Chính vì vậy việc phát triển cácphương pháp điều trị có hiệu quả mới cũng như việc phối hợp các phươngpháp điều trị nhằm nâng cao hiệu quả, cải thiện chất lượng sống, thời giansống thêm
Trang 1BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI
-*** -ĐÀO MẠNH PHƯƠNG
NuôI cấy hoạt hóa và đánh giá tính đáp
ứng miễn dịch của tế bào lympho tách
từ bệnh nhân ung th phổi
LUẬN VĂN BÁC SĨ NỘI TRÚ
Trang 2HÀ NỘI - 2016BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI
-*** -ĐÀO MẠNH PHƯƠNG
NuôI cấy hoạt hóa và đánh giá tính đáp
ứng miễn dịch của tế bào lympho tách
từ bệnh nhân ung th phổi
Chuyờn ngành : Húa sinh y học
LUẬN VĂN BÁC SĨ NỘI TRÚ
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC
TS Trần Huy Thịnh
Trang 3HÀ NỘI – 2016
Trang 4Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin gửi lời cảm ơn chânthành tới:
TS BS Trần Huy Thịnh, phó trưởng bộ môn Hoá sinh trường Đại học
Y Hà Nội, người hướng dẫn khoa học, người thầy đã trực tiếp chỉ bảo, tậntình truyền đạt những kiến thức, kinh nghiệm quý báu và tạo mọi điều kiệnthuận lợi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu để tôi có thể hoàn thànhluận văn này
GS TS BS Tạ Thành Văn, phó hiệu trưởng trường Đại học Y Hà Nội,trưởng bộ môn Hoá sinh, giảm đốc Trung tâm nghiên cứu gen- protein trườngĐại học Y Hà Nội, chủ nhiệm đề tài cấp bộ “Tiếp nhận và nghiên cứu pháttriển công nghệ nền tế bào miễn dịch trong điều trị ung thư từ Nhật Bản vềViệt Nam” đã giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quátrình học tập cũng như cho phép tôi tham gia thực hiện đề tài này
TS BS Nguyễn Thanh Bình, giảng viên bộ môn Sinh lý bệnh- Miễndịch trường Đại học Y Hà Nội, người thầy đã tận tình giúp đỡ, chỉ bảo, chia sẻnhững kinh nghiệm quý báu trong học tập và nghiên cứu
PGS TS Phạm Thiện Ngọc, nguyên trưởng bộ môn Hoá sinh trườngĐại học Y Hà Nội, đã giúp đỡ, tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình họctập tại bộ môn
Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới các thày cô, cán bộ giảng dạy, kỹthuật viên và y công bộ môn Hoá sinh trường Đại học Y Hà Nội, đã chỉ bảo,giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập tại bộ môn
Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới TS Trần Vân Khánh cùng toànthể cán bộ Trung tâm nghiên cứu gen- protein trường Đại học Y Hà Nội đã tậntình giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu
Trang 5giúp đỡ, cho phép tôi học tập các kỹ thuật và chia sẻ các kinh nghiệm quý báu.
Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Ban Giám hiệu, phòng Đào tạoSau đại học trường Đại học Y Hà Nội đã tạo điều kiện cho tôi được học tập vànghiên cứu
Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến các bệnh nhân và người tình nguyện
đã giúp đỡ để tôi có thể thực hiện được nghiên cứu này
Cuối cùng tôi xin ghi nhớ công ơn sinh thành, nuôi dưỡng và tình yêuthương của cha mẹ tôi, cũng như sự giúp đỡ của các anh em trong gia đình,những người đã luôn ở bên tôi, là chỗ dựa vững chắc cho tôi yên tâm học tập
và hoàn thành luận văn
Hà Nội, ngày 09 tháng 12 năm 2016
Bác sỹ nội trú
Đào Mạnh Phương
Trang 6Tôi là Đào Mạnh Phương, bác sỹ nội trú khoá 38, chuyên ngành Hoásinh y học.
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi, do chính tôithực hiện dưới sự hướng dẫn của TS Trần Huy Thịnh.Các số liệu, kết quảnghiên cứu nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bốtrong bất kỳ nghiên cứu nào khác
Hà nội, ngày 09 tháng 12 năm 2016
Người cam đoan
Đào Mạnh Phương
Trang 7AIET (Autologous Immune
Enhancerment Therapy)
Liệu pháp truyền tế bào miễn dịch tựthân
DC (Dendritic cells) Tế bào tua
ELISA (Enzyme Linked
Immunosorbent Assay)
Xét nghiệm miễm dịch gắn men
FDA (U.S Food and Drug
Administration)
Cục quản lý thực phẩm và dược phẩm Hoa Kỳ
NSCLC (non-small cell lung cancer) Ung thư phổi không phải tế bào nhỏPCR (Polymerase Chain Reaction) Phản ứng tổng hợp chuỗi
SCLC (Small Cell Lung Cancer) Ung thư phổi tế bào nhỏ
TAAs (Tumor Associated Antigens) Kháng nguyên liên kết khối u
TNF (Tumor Necrosis Factor) Yếu tố hoại tử u
Trang 10ĐẶT VẤN ĐÊ
Ung thư phổi (UTP) là bệnh có tỷ lệ mắc và tử vong hàng đầu trong sốcác loại ung thư trên thế giới Theo công bố của cơ quan nghiên cứu ung thưquốc tế (International Agency for Research on Cancer: IARC), tổ chức y tế thếgiới (World Health Orgnization: WHO) vào năm 2012, trên toàn thế giới sốbệnh nhân ung thư phổi mới mắc là khoảng 1.8 triệu và số bệnh nhân tử vong
do ung thư phổi lên tới 1.59 triệu[1] Tại Hoa Kỳ, một nước có nền y tế pháttriển, ước tính năm 2016 sẽ có tới 224390 bệnh nhân mới mắc và 158080trường hợp tử vong do ung thư phổi[2]
Tại Việt Nam, những ghi nhận về tình hình ung thư trên cả nước cũngcho thấy, UTP là một trong những loại ung thư đứng hàng đầu ở nam giới vàcũng là một trong các loại ung thư hàng đầu ở nữ giới[3], [4] Một điều đángbáo động cho các quốc gia đang phát triển như Việt Nam là trong khi tại cácnước phát triển, tỷ lệ mắc UTP đã có xu hướng giảm xuống thì tại các nướcđang phát triển, tỷ lệ mắc và tử vong do UTP ngày một tăng cao [5]
Về điều trị UTP, phương pháp điều trị phụ thuộc vào týp mô bệnh học(ung thư phổi không phải tế bào nhỏ- NSCLC hay ung thư phổi tế bào nhỏ-SCLC) và các đặc điểm khác của ung thư như giai đoạn bệnh[2] Các lựachọn điều trị bao gồm phẫu thuật, hoá trị, xạ trị và liệu pháp điều trị trúngđích Tuy nhiên, chỉ 16% bệnh nhân ung thư phổi được chẩn đoán ở giai đoạnung thư còn khu trú [2] Với các bệnh nhân chẩn đoán ở giai đoạn muộn,không còn khả năng phẫu thuật, khi đó các phương pháp hóa trị, xạ trị đượcchỉ định nhưng hiệu quả hạn chế và thường mang lại nhiều tác dụng khôngmong muốn[6] Những năm gần đây các phương pháp điều trị trúng đích rađời đem đến những bước tiến mới trong điều trị UTP đặc biệt là trong ung thưphổi không phải tế bào nhỏ (Non- Small Cell Lung Cancer: NSCLC)[7], [8]
Trang 11Tuy nhiên chi phí cho phương pháp điều trị này còn cao và sau một thời gianđiều trị, đã có các báo cáo ghi nhận hiện tượng kháng thuốc điều trị đích ởbệnh nhân trong khi các thuốc điều trị đích thế hệ sau vẫn còn trong các giaiđoạn thử nghiệm[9], [10], [11], [12], [13] Chính vì vậy việc phát triển cácphương pháp điều trị có hiệu quả mới cũng như việc phối hợp các phươngpháp điều trị nhằm nâng cao hiệu quả, cải thiện chất lượng sống, thời giansống thêm không bệnh và sống thêm toàn thể với bệnh nhân UTP là điều hếtsức có ý nghĩa.
Trên thế giới hiện nay, liệu pháp sử dụng tế bào miễn dịch đã được pháttriển để điều trị nhiều loại ung thư, bao gồm cả UTP với những kết quả banđầu hứa hẹn[14], [15], [16] Trong đó, liệu pháp sử dụng tế bào lympho T cóthẩm quyền miễn dịch (Adoptive T cell therapy) đã có những tiến bộ vượt bậc
và đang trở thành hướng tiếp cận chính, mở ra hy vọng mới trong điều trị vàgiúp cải thiện chất lượng cuộc sống của bệnh nhân[17], [18] Tuy nhiên ViệtNam vẫn chưa tiếp cận được công nghệ này
Do đó với mong muốn bước đầu tìm hiểu về liệu pháp sử dụng tế bàolympho T có thẩm quyền miễn dịch trong điều trị UTP, chúng tôi tiến hành
nghiên cứu “Nuôi cấy hoạt hóa và đánh giá tính đáp ứng miễn dịch của tế
bào lympho tách từ bệnh nhân ung thư phổi”, với 2 mục tiêu sau:
1 Áp dụng quy trình tách chiết và nuôi cấy hoạt hóa tế bào lympho tách từ bệnh nhân ung thư phổi.
2 Bước đầu đánh giá tính đáp ứng miễn dịch của tế bào lympho tách
từ bệnh nhân ung thư phổi đã hoạt hóa.
Trang 12CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1 Tổng quan chung về ung thư phổi
1.1 Khái niệm ung thư phổi:
Ung thư phổi là khối u phổi ác tính được đặc trưng bằng sự phát triển tếbào không kiểm soát ở các mô của phổi [19]
1.2 Dịch tễ học ung thư phổi
1.2.1 Trên thế giới:
UTP là loại ung thư thường gặp nhất, với khoảng 1.8 triệu bệnh nhân mớimắc trên toàn thế giới trong năm 2012, chiếm 12.9% tổng số trường hợp mớimắc các loại ung thư; trong đó 58% bệnh nhân mới được phát hiện là ở cácnước đang phát triển[1] Ở nam giới, UTP vẫn là loại ung thư có tỷ lệ mắc hàngđầu với khoảng 1.2 triệu bệnh nhân mới được chẩn đoán và tỷ lệ mắc bệnhchuẩn hóa theo tuổi cao nhất ở vùng Đông Âu và Trung Âu (53.5/ 100000nam), ở Tây Á (50.4/ 100000 nam) Tỷ lệ mắc UTP thấp hơn hẳn ở Đông Phi(2.0/ 100000 nam) và Tây Phi (1.7/ 100000 nam) UTP ở phụ nữ chủ yếu liênquan tới tiền sử phơi nhiễm với thuốc lá Do đó tỷ lệ mắc UTP của nữ ước tínhcao nhất ở Bắc Mỹ (33.8) và Bắc Âu (23.7), thấp nhất ở Tây và Trung Phi (lầnlượt là 1.1 và 0.8) [1]
Trang 13Hình 1.1 Tỷ lệ mắc và tử vong do UTP chuẩn hóa theo tuổi ở hai giới (trên
100000 người)
Globocan 2012
http://globocan.iarc.fr/old/FactSheets/cancers/lung-new.asp
Trong năm 2012 trên toàn thế giới, ung thư phổi cũng là nguyên nhân gây
tử vong hàng đầu trong số các loại ung thư, gây ra 1.59 triệu ca tử vong (chiếm19.4% trong tổng số bệnh nhân tử vong do các loại ung thư) Tỷ lệ tử vong củabệnh nhân ung thư phổi nói chung vẫn còn cao, tới 0.87[1]
1.2.2 Tại Việt Nam:
Theo Nguyễn Bá Đức, Lê Văn Quảng và cộng sự (2005), UTP là loại ungthư có tỷ lệ mắc cao nhất ở nam giới Việt Nam (30.7/ 100000 nam) và đứngthứ ba ở nữ (6.7/ 100000 nữ) [20] Kết quả ghi nhận ung thư tại 5 tỉnh, thànhphố trên cả nước giai đoạn 2001- 2005 cho thấy tỷ lệ mắc UTP tăng theo năm,
Trang 14Hà Nội có nhiều bệnh nhân được chẩn đoán UTP nhất (16079 trường hợp)[3].Theo báo cáo chương trình phòng chống ung thư giai đoạn 2002- 2008 củabệnh viện K, UTP đứng hàng thứ nhất trong các loại ung thư ở nam và đứnghàng thứ 6 trong các loại ung thư ở nữ [4] Hầu hết bệnh nhân UTP chỉ đượcchẩn đoán ở giai đoạn muộn, không còn khả năng điều trị triệt để và chỉ khoảng10- 20% bệnh nhân còn khả năng được cắt bỏ khối u [21].
tử vong vì UTP do thuốc lá[2 ] Các nghiên cứu cũng chỉ ra rằng, ngay cảnhững hút thuốc lá thụ động cũng có nguy cơ mắc UTP tăng 20- 30%[23 ],[24 ], [25 ].Mặc dù hút thuốc lá là nguyên nhân hàng đầu gây UTP, vẫn cókhoảng 15-20% những trường hợp UTP không có tiền sử hút thuốc lá đượcghi nhận[23 ]
1.3.1.2 Các nguyên nhân khác:
Những nguyên nhân khác được xác định có nguy cơ gây UTP bao gồm:khí radon, ô nhiễm không khí, các bức xạ ion hóa, phơi nhiễm nghề nghiệphay ở môi trường sống với một số hóa chất hữu cơ, kim loại (asenic,cadmium), virus, chế độ ăn, tiền sử mắc các bệnh phế quản phổi[2],[6],[25],[26], [27]
Trang 151.3.2 Cơ chế phân tử trong ung thư phổi
Các nghiên cứu ở cấp độ phân tử cho thấy, sự phát sinh, phát triển UTPdiễn ra qua nhiều giai đoạn dưới tác động của các yếu tố nguy cơ, sự mẫn cảmgen và quá trình tích lũy đột biến xảy ra trên các gen gây ung thư (oncogene)
và gen áp chế ung thư (tumor suppressor gene) Các cơ chế điều hòa gen vốnhoạt động nhịp nhàng và chặt chẽ khi bị rối loạn sẽ dẫn tới sự tăng cường hay
ức chế bất thường các gen chức năng[25],[28], [29], [30]
Ngày nay, các nhà khoa học đã phần nào giải thích được các con đườngtín hiệu phân tử nội bào liên quan đến sự kích hoạt các oncogen và bất hoạtcác gen áp chế ung thư Sự kích hoạt các oncogen thông qua các con đườngtín hiệu từ thụ thể yếu tố tăng trưởng biểu mô (EGFR) và một số thụ thểTyrosine kinase khác như MET, Her-2, c-KIT, IGF-1R, EML4-ALK Tiếp đócác tín hiệu này sẽ hoạt hóa 1 loạt các con đường RAS/RAF/MEK/MAPK,PI3K/AKT và JAK/STAT dẫn đến tế bào không ngừng tăng sinh, biệt hóa,xâm lấn, di căn và kháng lại chết tế bào (apoptosis) Bên cạnh đó, vai trò củamột số gen áp chế ung thư cũng được phát hiện như p53, RB1, CDKN2A,FHIT, RASSF1A và PTEN[29], [30], [31]
1.4 Chẩn đoán ung thư phổi
Phổi là cơ quan nằm sâu trong lồng ngực, các triệu chứng thường xuấthiện muộn và không đặc hiệu Vì vậy, nhiều bệnh nhân dù không có không cóbiểu hiện lâm sàng gì đặc biệt nhưng bệnh đã ở giai đoạn muộn, có di căn.Các biểu hiện lâm sàng có thể gặp là ho dai dẳng, ho ra máu, đau ngực, đôikhi khó thở; hoặc các biểu hiện toàn thân như gầy sút cân, sốt kéo dài; haycác dấu hiệu của các cơ quan di căn như đau đầu, đau nhức xương [24], [25],[27]
Chụp XQ phổi và đặc biệt là chụp cắt lớp vi tính lồng ngực có tiêm thuốccản quang cho phép xác định vị trí, kích thước, số lượng, mức độ xâm lấn và di
Trang 16căn sang một số vùng lân cận của ung thư Tuy nhiên cả hai phương pháp nàyđều không cho phép chẩn đoán phân biệt u lành với u ác [24], [25], [27], [32].PET Scan và PET- CT là hai phương pháp chẩn đoán hình ảnh dựa trênhoạt tính sinh học của tế bào ung thư Các tế bào ung thư phổi có khả nănghấp thu chuyển hoá glucose cao hơn các tế bào bình thường, do đó người ta
sử dụng glucose có đánh dấu phóng xạ sau đó ghi lại hình ảnh bằng các máyquét PET để phát hiện sự tích luỹ bất thường các chất phóng xạ Vì vậy, kỹthuật cho phép đánh giá được mức độ ác tính của khối u một cách tương đốithông qua độ bắt xạ, hơn nữa kỹ thuật cũng cho phép phát hiện được các dicăn của ung thư[24], [25], [32] Tuy nhiên, hiện nay chi phí cho PET Scan vàPET- CT còn khá cao nên phạm vi ứng dụng trên lâm sàng còn hạn chế, đặcbiệt ở những nước đang phát triển như Việt Nam
Mô bệnh học là tiêu chuẩn vàng để chuẩn đoán xác định ung thư Vì vậy,khi nghi ngờ UTP, các bệnh nhân cần phải làm các thăm dò xâm nhập để chẩnđoán mô bệnh Các kỹ thuật thông thường là sinh thiết qua nội soi phế quản,sinh thiết phổi xuyên thành ngực dưới hướng dẫn của siêu âm hoặc chụp cắtlớp vi tính Đôi khi, người ta có thể sinh thiết các tổn thương di căn của ungthư như hạch ngoại vi, gan hoặc xương UTP được phân loại thành ung thưphổi tế bào nhỏ (Small Cell Lung Cancer: SCLC), chiếm khoảng 20% và ungthư phổi không phải tế bào nhỏ (Non- Small Cell Lung Cancer: NSCLC),chiếm khoảng 80% Sau khi có những đánh giá về khối u, tình trạng di cănhạch và di căn xa, ung thư phổi được chia thành các giai đoạn từ 0, IA, IB,IIA, IIB, IIIA, IIIB và giai đoạn IV [33]
1.5 Điều trị ung thư phổi
Mặc dù trong nhiều năm qua, các nhà y sinh học, ung thư học đã nỗ lựcnghiên cứu về bệnh nguyên, bệnh sinh của UTP Tuy nhiên, việc điều trị UTPcho đến nay vẫn còn rất nhiều khó khăn, kết quả điều trị phụ thuộc rất nhiều vàoloại tổn thương mô bệnh học và giai đoạn bệnh khi phát hiện[2], [34], [35]
Trang 171.5.1 Ung thư phổi không phải tế bào nhỏ (Non- Small Cell Lung NSCLC):
Cancer-Hiện nay phương pháp điều trị chính cho NSCLC vẫn là phẫu thuật, tia
xạ và hoá trị Việc lựa chọn phương pháp điều trị phụ thuộc vào giai đoạnbệnh, chức năng hô hấp và toàn trạng bệnh nhân [34], [35]
1.5.1.1 Phẫu thuật:
Phẫu thuật là điều trị tốt nhất cho ung thư giai đoạn I, II và III và còn cókhả năng cắt bỏ [34] Phẫu thuật chuẩn được khuyến cáo là cắt phổi thuỳ hoặccắt toàn bộ phổi kèm theo vét hạch Hiện nay còn nhiều bàn luận liên quan tớiphẫu thuật ở bệnh nhân NSCLC giai đoạn IIIA có di căn hạch N2 Tuy nhiênhướng dẫn điều trị năm 2016 của mạng lưới ung thư quốc gia Hoa Kỳ(National Comprehensive Cancer Network- NCCN) cho rằng bệnh nhân ungthư phổi giai đoạn này vẫn nên thực hiện phẫu thuật nếu ung thư còn khảnăng cắt bỏ Đối với bệnh nhân NSCLC giai đoạn IIIA cắt được, hoá trị dẫnđầu hoặc bổ trợ sau mổ, có thể xạ trị thêm hay không có thể cải thiện tiênlượng bệnh nhân [34]
Trang 181.5.1.3 Xạ trị:
Xạ trị được chỉ định cho điều trị NSCLC trong các trường hợp: điều trịtriệt căn với ung thư tiến triển còn khu trú, thường kết hợp với hoá trị liệu;điều trị triệt căn cho ung thư giai đoạn sớm có chống chỉ định với phẫu thuật;điều trị bổ trợ trước hay sau mổ với bệnh nhân đã phẫu thuật; điều trị cho ungthư tái phát hay di căn; điều trị giảm nhẹ cho bệnh nhân NSCLC không cònkhả năng chữa khỏi [34]
1.5.1.4 Liệu pháp điều trị trúng đích:Hiện gần đây cũng được áp dụng trong
điều trị NSCLC tuy nhiên chi phí điều trị còn cao và gần đây cũng đã ghinhận được các trường hợp kháng thuốc trong khi các thuốc thế hệ mới vẫnđang trong giai đoạn thử nghiệm [9], [11], [12]
1.5.2 Ung thư phổi tế bào nhỏ (Small Cell Lung Cancer- SCLC)
Điều trị chính với SCLC hiện nay là hoá trị và xạ trị Phẫu thuật cũng
có thể được chỉ định tuy nhiên chỉ hạn chế trong các trường hợp giai đoạnsớm (T1-2, N0, M0) [36], [37] Kết hợp hoá xạ trị là phác đồ chuẩn khi bệnhcòn ở giai đoạn khu trú Bệnh nhân có thể trạng tốt có thể xét khả năng hoá xạtrị đồng thời, nếu thể trạng yếu, xét khả năng xạ trị trước sau đó hoá trị Vớitrường hợp bệnh ở giai đoạn muộn, hoá trị thường được chỉ định, có thể kèmcác biện pháp khác như xạ trị, điều trị chăm sóc giảm nhẹ [36], [37] Một sốphác đồ hoá chất thường được sử dụng hiện nay như cisplatin kết hợp vớietoposide; carboplatin với etoposide; cyclophosphamide với doxorubicin vàvincristine (phác đồ CAV), phác đồ irinotecan với cisplastin [36], [37]
1.5.3 Kết quả điều trị ung thư phổi hiện nay:
Tuy đã có nhiều tiến bộ trong chẩn đoán và điều trị bệnh nhân song ungthư phổi vẫn là một trong những ung thư có tiên lượng xấu hiện nay Tỷ lệsống sau 5 năm của bệnh nhân ung thư phổi nói chung chỉ ở mức 17% Tỷ lệsống sau 5 năm của bệnh nhân ở giai đoạn ung thư còn khu trú và di căn vùng
Trang 19cũng chỉ lần lượt là 55% và 27% [2] Do đó cải thiện tiên lượng cho bệnhnhân ung thư phổi là một việc làm cần thiết hiện nay mà một phương phápđiều trị mới có hiệu quả là hướng đi đáng để nghiên cứu.
1.2 Tổng quan về liệu pháp miễn dịch trong điều trị ung thư nói chung và ung thư phổi
1.2.1 Sự ra đời của liệu pháp miễn dịch trong điều trị ung thư nói chung và ứng dụng trong ung thư phổi
1.2.1.1 Sự ra đời của liệu pháp miễn dịch trong điều trị ung thư:
Năm 1891, William Coley, một nhà ngoại khoa tại New York, đã sử dụng
độc tố của Streptococus erysipelatis và Bacillus prodigious để điều trị cho các
bệnh nhân ung thư có sự phát triển của các khối viêm [38] Nghiên cứu sau đócủa Elie Metchikoff đã chứng minh hệ thống miễn dịch trong cơ thể conngười có khả năng tạo ra các phản ứng viêm và tiêu diệt các vi khuẩn xâmlấn; “độc tố Coley” có tác dụng hoạt hóa các thực bào phá hủy các tế bào ungthư xung quanh khu vực đó [39] Nghiên cứu của Paul Ehrlich cũng cho thấy
hệ thống miễn dịch của cơ thể có thể nhận biết và loại trừ trước khi các tế bàonày phát triển gây bệnh [40]
Vào giữa thế kỷ XX, Burnet và Thomas đã cung cấp những bằng chứng
rõ ràng về khả năng theo dõi và kiểm soát ung thư của hệ thống miễn dịchthông qua các công trình nghiên cứu thực nghiệm [41] Trải qua hơn 40 nămnghiên cứu, nhiều công trình khoa học khác đã chứng minh điều này bằngviệc xác định thành công kháng nguyên liên kết khối u (tumor associatedantigens: TAAs) cũng như phân lập thành công các tế bào lympho đặc hiệuTAAs có mặt trong các khối u [42]
Trang 20Cho đến nay, các bằng chứng về sự đáp ứng miễn dịch trong ung thư đãđược khẳng định một cách rõ ràng[43] Dựa trên nền tảng đó, các nhà khoa học
đã nghiên cứu và phát triển nhiều liệu pháp miễn dịch trong điều trị ung thư
1.2.1.2 Các hướng đi hiện nay của liệu pháp miễn dịch trong điều trị ung thư
và những ứng dụng trong điều trị UTP
Hiện nay các nhà khoa học vẫn đang tập trung với những hướng nghiêncứu bao gồm liệu pháp miễn dịch chủ động như sử dụng vaccine ung thư, tăngcường chức năng tế bào miễn dịch nhờ cytokin, điều hòa các điểm kiểm ttramiễn dịch (immune checkpoint regulators) và cả các liệu pháp miễn dịch thụđộng như sử dụng các kháng thể đơn dòng kháng khối u, truyền tế bào cóthẩm quyền miễn dịch (sẽ được trình bày ở phần sau) Một số hướng nghiêncứu đã được tiến hành trên bệnh nhân UTP như:
a, Sử dụng vaccine ung thư:
Trong điều trị NSCLC, một số thử nghiệm lâm sàng đã được tiến hànhđánh giá hiệu quả của vaccine ung thư và đưa ra kết quả hứa hẹn Trong mộtthử nghiệm pha II với vaccine Belagenpumatucel- L (chế phẩm Lucanix) trênđối tượng là các bệnh nhân NSCLC giai đoạn II đến giai đoạn IV, nhóm bệnhnhân được sử dụng liều cao vaccine này có thời gian sống thêm nhiều hơn 2năm với nhóm chứng được sử dụng liều thấp vaccine[44] Ngoài ra còn có cácthử nghiệm với một số vaccine khác như TG40, BLP25, MAGE- A3 [45],[46], [47], [48], [49], [50]
Đây là một tiến bộ lớn và có nhiều triển vọng trong điều trị UTP Tuynhiên liệu pháp này vẫn đang trong giai đoạn phát triển và việc ứng dụng rộngrãi liệu pháp này trong điều trị UTP chỉ có thể thực hiện được trong tương lai
b, Điều hòa các điểm kiểm tra miễn dịch:
Trên thế giới cũng đã có những nghiên cứu về các điểm kiểm tra miễndịch trong điều trị UTP, trong đó phải kể đến kháng nguyên lympho T độc 4
Trang 21(cytotoxic T- lymphocyte antigen 4: CTLA-4) và phân tử chết theo chươngtrình 1 (programed death-1: PD1).Tuy nhiên liệu pháp này cũng cần thời giannghiên cứu thêm [51], [52].
1.2.2 Liệu pháp sử dụng tế bào lympho T có thẩm quyền miễn dịch
(Adotive T cell therapy) trong trị liệu ung thư phổi
1.2.1.1 Giới thiệu chung về liệu pháp tế bào miễn dịch và liệu pháp sử dụng
tế bào lympho T có thẩm quyền miễn dịch (Adotive T cell therapy)
Liệu pháp tế bào miễn dịch trong trị liệu ung thư: đã được phát triểnmạnh mẽ trong những năm gần đây [53] Đây là phương pháp điều trị ung thưbằng tế bào miễn dịch mà chủ yếu là truyền tế bào miễn dịch tự thân(Autologous Immune Enhancerment Therapy: AIET) Theo dó các tế bàomiễn dịch được lấy ra khỏi cơ thể người bệnh từ nhiều nguồn khác nhau như
tổ chức ung thư, hạch lympho và máu ngoại vi, sau đó được phân tách thànhcác dòng tế bào riêng biệt, nuôi cấy, hoạt hóa và mẫn cảm với kháng nguyênung thư rồi cuối cùng truyền lại cơ thể bệnh nhân để điều trị Những dòng tếbào được phân tách và sử dụng nhiều nhất gồm tế bào lympho T hỗ trợ (T-CD4), tế bào T độc (T- CD8), tế bào tua (Dendritic cells: DC) [54]
Hiện nay liệu pháp sử dụng tế bào lympho T có thẩm quyền miễn dịch(Adotive T cell therapy) mà chủ yếu là các lympho T gây độc đã có nhữngtiến bộ vượt bậc và đang trở thành hướng tiếp cận chính cho liệu pháp sửdụng tế bào miễn dịch trong điều trị nhiều loại ung thư hiện nay trong đó cóung thư phổi [55]
1.2.1.2 Liệu pháp sử dụng tế bào T có thẩm quyền miễn dịch trong điều trị ung thư phổi:
Trong liệu pháp sử dụng tế bào lympho T điều trị một số loại ung thưnói chung cũng như ung thư phổi nói riêng, bệnh nhân được truyền tế bào Thoạt hóa có thẩm quyền miễn dịch nhằm mục đích loại trừ khối u và ngăn cản
Trang 22sự tái phát của chúng[56] Hiệu quả của phương pháp phụ thuộc vào việc tối
ưu hóa môi trường nuôi cấy, tiếp xúc đặc hiệu với kháng nguyên, thúc đẩy sựnhân lên của tế bào đồng thời vẫn giữ được thẩm quyền miễn dịch và khảnăng truyền ghép, di chuyển đến vị trí và thâm nhập vào tổ chức khối u củacác tế bào lympho[57], [58] Nhiều quy trình nuôi cấy và hoạt hóa tế bàolympho T đã được thiết lập và đưa vào sử dụng dựa vào vị trí thu nhận tế bàocho điều trị Trong đó, liệu pháp sử dụng tế bào lympho T tách chiết từ máungoại vi (CTL therapy) là một phương pháp có nhiều ưu điểm như ít xâm lấn,
ít ảnh hưởng đến quá trình sinh hoạt, công việc của bệnh nhân Bệnh nhân chỉcần đến cơ sở điều trị lấy một lượng máu nhất định và sau đó khoảng hai tuầnđược quay lại cơ sở điều trị để truyền tế bào lympho T đã được hoạt hóa vàmẫn cảm với kháng nguyên ung thư [59] Hai tuần này là thời gian để nhânviên y tế phân tách, nuôi cấy hoạt hoá, đảm bảo có đủ số lượng tế bào lympho
T dùng trong điều trị cho bệnh nhân Một số thử nghiệm đã được tiến hànhtrên bệnh nhân ung thư phổi và cho những kết quả ban đầu hứa hẹn [60]
1.2.3 Cơ chế tác dụng của các tế bào miễn dịch liệu pháp:
1.2.3.1 Vai trò của các tế bào lympho T trong liệu pháp:
Đáp ứng miễn dịch đặc hiệu chống lại khối u cần sự hoạt hóa của các tếbào lympho T đặc hiệu kháng nguyên[61] Quá trình đáp ứng miễn dịch quatrung gian tế bào với vai trò chính của tế bào lympho T gây độc thông qua cácphân tử hòa tan và trên bề mặt tế bào Trong khi đó tế bào lympho T hỗ trợ,ngoài việc duy trì chức năng của tế bào T gây độc, chúng còn giúp các tế bàolympho B sinh trưởng và biệt hóa thành các tế bào sinh kháng thể (plasmacells) [62] Mặt khác, các cytokin được tiết bởi tế bào lympho T cũng thúc đẩy
và tăng cường thẩm quyền miễn dịch của các tế bào khác như các đại thực bào,
tế bào tua và tế bào diệt tự nhiên [63] Chính vì vậy các tế bào lympho T đóngvai trò trung tâm trong quá trình đáp ứng miễn dịch đặc hiệu chống khối u
Trang 23Các tế bào lympho T gây độc và T trợ khác nhau bởi sự biểu hiện củaphân tử bề mặt CD8 hoặc CD4, cũng như sự hoạt động dựa trên phân tử thụ thểphức hợp hòa hợp mô chủ yếu (MHC:Major Histocompability Complex)[64].
Tế bào T-CD8 và T-CD4 lần lượt nhận biết các kháng nguyên đặc hiệu bámvào MHC lớp I và MHC lớp II
1.2.3.2 Vai trò của các tế bào lympho T-CD8
Tế bào T-CD8 hoạt hóa có thể trực tiếp nhận diện và tiêu diệt các tế bàoung thư biểu hiện kháng nguyên đặc hiệu như phức hợp pMHC trên bề mặt tếbào Quá trình ly giải và phá hủy các tế bào ung thư của T-CD8 được thựchiện theo nhiều cơ chế khác nhau Tế bào T-CD8 hoạt hóa có khả năng tiếtcác hạt gây độc tế bào chứa các protein gây độc như perforin và granzym,đồng thời chúng tăng cường biểu hiện các phối tử bề mặt thuộc họ các yếu tốhoại tử u (Tumor necrosis factor: TNF) bao gồm thụ thể Fas [65], [66], [67]
Tế bào lympho T gây độc sử dụng các phối tử TNF biểu hiện trên bề mặt củachúng bám vào các thụ thể tương ứng trên bề mặt tế bào ung thư và thúc đẩy
sự chết theo chương trình của các tế bào này [68] Bên cạnh đó việc tiết cácloại protein gây độc như perforin và granzym chỉ được thực hiện khi tế bào T-CD8 được hoạt hóa thông qua sự tiếp xúc với kháng nguyên đặc hiệu tế bào.Khi tiếp xúc với tế bào ung thư, các enzym này có thể ly giải và tiêu diệt các
tế bào ung thư trong vòng 20 phút [65], [66] Ngoài ra các cytokin chức năngđược tế bào T-CD8 hoạt hóa tiết ra cũng đóng vai trò đặc biệt trong đáp ứngmiễn dịch chống ung thư Các cytokin như IL-2, TNFγ, TNFα… có vai tròtrung gian trong đáp ứng miễn dịch chống ung thư, chúng tác động trực tiếplên chính tế bào ung thư hay huy động, hoạt hóa và thúc đẩy nhiều loại tế bàomiễn dịch khác tham gia vào cơ chế chống ung thư [63]
1.2.3.4 Vai trò của tế bào lympho T-CD4:
Tế bào T-CD4 không những có vai trò hoạt hóa và tăng cường khả năngmiễn dịch của tế bào T-CD8, mà chúng còn có vai trò trực tiếp trong việc tiêu
Trang 24diệt các tế bào ung thư [69] Thông qua các tín hiệu được cung cấp bởi các tếbào trình diện kháng nguyên, CD4 được biệt hóa thành các phân lớp tế bào cóchức năng khác nhau: Th1 và Th2 Trong đó Th1 tiết cytokin IFNγ và IL-2thúc đẩy hoạt động miễn dịch chống lại ung thư Hơn nữa, các cytokin đượctiết bởi tế bào Th1 có khả năng hóa ứng động và hoạt hóa đại thực bào [70].Các đại thực bào tiết NO (nitric oxide) có khả năng kháng ung thư [71].Tương tự, Th2 cũng đóng vai trò quan trọng trong việc tiêu diệt các tế bàoung thư Th2 là tế bào quyết định cho sự di chuển của các tế bào bạch cầu ưaacid Nhiều nghiên cứu đã chứng minh rằng bạch cầu ưa acid có khả năng tiêudiệt các tế bào ung thư thông qua việc tiết các protein gây độc [72] Mặt kháccác cytokin tiết ra bởi các tế bào Th2 thúc đẩy hơn nữa hoạt động của các tếbào miễn dịch tại tổ chức ung thư bao gồm tế bào lympho B, các đại thực bào,
tế bào tua và tế bào diệt tự nhiên Dưới tác dụng của các cytokin, các tế bàolympho biệt hóa thành các tế bào sinh kháng thể sản xuất ra các kháng thể đặchiệu thuộc các phân lớp IgG và IgA Cùng với các tế bào trình diện khángnguyên, hoạt động của các phân lớp kháng thể này giúp tăng cường khả năngtrình diện và nhận biết kháng nguyên ung thư nhờ đó làm tăng hiệu quả đápứng miễn dịch chống lại các tế bào ung thư [73], [74]
1.2.3.5 Vai trò của các kháng thể và cytokin trong nuôi cấy hoạt hóa tế bào lympho T trong liệu pháp:
Các tế bào lympho T tách chiết từ máu ngoại vi phần lớn không tiếpxúc trực tiếp với các tế bào ung thư do đó chúng có thể ở trạng thái chưa hoạthóa và ít có tính đặc hiệu với kháng nguyên ung thư [75] Chính vì vậy, saukhi được thu thập, các tế bào lympho T sẽ được nuôi cấy hoạt hóa cùng vớicác kháng thể đa dòng và một số cytokin để tạo ra các tế bào có thẩm quyềnmiễn dịch sử dụng trong điều trị ung thư [76]
Trang 251.3 Tình hình các nghiên cứu trên thế giới và trong nước
1.3.1 Nghiên cứu trên thế giới:
Trên thế giới, đã có những quy trình nuôi cấy hoạt hóa tế bào lymphotách từ bệnh nhân ung thư phổi được xây dựng, các tác giả đã đi xa hơn vàđánh giá hiệu quả điều trị của liệu pháp sử dụng tế bào lympho T thẩm quyềnmiễn dịch trên bệnh nhân Trong thử nghiệm giai đoạn II, Rato và cộng sự xửdụng liệu pháp tế bào miễn dịch kết hợp với IL-2 liều thấp trên 113 bệnh nhânNSCLC giai đoạn II, IIIa và IIIb Kết quả cho thấy tăng tỷ lệ sống trên 3 nămcủa các bệnh nhân; thời gian sống trung bình của nhóm điều trị tế bào miễndịch là 22.4 tháng so với 14.1 tháng ở nhóm đối chứng, sự khác biệt là có ýnghĩa thống kê [60] Năm 2011, nhóm tác giả tại bệnh viện đại học Y Tokyo
đã tiến hành nuôi cấy hoạt hóa tế bào lympho T tách từ máu ngoại vi bệnhnhân bằng zoledronat và IL-2 Kết quả lượng tế bào lympho thu được trungbình là 1.57×109 điều trị cho bệnh nhân bằng các tế bào này được đánh giá là
an toàn, kéo dài thời gian sống thêm không tiến triển bệnh ở bệnh nhân [77].Trong một nghiên cứu khác được thực hiện trên các bệnh nhân ung thư phổitiến triển tại 7 bệnh viện ở Tokyo, các tác giả đã so sánh hiệu quả điều trị của
ba nhóm bệnh nhân lần lượt nhận được điều trị bằng liệu pháp truyền tế bàolympho T thẩm quyền miễn dịch, hóa trị liệu và kết hợp liệu pháp miễn dịchvới hóa trị liệu Thời gian sống thêm toàn bộ trung bình ở 3 nhóm bệnh nhânlần lượt là 12.5, 15.7 và 20.8 tháng Từ đó các tác giả đã đưa ra kết luận liệupháp truyền tế bào lympho T thẩm quyền miễn dịch kết hợp với hóa trị liệugiúp tăng hiệu quả điều trị Ngoài ra các tác giả cũng ghi nhận rằng liệu phápmiễn dịch giúp duy trì chất lượng cuộc sống của bệnh nhân ung thư phổi chotới gần thời điểm tử vong [78]
1.3.2 Nghiên cứu trong nước:
Cho tới nay vẫn chưa có nghiên cứu nào về liệu pháp sử dụng tế bàolympho có thẩm quyền miễn dịch trong điều trị UTP ở Việt Nam được công
Trang 26bố Trong khi đó đây là một hướng đi mở ra thêm những hy vọng mới cũngnhư cải thiện chất lượng cuộc sống của bệnh nhân UTP Chính vì vậy tìm hiểu
đi đến áp dụng liệu pháp này với bước đi đầu tiên là xây dựng quy trình nuôicấy hoạt hóa và đánh giá tính đáp ứng miễn dịch của tế bào lympho tách từbệnh nhân ung thư phổi trong điều kiện ở Việt Nam là việc làm cần thiết
Trang 27CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 Đối tượng nghiên cứu
2.1.1 Cỡ mẫu: 7, lấy mẫu thuận tiện
Đối tượng nghiên cứu gồm 2 nhóm:
- Nhóm người tình nguyện khỏe mạnh: 5 người
- Nhóm bệnh: 2 bệnh nhân ung thư phổi
- Trong nghiên cứu này mẫu máu tĩnh mạch ngoại vi của người tìnhnguyện khoẻ mạnh được thu thập để thử nghiệm xây dựng các quytrình trong đề tài trước khi áp dụng trên mẫu máu bệnh nhân ung thưphổi
2.1.2 Tiêu chuẩn chọn và tiêu chuẩn loại trừ đối tượng nghiên cứu
2.1.2.1 Tiêu chuẩn lựa chọn và tiêu chuẩn loại trừ người tình nguyện khoẻ mạnh:
Tiêu chuẩn lựa chọn:
- Không phát hiện bất thường sức khoẻ cần điều trị trên kết quả khámsức khoẻ định kỳ tại bệnh viện Đại học Y Hà Nội (thực hiện theo nhucầu của người tình nguyện hoặc yêu cầu của cơ quan nơi người tìnhnguyện công tác)
- Không mắc bệnh lây truyền qua đường máu như HIV, viêm gan B,viêm gan C
- Trên 18 tuổi
- Tình nguyện tham gia nghiên cứu
Tiêu chuẩn loại trừ: Người tình nguyện đáp ứng các tiêu chuẩn lựachọn trên đều được đưa vào nghiên cứu
Các tiêu chuẩn lựa chọn và loại trừ này được đánh giá với bảng kiểmtrong bệnh án nghiên cứu mẫu dành cho người tình nguyện khoẻ mạnh
2.1.2.2 Tiêu chuẩn lựa chọn và tiêu chuẩn loại trừ bệnh nhân ung thư phổi:
Trang 28 Tiêu chuẩn lựa chọn:
- Bệnh nhân UTP nguyên phát giai đoạn II- III được chẩn đoán xác địnhbệnh và giai đoạn bệnh nhờ thăm khám lâm sàng, xét nghiệm cận lâmsàng và mô bệnh học
- Không bị ung thư khác hoặc bệnh lý khác kèm theo
- Tình nguyện tham gia vào nghiên cứu
Tiêu chuẩn loại trừ:
- UTP ở các giai đoạn khác hoặc UTP thứ phát
- Bệnh nhân có kết hợp các bệnh lý ung thư khác
- Bệnh nhân có bệnh lý tự miễn kèm theo
- Bệnh nhân đang điều trị thuốc ức chế miễn dịch
- Bệnh nhân, gia đình bệnh nhân không đồng ý tham gia nghiên cứu
Tất cả các nội dung trong tiêu chuẩn lựa chọn, tiêu chuẩn loại trừ trênđược đánh giá qua kết quả lựa chọn bệnh nhân trong bệnh án nghiêncứu- dành cho bệnh nhân ung thư
2.2 Phương pháp nghiên cứu
2.2.1 Thiết kế nghiên cứu
- Thiết kế nghiên cứu: Mô tả tiến cứu
- Địa điểm nghiên cứu: Trung tâm Nghiên cứu Gen – Proteintrường Đại học Y Hà Nội, bệnh viện đại học Y Hà Nội, bộ môn Hoásinh, bệnh viện Nhi trung ương
2.2.2 Nội dung và các chỉ số nghiên cứu thu thập ban đầu
Bao gồm một số thông tin cơ bản về đối tượng nghiên cứu và tình trạngbệnh nhân:
- Thông tin về người tình nguyện: họ tên, tuổi, giới, địa chỉ liên hệ, tiền
sử, kết quả các xét nghiệm chẩn đoán nhằm loại trừ HIV, HCV, HBV.Kết quả khám sức khoẻ tại bệnh viện Đại học Y Hà Nội (theo mẫu bệnh
án nghiên cứu dành cho người tình nguyện khoẻ mạnh)
Trang 29- Thông tin về bệnh nhân UTP: họ tên, tuổi, giới, địa chỉ liên hệ, tiền sử,kết quả mô bệnh học, kết quả chụp cắt lớp vi tính lồng ngực, kết quảchẩn đoán giai đoạn UTP cùng các kết quả các xét nghiệm, thăm dòđánh giá tình trạng bệnh nhân (theo mẫu trong bệnh án nghiên cứu dànhcho bệnh nhân ung thư phổi).
2.2.3 Phương pháp thu thập mẫu
- 10 ml máu tĩnh mạch ngoại vi sẽ được thu thập từ người tình nguyệnkhỏe mạnh hoặc bệnh nhân ung thư
- Các mẫu máu ngoại vi được thu thập tại Trung tâm Nghiên cứu protein trường Đại học Y Hà Nội hoặc tại bệnh viện Đại học Y HàNộivào ốngcó chứa chống đông EDTA hoặc heparin gen- protein trườngĐại học Y Hà Nội Các mẫu sau đó được chuyển sang đơn vị tế bào trịliệu trong Trung tâm Nghiên cứu gen- protein phòng tách chiết và nuôicấy tế bào Các mẫu máu được xử lý ngay trong vòng 6-8 giờ kể từ thờiđiểm thu thập
gen-2.2.4 Các phương pháp và kỹ thuật sử dụng
2.2.4.1 Phương pháp, kỹ thuật tách chiết, đánh giá chất lượng và định danh tế bào miễn dịch
Kỹ thuật phân tách tế bào lympho từ máu ngoại vi
Các tế bào miễn dịch được tách bằng phương pháp ly tâm thay đổi tỷtrọng sử dụng Ficoll Đây là phương pháp tách tế bào mới được phát triểntrong những năm qua Ưu điểm của phương pháp này là thao tác đơn giản,thời gian thực hiện ngắn thu được các tế bào miễn dịch có chất lượng cao.Phương pháp này sử dụng dung dịch chứa Ficoll và Natri metrizoate với tỷtrọng và mức độ thẩm lọc thích hợp Máu ngoại vi được chống đông sau khithu thập được đặt lên trên dung dịch Ficoll và Natri metrizoate trong ống lytâm tạo thành 2 lớp dung dịch khác nhau về tỷ trọng Sau đó chúng được lytâm với tốc độ thấp trong thời gian ngắn Trong quá trình ly tâm, dưới tác
Trang 30dụng của tỷ trọng và độ thẩm lọc, các thành phần trong ống sẽ tạo ra các lớpkhác nhau Theo thứ tự từ đáy ống ly tâm lên phía trên sẽ gồm các lớp: lớp tếbào hồng cầu, lớp bạch cầu hạt, dung dịch Ficoll, lớp tế bào lympho và tiểucầu, lớp huyết tương Lớp tế bào lympho và tiểu cầu sẽ được hút nhẹ nhàngbằng pipet, sau đó rửa bằng dung dịch NaCl 0,9% để loại bỏ tiểu cầu và thu tếbào lympho dùng cho nuôi cấy tế bào Việc tách chiết tế bào lympho từ máutĩnh mạch ngoại vi được thực hiện theo quy trình thống nhất (trong phụ lục).
b, Phương pháp đánh giá chất lượng và định danh tế bào lympho
Các tế bào lympho sau khi được tách từ máu ngoại vi được đánh giá chấtlượng và định danh bằng các marker bề mặt tế bào theo phương pháp đếmdòng chảy tế bào BD FACS Canto II Chất lượng tế bào lympho được đánhgiá dựa trên chỉ số:
- Số lượng tổng số tế bào thu được nhờ kết quả đếm tế bào dưới kínhhiển vi sử dụng buồng đếm tế bào
- Tỷ lệ chung của tế bào lympho và tỷ lệ từng loại tế bào lympho riêngbiệt trong quần thể tế bào
- Việc định danh tế bào lympho nhờ các marker bề mặt tế bào thông quacác kháng thể đặc hiệu của chúng và đếm bằng máy đếm dòng chảy tếbào BD FACS Canto II Các marker được sử dụng bao gồm: CD3, CD4,CD8, CD19, CD16, CD56 Dựa trên các marker bề mặt có thể xác địnhđược tỷ lệ từng loại tế bào lympho và giúp cho việc đánh giá chất lượng tếbào sau tách chiết
2.2.4.2 Kỹ thuật nuôi cấy hoạt hóa tế bào
Kỹ thuật nuôi cấy tế bàolympho:
Sau khi tách chiết, các tế bào miễn dịch được nuôi cấy trong các điềukiện nuôi cấy cơ bản, cấy chuyển, tăng trưởng và phát triển tế bào Thời giannuôi cấy là 2 tuần, với mục tiêu số lượng tế bào đạt được tối thiểu là 5 × 109
- Môi trường nuôi cấy gồm các thành phần chính (cho 1 lít môi trường) như sau:
Trang 31+ Môi trường nuôi cấy RPMI-HEPES (có chứa L-glutamine)
+ 110 ml huyết thanh người
2.2.4.3 Phương pháp hoạt hóa và biệt hóa tế bào lympho
- Các tế bào lympho trong thời gian đầu được nuôi cấy trong điều kiệnnuôi cấy cơ bản, cấy chuyển để các tế bào tăng trưởng và phát triển
- Khi các tế bào ổn định, đạt mật độ nuôi cấy cần thiết (70-80%), chúng sẽđược chuyển sang các điều kiện nuôi cấy hoạt hóa và biệt hóa nhằm tạo racác tế bào có thẩm quyền miễn dịch dùng trong điều trị UTP Khi đó môitrường nuôi cấy có các thành phần chính như trên sẽ được thay bằng môitrường mới có bổ sung kháng thể đa dòng kháng CD3 và CD28 nhằm mụcđích hoạt hóa các tế bào miễn dịch Bên cạnh đó, môi trường nuôi cấy cònđược bổ sung các cytokin IL-15 và IL-21với nồng độ thích hợp để biệthóa chúng thành các tế bào miễn dịch đặc hiệu với kháng nguyên ung thư
và các tế bào có trí nhớ miễn dịch nhằm duy trì thẩm quyền miễn dịch lâudài của chúng tại tổ chức ung thư
- Ngoài ra môi trường nuôi cấy cũng có sự hiện diện của IL-2 giúp cho các
tế bào có thể tăng sinh với số lượng lớn đủ phục vụ cho các mục đích saunày
2.2.4.4 Phương pháp đánh giá đáp ứng miễn dịch của các tế bào lympho T trị liệu:
Đáp ứng miễn dịch của các tế bào lympho trị liệu dựa trên mức độ hoạthóa và biệt hóa tế bào, mức độ biểu hiện mRNA của các cytokin gồm IL-2 vàTNFα
Trang 32 Phương pháp đánh giá mức độ hoạt hóa và biệt hóa của các tế bàolympho trị liệu
Dựa trên sự biểu hiện của các marker đặc hiệu trên bề mặt tế bào tươngứng với mỗi giai đoạn hoạt hóa và biệt hóa của mỗi loại tế bào lympho Cácmarker chính được sử dụng như: CD3, CD4, CD8, CD16, CD19, CD56
Các tế bào lympho được nhuộm với kháng thể kháng marker đặc hiệu tếbào cho từng giai đoạn hoạt hóa và biệt hóa của mỗi loại tế bào và được đếmtrên máy đếm dòng chảy tế bàoBD FACS Canto II Ngoài ra tỷ lệ sống của các
tế bào cũng được xác định Dựa trên kết quả về mức độ biểu hiện và tỷ lệ tếbào ở mỗi giai đoạn biệt hóa tương ứng với mỗi loại tế bào có thể đánh giáđược chức năng của các tế bào lympho
Phương pháp đánh giá mức độ biểu hiện các cytokin IL-2 và TNFα:
- Mức độ biểu hiện mRNA IL-2 và TNFαtrong tế bào lympho nhờ kỹthuật PCR định lượng (Real time PCR):
Kỹ thuật Realtime PCR dựa trên nguyên lý kiểm soát lượng huỳnhquang giải phóng ra trong phản ứng, từ đó có thể biết được lượng sản phẩmPCR tại từng chu kỳ của quá trình khuếch đại Chất phát huỳnh quang được sửdụng là một loại huỳnh quang chèn vào sợi đôi DNA (SYBR I)
Quy trình thực hiện có thể được tóm tắt như sau:
+ RNA tổng số được tách chiết từ các tếbào lympho theo quy trình kítRNeasy Mini của hãng Qiagen DNA bổ sung sau đó được tổng hợp từRNA tổng số theo kít Revertaid first strand cDNA synthesis
+ Các cặp mồi đặc hiệu với mỗi gen sao chép mRNA IL-2 và TNFα được
sử dụng trong phản ứng Realtime PCR để khuếch đại
+ Mức độ biểu hiện mRNA của các cytokin này ở tế bào lympho đượcđánh giá tại 2 thời điểm trước và sau khi nuôi cấy hoạt hóa và biệt hóa,đồng thời so sánh với gen nội chuẩn β actin Việc so sánh mức độ biểuhiện mRNA được thực hiện nhờ phương pháp 2-∆∆Ct Với ∆∆CT= (CT cytokin
