Nghiên cứu phương pháp phân tích nồng độ estriol ở người bằng phương pháp huỳnh quang

Khái niệm và vài nét lịch sử Một microarray protein hoặc protein chip là một phương pháp thông lượng cao được sử dụng để theo dõi các tương tác và hoạt động của protein, và để xác định,

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI

ĐÀM THỊ HÀ

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH

NỒNG ĐỘ ESTRIOL Ở NGƯỜI BẰNG PHƯƠNG PHÁP HUỲNH QUANG

Chuyên ngành: Hóa học phân tích

Mã số: 60440118

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC HÓA HỌC

Người hướng dẫn khoa học: TS Tạ Văn Thạo

HÀ NỘI, 2016

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan bản luận văn này là kết quả nghiên cứu của cá nhân tôi Các số liệu và tài liệu được trích dẫn trong luận văn là trung thực Kết quả nghiên cứu này không trùng với bất cứ công trình nào đã được công bố trước đó

Tôi chịu trách nhiệm với lời cam đoan của mình

Hà Nội, tháng 6 năm 2017

Em xin trân trọng cảm ơn các Thầy Cô giáo trong Bộ môn Hoá Phân tích

- Trường Đại học Sư phạm Hà Nội đã giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho em trong suốt quá trình học tập

Em xin chân thành cảm ơn các em sinh viên trong phòng thí nghiệm tổ

bộ môn Hóa phân tích - Trường Đại học Sư phạm Hà Nội đã nhiệt tình giúp

đỡ hỗ trợ em

Cuối cùng, em xin chân thành cảm ơn các anh chị, các bạn cao học K25 Hóa Phân tích, bạn bè và người thân đã ủng hộ và động viên em hoàn thành luận văn này

Hà Nội, tháng 6 năm 2017

Học viên

Đàm Thị Hà

MỞ ĐẦU

I LÍ DO CHỌN ĐỀ TÀI

Estriol (E3), hoặc oestriol, còn được gọi là 16α-hydroxyestradiol hoặc estra-1,3,5 (10) -triene-3,16α, 17β-triol; là một estrogen steroid tự nhiên và là một trong ba dạng estrogen chính trong cơ thể con người Ở phụ nữ không mang thai buồng trứng gần như không sản xuất Estriol, tuy nhiên lại tăng cao ở phụ nữ mang thai Estriol có thể đo được trong máu hoặc nước tiểu của phụ nữ mang thai và có thể được sử dụng như một dấu hiệu của sức khỏe của thai nhi

Các nghiên cứu gần đây cũng chỉ ra mối liên hệ giữa hàm lượng của Estriol và các

dị tật bẩm sinh của thai nhi liên quan đến bất thường nhiễm sắc thể (như bệnh Down, Edwards, Patau) Việc sàng lọc các dị tật bẩm sinh (DTBS) cho thai nhi trước khi sinh thông qua định lượng chỉ số Estriol đã được tiến hành thường quy ở các nước tiên tiến, cho thấy vai trò quan trọng của Estriol đối với người mang thai

Trong những thập niên gần đây, phân tích hóa sinh đã trở thành một trong những lĩnh vực nghiên cứu bùng nổ, minh chứng rõ nhất là các báo cáo khoa học liên quan đến lĩnh vực này luôn có số lượng lớn nhất Các nghiên cứu cũng chỉ ra những tiến bộ vượt bậc trong việc nâng cao độ nhạy, độ chính xác, độ đặc hiệu của phép phân tích từ cấp độ nguyên tử, phân tử, đại phân tử đến tế bào, cho phép ứng dụng không chỉ trong lĩnh vực y học mà còn có ứng dụng rộng rãi trong các lĩnh vực khác như hóa học, môi trường hay thực phẩm Trong đó, protein chip là một hướng nghiên cứu mới, có tiềm năng trong tương lai, giúp các phép phân tích trở nên đơn giản, gọn nhẹ, tiết kiệm mà vẫn chính xác Các Protein chip đang sẵn sàng trở thành một trong những công cụ mạnh mẽ nhất trong lĩnh vực sinh học quy mô lớn vì tiềm năng to lớn của chúng trong nghiên cứu cơ bản, chẩn đoán và khám phá dược phẩm Việc chế tạo các Protein chip phụ thuộc rất nhiều vào kỹ thuật cố định các phân tử thu lên bề mặt đế (điện cực, màng hay các giếng polymer), các kỹ thuật này quyết định trực tiếp đến độ nhạy, độ bền, độ lặp lại của phép phân tích Trong 3 kỹ thuật cố định phổ biến hiện nay gồm: 1) liên kết hóa học, 2) tương

còn lại là đơn giản Hơn nữa, việc lựa chọn kỹ thuật dò trong chế tạo Protein chip cũng đóng vai trò quan trọng quyết định đến độ nhạy của chip Phương pháp đo phổ huỳnh quang được xem là phương pháp có độ nhạy và độ chính xác cao, các nghiên cứu gần đây cho phép việc ứng dụng các phân tử phát huỳnh quang trong đánh dấu các phân tử thu trở nên dễ dàng và thuận lợi hơn nhiều Vì vậy việc áp dụng phổ huỳnh quang trong phân tích sinh hóa ngày càng được các nhóm nghiên cứu quan tâm

Với những lí do trên chúng tôi lựa chọn đề tài “Nghiên cứu xây dựng phương pháp phân tích nồng độ Estriol ở người bằng phương pháp huỳnh quang”

II MỤC ĐÍCH NGHIÊN CỨU

Mục đích của đề tài này bao gồm:

1) Tìm ra điều kiện tối ưu để cố định kháng thể Estriol lên bề mặt giếng polystyren theo phương pháp hấp phụ vật lý

2) Ứng dụng phân tích uE3 trên các mẫu chuẩn và mẫu thật dựa trên việc đo tín hiệu huỳnh quang của kháng thể dò

III ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

- Kháng thể Estriol và bề mặt giếng polystyrene

- Mẫu máu của thai phụ ở thai kỳ hai

IV PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

- Phương pháp thu thập, phân tích số liệu: Tổng quan, phân tích các tài liệu khoa học có liên quan đến vấn đề nghiên cứu

- Phương pháp thực nghiệm: Phương pháp thu thập mẫu, tách triết mẫu; phương pháp đo phổ huỳnh quang…

- Phương pháp quan sát: Được vận dùng thường xuyên trong suốt quá trình nghiên cứu đề tài

- Phương pháp phân tích tổng hợp và đánh giá

V NHIỆM VỤ NGHIÊN CỨU

- Nghiên cứu phương pháp cố định kháng thể lên bề mặt polystyren của giếng

- Xây dựng quy trình phân tích nồng độ kháng thể được cố định dựa trên phương pháp huỳnh quang

- Ứng dụng phân tích nồng độ Estriol ở thai phụ

CHƯƠNG I TỔNG QUAN

I.1 TỔNG QUAN VỀ PROTEIN CHIP

I.1.1 Khái niệm và vài nét lịch sử

Một microarray protein (hoặc protein chip) là một phương pháp thông lượng cao được sử dụng để theo dõi các tương tác và hoạt động của protein, và để xác định, định lượng và phân tích chức năng của protein trong nghiên cứu cơ bản và trên quy mô lớn[19] Ưu điểm chính của nó là ở chỗ số lượng lớn các protein có thể được theo dõi song song Chip bao gồm một bề mặt hỗ trợ như một tấm kính trượt, màng nitrocellulose, hạt hoặc tấm microtitre, mà một mảng protein được gắn

cố định ràng buộc [17] Các phân tử protein, thường được dán nhãn với thuốc nhuộm huỳnh quang, được thêm vào mảng Bất kỳ phản ứng nào giữa đầu dò và protein cố định phát ra tín hiệu huỳnh quang được đọc bởi máy quét laze [18] Các phân tử protein cực nhanh, tự động, tiết kiệm, và rất nhạy cảm, tiêu thụ một lượng nhỏ các mẫu và thuốc thử [20] Khái niệm và phương pháp của các mô hình protein chip lần đầu tiên được giới thiệu và minh hoạ trong các mô hình kháng thể

- kháng thể (còn gọi là ma trận kháng thể) vào năm 1983 trong một ấn bản khoa học [3] và một loạt các bằng sáng chế [24] Công nghệ thông lượng cao đằng sau protein chip tương đối dễ phát triển vì nó được dựa trên công nghệ phát triển cho các mô hình ADN, [7] đã trở thành các vi phân được sử dụng rộng rãi nhất

I.1.2 Cấu tạo chung của protein chip

Cấu tạo chung gồm 4 phần cơ bản là bề mặt rắn( chất nền hay giếng), phần cố định, mẫu và đầu dò

Hình I.1 Cấu tạo của Protein chip

Bề mặt rắn đã được lựa chọn sau đó được phủ một lớp phủ phải đáp ứng các chức năng đồng thời của việc giữ ổn định protein, ngăn ngừa sự biến tính của protein, định hướng protein theo hướng thích hợp để có thể tiếp cận các vị trí liên kết và cung cấp môi trường ưa nước, trong đó phản ứng liên kết có thể xảy ra Ngoài ra, bề mặt rắn cần phải tương thích với các hệ thống phát hiện khác nhau Các tác nhân cố định bao gồm các lớp nhôm hoặc vàng, polyme ưa nước, và gel polyacrylamide, hoặc xử lý các amin, aldehyde hoặc epoxy Các công nghệ màng

Phần cố định

Đầu dò

Mẫu

Chất nền

mỏng như lắng đọng hơi vật lý (PVD) và lắng đọng hóa học (CVD) được sử dụng

để phủ lớp phủ lên bề mặt đỡ

Môi trường nước là điều cần thiết ở tất cả các giai đoạn sản xuất mảng và hoạt động để ngăn chặn sự biến đổi protein Do đó, bộ đệm mẫu chứa một lượng glycerol cao (để hạ điểm đóng băng) và độ ẩm của môi trường sản xuất được điều chỉnh cẩn thận Microwells có lợi thế kép là cung cấp một môi trường nước trong khi ngăn ngừa sự lây nhiễm chéo giữa các mẫu

Để đạt được sự gắn chặt protein bề mặt chip và bền vững, trong khi giữ lại hoạt động và chức năng của các protein, một số nhóm nghiên cứu đã tạo ra những phản ứng cộng hóa trị trên kính có thể liên kết cộng hóa trị với các protein [29, 15, 30] Nói chung, một liên kết chéo bifunctional được sử dụng để thay đổi bề mặt chip; những liên kết chéo này có một nhóm chức năng phản ứng với các nhóm hydroxyl trên bề mặt rắn và một chất khác có thể phản ứng trực tiếp với các nhóm amin của các protein mong muốn (ví dụ: aldehyde, epoxy, hoặc NHS-ester nhóm) hoặc có thể thay đổi về mặt hóa học để đạt được độ đặc hiệu tối đa [16, 11] Một

bề mặt chip cụ thể có thể được dẫn xuất bằng một liên kết chéo chức năng hoặc kết hợp các liên kết chéo chức năng khác nhau để cải thiện khả năng liên kết protein, [22]

b Phần cố định

Các phần cố định được gắn trên bề mặt rắn có thể là kháng thể, kháng nguyên, aptamers (các phối tử gốc nucleic), các chất affibodies (các phân tử nhỏ được thiết kế để bắt chước các kháng thể đơn dòng) hoặc các protein dài Các phần

cố định này được lựa chọn hết sức cẩn thận để khi gắn lên bề mặt rắn, chúng không

bị biến tính và duy trì tính đặc hiệu của protein gắn vào chúng

Protein rất nhạy cảm với những thay đổi trong môi trường vi mô Điều này thể hiện một thách thức trong việc duy trì mảng protein trong điều kiện ổn định trong một khoảng thời gian dài Các phương pháp liên quan đến việc tổng hợp các protein trên chip khi được yêu cầu, trực tiếp từ ADN sử dụng các hệ thống biểu hiện protein không có tế bào Vì ADN là phân tử có độ ổn định cao nên nó không

bị biến đổi theo thời gian và do đó thích hợp để lưu trữ lâu dài Cách tiếp cận này cũng thuận lợi ở chỗ nó tránh được sự tốn kém của quá trình lọc protein riêng biệt

và nhân bản ADN vì các protein được tạo ra và cố định cùng một lúc trên bề mặt chip Các ví dụ về các kỹ thuật tại chỗ là PISA (protein tại chỗ), NAPPA (mảng protein lập trình nucleic) và DAPA (mảng ADN đến mảng protein)

c Đầu dò

Các phương pháp dựa trên phát hiện huỳnh quang thường được ưa chuộng để phát hiện vì chúng rất đơn giản, an toàn, nhạy cảm và mang lại độ phân giải cao [23] Thông thường, một con chip được kiểm tra trực tiếp bằng một phân tử được đánh dấu bằng huỳnh quang hoặc được thăm dò theo hai bước, bằng cách sử dụng đầu dò được gắn nhãn (ví dụ biotin) sau đó có thể được phát hiện trong bước thứ hai sử dụng một chất phản ứng ái lực huỳnh quang (ví dụ: Streptavidin), hoặc bằng cách sử dụng các kháng thể huỳnh quang cụ thể Các phương pháp phát hiện khác cũng có thể được sử dụng Ví dụ, ELISA đã được sử dụng để phát hiện các protein trên cả mảng tráng nitrocellulose [2, 13] và mảng kính [6] Ge et al [5], và Zhu et

al [29], đã từng sử dụng việc ghi nhãn đồng vị để nghiên cứu sự tương tác protein, protein-DNA, và protein-thuốc trên mảng tráng ni-trocellulose, cũng như

protein-sự tương tác kinase-chất nền trong nanowells

Các protein chip có thể phân thành hai loại, tùy thuộc vào ứng dụng của chúng: các phân tử protein chip phân tích và các tế bào vi phân protein chip chức năng

Các protein chip phân tích sử dụng các phân tử có đặc điểm tốt mà đã biết các hoạt động cụ thể như các đầu dò cố định, như các kháng thể, các phức hợp peptit-MHC, hoặc các lectins Nó đã trở thành một trong những nền tảng phát hiện

đa kênh mạnh mẽ nhất và có thể được sử dụng để giám sát biểu hiện protein, nhận biết biomarker, đánh dấu bề mặt tế bào / mô hình glycosyl hóa, chẩn đoán lâm sàng hoặc phân tích an toàn môi trường / thực phẩm.[22]

Chip protein chức năng được xây dựng bằng cách cố định số lượng lớn các protein tinh chế trên bề mặt rắn [9] Thường thì các protein cố định này không được đặc trưng tốt Nhiều protein khác nhau, hoặc thậm chí là tổng số protome của một cơ thể, được phát hiện riêng trên một protein chip chức năng Các protein chip chức năng chủ yếu được sử dụng để sàng lọc các loại hoạt động của protein, bao gồm protein-protein, protein lipid, protein-DNA, protein-thuốc và protein-peptid tương tác; Để xác định các chất nền enzyme; Và để mô tả phản ứng miễn dịch.[22]

Hình I.2 Ứng dụng của Protein chip I.1.3 Các mô hình protein chip

Có ba mô hình protein chip hiện đang được sử dụng để nghiên cứu các hoạt động sinh hóa của protein

Hình I.3 Các mô hình protein chip

Trong mô hình này, các protein và protein gắn kháng thể đánh dấu được đính trực tiếp vào giếng Những kháng thể này thường được phát hiện bằng các thử nghiệm phát quang hóa học, huỳnh quang vật lý hoặc colorymetric (nhuộm màu) Các peptide được gắn trên các giếng để cho phép định lượng protein của lysates mẫu

Tuy nhiên, phương pháp này thường có nhược điểm là làm biến tính các protein do quá trình đính trực tiếp lên giếng Phương pháp này cho phép xác định

sự có mặt của các protein thay đổi hoặc các chất khác có thể là kết quả của bệnh

Cụ thể, sửa đổi sau khi chuyển đổi, thường bị thay đổi do bệnh tật có thể được phát hiện.[8]

Mô hình “Protein bánh kẹp” này có ưu điểm là tính ổn định cao, triệt tiêu các cân bằng phụ, đặc biệt hữu ích trong việc so sánh biểu hiện protein trong các dung dịch khác nhau Ví dụ, phản ứng của các tế bào với một yếu tố đặc biệt có thể được xác định bằng cách so sánh các lysates của các tế bào được điều trị bằng các chất cụ thể hoặc được nuôi trong điều kiện nhất định với các lysates của tế bào kiểm soát Một ứng dụng khác là xác định và mô tả các mô bệnh

Hình B: Các protein và protein đánh dấu cạnh tranh nhau để gắn với kháng thể đính cố định trên giếng

Phương pháp này kém ổn định hơn so với mô hình “ protein bánh kẹp” dosinh ra nhiều cân bằng phụ trong quá trình cạnh tranh Tuy nhiên, nó có thể sử dụng trong phân tích các mẫu với nồng độ không cao (cỡ nano), khoảng thay đổi nồng độ hẹp, làm tăng độ phân giải Phương pháp được ứng dụng để xác định các tương tác protein-protein, protein-DNA, protein-RNA, protein-phospholipid và các phân tử protein-nhỏ khảo nghiệm hoạt động enzym và phát hiện kháng thể và chứng minh tính đặc hiệu của chúng Các protein chip này được sử dụng để nghiên cứu các hoạt động hóa sinh của toàn bộ proteome trong một thí nghiệm

I.1.5 Vai trò của protein chip

Protein chip có thể được dùng để chẩn đoán lâm sàng hoặc phân tích an toàn môi trường / thực phẩm Protein chip phân tích liên quan đến một chất phản ứng ái lực mật độ cao (ví dụ: kháng thể hoặc kháng nguyên) được sử dụng để phát hiện các protein trong hỗn hợp phức tạp Chip protein chức năng được xây dựng bằng cách cố định số lượng lớn các protein tinh chế trên bề mặt rắn, có tiềm năng rất lớn trong việc khảo sát các hoạt động sinh hóa khác nhau (ví dụ protein-protein, protein-lipid, protein-nucleic-acid và tương tác enzyme-chất nền) cũng như tương tác với thuốc và xác định ma túy

Hình I.4 Vai trò của Protein chip

I.2 TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP CỐ ĐỊNH PROTEIN

Cố định protein (hay kháng thể, antibody) là quá trình gắn các phân tử protein lên một bề mặt đế sử dụng làm các đầu thu sinh học Trong một số trường hợp nhất định, việc cố định có thể làm mất một phần hoặc toàn bộ hoạt tính của

protein vì khuynh hướng gắn ngẫu nhiên và dễ bị biến dạng cấu trúc Vì vậy, để quá trình cố định các kháng thể không làm mất hoạt tính sinh học của protein thì việc lựa chọn bề mặt và phương pháp cố định đóng vai trò quyết định Bề mặt đế cũng như quá trình cố định phải không làm ảnh hưởng đến cấu tạo và chức năng của các protein sau khi được cố định.[4]

Nhiều kĩ thuật cố định đã được phát triển trong những năm qua, chủ yếu dựa

trên ba cơ chế là: hấp phụ vật lý, liên kết hóa học và tương tác sinh học (Hình 1.3) I.2.1 Cố định hóa học

Việc cố định protein dựa trên liên kết hóa học là quá trình sử dụng các phản ứng hóa học liên kết protein với bề mặt đế Các phản ứng được lựa phải căn cứ vào các nhóm chức sẵn có của protein (-NH2, -COOH, -SH) và bề mặt đế (-OH, Au, -

NH2….)[xx] (Bảng 1.1) Các phản ứng hóa học sử dụng trong cố định protein phải

đáp ứng các yêu cầu khắt khe như: không làm ảnh hưởng đến hoạt tính của protein,

có thể phản ứng trong môi trường nước và diễn ra trong nhiệt độ thấp hơn hoặc bằng nhiệt độ phòng Việc dùng các liên kết hóa học để cố định protein giúp quá trình cố định bền và ổn định hơn, làm tăng độ lặp của phép phân tích Tuy nhiên,

do các nhóm chức dùng cho quá trình liên kết của protein được phân bố ngẫu nhiên, có nghĩa là bất cứ vị trí nào trên bề mặt protein cũng có thể tham gia vào phản ứng cố định, điều này dẫn đến việc sắp xếp các protein trên bề mặt đế là ngẫu nhiên, không theo trật tự nhất định Vì vậy, hoạt tính của các protein (đầu thu sinh

học) sẽ giảm đi đáng kể (Hình 1.3.b) Hơn nữa, Khi các nhóm chức trên bề mặt

protein tham gia phản ứng sẽ ít nhiều làm giảm hoạt tính (biến dạng, biến tính), ảnh hưởng đến độ nhạy và độ đặc hiệu của cảm biến sinh học.[21,4,28]

Bảng I.1: Các phản ứng hóa học sử dụng trong cố định hóa học

I.2.2 Cố định vật lý (Hấp phụ vật lý)

Cố định vật lý là phương pháp dựa trên tương tác hấp phụ vật lý giữa bề mặt

đế và chất cần phân tích (kháng thể) Trong phương pháp cố định vật lý, dung dịch kháng thể cố định được đưa trực tiếp lên bề mặt đế trong một khoảng thời gian nhất định để sự hấp phụ xảy ra nhờ tương tác giữa các phân tử, mà tương tác chủ yếu ở đây là các tương tác yếu như tương tác kị nước, tương tác tĩnh điện, tương tác Van der Van [4,12]

Hình I.5 Cố định vật lý

Ưu điểm của phương pháp cố định vật lý là nó đơn giản, dễ thực hiện, và nổi trội hơn cả so với hai phương pháp đã nêu trên đó là phương pháp này dựa trên cơ chế hấp phụ nên tính chất, chức năng của protein không bị biến tính trong quá trình

cố định [4]

Tuy nhiên, nhược điểm của cơ chế hấp phụ là định hướng ngẫu nhiên, sử dụng các tương tác yếu, độ bền chắc của tương tác lại bị phụ thuộc nhiều vào tính chất bề mặt đế, pH, thời gian hấp phụ và nồng độ chất phân tích (protein), các nhược điểm này làm cho protein dễ bị rửa trôi bởi một số bộ đệm hoặc chất tẩy rửa khi thực hiện phân tích các chất Ngoài ra, các vấn đề liên quan đến hiệu ứng phát tín hiệu tập trung và tín hiệu nền cao phát ra từ tương tác đặc hiệu có thể dẫn đến tính toán sai lầm của nồng độ chất phân tích Như vậy, cần phải tìm ra một loại giếng có thể đảm bảo được tính định hướng, hiệu suất gắn kết kháng thể trên bề mặt cao, khó bị mất trong quá trình sử dụng chất tẩy rửa và kháng thể sau khi cố định cũng có tính ổn định Qua quá trình nghiên cứu, chúng tôi khắc phục được nhược điểm và đã tìm ra loại giếng phù hợp được làm từ vật liệu polystiren (PS) Loại giếng làm từ vật liệu PS đảm bảo được tính đinh hướng.[14]

I.2.3 Cố định sinh học

Cố định sinh học là phương pháp cố định protein lên bề mặt đế dựa trên tương tác của các phân tử sinh học (tương tác sinh học) Trong phương pháp cố định sinh học thì bề mặt đế và protein cố định sẽ được gắn thêm các phân tử sinh học có tương tác với nhau, làm cầu nối giữa bề mặt đế và protein cố định Các tương tác sinh học thường được dùng như: protein A – kháng thể, streptavidin (STV) – biotin, ADN-ADN…[4] Các protein cố định theo phương pháp này có trật

tự sắp xếp cao, tương tác tương đối bền nên cảm biến sinh học dạng này sẽ có độ nhạy và độ lặp cao Tuy nhiên, việc cố định protein theo phương pháp này cũng có các hạn chế nhất đinh như: 1) cũng giống như phương pháp cố định hóa học, các protein cố định cũng cần được gắn thêm các phân tử sinh học khác có tương tác với bề mặt đế Việc dùng các phản ứng hóa học để gắn các phân tử sinh học sẽ làm

bề mặt protein thay đổi, giảm một phần hoạt tính 2) Việc bảo quản và lưu giữ các protein đã biến tính cũng trở nên khó khăn hơn, thời hạn sử dụng ngắnn hơn 3) Việc biến tính cũng làm tăng giá thành của sản phẩm Và, 4) Quá trình phân tích sẽ phải thực hiên qua nhiều bước, tốn thời gian phân tích hơn các phương pháp khác

Một trong các tương tác hay sử dung trong cố định sinh học là tương tác giữa streptavidin và biotin Hình 1.4 mô tả quá trình cố định Lectin-FITC thông qua tương tác của biotin-streptavidin-biotin

Hình I.6 Cô định Lectin-FITC trên bề mặt bằng biotin-streptavidin-biotin

Lectin-FITC Lectin-FITC

HO O

HO O

HO O

HO O

HO O

HO O

Sau đi đã khắc phục được nhược điểm và xem xét đến ưu điểm của các phương pháp cố định, chúng tôi đã lựa chọn phương pháp cố định sinh học để sử dụng trong quá trình nghiên cứu của mình

I.3 TỔNG QUAN VỀ uE3 VÀ CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH uE3

I.3.1 Vai trò, ý nghĩa của uE3

Estriol không liên hợp là một dạng steroid có nguồn gốc từ bào thai Estriol được sản xuất trong nhau thai từ 16 alpha- OH DHEA ( dehydroepiandrosterone), được lấy từ bào thai,có nguồn gốc từ 16 alpha - OH DHEA - S (dehydroepiandrosterone sulfate) Trong huyết thanh của thai phụ, Estriol có thể được đo ở dạng không liên hợp, uE3 Estriol cũng liên kết với Estriol sunfat và glucuronid trong gan của người mẹ Estriol do đó, tồn tại trong huyết thanh người

mẹ ở cả dạng liên hợp và không liên hợp Estriol tuần hoàn trong huyết thanh người mẹ có thời gian bán hủy từ 20-30 phút Những tác động trong việc sản sinh Estrogen ở thai nhi được nhanh chóng phán ánh qua sự thay đổi nồng độ Estriol

trong huyết thanh người mẹ

Hình I.7 Cấu tạo của Estriol

Trong suốt giai đoạn mang thai không biến chứng, nồng độ Estriol toàn phần

và không liên hợp trong cơ thể tăng lên trong suốt thai kỳ UE3 chiến khoảng 9% tất cả các dạng Estriol của thai nhi, nồng độ Estriol trong huyết thanh của người mẹ

bị ảnh hưởng bởi sự lưu thông tĩnh mạch ở hậu môn

Nồng độ estriol huyết thanh của người mẹ giảm đi khoảng một phần tư trong các trường hợp mang thai bị ảnh hưởng bởi hội chứng Down và có thể được sử dụng như là một phần của các chương trình sàng lọc đa trật tự trong thái kỳ I và thai kỳ II cùng với hCGb tự do hoặc hCG toàn phần và hAFP có hoặc không có inhibin A Mức độ cũng giảm trung bình trong các trường hợp mang thai bị ảnh hưởng bởi hội chứng Edwards và hội chứng Smith-Lemli-Opitz

Nồng độ estriol ở mẹ cũng được sử dụng để theo dõi tình trạng thai nhi trong thai kỳ Mức uE3 ở mẹ ở mức thấp trong thai kỳ I và thai kỳ II của thai kỳ được báo cáo ở trẻ sơ sinh non trẻ có cân nặng sơ sinh thấp Giảm mức độ estrogen không liên hợp hoặc tổng số đã được tìm thấy để cho thấy đau thai bào trong thời

kỳ mang thai Vì vậy, việc sàng lọc các dị tật bẩm sinh cho thai nhi trước khi sinh thông qua định lượng chỉ số uE3 đã được tiến hành thường quy ở các nước tiên tiến, cho thấy vai trò quan trọng của uE3 đối với người mang thai

I.3.2 Các phương pháp phân tích uE3

I.3.2.1 Phương pháp UV-VIS ( ELISA cạnh tranh)

ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) là một kỹ thuật phân tích sinh hóa để định lượng kháng thể hay kháng nguyên trong mẫu cần phân tích dựa vào phổ UV-VIS Hiện nay ELISA được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu trong đó có lĩnh vực y học.[10]

Trong phương pháp này, thuốc thử cần cho một Enzyme Immunoassay bao gồm: kháng thể, liên hợp enzyme-kháng nguyên và kháng nguyên tự nhiên

Về nguyên tắc, phương pháp ELISA dùng cho phân tích uE3 dựa trên nguyên tắc cạnh tranh ràng buộc giữa liên hợp enzyme-kháng nguyên và kháng nguyên tự nhiên với một số lượng giới hạn các vị trí liên kết với kháng thể Phản ứng được mô tả theo cân bằng sau:

Trong đó:

AbBtn: Kháng thể Biotin ( Biotinylated Antibody)

Ag: Kháng nguyên tự nhiên ( Native Antigen)

Enz

Ag: Liên hợp enzyme-kháng nguyên ( Enzyme- Antigen conjugate)

AgAbBtn: Phức hợp kháng nguyên và kháng thể ( Antigen- Antibody Complex)

Trong đó: StreptavidinCW: Streptavidin cố định trên giếng

Hoạt tính của enzyme trong phần gắp kết tỷ lệ nghịch với nồng độ kháng nguyên tự nhiên Bằng cách sử dụng một vài nồng độ kháng nguyên đã biết trước,

ta sẽ vẽ được một đường cong phi tuyến cho phép xác định được nồng độ của kháng nguyên cần tìm

I.3.2.2 Phương pháp sắc ký lỏng đầu dò khối phổ (LC-MS/MS)

Trong phương pháp này, mẫu phân tích thường được ly trích bằng một dung môi hữu cơ và được làm sạch bằng cách cho qua cột chiết pha rắn (nếu cần) Sau

đó dịch chiết được làm sạch và được hòa tan trong dịch pha động tiêm vào hệ thống HPLC với các đầu dò UV, PDA, FLD hoặc MS/MS Đối với đầu dò khối phổ, cấu tử ra khỏi cột được đưa vào đầu dò MS, và ở đây cấu tử được ion hóa, phân mành và được phát hiện dựa vào thông số m/z Trên cơ sở này, đầu dò MS có thể định danh và định lượng một cách dõ dàng, khẳng định về một hợp chất nào đó [1]

Hình I.8 Sơ đồ hệ thống sắc ký lỏng đầu dò khối phổ

a).Hệ thống bơm

Đặc điểm và yêu cầu của một hệ thống bơm cao áp:

- Áp suất có thể đạt tới 1000 bar

- Có thể điều chỉnh tốc độ dòng trong khoảng cách 0,01 – 10 ml/ min

- Thể tích chết nhỏ

- Trơ với dung môi của pha động

- Có thể trộn hai hay nhiều dung môi với nhau

b).Hệ thống tiêm mẫu

Đặc điểm của hệ thống tiêm mẫu:

- Có tác dụng tiêm mẫu

- Tự động ngắt khi áp suất cao

- Có thể bơm tuần hoàn

c).Buồng cột

Dùng để ổn định nhiệt độ cột và dung môi qua cột trong quá trình phân tích

Là một loại cột đặc biệt được nhồi đầy bằng các hạt nhồi ( pha tĩnh), kích thước cột: Dài (L):5-30 cm, đường kính trong: 2-5 mm, kích cỡ hạt: 1.7, 3,5, 10um.có hai loại cột thường dùng là cột pha đảo và cột pha thuận

e).Pha động

Là các dung môi hoặc hỗn hợp dung môi hữu cơ hoặc dung dịch đệm, yêu cầu:

- Độ tinh khiết cao ( ví dụ : nước/ đệm với MeOH/ACN )

- Không phản ứng với chất phân tích và pha tĩnh

- Không có bọt khí, không có bụi ( đánh siêu âm,lọc)

f).Đầu dò phổ MS

Đầu dò phổ MS được nối với đầu ra của cột sắc ký Việc phân tích khối phổ ( phân tích “ tỉ lệ khối lượng theo diện tích (m/z) của ion”) dựa trên sự bắn phá các phân tử hợp chất hữu cơ trung hòa thành các ion phân tử mang điện tích (+) hoặc phá vỡ thành các mảng ion, các gốc bằng các phân tử mang năng lượng cao ( như

va chạm electron, ion hóa học, ion hóa proton, bắn phá ion, ion hóa trường…) Ion phân tử và các mảnh ion là các phân tử có khối lượng từ đó người ta tính được số khối z=m/e ( khối lượng ion/ điện tích)

Kỹ thuật MS một lần có một số nhược điểm : không nghiên cứu được cơ chế phân mảnh, sự khác biệt giữa các đồng phâ, xác định thêm chi tiết cấu trúc hóa học, do kỹ thuật ion hóa nhẹ nên khối phổ đồ chỉ cho thấy ion phân tử… Kỹ thuật MS/MS (2 lần) khắc phục được những điểm này đồng thời tăng thêm độ nhạy, độ chính xác

Đầu dò khối phổ MS/MS hay máy đo khối phỏ hai lần liên tiếp gồm hai hệ máy khối phổ riêng biệt độc lập nhau được nối liền với nhau cách nhau bởi một buồng va chạm ( collision cell) MS đầu tiên ( tứ cực Q1)được sử dụng để cô lập

ion mẹ ( precursor ion ),ion này liền ngay sau đó sẽ bị phân mảnh tại buồng va chạm collision cell để cho ra những ion con ( product Ion ), tiếp theo MS thứ hai (

tứ cực Q2 ) sẽ phân tách những ion này Những ion mong muốn sẽ đi tới detector

và chuyển thành tín hiệu

g) Hệ thống thu nhận và xử lý dữ liệu

Là một hệ thống bao gồm hệ thống kết nối và thu nhận dữ liệu thô và phần mềm kiểm soát, điều khiển thiết bị, quá trình phân tích và tính toán, xử lý, báo cáo, kết xuất dữ liệu thô vừa thu được

Phương pháp LC – MS/MS sử dụng trong phân tích nồng độ uE3 với độ chính xác cao hơn phương pháp ELISA, sự không chính xác trong xét nghiệm là nhỏ hơn 10% [27] Tuy nhiên phương pháp này tương đối phức tạp và giá thành cao, nên khó có thể phổ biến rộng trong việc phân tích uE3

I.4.2.3 Phương pháp huỳnh quang

Về nguyên lý, phương pháp huỳnh quang phân tử trong phân tích uE3 cũng diễn ra theo cơ chế cạnh tranh giữa uE3 của mẫu và uE3 được gắn chất đánh dấu phát huỳnh quang Các quá trình của phương pháp huỳnh quang được mô tả chi tiết

theo Hình I.9a và I.9b

Hình I.9a Quá trình cố định kháng thể lên giếng

Hình I.9b Quy trình hoạt động của phương pháp huỳnh quang: a) kháng thể

cố định được cố định trên bề mặt giếng polystyrene thông qua liên kết giữa Steptavidin và biotin; b) hỗn hợp của uE3 (gắn với phân tử phát huỳnh quang) được thêm vào mẫu phân tích chứa uE3 và đưa vào giếng; c) chất đánh dấu phát huỳnh quang cho ta tín hiệu

Ưu điểm của phương pháp huỳnh quang là có độ nhạy cao, nó có thể định lượng được chất phân tích ở những nồng độ rất thấp Ngoài ra độ đặc hiệu của phương pháp này cũng rất cao vì với phương pháp huỳnh quang thì bức xạ kích thích và bức xạ dò là khác nhau [25]

Các nghiên cứu gần đây tập trung nghiên cứu gắn kháng thể dò với các phân

tử huỳnh quang có hệ số phát quang cao, một số các chất huỳnh quang phổ biến được chỉ ra trong Bảng 1.2

Bảng I.2: Một số chất huỳnh quang hay sử dụng trong cảm biến sinh học

Chất huỳnh quang Bước sóng kích thích Bước sóng phát xạ