Xây dựng quy trình nuôi cấy và đánh giá tác dụng invitro của interleukin 11 tái tổ hợp lên tế bào gốc tạo máu tủy xương

IL-11 là một cytokin có vai trò quan trọng trong quá trình tạo máu vàcytokine tạo máu này đã được tiến hành tìm hiểu trên nhiều mô hình hóa trịliệu hay mô hình ghép tủy xương nhằm xác đị

ĐẶT VẤN ĐỀ

Những năm gần đây, ở nước ta các bệnh về máu nói chung và đặc biệt

là các bệnh của hệ thống tạo máu ngày càng có xu hướng gia tăng mạnh mẽ.Theo số liệu thống kê chưa đầy đủ từ các cơ sở y tế chuyên điều trị các bệnh

về máu như Viện Huyết học - Truyền máu Trung ương, Bệnh viện Nhi trungương, Quân y 108, Trung tâm Huyết học và Truyền máu, Bệnh viện Trungương Huế cho thấy trong vòng 10 năm trở lại đây đã có 7200 ca mắc bệnh vềmáu, trong đó các bệnh liên quan đến ung thư máu chiếm tỷ lệ khoảng 70%.Nguyên nhân gia tăng các bệnh về máu có thể do ô nhiễm môi trường, hóa chất,các loại virus, các chất độc từ thời chiến tranh, đặc biệt là chất độc da cam đangphát tán hậu quả Điều đáng lo ngại là bệnh thường được phát hiện hầu hết ở cácbệnh nhân còn trẻ tuổi ở lứa tuổi lao động và gây tỷ lệ tử vong cao

Hiện nay vẫn chưa có phương pháp điều trị hữu hiệu cho các bệnh vềmáu Phương pháp điều trị ung thư máu và suy tủy xương được xem là tối ưunhất hiện nay là ghép tế bào gốc Khác với phương pháp truyền hoá chất và

xạ trị, các phương pháp điều trị bằng ghép tế bào gốc và tế bào gốc tạo máugiúp kéo dài tuổi thọ và đảm bảo chất lượng cuộc sống của người bệnh Trongtrường hợp điều trị bằng kết hợp nhiều phương pháp, ghép tế bào gốc có vaitrò cứu vớt, giúp người bệnh có thể chịu được liều lượng hoá chất và tia xạcao hơn, và do đó có thể nâng cao tỉ lệ kéo dài thời gan lui bệnh Trong thực

tế, ghép tế bào gốc đồng loại giúp chữa khỏi 90% các bệnh nhân bị rối loạn vềmáu Tuy nhiên chi phí cho một ca ghép tế bào gốc hiện nay vẫn còn khá cao

từ 400 triệu đồng đến hơn 1 tỷ đồng Hơn nữa để ghép được đòi hỏi giữangười cho và người nhận phải tương hợp về kháng nguyên hòa hợp tổ chứcHLA Với mức chi phí và yêu cầu phù hợp HLA như vậy, thực tế chỉ cókhoảng 2-3% người bệnh ung thư máu có đủ điều kiện để thực hiện ghép tế

bào gốc Do vậy, việc nghiên cứu tìm ra các công nghệ, các phương cách, cácloại thuốc an toàn và rẻ tiền hơn để cứu sống những bệnh nhân mắc các bệnh

về máu là điều hết sức quan trọng và bức thiết hiện nay

IL-11 là một cytokin có vai trò quan trọng trong quá trình tạo máu vàcytokine tạo máu này đã được tiến hành tìm hiểu trên nhiều mô hình hóa trịliệu hay mô hình ghép tủy xương nhằm xác định khả năng ứng dụng như làmột yếu tố kích thích tạo tiểu cầu Với các kết quả thu được khi thử nghiệmtrên chuột và khỉ đều cho kết quả khả quan về khả năng kích thích tạo tiểu cầucủa IL-11, vào năm 1997, hãng Neumega đã được cơ quan Quản lý Thựcphẩm và Dược phẩm Mỹ (US Food and Drug Administration - FDA) cấpphép cho việc áp dụng IL-11 tái tổ hợp để kiểm soát bệnh thiếu hụt tiểu cầu

và giảm bớt nhu cầu về tiểu cầu trong quá trình truyền máu sau khi hóa trị liệu

ức chế tủy đối với những bệnh nhân bị u tủy ác tính - những người có nguy cơcao về sự thiếu hụt tiểu cầu Tuy nhiên, giá thành còn cao trên thị trường,chưa phù hợp với người Việt nam

Trên cơ sở đó, Viện công nghệ sinh học đã nghiên cứu tái tổ hợp và tinhchế thành công IL-11 bằng công nghệ hiện đại Sản phẩm IL-11 được tạo racần phải được đánh giá tính an toàn và hoạt tính sinh học, trước khi sử dụngtrên lâm sàng Chúng tôi sử dụng sản phẩm để nghiên cứu trên mô hình nuôicấy tế bào gốc sau khi đã có đánh giá tính an toàn chung, độc tính cấp, độctính bán trường diễn, chí nhiệt tố và các nội độc tố trong mẫu sản phẩm Il-11.Đồng thời hoạt tính IL-11 cũng đã được đánh giá trên tế bào dòng TF-1, tếbào dòng ung thư dòng hồng cầu, mục tiêu của đề tài:

1 Áp dụng quy trình tách và nuôi cấy tế bào gốc tạo máu tủy xương.

2 Đánh giá tác dụng in vitro của IL-11 tái tổ hợp lên tế bào gốc tạo máu tủy xương.

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 Tế bào gốc

Tế bào gốc (Stem Cell) đã được phát hiện từ trên 60 năm nay, kể từ khinghiên cứu thành công tạo cụm tế bào lách trong nghiên cứu sinh máu ởchuột (1950) Từ đó dựa trên các tiến bộ về khoa học kỹ thuật; hình tháihọc; hóa học tế bào; miễn dịch, lai phân tử, huỳnh quang, PCR, RT-PCR,nuôi cấy tế bào người ta đã phân lập và biết được quá trình phát triển của

cơ thể người và động vật bắt đầu từ tế bào gốc toàn năng (totipotent stemcell) Từ đó, khái niệm tế bào gốc (TBG) là tế bào có khả năng sinh sản, tựtái sinh và biệt hóa thành các tế bào gốc kế cận, rồi phát triển thành TBG

có chức năng riêng, cuối cùng trở thành tế bào trưởng thành của toàn cơ thểngười và động vật

Đặc điểm của tế bào gốc toàn năng là tế bào có khả năng tạo ra tất cảcác tế bào gốc của các cơ quan trong cơ thể và có nhiều đặc điểm như khảnăng sinh sản và biệt hóa cao, tạo ra thai nhi ; có khả năng tự tái sinh để duytrì nguồn gốc của chúng; có số lượng rất ít nhưng khả năng sinh sản và biệthóa rất lớn, tuy nhiên chưa có dấu ấn riêng để nhận biết tế bào gốc toàn năng

Ở điều kiện bình thường tế bào gốc toàn năng ở trạng thái nghỉ ngơi, nhưngkhi có kích thích từ môi trường chúng sinh sản và biệt hóa nhanh để tạo ra các

tế bào gốc kế cận, các tế bào gốc kế cận này là các tế bào gốc của các cơ quanriêng biệt, lúc này chúng mới có dấu ấn riêng để có thể nhận biết được, ví dụ

tế bào gốc của cơ quan tạo máu có dấu ấn CD34+…đây là dấu ấn riêng đầutiên của tế bào gốc tạo máu kể từ khi tách khỏi tế bào gốc toàn năng

Trong cơ thể người và động vật, tế bào gốc có mặt ở các vị trí gồm tủyxương, máu ngoại vi, máu dây rốn; ở các cơ quan đặc như dây rốn, giác mạc,

não, cơ tim, xương, gan, da… Ở đây chúng vừa là tế bào dạng “nghỉ ngơi”,vừa là dạng tế bào thường trực để khi cần thiết có nhu cầu chúng sẽ sinh sản

và biệt hóa thành các tế bào gốc kế cận, rồi tạo ra các tế bào chức năng, thaythế thường xuyên cho tế bào già

1.2 Tế bào gốc tủy xương

Trong tủy xương có nhiều loại tế bào gốc khác nhau về các đặc điểmnhư tuổi của tế bào, về hình thái và chủng loại Người ta xếp các tế bào nàythành 2 nhóm lớn là tế bào gốc tạo máu và tế bào gốc không tạo máu

Tế bào gốc tạo máu là các tế bào được tách ra từ tế bào gốc toàn năngcủa toàn bộ cơ thể, là tế bào gốc vạn năng của cơ quan sinh máu, chúng cókhả năng tạo ra tất cả các tế bào gốc đầu dòng của tế bào máu, có khảnăng tự tái sinh để duy trì dòng tế bào, nhưng chỉ có tế bào gốc tạo máuvạn năng có dấu ấn CD34+ mới có khả năng này Các tế bào này còn cócác dấu ấn đặc hiệu khác như CD45, CD47 có thể nhận biết được Các tếbào gốc tạo máu có khả năng sinh sản và biệt hóa thành các tế bào máutrưởng thành Khả năng sinh sản rất lớn, mặc dù trong tủy xương chỉ có từkhoảng 1/100 đến 1/10000 tế bào gốc

Quá trình sản sinh và biệt hóa của tế bào gốc tạo máu được bắt đầu từ

tế bào gốc đa năng của lá phôi trung bì Các tế bào gốc tạo máu đầu tiên nàyđược phát triển và biệt hóa thành tế bào gốc đa năng dòng tủy, dòng lymphorồi thành tế bào gốc đầu dòng của các dòng tế bào máu như hồng cầu, bạchcầu và tiểu cầu Từ các tế bào này, chúng tiếp tục sinh sản và biệt hóa thànhcác tế bào con trưởng thành có chức năng cụ thể như: hồng cầu, bạch cầu hạt,mono, lympho…Quá trình trên có thể chia ra 3 giai đoạn hay 3 khu vực, baogồm tủy xương, máu ngoại vi và tổ chức (Hình 1)

Hình 1.1: Sơ đồ phát triển của tế bào gốc tạo máu

Tế bào gốc phát triển được là nhờ quá trình tự tái sinh, quá trình sinhsản, biệt hóa và quá trình chết theo chương trình Các hoạt động này luônluôn được điều hòa bởi các yếu tố kích thích phát triển và các yếu tố ức chế Khi sự sinh sản và biệt hóa hoạt động mạnh nhờ các yếu tố kích thích như cáccytokin, chemokin, yếu tố phát triển đơn dòng, đa dòng… nếu vượt ngưỡngbình thường thì các yếu tố ức chế và yếu tố của con đường chết theo chươngtrình tăng hoạt động Do đó, các yếu tố này tham gia điều chỉnh cân bằng nộimôi, cân bằng 2 quá trình sản sinh và biệt hóa Các yếu tố tham gia quá trìnhphát triển bao gồm các cytokin như IL-3, IL-11, IL-6,… các yếu tố kích thíchnhư GM-CSF, G-CSF, SF…

1.3 Một số yếu tố tham gia quá trình biệt hóa tế bào gốc tạo máu

Tác dụng của các cytokin ở các giai đoạn khác nhau của quá trình pháttriển và biệt hóa của dòng hồng cầu được minh họa trong Hình 2, có vai tròcủa IL-3, IL-11, GM-CSF Mỗi cytokin có tác dụng ở một giai đoạn nhất địnhcủa quá trình phát triển và biệt hóa, nhưng chúng thường có những điểm tácđộng chung trong quá trình này Các yếu tố này cũng có tác dụng trong dòngtiểu cầu, tuy nhiên các thời điểm tác dụng cũng khác so với dòng hồng cầu(Hình 3) Riêng dòng bạch cầu, có vai trò của IL-3, nhưng không có vai tròcủa IL-11 (Hình 4)

Hình 1.2: Vị trí tác dụng của các cytokin phát triển và biệt hóa dòng hồng

cầu

Hình 1.3: Vị trí tác dụng của các cytokin phát triển và biệt hóa dòng tiểu

cầu

Hình 1.4 : Vị trí tác dụng của các cytokin phát triển và biệt hóa dòng bạch

cầu

1.3.1 Interleukin-11 (IL-11)

Với IL-11, định nghĩa ban đầu chỉ là một yếu tố hòa tan trong môitrường với sự tham gia của chất cảm ứng IL-1α trên dòng tế bào đệm tủyxương, PU-34, nó được cung cấp lâu dài cho quá trình nuôi cấy tế bào Hiệnnay, IL-11 được biết tới là một cytokin tạo máu với vai trò là yếu tố sinhtrưởng cho tế bào nguồn của u tương bào (plasmacytomas), tế bào tạo máutiềm năng, nguyên mẫu tiểu cầu, đại thực bào, đồng thời ức chế chứng phátphì với tiền tế bào mỡ Chính vì vậy, IL-11 còn có tên gọi khác là yếu tố ứcchế chứng phát phì Nhiều nghiên cứu trên tế bào và trên các mô của các cơquan đã chỉ ra IL-11 còn có hoạt tính bảo vệ và hồi phục màng nhày của hệtiêu hóa; tác động như là tác nhân điều biến miễn dịch hay tham gia vào cáchoạt động trao đổi chất trong xương

Trong cơ thể người, gen hoàn chỉnh mã hóa cho IL-11 chiếm kíchthước khoảng 7 kb trong DNA của hệ gen, định vị trên cánh dài của nhiễmsắc thể số 19, tại vị trí 19q13.3-q13.4 Gen này chứa 5 vùng exon và 4 vùngintron Một điểm khá đặc biệt là mặc dù IL-11 nằm trong họ của IL-6 nhưng

trình tự DNA của gen il-11 lại khó tìm thấy sự tương đồng ở cấp độ

nucleotid Một vài vùng nằm ở đầu 5’ của gen lại có trình tự nucleotid tươngđồng đến 70% khi so sánh với các gen mã hóa cho các cytokin khác như IL-

2, IL-3, IL-9 và GM-CSF

Interleukin-11 là một phân tử protein có mức độ ổn định cao trướcđiều kiện nhiệt độ mặc dù trong cấu trúc không tồn tại acid amin cysteinnào Dạng tiền IL-11 bao gồm 199 acid amin Đoạn peptid tín hiệu gồm 21acid amin sẽ được loại bỏ sau dịch mã để tạo nên dạng IL-11 có hoạt tínhvới 178 acid amin Mức độ tương đồng của IL-11 ở người với thỏ là 88%,với linh trưởng khác là 94% Các vị trí acid amin 59 (methionin), 42 (lysin)

và 99 (lysin) là các vị trí cốt yếu để protein có thể gắn kết với thụ thể Cấutrúc không gian của IL-11 được mô phỏng cũng gồm 4 chuỗi xoắn A, B, C,

D (Hình 6) Tuy nhiên, không có vị trí nào của asparagin để hình thành cấutrúc glycosyl hóa hay sự biến đổi của chuỗi carbonhydrat Hơn nữa, vớithành phần acid amin gồm prolin (12%), leucin (23%) và các acid amin tíchđiện dương khác (14%) làm điểm đẳng điện của protein có giá trị khác vớicác cytokin khác (pI = 11,7)

Hình 1.5: Mô phỏng cấu trúc không gian của IL-11

Trong cơ thể, IL-11 có thể được tiết ra bởi nhiều loại tế bào ở các môkhác nhau Về mức độ tiết cơ bản của IL-11 được phát hiện ở các tế bào nhưnguyên bào sợi, tế bào biểu mô phổi, tế bào sụn, tế bào dịch khớp, tế bàosừng, tế bào nội mô, nguyên bào xương, một số dòng tế bào ung thư và một

số tế bào khác Đã có nhiều nghiên cứu về IL-11 và không chỉ áp dụng sản

phẩm này vào trong điều trị bệnh mà còn áp dụng vào trong nghiên cứu cơbản để sáng tỏ các cơ chế hay những con đường tác dụng của interleukin

trong cơ thể Những hướng nghiên cứu ấy được tiến hành trên cả in vitro và

in vivo Trong in vitro, các nghiên cứu đã chứng minh được rằng, sinh phẩm

IL-11 có thể tác động lên nhiều dạng tế bào khác nhau, bao gồm như các tếbào tạo máu, tế bào gan, tế bào mỡ, đại thực bào, tế bào biểu mô ruột, tế bàokhối u, tế bào tạo xương và tế bào hủy xương Trong nghiên cứu dược phẩm

in vivo, dạng cytokin tạo máu này đã được tiến hành tìm hiểu trên nhiều mô

hình hóa trị liệu hay mô hình ghép tủy xương nhằm xác định khả năng ứngdụng như là một yếu tố kích thích tạo tiểu cầu Các kết quả thu được khi thửnghiệm trên chuột và khỉ đều cho kết quả khả quan về khả năng kích thíchtạo tiểu cầu của IL-11 Chính vì vậy, năm 1997, hãng Neumega đã được cơquan Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Mỹ (FDA) cấp phép cho việc ápdụng IL-11 tái tổ hợp để kiểm soát bệnh thiếu hụt tiểu cầu và giảm bớt nhucầu về tiểu cầu trong quá trình truyền máu sau khi hóa trị liệu ức chế tủyđối với những bệnh nhân bị u tủy ác tính - những người có nguy cơ cao về

sự thiếu hụt tiểu cầu Hơn nữa, những nghiên cứu gần đây nhất còn xácnhận, IL-11 cũng có hiệu quả khi điều trị riêng rẽ hay hiệp đồng với G-CSFtrên bệnh nhân bị bệnh máu trắng và các bệnh ung thư liên quan đến các tếbào máu

1.3.2 Interleukin-3 (IL-3)

Trong số các interleukin, IL-3 được xem là loại cytokin có phổ tácdụng rộng nhất trong hệ thống tạo máu do nó có nhiều chức năng đối với cơthể Chính vì sự đa dạng về chức năng đó, hoạt tính của IL-3 được nghiêncứu trên nhiều dòng tế bào khác nhau Các tính chất hay hoạt tính của IL-3được gắn liền với nhiều tên như yếu tố kích thích tế bào bền vững, yếu tố

kích thích tế bào tạo histamin, yếu tố kích thích các dòng bạch cầu , yếu tốsinh trưởng tạo máu đa dòng, yếu tố kích ứng Thy-1, hoạt tính kích thíchCFU, yếu tố phát triển dòng tế bào mast, bạch cầu ái toan, mẫu tiểu cầu vàhồng cầu… Chức năng sinh học của IL-3 không chỉ là sự kích thích cácdòng tế bào nguồn mà còn có ý nghĩa mật thiết với các tế bào nguồn trongquá trình biệt hóa Nhiều hoạt tính của IL-3 còn được tăng cường hay phụthuộc dựa vào sự đồng kích thích của các cytokin khác Sự kích thích củaIL-3 mang tính phổ rộng với hàng loạt tế bào trong hệ tạo máu và với cáccytokin khác Hơn nữa, IL-3 còn có khả năng kích thích đặc hiệu sự pháttriển của tế bào gốc sớm, tế bào nguồn của tế bào mast và nguyên mẫu tiểucầu hay tế bào nhân khổng lồ

Ở người, gen mã hóa cho IL-3 được định vị trên nhiễm sắc thể số 5,tại vị trí 5q31.1 Sau quá trình phiên mã, tiền thân của IL-3 (152 aminoacid) được hình thành từ 5 đoạn exon với kích thước amino acid tương ứng

là 54, 14, 30 và 40 Tiếp theo là quá trình biến đổi sau dịch mã để loại bỏđoạn peptide tín hiệu (19 amino acid), IL-3 có hoạt tính bao gồm 133 aminoacid với khối lượng phân tử khoảng 15,1 kDa Về cấu trúc, protein này cũngbao gồm 4 chuỗi xoắn α A, B, C, D, có một cầu nối lưu huỳnh giữa aminoacid Cys16 và Cys84 (Hình 5) Các vị trí amino acid như Ser17, Asn18,Asp21, Thr25 trên chuỗi xoắn A và Arg108, Phe113, Lys116, Glu119 trênchuỗi D đóng vai trò không thể thiếu trong quá trình gắn kết giữa IL-3 vớithụ thể của nó trên bề mặt tế bào đích Đặc biệt, nếu thay thế vị trí Glu22,hoạt tính của IL-3 có thể bị mất hoàn toàn Ngoài ra, dạng IL-3 tự nhiêncũng có sự khác biệt so với IL-3 tổng hợp bởi sự đa dạng về thành phầnchuỗi carbonhydrat gắn kết vào trong quá trình hình thành cấu trúc glycosylhóa Do đó, kích thước tự nhiên của IL-3 tiết ra bởi tế bào T hoạt hóa có thểthay đổi từ 22, 28 hay 36 kDa

Hình 1.6 : Mô phỏng cấu trúc không gian của IL-3

Trong cơ thể, nguồn sản xuất IL-3 chính là tế bào lympho T đã hoạthóa Tế bào mast và bạch cầu ái toan cũng có thể tiết ra IL-3 khi được kíchthích và hoạt hóa Sản phẩm IL-3 tạo ra theo con đường tế bào mast có ýnghĩa quan trọng với quá trình biệt hóa các phân dòng tế bào tua Sự hoạthóa tế bào mast và việc tiết ra IL-3 cũng giúp tăng nhanh hoạt động sản xuấthistamin

Hiện nay, IL-3 vẫn còn đang được tiếp tục nghiên cứu lâm sàng đểđánh giá tác dụng của IL-3 Với khả năng kích hoạt các thành viên ban đầucủa các con đường biệt hóa tạo máu, IL-3 có thể ứng dụng trong nhiều mụcđích điều trị lâm sàng khác nhau Các kết quả thu được khi sử dụng IL-3 chođiều trị lâm sàng cho thấy IL-3 thúc đẩy sự phục hồi của tủy xương sau khighép tủy xương hoặc phục hồi suy tủy thứ phát do hóa chất độc, kích thích sựgia tăng của tiểu cầu Các thử nghiệm lâm sàng trên động vật và người cho

thấy IL-3 kết hợp với G-CSF hoặc GM-CSF có thể kích thích mạnh mẽ khảnăng tạo tế bào tủy xương, ứng dụng trong điều trị bệnh thiếu máu bất sảnhoặc là các bệnh thiếu máu khác Bên cạnh đó, cũng có nhiều nghiên cứu đã

và đang được tiến hành nhằm áp dụng IL-3 để điều trị các bệnh khác như đểkiềm chế một số bệnh nhiễm trùng, sử dụng để nâng cao hiệu quả tác độngcho tế bào trình diện kháng nguyên trong điều trị ung thư, kiểm soát các bệnhhen phế quản và dị ứng

1.3.3 GM-CSF (Granulocyte macrophage colony-stimulating factor)

GM-CSF được sản xuất chính từ các tế bào lympho, bạch cầu đơnnhân, xơ non, nội mạc Là một yếu tố kích thích tăng trưởng hệ tạo máu, nókích thích tế bào gốc tạo máu tạo ra một lượng lớn các tế bào tại tủy như bạchcầu đơn nhân, bạch cầu đa nhân trung tính, bạch cầu ái toan, hồng cầu, tiểucầu, tế bào đuôi gai… Do đó còn dùng điều trị các bệnh máu

1.4 Tách tế bào gốc tạo máu và nuôi cấy in vitro

Để có thể nghiên cứu được về tế bào gốc tạo máu hoặc ứng dụng điềutrị, người ta có thể sử dụng các phương pháp tách khác nhau từ các nguồnkhác nhau như tủy xương, máu ngoại vi, máu cuống rốn,… Trong đó có cácphương pháp miễn dịch như dùng kháng thể và hạt từ để có thể tách được các

tế bào có dấu ấn CD34+ riêng rẽ hoặc dùng máy đếm tế bào dòng chảy có bộphận tách riêng tế bào đặc hiệu này Ngoài ra, các phương pháp tách tế bàođơn nhân bằng phương pháp ly tâm tỷ trọng, trong đó có tế bào gốc CD34+được sử dụng phổ biến trong nghiên cứu cũng như trong điều trị truyền tế bàogốc tự thân hay đồng loài

Khi đã có tế bào gốc, việc lựa chọn phương pháp nghiên cứu cũng phảiđược cân nhắc Thông thường, phương pháp nghiên cứu biệt hóa của tế bào

gốc được thực hiện theo phương pháp nuôi cấy trong môi trường bán lỏng vàcho thấy cụm tế bào đặc trưng Nuôi cấy tế bào gốc đã được thực hiện từ lâu,với các nghiên cứu về các thành phần môi trường nuôi cấy có bổ sung cáccytokin Hiện tại môi trường nuôi cấy tế bào gốc có trên thị trường, cho phépnuôi cấy tế bào gốc một cách dễ dàng hơn

Hiện nay, các kỹ thuật hiện đại như đếm tế bào dòng chảy, sử dụngkháng thể đơn dòng gắn chất huỳnh quang (FITC, PE) để xác định dấu ấnkháng nguyên trên bề mặt tế bào xác định dấu ấn miễn dịch đặc trưng cho tếbào gốc tạo máu CD34+ đã được sử dụng phổ biến hơn Ngoài ra, người tacòn sử dụng các phương pháp đổ lam và nhuộm Giêmsa để đánh giá hình thái,tuổi tế bào…

1.5 Đặc điểm chung của bệnh suy tủy xương

Bình thường tủy xương có nhiệm vụ sinh sản các tế bào máu Quá trìnhsinh tế bào máu là quá trình tăng sinh (sinh sản tế bào) kèm biệt hóa và trưởngthành để từ một tế bào gốc ban đầu hình thành nên nhiều tế bào trưởng thành

có hoạt động chức năng đi vào máu đó là hồng cầu, bạch cầu và tiểu cầu Quátrình này được mô tả ở trên Quá trình sinh máu được điều hòa bởi các chấtkích thích tạo máu Tổ chức tủy là môi trường gồm các khoang sinh máu đểcác tế bào tạo máu sinh sản và biệt hóa trưởng thành Khi tủy xương khôngđảm bảo được quá trình trên thì gọi là suy tủy

Suy tủy xương là tình trạng tủy xương không sinh sản đủ tế bào máu đểcung cấp cho nhu cầu bình thường của cơ thể dẫn đến hiện tượng giảm các tếbào (hồng cầu bạch cầu hạt, tế bào mônô, tiểu cầu) ở máu ngoại vi Sự giảmsinh tế bào này không kèm theo rối loạn chất lượng tế bào Trong thực tế cónhiều trường hợp chỉ giảm một hoặc hai dòng tế bào Trường hợp tủy giảmhẳn (bất sản) cả 3 dòng tế bào gọi là suy tủy xương toàn bộ

Nếu phân tích máu ngoại vi của người suy tủy thì thấy các dòng tế bàohồng cầu, bạch cầu và tiểu cầu đều suy giảm Đặc điểm dòng hồng cầu cógiảm số lượng, huyết sắc tố giảm, thường dưới 80g/1, thiếu máu bình sắc,kích thước hồng cầu có thể to Hồng cầu lưới ở máu giảm hầu hết dưới 50 x

109/l.Số lượng bạch cầu giảm, giảm số lượng tuyệt đối bạch cầu đoạn trungtính, nhiều trường hợp bạch cầu đoạn trung tính còn dưới 0,2 x 109/l Côngthức bạch cầu bất thường biểu hiện là tỷ lệ giữa bạch cầu đoạn trung tính/ tếbào lympho thay đổi Bình thường tỷ lệ này khoảng 1,5-3,0 Trong suy tủyxương tỷ lệ này nhỏ hơn 1 Không có hình ảnh các tế bào bất thường Sốlượng tiểu cầu giảm, có thể gặp một số tiểu cầu có kích thước to hơn bìnhthường Theo thống kê tại Viện Huyết học - Truyền máu Trung ương thì 75%bệnh nhân suy tủy xương có số lượng tiểu cầu dưới 80 x 109/l

Khi xét nghiệm tế bào tủy xương thấy tủy nghèo tế bào, số lượng tế bàotủy dưới 30 x 109/l Tỷ lệ bạch cầu đoạn giảm nặng và không có tế bào áctính Xét nghiệm sinh thiết tủy xương thấy các khoang sinh máu hoang vu,không thấy hoặc thấy rất ít các tế bào dòng hạt, nguyên hồng cầu và mẫu tiểucầu, gặp tỷ lệ cao tế bào lympho, các khoang sinh máu thường bị mỡ hóa

Về chẩn đoán xác định thường dựa vào lâm sàng và xét nghiệm Xétnghiệm máu có giảm cả 3 dòng tế bào, trong công thức bạch cầu có tăng tỷ lệlymphocyt, giảm tỷ lệ và số lượng tuyệt đối bạch cầu đoạn Xét nghiệm tủy

đồ thấy hiện tượng giảm sinh, tủy nghèo tế bào, tăng tỷ lệ lympho/bạch cầuđoạn trung tính (công thức đảo ngược) Xét nghiệm sinh thiết tủy là xétnghiệm quyết định chẩn đoán với hình ảnh các khoang sinh máu hoang vu,

mỡ hóa, chỉ gặp các tế bào lympho

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

- Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 11/2015 đến tháng 8/2016

- Khoa huyết học Bệnh viện Nhi Trung ương, Viện Huyết học Truyềnmáu Trung ương, nơi cung cấp mẫu và dữ liệu liên quan

- Phòng Kỹ thuật di truyền, Viện công nghệ sinh học, nơi cung cấp mẫuIL-11 tái tổ hợp

- Bộ môn Sinh lý bệnh-Miễn dịch, Trường đại học Y Hà Nội, nơi thựchiện các kỹ thuật chiết tách, nuôi cấy tế bào gốc

2.2 Đối tượng và mẫu nghiên cứu

- 10 bệnh nhân đến khám và điều trị tại Bệnh Viện Nhi Trung ương,trong đó có 5 bệnh nhân có tủy xương bình thường và 5 bệnh nhânđược chẩn đoán là suy tủy Mẫu được thu thập tại Khoa huyết học Bệnhviện Nhi Trung ương

- 01 mẫu tế bào gốc được làm giàu từ máu ngoại vi ở người cho máu (cókích thích tủy xương), Viện Huyết học Truyền máu Trung ương

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Tách tế bào gốc từ các nguồn mẫu

Để đánh giá tác dụng sinh học của IL-11, chúng ta cần có mô hình tách,nuôi cấy và thử thích hợp Chúng tôi chỉ áp dụng các phương pháp tách bạchcầu đơn nhân/bạch cầu để sơ bộ đánh giá khả năng tăng sinh của IL-11 Cácphương pháp tách bao gồm:

2.3.1.1 Tách tế bào gốc từ tủy xương theo phương pháp ly tâm tỷ trọng

- Quy trình thực hiện với Ficoll 1.077, được tóm lược như sau :

- 1ml dịch tủy xương có chống đông EDTA đã được pha loãng gấp đôivới môi trường RPMI

- Cho 1 ml Ficoll vào tube nhựa 15ml sau đó cho từ từ dịch tủy xương

đã pha loãng vào trên lớp Ficoll (không được trộn lẫn Ficoll và dịchtủy xương)

- Ly tâm 2500rpm x 20 phút ở nhiệt độ 40C bằng ly tâm

- Hút phần bạch cầu đơn nhân (vòng trắng đục) sau khi ly tâm và chosang một tube mới

- Rửa 2 lần tế bào thu được bằng dung dịch PBS 1x (1000rpm/5 phút)

- Hòa tan cặn tế bào trong 1ml môi trường nuôi cấy tế bào gốc tủy xươngStemPro34 với đầy đủ các thành phần cần thiết, trong đó có 100ng/mlSCF, 50ng/ml IL-3 và 25ng/ml GM-CSF

- Đếm tổng số tế bào bạch cầu thu được và tế bào CD34+

tương (trong đó chứa tiểu cầu) 2) Bạch cầu đơn nhân 3) Ficoll 4) Bạch cầu hạt 5) Hồng cầu

2.3.1.2 Tách tế bào gốc từ máu ngoại vi có kích thích tăng sinh tủy

Bệnh nhân/người cho tế bào gốc được tiêm chất kích thích sinh tủy mộtngày trước khi gạn tách tế bào Tế bào gốc được thu hoạch từ dòng máu ngoại

vi bằng cách cho dòng máu chảy qua máy gạn tách tế bào Qui trình này thựchiện trong đơn vị gạn tách Máu tĩnh mạch đi vào trong máy, sau đó máu được

ly tâm và tách thành phần chứa tế bào gốc ra khỏi máu toàn phần, phần cònlại được máy đưa ra và truyền trả lại bệnh nhân theo đường ven khác quacatheter gạn tách Cuối buổi gạn tách, phòng xét nghiệm tế bào gốc sẽ đếm sốlượng tế bào gốc Sau lấy túi tế bào gốc từ máy tách tế bào, nhân viên sẽ tiếnhành ly tâm túi tế bào, tách lấy phần huyết tương để truyền lại cho người cho.Khối tế bào gốc được mang đi xử lý, thêm chất bảo quản, chống đông, dungdịch treo tế bào gốc rồi tiến hành bảo quản đông lạnh Sau khi đếm tế bào, lấy0.5ml dung dịch tế bào thu được và chuyển về lab để tiến hành nuôi cấy theoquy trình

2.3.2 Nuôi cấy tế bào gốc

Tế bào bạch cầu thu được (thường ở nồng độ cao) được pha loãngthành 300000 bạch cầu/ml môi trường nuôi cấy StemPro34 hoàn chỉnh Hút200µl hỗn dịch tế bào cho vào mỗi giếng của bản nhựa nuôi cấy 96 giếng vàđặt trong tủ ấm 370C có 5% CO2 Hàng ngày kiểm tra sự phát triển của tếbào, theo dõi đến khi thu hoạch đánh giá sự phát triển số lượng tế bào và tếbào CD34+ Số tế bào tách được còn lại được lưu trong nitơ lỏng với môitrường nuôi cấy có 10% DMSO và điều kiện làm lạnh từ từ

2.3.3 Hình thái tế bào

Là phương pháp làm tiêu bản, cố định, nhuộm Giêmsa và quan sát hìnhthái tế bào bởi kính hiển vi vật kính dầu 10x Phương pháp này có thể phânbiệt được các tế bào non và tế bào trưởng thành, từ đó giúp đánh giá khả năngtồn tại và phát triển của tế bào gốc Kỹ thuật này thực hiện như sau:

− Các tế bào nuôi cấy thu hoạch xong được đổ lam bằng máy Cytotex;

− Để khô tự nhiên ở nhiệt độ phòng 30 phút;

− Cố định bằng cồn tuyệt đối và để khô;

− Nhỏ 1ml Giêmsa 10%, phủ kín vị trí tế bào trên lam kính x 10 phút;

− Rửa Giêmsa bằng nước máy;

− Để khô ở nhiệt độ phòng;

− Đọc ở vật kính 40x và vật kính dầu 100x;

2.3.4 Đếm tế bào CD34+ bằng phương pháp đếm tế bào dòng chảy

Dựa trên kỹ thuật đếm tế bào dòng chảy Sử dụng kháng thể đơn dònggắn chất huỳnh quang (FITC, PE) để xác định dấu ấn kháng nguyên trên bềmặt tế bào xác định dấu ấn miễn dịch đặc trưng cho tế bào gốc tạo máu CD34.Các bước tiến hành được thực hiện như sau:

- Đánh dấu ống (viết tên hoặc số);

- Dùng pipet cho 50µl mẫu vào ống Trucount Lưu ý dùng phương pháphút pipet đảo ngược (reverse pipet);

- Thêm 20µl dung dịch CD45FITC/CD34PE, thêm 10µl dung dịch AAD;

7 Đậy ống và lắc đều bằng vortex;

- Ủ trong tối 15 phút / nhiệt độ phòng (220C);

- Thêm 1ml dung dịch ammonium chlorid lysing;

- Đậy nắp ống và lắc đều bằng vortex;

- Ủ trong tối 15 phút / nhiệt độ phòng (220C);

- Tiến hành phân tích mẫu bằng phần mềm FACS Canto;

2.3.5 Quy trình thử hoạt tính của IL-11

Các tế bào được rã đông bằng cách lấy tube tế bào từ nitơ lỏng cho ngayvào 370C cho đến khi tan hoàn toàn, cho thêm môi trường RPMI và ly tâm bỏdịch nổi, sau đó hoà tan cặn và đếm tế bào, sau đó pha loãng theo quy trìnhnuôi cấy với số lượng tế bào 300000 tế bào sống/ml, sau đó nuôi cấy 72 giờmới cho thuốc gồm các giếng chứng âm, chứng dương và thử nghiệm Tiếptục nuôi cấy 72 giờ kể từ khi cho IL-11, tiến hành thu hoạch tế bào để đổ lam

và đếm CD34+ Nồng độ Il-11 là 1ng, 10ng và 50ng/ml, dựa theo nồng độ thửtrên tế bào dòng

Sơ đồ 1 Sơ đồ thử nghiệm tác dụng sinh học của IL-11

2.3.6 Xử lý số liệu

Các số liệu được xử lý bằng phần mềm GRAPH PRISM 7.02

2.4 Vật liệu, dụng cụ nghiên cứu

2.4.1 Vật liệu nghiên cứu

- Tủy xương bình thường và tủy xương bệnh nhân suy tủy

- IL-11 chuẩn do hãng Biovision cung cấp (tên thương phẩm)

- IL-11 tái tổ hợp do viện công nghệ sinh học cung cấp

- Bơm tiêm nhựa các loại: 1ml, 3ml, 5ml

- Pipette man các loại từ 10-1000µl

- Đầu côn các loại

- Pipet điện tử dùng cho pipet nhựa các loại 5m, 10ml, 20ml

- Lọ nuôi cấy

- Đĩa (plate) nuôi cấy 12, 24, 96 giếng

- Cốc thủy tinh chia vạch các loại

- Giấy thấm/lau loại không tan

2.4.3 Trang thiết bị phục vụ nghiên cứu

- Tủ âm sâu -800C

- Máy đếm tế bào dòng chảy

2.5 Đạo đức nghiên cứu

Chúng tôi sử dụng mẫu tủy xương của những bệnh nhân đã được làmxét nghiệm và chẩn đoán, được sự cho phép của khoa Huyết học Bệnh việnNhi Trung Ương

Đảm bảo giữ bí mật về các thông tin liên quan đến sức khỏe cũng nhưcác thông tin cá nhân khác của đối tượng nghiên cứu Mẫu tủy xương chỉ sửdụng cho mục đích nghiên cứu phục vụ sức khỏe bệnh nhân

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

3.1 Hình thái tế bào

3.1.1 Hình thái tế bào trước và sau khi nuôi cấy chưa thử thuốc

Các tế bào trước nuôi cấy (A) chủ yếu là bạch cầu đơn nhân, có lẫnbạch cầu trung tính, hồng cầu Sau nuôi cấy 72h (B) có thấy tế bào non (mũitên màu đỏ) Có tế bào trung gian

Nhận xét:

Hình 3.1: (A) Trước nuôi cấy 72h; (B) Sau nuôi cấy

Nhận xét: Các tế bào trước nuôi cấy có mật độ thấp hơn, có tuổi trung gian,

nhưng ít hơn so với sau nuôi cấy 72h

3.1.2 Hình thái tế bào ở các nhóm thử thuốc 72 giờ (IL-11: 50ng/ml)

(A) Có tế bào trung gian, kiềm tính, nhân lớn (mũi tên màu đỏ)

(B) : Chứng dương IL-11 Tế bào non (kích thước lớn, kiềm tính (mũi tên màu trắng) Tế bào trung gian, kiềm tính, nhân lớn (mũi tên màu đỏ) Tế bào hồng cầu non (mũi tên màu xanh)

A

B

Hình 3.2: (A) Chứng âm ; (B) Chứng dương; (C) Thử nghiệm

Nhận xét: Các tế bào nuôi cấy phát triển tốt, có nhiều tế bào có đặc điểm là tế

bào trung gian ở các nhóm nghiên cứu giống như tủy đồ Có các tế bào hồng cầu non

C

Số lượng bạch cầu sau khi

nuôi cấy 72h(x105/ ml)

X ± SD

5

Biểu đồ 3.1: Số lượng tế bào bạch cầu trước và sau nuôi cấy 72h của bệnh

nhân tủy bình thường Nhận xét: Số lượng tế bào sau nuôi cấy tăng nhiều hơn so với trước nuôi cấy

Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với p<0.05

Bảng 3.2: Số lượng tế bào CD34+ trước và sau nuôi cấy 72h

Biểu đồ 3.2: Số lượng CD34+ trước và sau nuôi cấy của bệnh nhân có tủy

bình thường Nhận xét: Số lượng CD34+ sau khi nuôi cấy 72h cao hơn so với trước khi nuôi

cấy Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với p<0.05

3.2.2 Đánh giá tác dụng tăng sinh của IL-11 trên tế bào gốc tạo máu

CD34+ trên bệnh nhân có tủy bình thường.

Các tế bào thu được sau khi tách qua Ficoll, nuôi cấy 2 ngày rồi đếm sốlượng bạch cầu và CD34+ và cho IL-11 với các nồng độ 1ng/ml, 10ng/ml,50ng/ml, nuôi tiếp 3 ngày Kết quả được trình bày trong các bảng sau:

Bảng 3.3: So sánh số lượng tế bào CD34+ ở các nhóm nghiên cứu

với nồng độ IL-11 là 1ng/ml

Trung

Chứng âm(tế bào/ml)

IL-11 chuẩn (chứng dương)(tế bào/ml)

IL-11 thử nghiệm(tế bào/ml)X±SD

5

Biểu đồ 3.3 Số lượng CD34+ ở các nhóm nghiên cứu với nồng độ 1ng/ml

của bệnh nhân có tủy bình thường Nhận xét:

Với nồng độ 1ng/ml số lượng tế bào trong nhóm dùng IL-11 thửnghiệm cao hơn chứng âm và cả nhóm chứng dương với p<0.05

Bảng 3.4: So sánh số lượng tế bào CD34+ ở các nhóm nghiên cứu với

nồng độ IL-11 là 10ng/ml

Trung bình n Chứng âm

(tế bào/ml)

IL-11 chuẩn (chứng dương)(tế bào/ml)

IL-11 thử nghiệm(tế bào/ml)

Biểu đồ 3.4 Số lượng CD34+ ở các nhóm nghiên cứu với nồng độ 10ng/ml

của bệnh nhân có tủy bình thường Nhận xét:

Với nồng độ 10ng/ml số lượng tế bào trong nhóm dùng IL-11 thửnghiệm cao hơn chứng âm và cả nhóm chứng dương với p<0.05

Bảng 3.5: So sánh số lượng tế bào CD34+ ở các nhóm nghiên cứu với

nồng độ IL-11 là 50 ng/ml (tủy bình thường)

IL-11 thử nghiệm(tế bào/ml)X±SD

5

Biểu đồ 3.5: Số lượng CD34+ ở các nhóm nghiên cứu với nồng độ 50ng/ml

của bệnh nhân có tủy bình thường Nhận xét:

Với nồng độ 50ng/ml số lượng tế bào trong nhóm dùng IL-11 thửnghiệm cao hơn chứng âm và cả nhóm chứng dương với p<0.05

3.2.3 Tác dụng tăng sinh tế bào của IL-11 đối với tế bào gốc CD34+ thu được từ máu ngoại vi

Đối với việc tách tế bào bằng phương pháp làm giàu tế bào CD34+ từmáu ngoại vi cũng cho những kết quả tốt, được trình bày trong bảng 6.

Bảng 3.6: So sánh số lượng tế bào CD34+ ở các nhóm nghiên cứu với

nồng độ IL-11 là 50 ng/ml (máu ngoại vi)

(tế bào/ml)

IL-11 chuẩn (chứng dương)(tế bào/ml)

IL-11 thử nghiệm(tế bào/ml)

Nhận xét :

Số lượng tế bào gốc thu được cao hơn rất nhiều so với tách từ tủy xương

Số tế bào CD34+ ở cả nhóm chứng và nghiệm đều tăng so với chứng âm Tuynhiên, nhóm thử nghiệm cao hơn với p<0.05

3.2.4 Tác dụng tăng sinh tế bào của IL-11 trên tế bào gốc tạo máu CD34+ với tủy xương giảm cả 3 dòng hồng cầu, bạch cầu và tiểu cầu

Bảng 3.7 Số lượng tế bào HC, BC, TC máu ngoại vi ở bệnh nhân suy tủy

Trung bình n BC (x10^3/ml) Các dòng tế bàoHC (x10^6/ml) TC (x10^3/ml)

Bảng 3.8: Số lượng tế bào trước và sau nuôi cấy 72h ở bệnh nhân suy tủy

Trung bình n Trước nuôi cấy

trước khi nuôi cấy với p<0.05.

Bảng 3.10: Số lượng CD34+ trước và sau thử nghiệm IL-11 ở 72h

với nồng độ 1ng/ml ở bệnh nhân suy tủy

Trung

Chứng âm(tế bào/ml)

IL-11 chuẩn(chứng dương)(tế bào/ml)

IL-11 thử nghiệm(tế bào/ml)X±SD

5

Biểu đồ 3.8: Số lượng CD34+ ở các nhóm nghiên cứu với nồng độ 1ng/ml ở

bệnh nhân suy tủy

Nhận xét: Với nồng độ 1ng/ml số lượng tế bào trong nhóm dùng IL-11 thửnghiệm cao hơn chứng âm và cả nhóm chứng dương