxyectoine, glutamate, trehalose, NADA

2.5 M Glucose

Estepa và

Garcia-cs (2006)

Halomonas

boliviensis

DSM 15516T

Ectoine, hydroxyectoine 2.58 M

Glucose, glutamate

Guzman

và cs (2009)

Halomonas

campisalis

ATCC 700597

Ectoine, hydroxyectoine, glycine betaine

Tăng gradient 0-3 M

Glucose + cao nấm men +

Vi lượng

Aston và Peyton (2007)

Ectoine, hydroxyectoine, glycine betaine

Tăng gradient 0-3 M

Glucose + NaNO3+ trace

Vi lượng

Aston và Peyton (2007)

Halomonas

elongata

ATTC 33173T

Ectoine, glutamate, glycine betaine, alanine, hydroxyectoine

4.3 M

1.3-1.7-Glucose

Wohlfarth

và cs (1990)

cs (1990)

Ectoine, trehalose, betaine

Tăng gradient Glucose

Maskow

và Babel

2.56 M (batch medium),

0 M (downsho

ck medium)

Glucose

Sauer và Galinski (1998)

Halomonas

elongata K63

Ectoine, alanine, NADA, hydroxyectoine

Môi trường quang dưỡng

Wohlfarth

và cs (1990)

DSM 1059T

Betaine, ectoine, trehalose

Môi trường quang dưỡng Wohlfarth

và cs (1990)

Halorhodospira

halophila

DSM 244T

Betaine, ectoine, trehalose 3.42 M

Môi trường quang dưỡng

Wohlfarth

và cs (1990)

Marinobacter

hydrocarbonoclasti

cus

Ectoine, betaine, glutamate, beta-glutamate

1.5 M

Eicosane (nguồn cacbon duy nhất)

Fernandez-Linares L

và cs (1996)

Canamas

và cs (2007)

Pseudomonas

halophila

DSM 3050T

Betaine, hydroxyectoine, ectoine

Vibrio costicola

CCM 2811 Ectoine, betaine 1.71 M

Cao nấm men

Severin và

cs (1992)

Vibrio fischeri

DSM 507

Ectoine, glutamate, betaine 0.86 M

Môi trường hỗn hợp

Schmitz

và Galinski (1996_

Vibrio fischeri

DSM 7151

Glutamate, ectoine, betaine 0.86 M

Môi trường hỗn hợp

Schmitz

và Galinski (1996)

Vibrio harveyi

DSM 2165

Ectoine, GABA, glutamate, alanine

0.86 M Glycerol

Schmitz

và Galinski (1996)

Vibrio harveyi

DSM 6904 Ectoine, glutamate 0.86 M Glycerol

Schmitz

và Galinski (1996)

1.4 Sản xuất và ứng dụng của ectoines

1.4.1 Sản xuất ectoines

Quy trình công nghệ sản xuất ectoine đầu tiên có tên gọi “tạo sữa ở vi khuẩn” – “bacterial milking” được thiết kế bởi Sauer và Galinski (1998) Trong

qui trình đó, chủng vi khuẩn ưa mặn trung bình Halomonas elongatea (chủng vi

khuẩn đã được phát hiện lần đầu ở một cơ sở sản xuất muối, Bonaire, Hà Lan) được nuôi cấy trong môi trường có nồng độ muối cao (15% NaCl) để kích thích sinh tổng hợp ectoine Sau khi đạt được mật độ tế bào cao (khoảng 48 g/l), các tế bào vi khuẩn được cô đặc nhờ màng lọc, sau đó chuyển sang môi trường có nồng độ muối thấp khoảng 3% Trong môi trường mới có nồng độ muối thấp,

các tế bào vi sinh vật sẽ tiết hợp chất tương thích ra môi trường xung quanh nhằm cân bằng áp suất thẩm thấu Dung dịch có chứa ectoine được tách bằng phương pháp lọc, sau đó được tinh sạch bằng phương pháp sắc ký, lọc, bay hơi

và tinh thể hóa (hình 1.4) Tế bào vi khuẩn được thu lại và tiếp tục được nuôi trong môi trường có nồng độ muối 15% để kích thích sinh tổng hợp ectoine Sau khoảng 1 ngày nuôi cấy, qui trình cô đặc và tách chiết lại được lặp lại, Sauer và Galinski (1998) đã lặp lại 9 chu kỳ và thu được hàm lượng khoảng 155 mg ectoine/g sinh khối khô

Hình 1.4 Sơ đồ chung quy trình công nghiệp sản xuất ectoine

Các vi sinh vật thuộc chi Brevibacterium cũng là các vi sinh vật tiềm năng

sử dụng để sản xuất ectoines Phương pháp sản xuất dựa trên sự giảm áp suất

thẩm thấu đã được Nagata và cs (2008) mô tả khi nuôi cấy chủng Brevibacterium

sp.JCM 6894 Để giảm áp suất thẩm thấu tế bào vi khuẩn được cô đặc bằng màng

Thu hồi và tinh sạch ectoine

Lên men sinh tổng hợp ectoine

Làm khô/ kết tinh

Sắc khí trao đổi cation Axit hóa và

kết tủa protein

Sản phẩm

Loại bỏ môi trường thừa

Đầu đọc

Lọc thu tế bào

lọc sau đó hòa vào nước cất.Tuy nhiên, năng suất và sản lượng của ectoine thấp chỉ đạt 0.34 g/l/ngày

Mặc dù qui trình " tạo sữa ở vi khuẩn " là qui trình thành công nhất để sản xuất ectoine, tuy nhiên qui trình này còn có nhiều hạn chế như sự ăn mòn của thiết bị,

sự giảm tốc độ tăng trưởng tế bào ở nồng độ muối cao (Schubert và cs, 2007) Một cách khác để khắc phục những hạn chế của môi trường mặn cao trong các quy trình công nghiệp sản xuất ectoines là sử dụng các chủng tự nhiên có thể tổng

hợp ectoine và phát triển mạnh trong điều kiện mặn tương đối thấp Halomonas

salina là vi khuẩn ưa mặn có thể phát triển và giải phóng ectoine ở nồng độ muối

thấp, đã được chọn để sản xuất ectoine sử dụng MSG làm nguồn carbon và nitơ trong hệ thống lên men ở nồng độ NaCl 0,5 M Hàm lượng ectoine đạt 6,9 g/l và năng suất là 7,9 g/l/ngày (Zhang và cs, 2009)

Cũng dựa theo nguyên lý cơ bản được thiết kế bởi Sauer và Galinski, quy trình nghiên cứu sản xuất ectoine được thiết kế bởi Van-Thuoc và cs (2010), bằng cách nuôi cấy hai pha để sản xuất sinh khối và ectoine sử dụng chủng vi khuẩn ưa

mặn Halomonas boliviensis Pha nuôi cấy đầu tiên được thực hiện trong điều kiện

tối ưu cho sự sinh trưởng của tế bào, kết quả khối lượng tế bào khô đạt được 41g/l sau 24 giờ nuôi cấy Ở pha nuôi cấy thứ hai nồng độ muối tăng dần, sự tích lũy ectoines tăng tuy nhiên khối lượng tế bào giảm khi nồng độ muối tăng Năng suất tối đa của ectoine và hydroxyectoine đạt được là 10 g/l/ngày với nồng độ ectoine

là 6 g/l và nồng độ hydroxyectoine 8 g/l sau 9 giờ nuôi cấy ở 18,5% NaCl Các tế

bào H boliviensis được tiếp tục tái sử dụng cho quá trình sản xuất sau khi giải

phóng ectoines Khoảng 75% ectoines tích lũy được giải phóng bằng cách sốc giảm thẩm thấu Sau đó, các tế bào được tái nuôi cấy trong môi trường có chứa nồng độ muối cao hơn để có thể tái tổng hợp ectoines năng suất ectoines đạt được

là 11,1g/l/ngày, trong đó ectoine và hydroxyectoine đạt được lần lượt là 9,1 và 2,0 g/l/ngày (Van-Thuoc và cs, 2010) Trong một nghiên cứu khác, Fallet và cs (2010) đã kết hợp quá trình tổng hợp và giải phóng ectoines bằng cách sử dụng

hai hệ thống lên men liên tục Thông qua quá trình tối ưu hoá, hàm lượng của ectoine và hydroxyectoine đạt lần lượt là 540 và 400 mg/g CDW, năng suất ectoine và hydroxyectoine tương ứng đạt được 32,5 và 17,5 g/l/ngày

Các dẫn xuất hydroxy hóa của ectoine, như hydroxyectoine cũng được quan tâm, do đặc điểm sinh học đặc biệt của nó khác với các hợp chất tương thích khác Như khả năng ứng dụng của nó để cải thiện khả năng chịu nhiệt của protein

và tế bào, hơn nữa khả năng bảo vệ của hydroxyectoine cũng tốt hơn so với ectoine Để sản xuất hydroxyectoine, Frings và cs (1995) đã thiết kế quá trình lên

men sử dụng chủng Marinsococcus Một phương pháp mới nhằm tăng nhanh số lượng tế bào được sử dụng trong nuôi cấy chủng Marinococcus M52, đó là nuôi

cấy mẻ có sự trao đổi môi trường Đây là một trong những kĩ thuật có triển vọng nhất để tăng nhanh mật độ tế bào, giảm tác động ức chế của các sản phẩm phụ chuyển hóa đối với sự phát triển của chủng Kết quả khối lượng tế bào khô tối đa đạt 56 g/L và hàm lượng hydroxyectoine đạt được 13,5% CDW sau khoảng 120 giờ nuôi cấy

Hydroxyectoine cũng được sản xuất từ chủng H elongata bằng cách thay đổi

các điều kiện lên men trong quá trình “tạo sữa ở vi khuẩn” Tỷ lệ của ectoine và

hydroxyectoine ở H elongata phụ thuộc vào độ mặn và nhiệt độ của môi trường

(Sauer và Galinski 1998) Ở độ mặn lên tới 15% NaCl (w / v) và nhiệt độ dưới 25OC, chỉ có ectoine được tạo ra Tuy nhiên, hàm lượng hydroxyectoine tăng lên với độ mặn và nhiệt độ cao hơn Tỷ lệ tương đối của hydroxyectoine có thể đạt 50% khi

chủng H elongata được nuôi cấy ở nồng độ NaCl 20% (w / v) và 40 OC Trong nghiên cứu của Van-Thuoc và cs (2010), sử dụng phương pháp tối ưu bằng nuôi cấy

hai pha của vi khuẩn H boliviensis năng suất hydroxyectoine đạt được 8,0 g/l, cao gấp 5 lần so với Marinococcus M52 đạt được

1.4.2 Ứng dụng của ectoines

Bên cạnh chức năng chủ yếu giúp tế bào cân bằng áp suất thấu, rất nhiều

enzyme, DNA, và tế bào chống lại các điều kiện môi trường bất lợi như nóng, khô, lạnh, pH bất lợi…(Lippert và Galinski 1992; Welsh 2000; Van-Thuoc và

cs 2013)

Bảo vệ enzyme

Nhiều nghiên cứu đã chứng minh vai trò của ectoines trong việc bảo vệ enzyme trong các điều kiện môi trường bất lợi do đó làm tăng khả năng hoạt động của enzyme Lippert và Galinski (1992) đã nghiên cứu ảnh hưởng của một

số hợp chất tương thích như glycine betaine, trehalose, maltose, sucrose, ectoine

và hydroxyectoine đến hoạt động của lactic dehydrogenase (LDH) và phosphofructokinase (PFK), kết quả cho thấy các hợp chất tương thích thử nghiệm đã giúp enzyme chống lại điều kiện môi trường bất lợi như nóng, lạnh

và khô Trong đó hydroxyectoine và ectoine thể hiện khả năng bảo vệ tốt nhất Khi bổ sung hydroxyectoine sau 4 chu kì đông lạnh và rã đông hoạt tính của LDH còn lại 100%, đối với PFK ectoine thể hiện khả năng bảo vệ tốt nhất (100%) Kết quả cũng cho thấy LHD sau khi đông khô được hòa lại với nước hoạt tính mất hoàn toàn, PFK chỉ giữ lại 20 % hoạt tính Bổ sung hydroxyectoine trước đông khô giúp bảo vệ cả 2 enzyme này giữ được khoảng 80% hoạt tính Hydroxyectoine cũng được chứng minh là chất bảo vệ nhiệt giúp LDH giữ 100% hoạt tính ở nhiệt độ lên đến 50 OC và PFK ở nhiệt độ lên đến 55

O

C (Lippert và Galinski (1992) Ectoine và hydroxyectoine cũng có khả năng bảo vệ và giúp xylanase có thể hoạt động trong điều kiện pH thấp (4,5 và 5) hoặc cao (11 và 12) (Van-Thuoc và cs, 2013) Hiệu quả bảo vệ của hydroxyectoine cao hơn so với ectoine và trehalose Sự có mặt của hydroxyectoine làm tăng hoạt tính còn lại của xylanase từ khoảng 45% đến 86%

ở pH 5 và từ 33% đến 89% ở pH 12 Khi xylanase được ủ ở 65O

C trong 5 giờ với 50 mM hydroxyectoine ở pH 10, khoảng 40% hoạt tính gốc được duy trì Hoạt tính của xylanase được kích thích khi bổ sung 25 mM ectoine và giảm dần

với nồng độ tăng lên đạt 85% và 90% với nồng độ hydroxyectoine và ectoine

100 mM

Bảo vệ DNA

Ngoài khả năng bảo vệ protein-enzyme, ectoine còn có khả năng bảo vệ DNA chống lại điều kiện môi trường bất lợi Ectoine có khả năng làm giảm nhiệt độ nóng chảy DNA từ 3- 6 OC khi bổ sung 0.5-1M ectoine trong phản ứng PCR (Lapidot và cs,1999; Schnoor cs, 2004) Ectoine và hydroxyectoine còn có khả năng làm tăng khả năng bền nhiệt của DNA polymerase, do đó có thể sử dụng để tăng 4-10 lần hoạt động của enzyme này trong phản ứng PCR (Lapidot

và cs, 1999)

Bảo vệ tế bào

Ectoines không chỉ ổn định protein và các đại phân tử khác mà còn bảo vệ

tế bào Louis và cs (1994) cho thấy việc bổ sung ectoine và hydroxyectoine

trước khi đông khô làm tăng tỷ lệ sống sót của hai chủng E coli được thử

nghiệm Trong công nghệ lên men ectoine có thể được sử dụng để làm tăng sự thẩm thấu và năng suất trong quá trình sản xuất các axit amin của chủng vi

khuẩn Coryneform (Yasuhiko và cs, 1997) Trong một nghiên cứu khác,

Manzanera và cs (2004) nhận thấy hydroxyectoine làm tăng khả năng chống

chịu của E coli trong điều kiện khô Ngoài ra, kết quả thu được đối với vi khuẩn Gram âm Pseudomonas putida cho thấy hydroxyectoine hoạt động như chất bảo

vệ chống khô vượt trội hơn so với trehalose, do đó cung cấp một tiềm năng đáng

kể như là một chất chống khô cho các vi sinh vật sống (Manzanera và cs, 2002)

Khả năng bảo vệ của ectoines không chỉ giới hạn đối với các tế bào vi khuẩn, chúng có khả năng bảo vệ cả các tế bào nhân thực Ectoine có khả năng bảo vệ tế bào da người chống lại tia tử ngoại (Bünger và Driller, 2004) Vai trò của ectoine đối với màng tế bào đã được chứng minh bằng cách xét nghiệm hồng cầu và kết quả cho thấy sự tổn thương màng tế bào được giảm đáng kể khi

sử dụng ectoine trước đó Bổ sung ectoines vào trong mỹ phẩm có tác dụng dưỡng da và làm tăng độ ẩm cho da Các nghiên cứu in vitro về tác dụng của ectoine đối với da người được chứng minh bằng các thử nghiệm lâm sàng trên

da lão hóa (Heinrich và cs, 2007) Bổ sung 2% ectoine, làm da ẩm hơn, dẫn đến tăng độ đàn hồi cấu trúc của bề mặt da Từ những lí do trên, ngày nay ectoines được quan tâm trong lĩnh vực mỹ phẩm (Hình 1.5), ectoine (EctoineTM) hiện đang được sử dụng trong một loạt các sản phẩm chăm sóc da ngày càng tăng (Lentzen và Schwarz, 2006)

Hình 1.5 Một số sản phẩm trong y tế sử dụng ectoine trên thị trường

Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

Các chủng vi khuẩn được phân lập từ các mẫu chượp mắm tôm và cá trong giai đoạn đang lên men 5-15 ngày thu thập tại xã Hải Triều, huyện Hải Hậu, tỉnh Nam Định

2.2 Địa điểm, thời gian, môi trường nghiên cứu

- Địa điểm nghiên cứu: Tại phòng thí nghiệm bộ môn CNSH- Vi sinh, khoa Sinh học, trường Đại học Sư phạm Hà Nội

- Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 11-2015 đến tháng 6-2017

- Môi trường nghiên cứu được trình bày trong bảng 2.1

Bảng 2.1 Công thức của các loại môi trường sử dụng trong nghiên cứu

Hóa chất dụng cụ và thiết bị nghiên cứu:

Hóa chất: Các loại hóa chất dùng để pha chế môi trường và một số loại

hóa chất khác như Cloroform (Merck, Đức), Methanol (Merck, Đức), Ectoine và hydroxyectoine (Sigma, Mỹ), và các hóa chất thông dụng khác như

Na2HPO4.12H2O, NaH2PO4.2H2O,…

Dụng cụ và thiết bị: : Nồi hấp thanh trùng (Tommy, Nhật); máy so màu

(UV- vis, Nhật); máy đo pH (MP200R, Thụy Sĩ); tủ ấm, tủ sấy (Binder, Đức); máy li tâm (Sorvall, Mỹ); cân phân tích (Pracisa XT 320M, Thụy Sĩ); máy lắc ổn nhiệt (BR300LF, Nhật), micropipet (Gilson, Pháp) các loại từ 10µl- 1ml, máy PCR (Applied biosistems, Mỹ), máy đông khô (Flexi Dry, Mỹ), máy sắc ký lỏng Dionex Ultimate 3000 pump với cột Aminex-87C để xác định hàm lượng ectoines (Thermo Scientific, Mỹ), buồng cấy vô trùng (Thermo, Đức),… và các dụng cụ thông dụng khác của phòng CNSH - Vi sinh, khoa sinh học, Đại học Sư Phạm Hà Nội

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp phân lập

Cân 1gam mẫu chượp mắm cho vào ống nghiệm chứa 9 ml nước chứa 10% NaCl đã thanh trùng, trộn đều hỗn hợp bằng máy vortex Hút 1ml dịch chuyển sang ống nghiệm thứ 2 chứa sẵn 9ml nước chứa 10% NaCl đã thanh trùng, trộn đều được dung dịch có độ pha loãng 10-2 Thao tác tương tự với ống nghiệm thứ 3 thu được dung dịch có độ pha loãng 10-3

Hút 100µl dịch ở các nồng độ pha loãng nhỏ vào chính giữa đĩa môi trường dùng để phân lập, dùng que trang gạt đều Sau 24-72 giờ ủ ở 30 OC lựa chọn các khuẩn lạc mọc riêng rẽ dùng tăm cấy chuyển

vào đĩa Petri chứa môi trường MPA nồng độ NaCl 5% và 10% để giữ giống

2.3.2 Phương pháp tuyển chọn vi khuẩn

Các khuẩn lạc riêng rẽ sau khi cấy chuyển sang đĩa Petri chứa môi trường MPA nồng độ 5% NaCl, sẽ được cấy lên môi trường có chứa các nồng độ NaCl khác nhau: 5%, 10%, 15%, 20% Sau 24 – 48 giờ kiểm tra xem chủng vi khuẩn nào phát triển tốt nhất trên môi trường nghiên cứu thì chọn (ưu tiên chủng nào phát triển ở khoảng muối rộng)

Các chủng vi khuẩn được tuyển chọn sẽ được nuôi cấy trong môi trường MPA lỏng nồng độ 10% NaCl, nuôi trong tủ lắc 180 vòng/phút, nhiệt độ 30 OC Sau 30 giờ tiến hành thu sinh khối, tính khối lượng tế bào khô (CDW) và phân tích hàm lượng ectoines trong tế bào

2.3.3 Phương pháp giữ giống vi khuẩn

Phương pháp cấy truyền định kỳ: Tiến hành cấy truyền các chủng vi khuẩn giống định kỳ 1,5-2 tháng một lần trên ống thạch nghiêng chứa môi trường MPA nồng độ 5% NaCl, đặt trong tủ ấm 35 OC, sau 24 - 48 giờ vi khuẩn đã mọc tốt thì chuyển sang giữ trong tủ lạnh ở nhiệt độ 4 OC

2.3.4 Phương pháp hoạt h chủng vi khuẩn tuyển chọn

Cấy chủng vi khuẩn tuyển chọn trên môi trường MPA có chứa 5% NaCl đặc ở nhiệt độ 35 C trong 24 giờ, cấy chuyển sang môi trường MPA nồng độ 5% NaCl lỏng, nuôi trong tủ lắc với tốc độ 180 vòng/phút ở nhiệt độ 35 OC trong 14 giờ Lúc này chủng vi khuẩn đã được hoạt hóa và nhân giống cấp 1 sẵn sàng để sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo

2.3.5 Phương pháp nghiên cứu đặc điểm hình thái tế bào

Nhuộm đơn: Cấy vi khuẩn lên môi trường MPA nồng độ 5% NaCl đặc, nuôi trong tủ ấm 35 OC trong 24 giờ Làm vết bôi lên kính: nhỏ 10 µl nước cất vô trùng lên phiến kính sạch Dùng que cấy vô trùng lấy vi khuẩn cần nghiên cứu cho vào giọt nước tạo ra dung dịch huyền phù tại chỗ Dàn đều, để khô và cố định bằng cách hơ qua ngọn lửa đèn cồn Nhuộm đơn bằng Fucsin kiềm trong khoảng 1-2 phút Rửa bằng nước, thấm khô, quan sát và mô tả kích thước tế bào dưới kính hiển vi quang học với độ phóng đại 1000 lần

Hình dạng và kích thước tế bào của chủng vi khuẩn tuyển chọn cũng được xác định nhờ ảnh chụp qua kính hiển vi điện tử quét (SEM) tại Vệ sinh Dịch tễ Trung ương

Nhuộm Gram: Làm vết bôi bằng giọt huyền phù (0,01ml) các vi khuẩn đã được nuôi cấy 24 giờ trên môi trường MPA nồng độ 5% NaCl lỏng Hong khô

và cố định vết bôi bằng dung dịch Genatian trong 2 phút Đặt nghiêng cho thuốc nhuộm thừa chảy xuống chậu hứng Nhỏ dung dịch Lugol lên vết bôi và nhuộm trong 1 phút Rửa tiêu bản bằng dung dịch cồn trong khoảng 15-20 giây, rửa cồn

dư bằng nước, nhuộm màu bổ sung bằng dung dịch safranin trong 2 phút Rửa tiêu bản bằng nước, thấm khô tiêu bản, soi kính hiển vi với vật kính dầu để xác định Gram của vi khuẩn nghiên cứu

2.3.6 Phương pháp đông khô

Chủng vi khuẩn sau khi được nuôi lỏng trên môi trường ở các nồng độ NaCl khác nhau trong 30 giờ Tiến hành li tâm thu sinh khối, sau đó rửa qua với nước muối tương đương với các nồng độ NaCl có trong môi trường nuôi cấy, giữ lại sinh khối tế bào, đông khô bằng máy đông khô Flexi Dry (Mỹ), sau đó dùng

để phân tích hàm lượng ectoines trong tế bào

2.3.7 Phương pháp định loại vi khuẩn bằng kỹ thuật di truyền phân tử

Nuôi cấy chủng tuyển chọn trên môi trường MPA nồng độ 5% NaCl lỏng, trong 14 giờ Tiến hành tách chiết DNA tổng số theo các bước trong bộ kit “ZR Fungal/Bacterial DNA MiniPrepTM”

DNA tổng số được sử dụng để tiến hành phản ứng PCR nhằm khuếch đại đoạn trình tự 16S rDNA với cặp mồi (314F: 5’- CCT ACG GGA GGC AGC AG

- 3’ và 907R: 5’ - CCG TCA ATT CCT TTG AGT TT - 3’) Sử dụng bộ kit

“Dream Taq PCR Master Mix (2X)” (Thermo Fisher Scientific, USA) Phản ứng PCR được thực hiện trong điều kiện: Biến tính DNA ở 94 O

C trong 3 phút Lặp lại

35 chu kỳ với chu trình nhiệt cho phản ứng PCR: (1) Giai đoạn biến tính DNA ở

94 OC trong 30 giây; (2) Giai đoạn bắt cặp mồi ở 52 OC trong 30 giây; (3) Giai đoạn kéo dài: 72 OC trong 1 phút Giai đoạn kéo dài chuỗi cuối cùng là 7 phút ở

72 OC và giữ sản phẩm PCR ở 4 OC (∞) Kiểm tra sản phẩm PCR trên gel agarose

“PAGErTM EM Gels Mid/High (10-350 kDa) 4 - 12% (Lonza, USA)” với điện

áp 220V trong 6-10 phút và hiện hình ảnh sản phẩm dưới tia UV Sản phẩm PCR được gửi tới công ty Gentis (Singapore) để giải trình tự Trình tự gen sau đó được

so sánh với ngân hàng gen để xác định chủng loại phát sinh của chủng vi khuẩn tuyển chọn

2.3.8 Phương pháp lên men thu sinh khối tế bào

Bổ sung 5% (v/v) giống vi khuẩn đã hoạt hóa 14 giờ trong môi trường MPA nồng độ 5% NaCl lỏng vào bình tam giác chứa 25ml môi trường MPA 5%

NaCl Đặt các bình tam giác trong tủ lắc 180 vòng/phút ở nhiệt độ 35 OC trong 30 giờ

Giá trị CDW được xác định theo các bước: Chuẩn bị eppendorf 2 ml đánh

số thứ tự, sấy khô đến khối lượng không đổi sau đó cân để xác định khối lượng ban đầu (M0) của từng eppendorf Hút lần lượt 3ml dịch nuôi cấy cho vào eppendorf trên Sau đó li tâm 12000 vòng trong 5 phút, giữ lại sinh khối tế bào Rửa sinh khối bằng nước cất, sấy khô eppendorf chứa sinh khối đến khối lượng không đổi, cuối cùng cân eppendorf để xác định khối lượng eppendorf và tế bào (M1), mỗi mẫu lặp lại 3 lần Tính khối lượng tế bào khô (CDW) theo công thức:

CDW (g/l) = (M1 - M0)/3*1000

Li tâm toàn bộ dịch nuôi cấy, thu sinh khối, rửa bằng nước muối tương đương với các nồng độ muối của môi trường nuôi cấy Sau đó đông khô để phân tích ectoines

2.3.9 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng củ điều kiện nuôi cấy và dinh dưỡng đến khả năng sinh trưởng của chủng tuyển chọn

2.3.9.1 ghiên cứu ảnh hưởng củ pH đến sự sinh trưởng của chủng tuyển chọn

Bổ sung 5% (v/v) giống vi khuẩn đã hoạt hóa 14 giờ vào trong bình tam giác 100ml chứa 25ml môi trường MPA nồng độ 5% NaCl đệm photphate 0,01M

có pH khác nhau: 6; 6,5; 7; 7,5; 8 Nuôi trong tủ lắc với tốc độ 180 vòng/phút ở nhiệt độ 35 C trong 30 giờ Thu mẫu để xác định khối lượng tế bào khô (CDW)

2.3.9.2 Nghiên cứu ảnh hưởng củ nhiệt độ đến sự sinh trưởng củ chủng tuyển chọn

Bổ sung 5% (v/v) giống vi khuẩn đã hoạt hóa 14 giờ vào trong bình tam giác 100ml chứa 25ml môi trường MPA nồng độ 5% NaCl ở các mức nhiệt độ khác nhau: 25 O

C, 30 OC, 35 OC, 40 OC, 45 OC lên men trong 30 giờ, rồi đánh giá

khả năng sinh trưởng của các chủng vi khuẩn tuyển chọn dựa vào CDW