Nghiên cứu đặc điểm sinh học phân tử gen kháng cephalosporin của vi khuẩn e coli sản sinh men betalactamase phân lập từ người chăn nuôi và lợn tại thái bình và sóc sơn

coli từ vật nuôi sang người, tôi thực hiện đề tài khoa học“Nghiên cứu đặc điểm sinh học phân tử gen kháng Cephalosporin của vi khuẩn E... Cấu trúc của vòng beta-lactam  Cơ chế tác dụn

TRẦN XUÂN BÁCH

Nghiên cứu đặc điểm sinh học phân

tử gen kháng Cephalosporin của vi khuẩn E coli sản sinh men Beta- lactamase phân lập từ người chăn

nuôi và lợn tại Thái Bình và Sóc Sơn

LỜI CẢM ƠN

Trước tiên tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn chân thành đến TS Đặng Thị

Thanh Sơn đã tận tình, hướng dẫn và tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp đỡ tôi

trong suốt quá trình hoàn thành khóa luận này

Tôi xin chân thành cảm ơn đến Ban lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học – Viện Hàn lâm khoa học và công nghệ Việt Nam, toàn thể cán bộ Phòng Công nghệ tế bào động vật, Trung tâm giám định ADN, Phòng Công nghệ sinh học tái tạo môi trường đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi trong cả quá trình học tập, thực hiện nghiên cứu và hoàn thiện luận văn

Tôi xin chân thành cảm ơn các cán bộ Bộ môn Vệ sinh Thú y- Viện Thú y

đã cung cấp mẫu cho nghiên cứu Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo, các cán bộ của cơ sở đào tạo sau Đại học Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật

đã tận tâm truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt khóa học

Luận văn này là một phần kết quả của đề tài có mã số 106-YS thuộc Quỹ phát triển khoa học và công nghệ quốc gia (NAFOSTED) Tôi xin chân thành cảm ơn sự hỗ trợ kinh phí từ đề tài

Cuối cùng tôi xin chân thành cảm ơn sự động viên khích lệ của gia đình, bạn bè và các đồng nghiệp trong suốt thời gian thực hiện khóa luận này

Hà Nội, ngày tháng năm 2016

Học viên

Trần Xuân Bách

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là trung thực và chưa được sử dụng công bố trong bất kỳ tài liệu nào

Tôi xin cam đoan mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn này đã được cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn đều đã được chỉ rõ nguồn gốc

Hà Nội, ngày tháng năm 2016

Học viên

Trần Xuân Bách

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1.Vi khuẩn Escherichia coli (E coli) 4

1.1.1 Sức đề kháng của vi khuẩn E coli 6

1.1.2 Đặc tính gây bệnh của vi khuẩn E coli 6

1.1.3 Đặc điểm di truyền của vi khuẩn E coli 7

1.2 Hiện tượng kháng kháng sinh của vi khuẩn E coli 7

1.2.1 Hiểu biết về thuốc kháng sinh 7

1.2.2 Khả năng kháng kháng sinh của vi khuẩn 12

1.2.3 Enzyme beta-lactamase 16

1.3 Một số nghiên về tính kháng thuốc của vi khuẩn trong và ngoài nước 20

1.3.1 Một số nghiên cứu trên thế giới 20

1.3.2 Một số nghiên cứu trong nước 22

CHƯƠNG II: NỘI DUNG, VẬT LIỆU, VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24 2.1 Nội dung nghiên cứu 24

2.2 Vật liệu nghiên cứu 24

2.1.2 Hóa chất sử dụng 25

2.1.3 Thiết bị sử dụng 25

2.1.4 Phần mềm tin sinh học 26

2.2 Phương pháp nghiên cứu 27

2.2.1 Tách chiết ADN tổng số của vi khuẩn E coli 27

2.2.2 Nhân đoạn gen kháng kháng sinh của E coli bằng phản ứng PCR 28

2.2.3 Phương pháp điện di kiểm tra kết quả 33

2.2.4 Phương pháp giải trình tự theo phương pháp F Sanger 33

2.2.5 Phương pháp phân tích trình tự nucleotide 34

CHƯƠNG III – KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 36

3.1 Kết quả phát hiện gen kháng kháng sinh nhóm cephalosporin của các

chủng E coli kháng cefotaxime phân lập từ Thái Bình và Sóc Sơn 36

3.2 Đặc điểm sinh học phân tử của một số gen kháng kháng sinh 40

3.2.1 Giải trình tự các gen kháng kháng sinh thu được 40

3.2.2 Đặc điểm sinh học phân tử gen CTX -M 43

3.2.3 Đặc điểm sinh học phân tử gen TEM 49

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 52

TÀI LIỆU THAM KHẢO 54

BẢNG CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Một số kháng sinh thuộc nhóm Cephalosporin 12

Bảng 2.1 Số lượng chủng E coli nghiên cứu……… 24

Bảng 2.2 Các thiết bị sử dụng cho nghiên cứu 26

Bảng 2.3 Phần mềm sử dụng 27

Bảng 2.4 Các cặp gen mồi để phát hiện các gen kháng kháng sinh TEM, SHV and CTX-M (Hasman et al 2005) 32

Bảng 2.5 Chu trình nhiệt phản ứng PCR 32

Bảng 3.1 Tỷ lệ phát hiện gen CTX-M và gen TEM ở các chủng E coli kháng cefotaxime………37

Bảng 3.2 Nguồn gốc các chủng E coli được giải trình tự gen kháng kháng sinh 41

Bảng 3.3 Bảng kí hiệu gen CTX-M 43

Bảng 3.4.Vị trí đột biến nucleotit gen CTX-M 44

Bảng 3.5 Vị trí đột biến axit amin 46

Bảng 3.6 Nhóm các gen có trình tự nucleotit giống nhau 48

Bảng 3.7 Bảng kí hiệu gen TEM…… ……… 49

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Hình mô tả vi khuẩn E coli 5

Hình 1.2 Cấu trúc của vòng beta-lactam 10

Hình 1.3 Cấu trúc chung của cephalosporin 11

Hình 1.4 Sự lan truyền gen kháng thuốc bằng hình thức thông qua các R-plasmid (ảnh nguồn internet) 15

Hình 1.5 Đề kháng thu được do nhận được gen nằm trên Integron 16

Hình 1.6 Vị trí tác động của enzyme beta-lactamse 20

Hình 2.1 Vi khuẩn E coli trên môi trường thạch………25

Hình 2.2 Sơ đồ nguyên lý phản ứng PCR 29

Hình 2.3 Các bước của một chu kì PCR 31

Hình 2.4 Nguyên lý giải trình tự ADN theo phương pháp Sanger 33

Hình 2.5 Kiểm tra chất lượng tín hiệu dựa trên dữ liệu trình tự 34

Hình 2.6 Kiểm tra chất lượng giải mã trình tự bằng phương pháp phổ thông 35

Hình 3.1 Kết quả phát hiện gen TEM của một số chủng E coli bằng phản ứng PCR……… 36

Hình 3.2 Kết quả phát hiện gen CTX-M của một số chủng E coli bằng phản ứng PCR 36

Hình 3.3.Tỉ lệ chủng E coli ở người mang gen kháng kháng sinh 38

Hình 3.4 Tỉ lệ chủng E coli ở lợn mang gen kháng kháng sinh 38

Hình 3.5 Kết quả phát hiện gen SHV của một số chủng E coli bằng phản ứng PCR 40

Hình 3.6 Hình ảnh quá trình xử lý trình tự nucleotit của gen CTX-M 42

Hình 3.7 So sánh mức độ tương đồng của các gen CTX-M với các gen trên ngân hàng gen thế giới 42

Hình 3.8 So sánh trình tự nucleotit gen CTX-M 44

Hình 3.9 So sánh trình tự nucleotit gen TEM 50

MỞ ĐẦU

Việc sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi chưa được quản lý chặt chẽ (về liều lượng kháng sinh, cách pha trộn,và dùng kháng sinh theo thói quen) sẽ dẫn đến hiện tượng tồn dư kháng sinh trong thực phẩm và các sản phẩm từ chăn nuôi gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến sức khỏe con người [52] Nguy hiểm hơn cả là tạo ra các chủng vi khuẩn có khả năng kháng kháng sinh Vấn

đề vi khuẩn kháng thuốc trong những năm gần đây trở thành vấn đề toàn cầu khi ngành chăn nuôi, và đặc biệt là khi chăn nuôi lợn đang phát triển mạnh

mẽ Với đặc điểm thời tiết nóng ẩm mưa nhiều ở nước ta, dịch bệnh ở đàn lợn nuôi thường xuyên xảy ra Một trong những biện pháp chính để phòng trị bệnh xảy ra trong chăn nuôi lợn là sử dụng thuốc kháng sinh, không chỉ riêng

ở Việt Nam mà ở nhiều nước trên thế giới [26]

Vi khuẩn kháng kháng sinh luôn là vấn đề quan tâm của các nước trên thế giới, đặc biệt là các nước đang phát triển Theo Son và cs (2011), vi khuẩn kháng lại kháng sinh đang tiếp tục gây nên những tổn thất nặng nề về kinh tế trong chăn nuôi và gây nguy hiểm đến tính mạng của người bệnh và vật nuôi [48] Vi khuẩn và gen kháng thuốc của vi khuẩn có thể nhanh chóng lan truyền ra môi trường, kể cả trong bệnh viện, cộng đồng và trong chăn nuôi Trong khi tốc độ đề kháng kháng sinh ngày càng gia tăng thì việc nghiên cứu tìm ra các loại kháng sinh mới để điều trị thì gặp khó khăn Như vậy trong cuộc chạy đua dành ưu thế thì vi khuẩn đang vươn lên dẫn trước Khoảng cách giữa khả năng vi khuẩn biến đổi để trở thành chủng kháng kháng sinh và khả năng con người kiểm soát được vi khuẩn đang được nới rộng Vì vậy, nếu chúng ta không có biện pháp làm giảm tốc độ kháng thuốc kịp thời thì sẽ đẫn đến hậu quả không có thuốc kháng sinh để điều trị

Kháng sinh nhóm beta-lactam được biết đến sớm nhất trong lịch sử kháng sinh và có vai trò đặc biệt trong điều trị nhiễm khuẩn Hiện nay nhóm beta-lactam có số lượng kháng sinh lớn nhất, chiếm ba phần tư tổng số lượng

kháng sinh đang lưu hành Trong những năm gần đây, các kháng sinh Cephalosporin được sử dụng rộng rãi trong điều trị lâm sàng nói chung và trong điều trị thú y nói riêng Do được sử dụng rộng rãi nên tỷ lệ vi khuẩn đề kháng các kháng sinh này là rất cao, nhất là ở các vi khuẩn Gram âm Hiện nay đã xuất hện nhiều chủng vi khuẩn Gram âm sinh men beta-lactamase và beta-lactamase phổ rộng (ESBL: Extended Spectrum beta-lactamase) đề kháng các kháng sinh nhóm beta-lactam, bao gồm các kháng sinh phổ rộng như Cephalosporin Sinh ESBL vẫn là nguyên nhân chủ yếu gây gia tăng đề kháng kháng sinh nhóm beta-lactam ở những vi khuẩn Gram âm như:

Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa đặc biệt là Escherichia coli

Trên thế giới đã có nhiều công trình nghiên cứu phát hiện sự tương đồng kiểu

hình và kiểu gen của các chủng E coli sản sinh enzyme beta-lactamse được

phân lập từ bệnh phẩm bệnh nhân, sản phẩm chăn nuôi, và môi trường

Vi khuẩn E coli dễ dàng được phát hiện trong chất thải chăn nuôi (Son et

al., 2011) [47] Đây là vi khuẩn chính gây bệnh đường tiêu hóa ở lợn và

người Việc quản lý chất thải trong ngành chăn nuôi chưa được thực hiện một cách triệt để nên một lượng lớn chất thải lợn được xả thẳng ra môi trường Đặc biệt đối với các hộ chăn nuôi nhỏ lẻ thì việc sử dụng đồ bảo hộ, các công

cụ hỗ trợ việc ngăn chặn vi khuẩn từ vật nuôi sang người trực tiếp chăn nuôi gần như chưa có Đây là nguy cơ làm cho các vi khuẩn, trong đó có các vi khuẩn kháng kháng sinh có trong chất thải chăn nuôi lây nhiễm sang người Đây phải chăng là những nguyên nhân cơ bản làm tăng khả năng kháng kháng

sinh của E coli ở đàn lợn và làm lây nhiễm E coli kháng thuốc cho người

chăn nuôi lợn (do thường xuyên tiếp xúc với chất thải chăn nuôi)

Để làm sáng tỏ hiện tượng lây truyền gen kháng thuốc của vi khuẩn E

coli từ vật nuôi sang người, tôi thực hiện đề tài khoa học“Nghiên cứu đặc

điểm sinh học phân tử gen kháng Cephalosporin của vi khuẩn E coli sản

sinh men Beta-lactamase phân lập từ người chăn nuôi và lợn tại Thái Bình

và Sóc Sơn”

Kết quả sử dụng trong luận văn được trích từ kết quả của đề tài NAFOSTED có mã số 106-YS

Mục tiêu của đề tài

- Xác định được tỷ lệ nhiễm vi khuẩn E coli kháng kháng sinh nhóm

Cephalosporin (sản sinh enzyme beta-lactamase) phân lập từ chất thải của

người chăn nuôi, chất thải của lợn và môi trường

- Xác định trình tự gen kháng kháng sinh của vi khuẩn E coli sản sinh

enzyme beta-lactamase

- Đánh giá sự tương đồng về kiểu gen kháng kháng sinh của E coli

được phân lập từ người chăn nuôi và lợn

Ý nghĩa của đề tài

- Kết quả nghiên cứu của đề tài là tài liệu khoa học cung cấp thông tin

về thực trạng nhiễm vi khuẩn E coli kháng kháng sinh nhóm Cephalosporin

ở lợn và người chăn nuôi

- Làm cơ sở khoa học cho việc khẳng định có hay không hiện tượng truyền lây gen kháng thuốc beta-lactam qua plasmid giữa người và lợn để từng bước kiểm soát vi khuẩn kháng thuốc, ngăn chặn nguy cơ kháng kháng sinh của vi khuẩn ở Việt Nam

CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1.Vi khuẩn Escherichia coli (E coli)

Vi khuẩn Escherichia do nhà khoa học Escherich phát hiện lần đầu tiên năm

1885 Giống Escherichia được chọn là đại diện điển hình của họ vi khuẩn đường ruột Giống này gồm nhiều loại như E coli, E.adecarboxylase,

E.blattae, E.fergusonii, E.hermanii và E.vulneris Trong đó E coli có vai trò

quan trọng nhất và được chọn là loài điển hình của giống Escherichia, chiếm

80% các vi khuẩn hiếu khí kí sinh ở đường ruột của người

Trước đây vi khuẩn Escherichia coli được gọi là Bacterium coli commune hay

Bacilus coli commnis, lần đâu tiên được phân lập từ phân trẻ em bị tiêu chảy

năm 1885 và được đặt theo tên của người bác sĩ nhi khoa Đức Theodor

Escherich [5] Vi khuẩn E coli tổng hợp một số sinh tố B, E, K và tạo quần thể vi khuẩn cân bằng ở ruột Đồng thời E coli cũng là nguyên nhân gây nên

một số bệnh

Vi khuẩn E coli là trực khuẩn Gram (-) có kích thước trung bình là 2-3 µm x

0,3-0,6 µm, trong môi trường nuôi cấy như canh khuẩn già xuất hiện những

trực khuẩn dài 4-8µm hoặc vi khuẩn có thể dài như sợi chỉ Rất ít chủng E

coli có vỏ nhưng hầu hết có lông và có khả năng di động, chúng không sinh

nha bào và có thể có giáp mô Vi khuẩn E coli sống ở nhiều nơi trong môi trường, đặc biệt có cả trong cơ thể người và động vật Trong ruột, E coli sống

hòa bình và giúp cơ thể tổng hợp các loại vitamin K, B Hiện nay, đã tìm ra

hàng trăm chủng vi khuẩn E coli Hầu hết các chủng E coli là vô hại và sống

trong đường ruột của người và động vật khỏe mạnh

Loài: Escherichia coli

Nơi cư trú chính của Escherichia coli thường ở phần sau của ruột, ít khi

ở dạ dày hay ở phần trước ruột các loài động vật như: ngựa, bò, dê, cừu, lợn, chó, mèo, gia cầm và người Chúng theo phân của người hay gia súc đào thải

ra ngoài, loài ăn thịt bài tiết nhiều E coli hơn loài ăn cỏ E coli xuất hiện và

sinh sống rất sớm trong đường ruột người và động vật, chỉ vài giờ sau sinh (sau khi đẻ 2 giờ) và tồn tại đến khi con vật chết

Theo Nguyễn Như Thanh và cs (2001) Các chủng E coli không gây

bệnh mà chỉ khi các điều kiện nuôi dưỡng, chăm sóc, vệ sinh thú y kém và trên cơ sở mắc kế phát sau các bệnh ký sinh trùng, bệnh virus, … dẫn tới sức

chống đỡ của con vật suy giảm thì vi khuẩn E coli mới trở nên cường độc và

có khả năng gây bệnh [6]

1.1.1 Sức đề kháng của vi khuẩn E coli

Vi khuẩn E coli không sinh nha bào nên có sức đề kháng yếu, bị diệt ở

nhiệt độ 55oC trong 1 giờ hoặc 60oC trong vòng 30 phút, đun sôi 100oC thì

chết ngay Những chủng vi khuẩn E coli trong phân có xu hướng đề kháng

cao hơn những chủng phân lập được ở môi trường bên ngoài Ở môi trường

bên ngoài, các chủng vi khuẩn E coli gây bệnh có thể tồn tại đến 4 tháng [6]

Các chất sát trùng thông thường như axit Phenic 3%, Hydroperoxit 1%, Focmon 1% có thể diệt vi khuẩn trong 5 phút

1.1.2 Đặc tính gây bệnh của vi khuẩn E coli

E coli là thành viên thuộc nhóm vi khuẩn thông thường sống trong

đường tiêu hóa của người và vật nuôi, chiếm tỷ lệ cao nhất trong số các vi

khuẩn hiếu khí Tuy nhiên, E coli cũng là vi khuẩn gây bệnh quan trọng , nó

đứng đầu trong các vi khuẩn gây bệnh tiêu chảy, viêm đường tiết niệu, viêm

đường mật E coli gây bệnh bởi nhiều yếu tố, có yếu tố là độc tố và có yếu tố

không phải là độc tố bao gồm:

- Khả năng bám dính: yếu tố bám dính giúp vi khuẩn thực hiện bước đầu tiên của quá trình gây bệnh là bám dính lên niêm mạc ruột nhờ một hay nhiều yếu tố bám dính Chúng có 4 yếu tố bám dính quan trọng là F4, F5, F6, F41

- Khả năng xâm nhập: là khả năng vi khuẩn qua được hàng rào bảo vệ lớp musoca trên bề mặt ruột non và tế bào biểu mô, đồng thời sản sinh và phát triển trong lớp tế bào này, tránh sự đại thực bào

- Khả năng gây dung huyết: khả năng sản sinh ra Heamolysin của E

coli có thể được coi như một yếu tố độc lực quan trọng Kiểu dung huyết quan

trọng nhất là kiểu α và β

- Tính kháng kháng sinh: Yếu tố quy định khả năng kháng kháng sinh

của E coli nằm trong plasmid Các plasmid nằm trong tế bào vi khuẩn thuộc

họ vi khuẩn đường ruột nói chung và E coli nói riêng có khả năng tồn tại,

nhân lên và chuyển giao giữa các chủng vi khuẩn, do vậy nó có vai trò quan trọng có thể gây nên hiện tượng kháng thuốc và có thể truyền ngang (lây truyền giữa các loài vi khuẩn khác nhau) hoặc truyền dọc (lây truyền tính kháng thuốc giữa các vi khuẩn cùng loài) Sử dụng một thuốc hóa học điều trị

nào điều trị E coli trong một thời gian dài dẫn đến khả năng kháng không chỉ

thuốc đó mà còn kháng cả thuốc khác [4], [7]

1.1.3 Đặc điểm di truyền của vi khuẩn E coli

Vật liệu di truyền của vi khuẩn E coli là ADN Có hai loại ADN là

ADN nhiễm sắc thể và ADN ngoài nhiễm sắc thể ADN nhiễm sắc thể là một phân tử ADN xoắn kép dạng vòng tạo nên nhiễm sắc thể duy nhất ADN ngoài nhiễm sắc thể hay còn gọi là plasmid

Plasmid cũng là ADN hai sợi xoắn kép dạng vòng, chúng chứa nhiều gen mã hóa cho nhiều đặc tính không thiết yếu cho sự sống của tế bào nhưng

có thể giúp cho E coli tồn tại dưới áp lực của chọn lọc Nhờ plasmid mà

chúng có thể vận chuyển yếu tố di truyền cho tế bào khác qua các cơ chế: biến nạp, tải nạp và tiếp hợp

1.2 Hiện tượng kháng kháng sinh của vi khuẩn E coli

1.2.1 Hiểu biết về thuốc kháng sinh

1.2.1.1 Định nghĩa [3], [8]

Năm 1929, Alexander Fleming phát hiện ra khả năng kháng khuẩn của

nấm Penicillium notatum, mở đầu cho nghiên cứu và sử dụng kháng sinh

Năm 1938, Florey và Chain đã thực nghiệm penicillin trong điều trị Năm 1942, Waksman (là người phát hiện ra streptomycin và được giải Nobel) đã định nghĩa:

“Một chất kháng sinh hay một hợp chất có tính kháng sinh là một chất

do các vi sinh vật sản xuất ra, có khả năng ức chế sự phát triển hoặc thậm chí tiêu diệt các vi khuẩn khác”

Năm 1950, Baron bổ sung và giới hạn định nghĩa như sau: “Kháng sinh là những chất được tạo ra bởi những cơ thể sống, có khả năng ức chế sự

phát triển hay sự tồn tại của một hay nhiều chủng vi sinh vật ở nồng độ thấp”

Ngày nay, kháng sinh không chỉ được tạo ra bởi các vi sinh vật mà còn được tạo ra bằng quá tình bán tổng hợp hoặc tổng hợp hóa học, do đó định nghĩa về kháng sinh cũng được thay đổi, hiện nay kháng sinh được định nghĩa như sau: “Kháng sinh là những chất có nguồn gốc vi sinh vật, được bán tổng hợp hoặc tổng hợp hóa học Với liều lượng thấp có tác dụng kìm hãm hoặc tiêu diệt vi sinh vật gây bệnh”

2.2.1.2 Cơ chế tác dụng của thuốc kháng sinh

 Kháng sinh ức chế tổng hợp màng vách tế bào vi khuẩn

Chất kháng sinh ức chế tổng hợp mucopeptid ở vách thế bào vi khuẩn Thuộc nhóm này gồm có các beta-lactam, Cephalosporin… Penicillin

và các dẫn xuất beta-lactam có cấu trúc giống như chuỗi peptid do vi khuẩn tổng hợp nên để tạo màng tế bào Do vậy, khi tổng hợp màng tế bào, vi khuẩn tạo phức nhầm với các chất đó, phức hợp này bền vững và không hồi phục Phản ứng xuyên mạch tạo màng bị cản trở

Một số kháng sinh lại có tác dụng vào việc vận chuyển, trùng hợp mucopeptid Chúng có tác dụng phá hoại chức năng màng nguyên sinh của tế bào vi khuẩn Thuộc nhóm này có 30 chất, trong đó có: Polymicin B, Colistin, Bacitracin, Anbomycin, Vancomycin, Ristomycin

 Kháng sinh ức chế tổng hợp protein của vi khuẩn

Kháng sinh làm tổng hợp protein bất thường: Đại diện nhóm này là Streptomycin, tác dụng gây ức chế tổng hợp protein của vi khuẩn ở mức ribosome Thuốc gắn vào tiểu phần 30S của ribosom Qua đó làm đọc sai mã

di truyền, dẫn đến việc tổng hợp tích lũy những polypeptide sai lạc Thuốc có tác dụng kìm hãm sự phát triển của vi khuẩn

Kháng sinh phong bế tổng hợp protein: Đại diện nhóm này là Chloramphenicol, thuốc gắn với tiểu phần 50S, 70S của ribosom trong tế bào, ngăn cản mạch peptid kéo dài Chlophenicol làm quá trình tổng protein của vi khuẩn bị đình trệ ngay Các thuốc thuộc nhóm Tetracycline lại gây ức chế quá trình tổng hợp protein của vi khuẩn bằng cách gắn vào phần 30S của ribosom nên ức chế gắn aminoacyl – ARNt mới vào vị trí tiếp nhận trên phức hợp ARNm-ribosom gây gián đoạn quá trình tỏng hợp chuỗi peptid

 Thay đổi tính thấm của màng tế bào

Màng có tính thấm chọn lọc đối với các ion để duy trì sự ổn định cho các thành phần bên trong màng Các kháng sinh tác động lên màng, làm thay đổi tính thấm của màng, gây rối loạn quá trình trao đổi chất giữa tế bào vi khuẩn với môi trường làm vi khuẩn bị tiêu diệt

 Kháng chuyển hóa (ức chế tổng hợp axit folic)

Axit folic cần cho sự tồn tại và phát triển của vi khuẩn.Các kháng sinh kháng chuyển hóa có khả năng ức cạnh tranh với enzyme làm nhiệm vụ tổng hợp và chuyển hóa axit folic Kết quả là quá trình tổng hợp và chuyển hóa axit folic bị ngưng làm cho vi khuẩn bị tiêu diệt

1.2.1.3 Phân loại thuốc kháng sinh

Có nhiều cách phân loại thuốc kháng sinh như: Phân loại theo nguồn gốc, phân loại theo hoạt phổ kháng sinh, phân loại theo mức độ tác dụng, phân loại theo cơ chế tác dụng, phân loại theo cấu trúc hóa học,…Tuy nhiên phân loại theo cấu trúc hóa học là cách phân loại thông dụng nhất vì hoạt phổ kháng sinh, mức độ tác dụng, cơ chế tác dụng và cấu trúc hóa học luôn liên quan chặt chẽ với nhau [2] Với cơ sở này, người ta phân loại thuốc kháng sinh thành các nhóm sau:

1 Kháng sinh Beta-lactam

 Cấu trúc kháng sinh nhóm beta - lactam

Tất cả các kháng sinh nhóm beta-lactam đều có vòng beta-lactam trong cấu trúc phân tử Vòng beta-lactam có cấu trúc không gian hoá học 4 cạnh gồm 3 nguyên tử C và một nguyên tử N

Hình 1.2 Cấu trúc của vòng beta-lactam

 Cơ chế tác dụng của kháng sinh nhóm beta-lactam

Vi khuẩn tổng hợp vách tế bào cần enzyme transpeptidase, xúc tác tạo các liên kết chéo trong hệ thống peptidoglycans cấu tạo vách tế bào Kháng sinh nhóm beta-lactam gắn được vào vị trí hoạt động của transpetidase này nên ức chế quá trình tổng hợp vách tế bào vi khuẩn, từ đó vi khuẩn dễ dàng bị tiêu diệt

 Phân loại kháng sinh nhóm beta-lactam

Gồm 2 phân nhóm chính: penicillins và cephalosporins [8]

+ Cephalosporin

Lịch sử, cấu tạo

Năm 1948, Abraham và cộng sự phân lập từ môi trường nuôi cấy nấm

Cephalosporinum aeremonium thu được cephalosporin có hoạt tính kháng

khuẩn yếu nên không được dùng trong điều trị Các cephalosporin hiện đang dùng là các chất bán tổng hợp từ 7-amino-cephalosporin Cấu trúc vòng 7ACA cũng dễ bị cephalosporinase phá hủy làm mất tác dụng kháng khuẩn

Cấu trúc chung của kháng sinh cephalosporin gồm 2 vòng: vòng lactam 4 cạnh gắn với một dị vòng 6 cạnh Khi thay đổi các gốc R được các cephalosporin có độ bền, tính kháng khuẩn và dược động học khác nhau

beta-Hình 1.3 Cấu trúc chung của cephalosporin

Bảng 1.1 Một số kháng sinh thuộc nhóm Cephalosporin

Thế hệ 1

Cefazolin, Cephalothin, Cephalexin, Cefadroxil, Cefaloridine, Cefalotin, Cefapirin, Cefazedone, Ceftezole…

Thế hệ 2 Cefuroxime, Cefaclor, Cefamandole, Cefamycins

Thế hệ 3

Cefoxime, Ceftriaxone, Cefpodoxime, cefodizime, Ceftizoxime, Ceftazidime…

Thế hệ 4 Cefepime, Cefpirome, Cefquinome, Cefozopran

Thế hệ 5 Cefbiprole, Ceftaroline fosamil

Trong khuôn khổ nghiên cứu của đề tài, nhóm nghiên cứu tập trung nghiên cứu phát hiện gen và phân tích mức độ tương đồng gen kháng Cephalosporin là nhóm kháng sinh được sử dụng để điều trị bệnh do vi khuẩn

E coli gây ra

1.2.2 Khả năng kháng kháng sinh của vi khuẩn

1.2.2.1 Hiện tượng kháng thuốc kháng sinh của vi khuẩn

Kháng thuốc kháng sinh là nói đến khả năng của vi khuẩn chống lại hiệu quả của thuốc kháng sinh Kháng thuốc xảy ra khi vi khuẩn thay đổi theo một cách mới để làm giảm hoặc loại bỏ hiệu quả của thuốc chữa bệnh Một khi kháng thuốc, vi khuẩn không chết mà vẫn tồn tại và tiếp tục nhân lên, gây

ra nhiều tác hại khác

Theo Nguyễn Vĩnh Phước (1978), một vi khuẩn của một loài nhất định được gọi là đề kháng với thuốc nếu nó có thể sống tồn tại và phát triển được trong môi trường có nồng độ kháng sinh cao hơn nồng độ ức chế sinh trưởng

và phát triển của phần lớn những cá thể khác hoặc những loài khác trong cùng một canh khuẩn [5]

1.2.2.2 Phân loại hiện tượng kháng thuốc

Nguyên nhân do kháng sinh không thể tiếp cận được đích hoặc có ái

lực yếu với đích Ví dụ: các Pseudomonas kháng kháng sinh nhóm

Macrolides, hoặc vi khuẩn Gram âm kháng Vancomycine đều là tự nhiên Đây là sự đề kháng thường xuyên và có nguồn gốc nhiễm sắc thể, ổn định và

di truyền lại cho các thế hệ con cháu (truyền dọc) khi phân chia tế bào, nhưng không truyền từ vi khuẩn này sang vi khuẩn khác (truyền ngang)

 Đề kháng thu được

Đề kháng thu được là khả năng đề kháng một hay nhiều kháng sinh do biến cố di truyền mà vi khuẩn từ chỗ không có trở thành có gen đề kháng Những đề kháng thu được có thể là do:

- Đột biến trên NST: qua các thử nghiệm sao chép đĩa của Lederberg (1952) có thể giải thích được vi khuẩn đề kháng thuốc là do đột biến

- Nhận được gen đề kháng qua các hình thức vận chuyển di truyền như: tiếp hợp khi hai vi khuẩn tiếp xúc trực tiếp với nhau, biến nạp khi vi khuẩn bị

ly giải và giải phóng ra ADN tự do hoặc tải nạp nhờ phage hoặc do một thành phần di truyền di động (transposons)

Cơ chế sinh hóa của sự đề kháng thu được

- Làm giảm tính thấm của màng nguyên tương

- Làm thay đổi đích tác động

- Làm cho kháng sinh thoát ra ngoài màng tế bào vi khuẩn quá mức

- Tạo ra các enzyme ức chế tác động của kháng sinh:

Cơ sở di truyền học của đề kháng thu được

 Đề kháng thu được do đột biến trên NST

Đột biến thường xảy ra ở giai đoạn sao chép các bazơ purin và pyrimidin trong quá trình tổng hợp của ADN, các ADN mới được tổng hợp sẽ không còn giống với phiên bản của ADN thế hệ trước

 Đề kháng thu được do nhận được gen đề kháng qua các hình thức

vận chuyển di truyền

Biến nạp

Là hiện tượng một phần nhỏ ADN tự do của vi khuẩn cho vào được tế bào vi khuẩn nhận, gắn vào bộ gen của vi khuẩn nhận, quyết định tính chất mới của vi khuẩn này và tính chất này có thể di truyền

Hình 1.5 Đề kháng thu được do nhận được gen nằm trên Integron

(ảnh nguồn internet)

1.2.3 Enzyme beta-lactamase

Năm 1929 chất kháng kháng sinh đầu tiên được phát hiện là penicillin

từ loài nấm Penicillium bởi Alexander Fleming, đây cũng chính là kháng sinh

đầu tiên của nhóm beta-lactam Tuy vậy đến năm 1944 lần đầu tiên xuất hiện

S aureus kháng penicillin do sinh enzyme penicilinase Sau đó vào những

năm 1948 đến năm 1956 các cephalosporin thế hệ đầu tiên được nghiên cứu

và đưa vào sử dụng gọi là cephalosporin thế hệ 1 [11]

Năm 1961 thế hệ penicillin phổ rộng đầu tiên là ampicillin được ra đời

có tác dụng điều trị với cả trực khuẩn Gram âm và cầu khuẩn Gram dương Chỉ vài năm sau, vào năm 1963 tại Athens Hy lạp từ máu một bệnh nhân tên

là Temoneria người ta phân lập được chủng E coli kháng ampicillin có sinh

loại enzyme beta-lactamase và lấy luôn tên bệnh nhân đặt tên cho enzyme này

là TEM-1 [24], [42]

Năm 1965, người ta phát hiện ra TEM-2 là do TEM-1 biến đổi một axit amin Nhờ TEM-1 và TEM-2 đã làm cho vi khuẩn Gram âm kháng lại các penicillins, ampicillin và cephalosporin thế hệ 1 trong một thời gian dài sau

đó, như các thông báo về N gonorrhoeae kháng pencicllin, H influenzae và

Shigella spp đề kháng kháng sinh vào những năm 1971 – 1973 ở Châu Á và

nhiêu nơi trên thế giới [24], [42]

Cho đến năm 1974 chủng K pneumoniae có gen mã hóa enzyme

lactamase trên plasmid được phát hiện, enzyme này có nhiều thay đổi về axit amin so với TEM-1 và TEM-2 nên đặt là SHV-1 (Sulphyrul Variable) Như vậy vi khuẩn đã có TEM-1, TEM-2 và SHV1 nên các penicillins, cephalosporins thế hệ 1 đã bị kháng lại rất nhiều [42]

Đầu những năm 1980 thì các kháng sinh bate-lactam phổ rộng như cephalosporin thế hệ 2, thế hệ 3 và monobactams được đưa vào điều trị các vi khuẩn kháng thuốc Sự ra đời các kháng sinh beta-lactam mới này đặc biệt là cephalosporins thế hệ 3 đã là thành công của các nhà khoa học trong cuộc chiến đấu dài lâu với vi khuẩn gây bệnh có TEM-1, TEM-2, SHV-1 Nhưng

rồi có một loại enzyme beta-lactamase có khả năng phân hủy cephalosporins

thế hệ 2, cephalosporins thế hệ 3 và monobactams có nguồn gốc do TEM-1, TEM-2, SHV-1 đột biến thay đổi một số axit amin gọi là ESBL đã xuất hiện [42]

Năm 1983, ở Đức đã phát hiện chủng K ozaenae sinh enzyme

beta-lactamase phân hủy cefotaxime được đặt tên là SHV-2, đây là trường hợp sinh ESBL đầu tiên được ghi nhận Năm 1984 đến 1987 tại Pháp đã phát hiện

chủng K pneumoniae có gen mã hóa ESBL trên plasmid kháng cefotaxime

đặt tên là CTX-1 Cũng vào những năm 1986 ở Nhật Bản Masumato và năm

1989 ở Đức, Bauernfein phát hiện E coli sinh ESBL kháng cefotaxime không

phải TEM và SHV nên đặt tên là CTX-M-1 Đáng ngai là CTX-M có khả năng phân hủy hầu hết cephalosporins thế hệ 3 và cả cephalosporins thế hệ 4 [34], [42]

Như vậy, với việc sử dụng các kháng sinh nhóm beta-lactam ngày càng nhiều đặc biệt là các cephalosporin thế hệ 3 (oxyimino-beta-lactam) và có nhiều ESBL được mã hóa qua R-plasmid nên ngày càng làm gia tăng tỉ lệ lẫn chủng loại ESBL trong đó có các ESBL ngoài TEM, SHV, CTX-M như OXA-, PER-, VEB…Đến nay các ESBL mới vẫn tiếp tục được tìm thấy Điều này cảnh báo một nguy cơ gia tăng vi khuẩn kháng kháng sinh và hết kháng sinh điều trị trong một tương lai gần

Hiện nay các nghiên cứu trên thế giới đã biết đến hơn 200 loại ESBL Những enzyme này được nhiều nhà khoa học phân loại theo các cách khác nhau và phức tạp Tuy vậy có hai hệ thống phân loại chính được sử dụng rộng rãi trên toàn thế giới là hệ thống phân loại của Ambler R P và hệ thống phân loại của nhóm tác giả Bush Karen , Jacoby G A và Medeiros A A Ambler chia các beta-lactamase thành 4 lớp: A, B, C và D, một số beta-lactamase lớp

A và D được gọi là ESBL [33], [43], [46]

Type TEM – (ESBL) lớp A

Từ các TEM ban đầu do đột biến thay đổi vị trí các axit amin tạo thành các enzyme mới, ESBL mới có cấu trúc thay đổi kể cả có sự thay đổi các mức

độ ảnh hưởng đối với chất ức chế Hiện nay có trên 100 TEM (ESBL) đã tìm thấy [Boyd 2004 [46]

 Type SHV – (ESBL) lớp A

SHV-1 có sự tương đồng 68% các axit amin so với TEM-1 và có cấu trúc tương tự Cũng như nhóm TEM, SHV – (ESBL) cũng có sự thay thế 1 hay nhiều axit amin quanh vị trí hoạt hóa Có trên 50 SHV đã được biết đến Các nhóm SHV – (ESBL) thường gặp là SHV-5 và SHV-12 [42]

 Type CTX – (ESBL) lớp A

Đặc điểm nổi bật là khả năng phân hủy cefotaxime mạnh hơn khả năng phân hủy ceftazidime, các thành viên CTX-M hay gặp là CTX-M-14, CTX-M-3, CTX-M-2 [15], [42]

1.2.4 Cơ chế kháng kháng sinh của vi khuẩn E coli Một số chủng thuộc

họ vi khuẩn đường ruột có khả năng đề kháng tự nhiên với với kháng sinh nhóm beta-lactam , nó mang đặc tính di truyền bình thường của loài Nghiên cứu trên những chủng vi khuẩn họ đường ruột với các kháng sinh khác nhau trong nhóm beta-lactam cho phép ngươi ta xác định được các kiểu cách đề kháng tự nhiên khác nhau của chúng Cơ chế kháng kháng sinh của vi khuẩn

E coli sản sinh enzyme beta-lactamase là do loại enzyme này có khả năng

thủy phân các kháng sinh nhóm cephalosporin (Paterson, 2006) Theo các tác

giả Howard et al., (1996) bản chất hóa học của hiện tượng kháng thuốc là các

enzyme beta-lactam làm bất hoạt các kháng sinh nhóm beta-lactam bằng cách phá hủy mạch nối amide của vòng beta-lactam của cephalosporin Sinh

enzyme cephalosporinase nhờ gen mã hóa nằm trên NST thường gặp ở E coli

[23], [43]

Tăng cường sản xuất enzyme cephalosporinase thường gặp ở những nhóm kháng kháng sinh theo cơ chế đề kháng tự nhiên, do sinh ra enzyme cephalosporinase cảm ứng và khi có sự đột biến ở gen điều hoà trong quá trình sinh tổng hợp enzyme, nên đã tăng cường sản xuất enzyme này

Tăng cường sản xuất enzyme cephalosporinase ở loài E coli là do hậu

quả của sự khuếch đại gen hoặc do có sự thiết lập những gen điều hòa mới

Hình 1.6 Vị trí tác động của enzyme beta-lactamse 1.3 Một số nghiên về tính kháng thuốc của vi khuẩn trong và ngoài nước 1.3.1 Một số nghiên cứu trên thế giới

Trực khuẩn Gram âm đường ruột sản sinh ESBL bắt đầu xuất hiện ở Tây Âu cho đến nay đã phát hiện ở nhiều nơi trên thế giới như Mỹ, Châu Á

với những tỉ lệ khác nhau Nghiên cứu về sự ô nhiễm vi khuẩn E coli sản sinh

men ESBL có nguồn gốc động vật và sản phẩm động vật cũng đã được nhiều

nhà khoa học trên thế giới thực hiện (Li et al., 2007; Hansen et al, 2013)

Ở Mỹ, tỷ lệ vi khuẩn đường ruột sản sinh ESBL thay đổi từ 0 – 25% Theo kết quả nghiên cứu của chương trình giám sát kháng khuẩn SENTRY

năm 1997 – 1998, tỷ lệ E coli sinh ESBL là 3.3% ở Mỹ và 4.2% ở Canada

Nghiên cứu của Moland và cs vào năm (2001 – 2002) trên khắp nước Mỹ cho

biết tỷ lệ sinh ESBL ở E coli là 2.6% Ở châu Âu, vi khuẩn đường ruột sinh

ESBL cũng đã được phát hiện tại nhiều quốc gia Tại Hà Lan, một nghiên cứu

trên 11 phòng thí nghiệm vào năm 1999 cho thấy tỷ lệ E coli có sinh ESBL ở

mức độ thấp (1%) (Bradford, 2001) Tại châu Á, tỷ lệ vi khuẩn đường ruột

sinh ESBL ở mức <0,1% đối với E coli trong các nghiên cứu tại Nhật Bản (Yangi và cs., 2006), nhưng tỷ lệ E coli sinh ESBL ở một số nước khác đã ở

Beta-lactamase

mức cao cùng thời điểm, tỷ lệ phát hiện tại Trung Quốc là 24.5%, Hồng Kong

là 14.3%, và Singapore là 11.3% (Yoichi và cs., 2005), tại Thái Lan (2006)

có tỷ lệ phát hiện E coli sinh ESBL là 26.3% (Aprisarnthanarak và cs.,

2006)

Việc sử dụng kháng sinh nói chung và cephalosporin chưa được quản

lý chặt chẽ trong chăn nuôi thú y là yếu tố nguy cơ chủ yếu, ảnh hưởng tới

mức độ ô nhiễm vi khuẩn E coli sản sinh ESBL ở vật nuôi (Damborg et al.,

2012), và lây sang người (Paterson, 2005) Việc sử dụng kháng sinh nhóm cephalosporin thế hệ mới như Cefiofur và Cefquinome được cho là nguyên nhân quan trọng cho hiện tượng lây nhiễm vi khuẩn sản sinh ESBL trong thức

ăn gia súc và sản phẩm chăn nuôi (Agerso et al., 2012) Chính vì vậy, tại Đan

Mạch, các trang trại chăn nuôi lợn đã dừng sử dụng kháng sinh nhóm cephalosporin điều trị bệnh cho lợn từ năm 2010 [23]

Hiện nay những nguy cơ ảnh hưởng tới sức khỏe của người và vật nuôi

của vi khuẩn E coli sản sinh enzyme beta-lactam phổ rộng (ESBL) đang

được nhiều nhà khoa học trên thế giới quan tâm [34] và đã có rất nhiều nghiên

cứu về tỷ lệ nhiễm E coli sản sinh beta-lactam trên người (Tzelepi et al.,

2000) Kết quả nghiên cứu của tác giả Ben-Ami et al (2009) trên người mắc

bệnh tiêu hóa cho thấy có tới 339 ca (chiếm 34.5%) nhiễm chủng E coli sản

sinh ESBLs trong tổng số 983 ca mắc Theo kết quả nghiên cứu dịch tễ của

Doi et al., (2013) thực hiện tại Mỹ, có tới 107 người (chiếm 81.5%) bệnh nhiễm trùng đường tiêu hóa bị nhiễm E coli ESBLs và hiện tượng lây nhiễm

vi khuẩn E coli sản sinh ESBL hiện nay đã lan rộng sang cộng đồng dân cư

chưa từng có biểu hiện lâm sàng Tại Ấn Độ, xét nghiệm trên bệnh nhân cho

thấy enzyme ESBL được phát hiện ở 63.6% tổng số chủng E coli và 66.7% tổng số chủng K.Pneumoniae phân lập được ( Goyal et al., 2009) Tỷ lệ bệnh nhân chết do mắc vi khuẩn E coli sản sinh ESBL kháng thuốc là rất cao,

chiếm 60.8% so với 23.7% ở nhóm bệnh nhân nhiễm các chủng E coli thông

thường (Melzer and Petersen, 2007)

1.3.2 Một số nghiên cứu trong nước

Mặc dù Việt Nam là một nước Nông nghiệp và nằm trong khu vực có nguy cơ lây lan rộng rãi của ESBLs (Hawkey, 2008) nhưng số lượng những

nghiên cứu về nguồn lưu cữu vi khuẩn E coli có khả năng sản sinh men

ESBL có nguồn gốc từ vật nuôi và sản phẩm chăn nuôi (thịt, trứng, sữa), và chất thải chăn nuôi còn rất hạn chế [32], chủ yếu là các nghiên cứu bên nhân

y

Năm 1999, các tác giả Nguyễn Việt Lan, Võ Thị Chi Mai và Trần Thị Thanh Nga đã khảo sát 1228 mẫu vi khuẩn đường ruột tại bệnh viện Chợ Rẫy,

kết quả có 4.3% E coli sinh ESBL Năm 2005, tác giả Hoàng Kim Tuyến và

cộng sự khảo sát các vi khuẩn sinh ESBL, kết quả cho thấy có 17.8% vi

khuẩn sinh ESBL, trong đó tỷ lệ sinh ESBL ở E coli là 17.7% Khi nghiên

cứu từ tháng 10 cho đến tháng 12 năm 2006 tại bệnh viện trung ương Huế, tác giả Mai Văn Tuấn cho kết quả: tỷ lệ sản sinh ESBL là 30.4% (65/214 chủng)

và 27 chủng E coli phân lập sinh ESBL [9] Tác giả Hoàng Thị Phương Dung

thực hiện nghiên cứu từ tháng 7 – 12/2008 tại bệnh viện Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh, tỷ lệ sinh ESBL là 42.4% (66/204 chủng), trong đó

tỷ lệ sinh ESBL cao nhất là E coli với 71.2% (47/66 chủng)

Theo số liệu giám sát trong năm 2012 của bệnh viện Nhiệt đới Trung

ương, tỉ lệ kháng Ampicilin của E coli lên tới 81,4%, kháng

Amoxicillin/Clavunanic và Ampicillin/Sulbactam khoảng 40% Các kháng sinh nhóm cephalosporin thế hệ ba cũng bị kháng đến gần một nửa và nhóm Fluoro-quinolon cũng bị kháng khoảng 45% Tỉ lệ (%) kháng kháng sinh của

60 chủng E coli phân lập từ thực phẩm là Ampicillin (55%);

Amoxicillin/clavulanic acid (11,7%); Nitrofurantoin (10%); CS: Colistin (3,3%); Cephalexine (12,5%); Mecillinam (10%); Ceftazidime (1,7%);

Cotrimoxazole (58,63%); Gentamicin (30%); Piperacillin (13,3%);

Ciprofloxacin (8,3%); Tetracyline (53,3%) và 100% các chủng E coli nhạy

cảm với Amikacin và Netrilmicin

Ampicillin, Cotrimoxazole, và Tetracyline là 3 loại kháng sinh thường được sử dụng nhiều trong chăn nuôi Đây cũng có thể là nguyên nhân đưa đến

tỉ lệ kháng kháng sinh cao Kết quả này phù hợp với một số nghiên cứu của các tác giả khác trong nước và trên thế giới về khả năng kháng sinh của các

chủng E coli phân lập từ thực phẩm (Trần Thị Thùy Giang và cộng sự, 2014)

Theo tác giả Ba và cộng sự 100% E coli O157:H7 phân lập từ mẫu

phân của trâu bò khỏe mạnh tại Miền Trung Việt Nam kháng với Oxacillin và

Erythromycin [15] Theo tác giả Nguyễn Lan Khanh (2010), vi khuẩn E coli

phân lập từ bệnh phẩm lợn con mắc bệnh phân trắng cũng kháng với rất nhiều loại kháng sinh, trong đó 47.2% kháng với Enrofloxacin, 33.3% kháng với Ciprofloxacin, 40% kháng với Norfloxacin, 86.6% kháng với Erythromycin

Nhìn chung các kết quả nghiên cứu về nguy cơ lây nhiễm vi khuẩn kháng kháng sinh trong chăn nuôi và cộng đồng còn rất hạn chế tại nước ta Kết quả nghiên cứu của chúng tôi sẽ góp phần xây dựng cơ sở dữ liệu khoa học, làm nền tảng cho các nghiên cứu sinh học phân tử tiếp theo về gen kháng thuốc của vi khuẩn Bên cạnh đó đề tài nghiên cứu sẽ làm rõ bức tranh về con đường lây truyền và bản chất của hiện tượng kháng thuốc của vi khuẩn ở người và vật nuôi Tiến tới xây dựng các chiến lược sử dụng kháng sinh an toàn và hiệu quả, từng bước ngăn chặn nguy cơ lây lan vi khuẩn kháng thuốc

CHƯƠNG II: NỘI DUNG, VẬT LIỆU, VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nội dung nghiên cứu

- Nghiên cứu xác định tỉ lệ vi khuẩn E coli kháng kháng sinh

cephalosporin được phân lập từ chất thải người chăn nuôi và chất thải của lợn

ở Thái Bình và Sóc Sơn

- Xác định trình tự nucleotit gen kháng kháng sinh CTX-M, TEM và SHV

- Đánh giá sự tương đồng về kiểu gen kháng kháng sinh của E coli

được phân lập từ chất thải người chăn nuôi và chất thải của lợn

2.2 Vật liệu nghiên cứu

Gồm 160 chủng E coli kháng cefotaxime do Bộ môn Vệ sinh Thú y-

Viện Thú y phân lập từ chất thải của người chăn nuôi và chất thải lợn ở Sóc Sơn và Thái Bình- Là hai địa phương còn rất nhiều hộ chăn nuôi nhỏ lẻ nằm xen kẽ trong khu dân cư Số liệu các chủng được kiểm tra phát hiện gen

kháng thuốc tại mỗi địa phương được trình bày ở bảng 2.1 và hình 2.1

Bảng 2.1 Số lượng chủng E coli nghiên cứu

Địa phương lấy mẫu

Hình 2.1 Vi khuẩn E coli trên môi trường thạch

2.1.2 Hóa chất sử dụng

Agarose (Sigma)

Bộ kit tinh sạch DNA tổng số (Fermentas)

Bộ kit tinh sạch sản phẩm PCR (Fermentas)

Bộ kit dùng cho phản ứng PCR (Roche)

Các mồi cho phản ứng PCR đặt của (Sigma)

Công nghệ Việt Nam được sử dụng để thực hiện nghiên cứu, danh mục theo

Bảng 2.2

Bảng 2.2 Các thiết bị sử dụng cho nghiên cứu

Ly tâm

Pipetman 10µl, 20 µl, 100 µl, 200

Các phần mềm tin sinh học được sử dụng trong nghiên cứu này và chức

năng của chúng được liệt kê theo Bảng 2.3

Bảng 2.3 Phần mềm sử dụng Phần

BioEdit Kiểm tra chất lượng trình tự và

so sánh trình tự

http://www.mbio.ncsu.edu/bioe dit/bioedit.html

BLAST So sánh trình tự với gen chuẩn

công bố trên ngân hàng gen http://www.ncbi.nlm.nih.gov/

MEGA6 Dựng cây phát sinh của các gen

và một số ứng dụng khác http://www.megasoftware.net/

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Tách chiết ADN tổng số của vi khuẩn E coli

ADN tổng số của mỗi chủng E coli cần kiểm tra được tách chiết bằng

cách sử dụng phương pháp tách DNA được mô tả bởi tác giả Sambrook và cs

1989 [35] quy trình tách được tóm tắt như sau:

- Thu sinh khối vi khuẩn vào ống eppendorf bằng cách ly tâm 6000 v/p trong

10 phút ở 4oC

- Bổ sung dH2O để rửa sinh khối, ly tâm 6000v/p trong 10 phút ở 4oC

- Bổ sung 400 µl Lysis buffer, vortex đều

- Bố sung 50 µl lysozyme 10 mg/ml, ủ ở 37oC trong 30-45 phút

- Bổ sung 20 µl proteinase K ủ ở 56oC trong 1 giờ

- Bổ sung C:I (24:1) với tỷ lệ 1:1 (v:v), vortex, ly tâm 12000 v/p trong 15 phút

ở 4oC

- Hút phần dịch nổi phía trên sang ống eppendorf mới

- Bổ sung isopropanol với tỉ lệ 1:1 về thể tích, ủ ở 4oC qua đêm

- Ly tâm 12000 v/p trong 15 phút ở 4oC, thu tủa

- Bổ sung ethanol 100% tỷ lệ 1:1 (v:v)

- Ly tâm 12000v/p trong 15 phút ở 4oC, thu tủa, rửa tiếp bằng ethanol 70%

- Làm khô chất kết tủa

- Hòa trong 30µl TE, bảo quản ở tủ lạnh 4oC

2.2.2 Nhân đoạn gen kháng kháng sinh của E coli bằng phản ứng PCR

Phản ứng PCR (Polymerase Chain Reaction) là một phản ứng sinh hoá phụ thuộc nhiệt độ, sử dụng đặc điểm của quá trình sao chép ADN với sự tham gia của một loại enzyme DNA polymerase chịu nhiệt, có 2 đoạn ngắn ADN một sợi làm mồi và dùng các đoạn ADN mạch đơn làm khuôn để tổng hợp nên sợi mới bổ sung với nó Vì vậy để khởi đầu quá trình tổng hợp ADN cần cung cấp đoạn mồi oligonucleotit (có độ dài từ 6 – 30 nucleotit) Đoạn này gắn kết với ADN khuôn tại điểm khởi đầu sao chép, và được enzyme DNA polymerase điều khiển để tổng hợp nên một sợi ADN đặc thù Các sợi ADN mạch đơn làm khuôn được tạo ra theo cách đơn giản là nâng nhiệt độ lên trên 900C (92 – 980C) mà thường là 940C cho chuỗi xoắn kép ADN bung

ra

Cả 2 sợi ADN đều được dùng làm khuôn cho quá trình tổng hợp nếu các đoạn mồi (gọi là oligonucleotit hay primer) được cung cấp để bám vào vị trí tương ứng cho cả 2 sợi Trong kỹ thuật PCR, các đoạn mồi được chọn nằm ở

2 đầu đoạn ADN cần nhân lên, sao cho các sợi ADN tổng hợp mới được bắt đầu tại mỗi đoạn mồi và kéo dài về phía đoạn mồi nằm trên sợi kia, cho sản phẩm có độ dài nằm giữa 2 đoạn mồi này Độ dài của sản phẩm PCR có thể từ vài trăm cho đến hàng ngàn, thậm chí hàng chục ngàn cặp nucleotit Như vậy, sau mỗi chu kỳ, các điểm bám cho các đoạn mồi lại xuất hiện trên mỗi sợi ADN mới được tổng hợp Hỗn hợp phản ứng lại được nâng nhiệt độ lên thích hợp sao cho các sợi ban đầu tách khỏi sợi mới tổng hợp, các sợi này sau đó được dùng làm khuôn cho chu kỳ tiếp theo, bao gồm các bước: gắn mồi, tổng hợp ADN và tách rời các đoạn

Kết quả cuối cùng của phản ứng PCR là sau n chu kỳ của phản ứng, tính theo lý thuyết, ta sẽ có 2n bản sao các phân tử ADN mạch kép nằm giữa 2

đoạn mồi (Hình 2.2) Như vậy, kết quả là một đoạn ADN định trước được

“nhân lên” với một lượng rất lớn Ví dụ sau 30 chu kỳ số lượng bản sao ADN của PCR sẽ là 230 = 1.073.741.824

hệ gen là đủ Tuy nhiên ngày nay trong nhiều trường hợp, phản ứng PCR có thể nhân các đoạn ADN chỉ từ một phân tử ADN riêng lẻ

Thành phần chủ yếu của phản ứng PCR bao gồm:

- ADN làm khuôn

- Hai đoạn mồi để xác định các điểm bắt đầu tổng hợp ADN (primer)

- Enzyme chịu nhiệt DNA - polymerase (hiện nay được dùng phổ biến nhất là

Taq, chiết xuất từ vi khuẩn chịu nhiệt Thermus aquaticus)

- Hỗn hợp của tất cả 4 tiền chất deoxynucleotit (ở dạng dNTP)

- Môi trường đệm cung cấp ion Magie (Mg++)

- Nước tinh khiết (không có DNAase; RNase v.v )

- Dung tích tổng số cho một phản ứng PCR là 50 l hoặc 25 l

- Có 3 giai đoạn (ba bước điều chỉnh nhiệt độ) cho 1 chu kỳ

Bung liên kết của ADN (Denaturation): Được thực hiện ở nhiệt độ 90C

- 98C trong vài giây đến vài phút Tại nhiệt độ này, các phân tử ADN mạch kép sẽ bị tách ra tạo nên các sợi đơn dùng để làm khuôn cho các đoạn mồi bám vào và enzyme RNA Polymerase xúc tác tổng hợp

Mồi bám (hay còn gọi là ủ với mồi – Annealing) Sau bước 1, ngay lập tức, nhiệt độ được hạ xuống 37 – 68°C để các đoạn mồi bám vào với các trình

tự bổ sung tương ứng trên các phân tử ADN làm khuôn

Tổng hợp (hay còn gọi là kéo dài – Extension): Nhiệt độ ngay lập tức được nâng lên 68°C – 72°C (thông thường 72C) trong vài chục giây đến vài chục phút để các sợi ADN vừa được tổng hợp xoắn vào nhau tạo nên ADN sợi kép, chính là sản phẩm PCR

Hình 2.3 Các bước của một chu kì PCR

Cứ như vậy, phản ứng xảy ra trong 25 – 40 chu kỳ và tiếp tục cho đến chu kỳ cuối cùng Sau chu kỳ cuối, nhiệt độ được duy trì ở 720C trong 5 –10 phút sao cho tất cả các sợi đơn ADN có trong phản ứng xoắn lại tạo nên sản phẩm PCR Cuối cùng, nhiệt độ hạ xuống 40C để bảo quản sản phẩm

PCR các mẫu đã tách được DNA

Lấy 1 µl ADN tổng số của từng chủng được sử dụng cho phản ứng PCR

Phương pháp PCR đa mồi phát hiện genTEM và SHV

Các cặp gen mồi dùng cho nghiên cứu được trình bày ở bảng 2.4

Phản ứng PCR thực hiện với nguyên lý cơ bản trên hệ thống luân nhiệt với thành phần các chất có trong phản ứng PCR bảng 2.5 và chu trình nhiệt bảng 2.6

Kiểm tra hiệu quả quá trình khuếch đại và kích thước sản phẩm PCR trên gel agarose 1% và nhuộm bằng Ethidium bromide

Phương pháp PCR đơn mồi phát hiện gen CTX-M

Các bước tiến hành tương tự quy trình phía trên, chí có một chi tiết thay đổi là 30 chu kỳ (940C/ 1 phút - 580C/1 phút - 720C/1 phút)

Bảng 2.4 Các cặp gen mồi để phát hiện các gen kháng kháng sinh TEM,

SHV and CTX-M (Hasman et al 2005)

m PCR

Nhiệt độ ở chukỳbiếntính

Các bước của phản ứng PCR Nhiệt độ Thời gian Chu kỳ

Biến tính ban đầu

Biến tính

30Gắn mồi

50oC (60oC)