NGHIÊN CỨU MỘT SỐ CHỦNG XẠ KHUẨN SINH HOẠT CHẤT KHÁNG NẤM FUSARIUM GÂY HẠI TRÊN CÂY CÀ CHUA (LYCOPERSICON ESCULENTUM MILL.)

HỒ CHÍ MINH Đặng Đào Ý Đoan NGHIÊN CỨU MỘT SỐ CHỦNG XẠ KHUẨN SINH HOẠT CHẤT KHÁNG NẤM FUSARIUM GÂY HẠI TRÊN CÂY CÀ CHUA LYCOPERSICON ESCULENTUM MILL... HỒ CHÍ MINH Đặng Đào Ý Đoan N

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP HỒ CHÍ MINH

Đặng Đào Ý Đoan

NGHIÊN CỨU MỘT SỐ CHỦNG XẠ KHUẨN

SINH HOẠT CHẤT KHÁNG NẤM FUSARIUM

GÂY HẠI TRÊN CÂY CÀ CHUA

(LYCOPERSICON ESCULENTUM MILL.)

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Thành ph ố Hồ Chí Minh - 2014

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP HỒ CHÍ MINH

Đặng Đào Ý Đoan

NGHIÊN CỨU MỘT SỐ CHỦNG XẠ KHUẨN

SINH HOẠT CHẤT KHÁNG NẤM FUSARIUM

GÂY HẠI TRÊN CÂY CÀ CHUA

(LYCOPERSICON ESCULENTUM MILL.)

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

TS TRẦN THANH THỦY

Thành phố Hồ Chí Minh - 2014

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực và chưa từng được công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Tác giả luận văn

Đặng Đào Ý Đoan

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS Trần Thanh Thủy, người đã trực tiếp hướng dẫn, tận tình chỉ dẫn tôi trong suốt quá trình xây dựng đề cương và hoàn thành luận văn Cô đã giúp đỡ và tạo mọi điều kiện tốt nhất để tôi hoàn thành luận văn này

Xin chân thành cảm ơn Ths Trần Thị Minh Định cùng toàn thể các thầy cô khoa Sinh và cán bộ phòng Vi sinh – Sinh hóa, Trường Đại học Sư phạm Thành phố Hồ Chí Minh đã tạo nhiều điều kiện để tôi hoàn thành luận văn

Cuối cùng, tôi xin gởi lời cảm ơn đến các thầy cô, bạn bè và những người thân trong gia đình đã luôn bên cạnh và tạo điều thuận lợi để tôi hoàn thành luận văn này

MỤC LỤC

Trang phụ bìa

Lời cam đoan

Lời cảm ơn

Mục lục

Danh mục các chữ viết tắt

Danh mục các bảng

Danh mục các hình

M Ở ĐẦU 1

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Fusarium gây bệnh trên cây cà chua 3

1.1.1 Nấm Fusarium 3

1.1.2 Cây cà chua 8

1.2 Xạ khuẩn 13

1.2.1 Đặc điểm sinh học của xạ khuẩn 13

1.2.3 Các đặc điểm phân loại xạ khuẩn 15

1.2.4 Các chất có hoạt tính sinh học từ xạ khuẩn 16

1.3 Chất kháng sinh 18

1.3.1 Lược sử nghiên cứu chất kháng sinh 18

1.3.2 Cơ chế tác động của chất kháng sinh 20

1.3.4 Các chất kháng sinh có khả năng kháng nấm từ xạ khuẩn 22

1.3.5 Tình hình nghiên cứu và sử dụng các kháng sinh có nguồn gốc từ xạ khuẩn trên thế giới và Việt Nam 24

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27

2.1 Vật liệu 27

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu Error! Bookmark not defined 2.1.2 Hóa chất 27

2.1.3 Thiết bị và dụng cụ 27

2.1.4 Các môi trường sử dụng trong nghiên cứu 27

2.2 Phương pháp nghiên cứu 28

2.2.1 Phân lập xạ khuẩn 28

2.2.3 Quan sát hình thái xạ khuẩn 30

2.2.4 Xác định khả năng kháng nấm của XK 30

2.2.5 Tuyển chọn các chủng XK sinh chất kháng nấm 31

2.2.6 Phương pháp định loại xạ khuẩn bằng kĩ thuật di truyền phân tử 31

2.2.7 Khảo sát môi trường và điều kiện nuôi cấy thích hợp 34

2.2.8 Phương pháp tách chiết chất kháng nấm 36

2.2.9 Xác định ảnh hưởng của dịch lên men đến khả năng nảy mầm của hạt và sự sinh trưởng của cây cà chua 37

2.2.10 Thử nghiệm khả năng kháng Fusarium của dịch lên men XK trên cây cà chua 37

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 40

3.1 Phân lập và tuyển chọn chủng xạ khuẩn có khả năng sinh hoạt chất kháng nấm Fusarium 40

3.2 Đặc điểm hình thái của chủng D7 42

3.3 Định danh đến loài chủng xạ khuẩn D7 44

3.4 Khảo sát môi trường và điều kiện nuôi cấy thích hợp cho chủng S pseudogriseolus sinh hoạt tính kháng Fusarium 45

3.4.1 Lựa chọn MT và thời gian lên men thích hợp 45

3.4.2 Ảnh hưởng của nguồn cacbon 48

3.4.3 Ảnh hưởng của hàm lượng cacbon 49

3.4.4 Ảnh hưởng của nguồn nitơ 51

3.4.5 Ảnh hưởng của hàm lượng nitơ 53

3.4.6 Ảnh hưởng pH ban đầu của MT nuôi cấy 54

3.4.7 Ảnh hưởng của nhiệt độ môi trường nuôi cấy 55

3.4.8 Động học của quá trình lên men sinh tổng hợp chất kháng nấm của chủng S pseudogriseolus 57

3.5 Tách chiết chất kháng nấm 59

3.6 Bước đầu tìm hiểu ảnh hưởng của dịch lên men đến khả năng nảy mầm của hạt và sự phát triển của cây cà chua trong phòng thí nghiệm 62

3.7 Kết quả thử nghiệm khả năng kháng Fusarium của dich lên men chủng

XK trên cây cà chua trong chậu thí nghiệm 67

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 71 TÀI LIỆU THAM KHẢO 73 PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1 Thành phần của phản ứng PCR 32

Bảng 3.1 Các chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng Fusarium 41 Bảng 3.2 Ảnh hưởng của các loại MT đến hoạt tính kháng Fusarium của

chủng S pseudogriseolus theo thời gian 46

Bảng 3.3 Ảnh hưởng của nguồn cacbon đến hoạt tính kháng 48

Bảng 3.4 Ảnh hưởng của hàm lượng cacbon đến hoạt tính kháng Fusarium

của chủng S pseudogriseolus 50 Bảng 3.5 Ảnh hưởng của nguồn nitơ đến hoạt chất kháng Fusarium của

chủng S pseudogriseolus 51 Bảng 3.6 Ảnh hưởng của hàm lượng nitơ đến hoạt tính kháng Fusarium

của chủng S pseudogriseolus tại 72 h 53 Bảng 3.7 Ảnh hưởng pH ban đầu của MT lên hoạt tính kháng Fusarium

của chủng S pseudogriseolus sau 72h 54 Bảng 3.8 Ảnh hưởng nhiệt độ của MT lên hoạt tính kháng Fusarium của

chủng S pseudogriseolus sau 72 h 56 Bảng 3.9 Động học quá trình lên men sinh tổng hợp chất kháng Fusarium

của chủng S pseudogriseolus 57 Bảng 3.10 Hoạt tính kháng Fusarium của chủng S pseudogriseolus được

chiết bằng các dung môi hữu cơ từ sinh khối 60

Bảng 3.11 Hoạt tính kháng Fusarium của chủng S pseudogriseolus được

chiết bằng các dung môi hữu cơ từ dịch lên men 61 Bảng 3.12 Tỉ lệ nảy mầm của hạt khi ngâm ở dịch lên men ở các nồng độ

khác nhau 63 Bảng 3.13 Ảnh hưởng của dịch lên men lên khả năng sinh trưởng của cây

cà chua 65

Bảng 3.14 Ảnh hưởng của dịch lên men đến khả năng ức chế Fusarium trên

cây cà chua 67

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Bào tử của Fusarium 4

Hình 1.2 Penicillium notatum ức chế sự phát triển của Staphylococus aureus 18

Hình 1.3 Vị trí tác động của kháng sinh 20

Hình 1.4 Cấu trúc của kasugamyxin 22

Hình 1.5 Cấu trúc của polioxin 23

Hình 1.6 Cấu trúc của blastixidin S 23

Hình 1.7 Cấu trúc validamyxin A 24

Hình 3.1 Hình thái khuẩn lạc một số chủng xạ khuẩn phân lập được 40

Hình 3.2 Hoạt tính kháng Fusarium của 8 chủng XK tuyển chọn được 42

Hình 3.3 Đặc điểm hình thái khuẩn lạc của chủng xạ khuẩn D7 43

Hình 3.4 Hệ sợi chủng D7 43

Hình 3.5 Cuống sinh bào tử và bào tử chủng D7 43

Hình 3.6 Kết quả giải trình tự ARNr 16S của chủng D7 44

Hình 3.7 Biểu đồ ảnh hưởng của thành phần MT đến hoạt tính kháng Fusarium của chủng S pseudogriseolus theo thời gian 47

Hình 3.8 Hoạt tính kháng Fusarium của chủng D7 trên 4 loại MT sau 72 h nuôi cấy 48

Hình 3.9 Ảnh hưởng của nguồn cacbon đến hoạt tính kháng Fusarium của chủng S pseudogriseolus 49

Hình 3.10 Đồ thị ảnh hưởng của hàm lượng cacbon đến hoạt tính kháng Fusarium c ủa chủng S pseudogriseolus sau 72 h 51

Hình 3.11 Biểu đồ ảnh hưởng của nguồn nitơ đến hoạt tính kháng Fusarium của chủng S pseudogriseolus sau 72h 52

Hình 3.12 Đồ thị ảnh hưởng hàm lượng nitơ đến hoạt tính kháng Fusarium của chủng S pseudogriseolus 53

Hình 3.13 Ảnh hưởng pH ban đầu của MT lên hoạt tính kháng Fusarium của chủng S pseudogriseolus 55

Hình 3.14 Đồ thị ảnh hưởng nhiệt độ lên hoạt tính kháng Fusarium của

chủng S pseudogriseolus 56

Hình 3.15 Động thái quá trình lên men sinh tổng hợp chất kháng Fusarium của chủng S pseudogriseolus theo thời gian 58

Hình 3.16 Biểu đồ hoạt tính kháng Fusarium của chủng S pseudogriseolus được chiết bằng các dung môi hữu cơ từ sinh khối 60

Hình 3.17 Hoạt tính kháng Fusarium của chủng S pseudogriseolus được chiết bằng các dung môi hữu cơ từ dịch lên men 61

Hình 3.18 Dịch lên men của chủng S pseudogriseolus 62

Hình 3.19 Biểu đồ ảnh hưởng của nồng độ dịch lên men đến khả năng nảy mầm của hạt cà chua 63

Hình 3.20 Tỉ lệ nảy mầm của hạt khi xử lý dịch lên men chủng S pseudogriseolus ở các nồng độ khác nhau 64

Hình 3.21 Ảnh hưởng của nồng độ dịch lên men đến khả năng sinh trưởng của cây cà chua 66

Hình 3.22 Ảnh hưởng của dịch lên men đến sự phát triển của rễ cây cà chua 66

Hình 3.23 Cây cà chua sinh trưởng bình thường sau thời gian 68

Hình 3.24 Cây cà chua bị nhiễm Fusarium sau thời gian 68

Hình 3.25 Cây cà chua sau 4 tuần ở lô ĐC 1 69

Hình 3.26 Cây cà chua sau 4 tuần ở lô ĐC 2 69

Hình 3.27 Cây cà chua sau 4 tuần ở lô TN1 69

Hình 3.28 Cây cà chua sau 4 tuần ở lô TN2 69

M Ở ĐẦU

1 Lí do ch ọn đề tài

Việt Nam nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa, nóng ẩm quanh năm nên thuận lợi cho sự phát triển của nhiều loại cây trồng, đặc biệt là các loại rau màu Đồng thời, điều kiện khí hậu nơi đây cũng rất thuận lợi cho sự phát triển của nhiều

loại vi sinh vật (VSV) trong đó có VSV gây hại cây trồng

Trong các loại rau màu ở nước ta, cà chua được xếp vào loại rau trồng có giá trị kinh tế và cho sản lượng khá cao hàng năm Riêng ở Lâm đồng, theo thống kê của Sở Nông nghiệp và Phát triển nông thôn tỉnh này, năng suất cà chua trung bình hiện nay là 70 tấn/ha/vụ Tuy nhiên, các loại bệnh do vi nấm gây ra đã làm giảm

năng suất thu hoạch từ 30-70% trên rau màu Đặc biệt, Fusarium là tác nhân gây

bệnh trên rất nhiều loại cây trồng, trong đó có cây cà chua Chúng có thể gây hại trên mọi giai đoạn sinh trưởng của cây cà chua, làm lá biến vàng héo khô dần, cây sinh trưởng yếu và cuối cùng toàn cây bị héo chết Thêm nữa, các bệnh cây do chúng gây ra có thể lan rộng nhanh chóng thành dịch lớn trên đồng ruộng nhờ gió, mưa và cả các hoạt động của côn trùng [3,7,11]

Để phòng trừ nấm gây bệnh, người nông dân thường sử dụng nhiều loại thuốc hóa học Mỗi năm, Việt Nam sử dụng khoảng 25000 tấn thuốc hóa học diệt sâu

bệnh Theo thống kê năm 2004, ở Việt Nam có tới 436 loại hóa chất với 1231 tên thương phẩm hóa học khác nhau [37] Mặc dù biện pháp này có ưu điểm lớn là diệt

trừ dịch hại nhanh chóng, triệt để, có hiệu quả cao nhưng lại rất tốn kém, gây ô nhiễm môi trường (MT), làm mất cân bằng sinh thái, ảnh hưởng đến sức khỏe con người và vật nuôi

Vì vậy, để khắc phục những hạn chế này, xu hướng hiện nay là sử dụng các tác nhân sinh học hay những sản phẩm trao đổi chất của những tác nhân này để phòng, trừ bệnh hại cây trồng Trong số đó, xạ khuẩn (XK) là nhóm có nhiều tiềm năng nhất vì tỷ lệ loài có khả năng sinh chất kháng sinh cao, trong đó có nhiều chất kháng sinh có khả năng chống nấm mạnh

Từ những lí do trên, với mong muốn tìm hiểu và khai thác nguồn tài nguyên VSV

vô cùng phong phú của Việt Nam, chúng tôi quyết định thực hiện đề tài nghiên cứu:

“Nghiên cứu một số chủng xạ khuẩn sinh hoạt chất kháng nấm Fusarium gây hại trên cây cà chua (Lycopersicon esculentum Mill.)”

2 M ục tiêu

Thu nhận và thử nghiệm tác dụng chất kháng Fusarium gây bệnh trên cây cà

chua từ chủng xạ khuẩn tuyển chọn

3 N ội dung nghiên cứu

- Phân lập và tuyển chọn chủng XK có khả năng sinh hoạt chất kháng nấm

Fusarium cao từ đất trồng cà chua tại Ấp Long Giêng, xã Phước Hậu, huyện Cần Giuộc, tỉnh Long An

- Nghiên cứu đặc điểm sinh học và phân loại đến loài của chủng XK tuyển

chọn

- Khảo sát điều kiện lên men thích hợp cho việc sinh chất kháng Fusarium của

chủng XK

- Thu nhận chất kháng Fusarium từ chủng XK nghiên cứu

- Bước đầu thử nghiệm ứng dụng dịch lên men chất kháng nấm để phòng trừ

Fusarium gây bệnh trên cây cà chua

4 Đối tượng nghiên cứu

- Các chủng XK phân lập từ đất trồng cà chua, tại Ấp Long Giêng, xã Phước

Hậu, huyện Cần Giuộc, tỉnh Long An

- Nấm Fusarium do Trường ĐH Nông Lâm cung cấp

- Giống cà chua được cung cấp từ Công ty TNHH Nguyên Nông - Gino

(146/ 6A Võ Thị Sáu, quận 3, Tp.HCM)

5 Ý nghĩa của đề tài

Góp phần tìm hiểu về khả năng phòng trừ các bệnh do nấm Fusarium gây ra

trên cây trồng của xạ khuẩn

6 Th ời gian và địa điểm nghiên cứu

Thời gian: 12/2013 – 8/2014 Địa điểm: phòng thí nghiệm Vi sinh – Sinh hóa Trường Đại học Sư phạm TP.HCM Tiến hành thực nghiệm tại 96 A, Lý Phục Man, Bình Thuận, quận 7, Tp.HCM

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Fusarium gây bệnh trên cây cà chua

1.1.1 Nấm Fusarium

1.1.1.1 Đặc điểm sinh học

Fusarium là chi lớn nhất trong họ Tuberculariaceae Chúng sống hoại sinh hoặc ký sinh trên nhiều cây trồng, cây ăn trái và rau Hệ sợi nấm phân nhánh, có vách ngăn, sợi nấm thường không màu và chuyển màu nâu khi già Hệ sợi nấm sản sinh độc tố tiết vào hệ mạch gây héo cây chủ Cơ thể dinh dưỡng dạng sợi đa bào, phân nhánh phức tạp, vách ngăn có lỗ thủng đơn giản ở giữa, trong tế bào có một nhân hoặc nhiều nhân Vách tế bào bằng chitin, glucan Trên MT nuôi cấy, tản nấm

có thể tơi xốp như bông, bằng phẳng hoặc lan rộng trên bề mặt môi trường Mặt trên của tản nấm có màu trắng, kem, vàng cam, đỏ, tím hồng hoặc tím Mặt dưới có thể không màu, hoặc vàng cam, đỏ, tía sẫm hay màu nâu BT lớn hơi cong hình lưỡi liềm, có 3 – 5 vách ngăn, kích thước từ 27 - 46 x 3 - 5µm BT nhỏ hình ovan hoặc elip, kích thước từ 5 – 12 x 2,2 – 3,5µm, không có vách ngăn, BT được hình thành trong bọc giả

Fusarium có 2 hình thức sinh sản: sinh sản sinh dưỡng và sinh sản vô tính Thiếu giai đoạn sinh sản hữu tính trong vòng đời nên người ta gọi chung là nấm không hoàn chỉnh hay nấm bất toàn

- Sinh sản sinh dưỡng: từ 1 sợi nấm riêng rẽ, khi gặp điều kiện thuận lợi sẽ sinh trưởng và phân nhánh thành hệ sợi nấm Bào tử hậu (BT màng dày, BT áo) là những tế bào hơi tròn, có tế bào chất được cô đặc lại, có màng dày bao bọc Thỉnh thoảng có bào tử hậu với vách tế bào xù xì hoặc có sắc tố Ở bào tử này, chất dinh dưỡng được chuyển từ tế bào kề bên sang tế bào ưu tiên làm tế bào này phồng lên, chứa nhiều chất dự trữ và có thể chịu đựng những điều kiện bất lợi trong thời gian dài Khi gặp điều kiện thuận lợi chúng sẽ nảy mầm và phát triển thành sợi nấm mới

- Sinh sản vô tính bằng bào tử (BT) gồm BT đính lớn, BT đính nhỏ + BT đính lớn (bào tử lớn) có kích thước 3 – 8 x 11 - 70µm, trong suốt, dài, nhiều nhân, hình liềm hoặc cong được sinh ra từ cuống bào tử Đầu và cuối bào tử lớn thuôn và nhọn Một vài BT lớn tách rời và không gắn trên cuống BT Những tế

bào sinh BT lớn gọi là thể bình [4, 5]

+ BT đính nhỏ (BT nhỏ) kích thước 2 – 4 x 4 – 8 µm, được hình thành từ thể bình hoặc những cuống BT phân nhánh hoặc không phân nhánh, có thể mọc trực tiếp từ sợi nấm tạo thành dạng bọc giả trên đầu cành hoặc hình thành dạng chuỗi

BT có nhiều hình dạng khác nhau như hình cầu, hình oval, hình thoi, hình trứng [

4, 5]

1.1.1.2 Tác hại của Fusarium trên rau màu

Fusarium là nấm phân bố rộng ở tất cả các vùng địa lý trên thế giới, có khả

năng gây bệnh với nhiều loại cây trồng Fusarium đã gây thiệt hại rất lớn đến nền

sản xuất nông nghiệp ở Việt Nam cũng như trên thế giới Hằng năm, tại Pakistan

bệnh do Fusarium đã làm năng suất đậu xanh giảm 10 – 50% (Khan et al., 2002)

[23] Ở Braxin, nấm này cũng làm năng suất cây cà chua giảm từ 45 – 80% hàng

năm [24] Fusarium gây ra nhiều bệnh khác nhau trên cây trồng như héo do tắc bó

mạch, thối rễ, thân, củ Một số loài cũng sản sinh độc tố nấm lẫn tạp trong hạt ngũ

cốc Ví dụ, sự có mặt của F oxysporum trên cây gây các bệnh héo do tắc mạch, hay

ký sinh trên hệ rễ gây bệnh thối rễ Chúng gây thối dưa hấu và củ khoai tây đã bị sâu hoặc do dụng cụ gặt hái làm tổn thương Chỉ tính riêng với khoai tây thiệt hại do

Fusarium gây thối củ trên đồng ruộng và trong bảo quản cũng đã chiếm tới 20% sản

lượng thu hoạch được [29, 35, 41] Thối bắp ngô, chủ yếu do F graminearum và F verticilliodes gây ra, cả hai loài đều sản sinh độc tố nấm tồn tại trong hạt F moniliform tiết ra giberelin kích thích sự sinh trưởng gây bệnh lúa von Chúng còn

Hình 1.1 Bào tử của Fusarium

a BT đính lớn

b Bào tử đính nhỏ

c Bào tử hậu (BT vách dày)

tiết ra fumonisin gây bệnh ung thư thực quản ở người (Mazasass, 1972) Một số

dạng F solani gây thối cổ rễ cây con họ đậu Hà Lan, đậu cô ve và thối rễ ở các cây trưởng thành Các bệnh héo Fusarium thường nghiêm trọng hơn trong điều kiện

thời tiết ấm và ẩm ướt, nhiệt độ trung bình 27 – 300C Nấm gây bệnh có thể lan truyền qua hạt giống, cây nhiễm bệnh hoặc lan truyền theo nước tưới và nhờ gió (Haware , 1978) [45]

Con đường xâm nhiễm của Fusarium từ sợi nấm và bào tử nảy mầm trong tàn

dư cây bệnh và đất xâm nhiễm vào rễ con còn non, sau đó lan dần vào các mạch xylem Sau khi phát triển trong mạch xylem sẽ lan lên hệ thống mạch dẫn trong thân, gây tắc mạch xylem làm giảm lượng nước di chuyển lên cây, khiến cho cây bị héo rồi chết Quá trình này gây phản ứng của cây, tạo ra các hợp chất phenol và tạo

ra thể sần có màu nâu (Nene, 1991) [45]

Các triệu chứng bệnh thường thấy do Fusarium gây ra trên cây cà chua con lá

cây không phát triển được và trở nên khô héo Ở những cây trưởng thành, lá sẽ bị héo rũ cụp xuống, thường bắt đầu từ các lá chét phía gốc ở một bên cây sau đó lan

ra toàn cây làm cho lá héo rũ, màu vàng Vết bệnh ở trên thân sát mặt đất hoặc cổ rễ thường có màu nâu, vết bệnh lớn dần làm khô tóp cả đoạn thân sát mặt đất, bộ rễ kém phát triển, rễ thối dần và chết đi [3, 7, 9, 18, 20]

1.1.2.3 Các biện pháp phòng trừ nấm Fusarium gây hại trên rau màu

Phòng và trừ bệnh hại là hai mặt không thể tách rời nhau của việc bảo vệ cây trồng và nông sản nhằm bảo đảm hiệu quả kinh tế cao Các biện pháp phòng trừ có thể được chia thành các nhóm sau đây dựa trên nguyên lý tác động và phương pháp

sử dụng các biện pháp đó:

• Biện pháp sử dụng giống chống bệnh và giống sạch bệnh

Tuyển chọn các giống chống một loại bệnh hoặc chống một nhóm bệnh có tác dụng làm giảm tổn thất và giảm chi phí cho các biện pháp phòng trừ khác là biện pháp có hiệu quả kinh tế cao Mặt khác, sử dụng giống không mang bệnh để gieo trồng có tác dụng phòng trừ bệnh trên đồng ruộng rất lớn Do đó, đây là biện pháp đem lại hiệu quả, đảm bảo được chất lượng và năng suất cây trồng cao [5]

- Tiêu diệt hoặc làm hạn chế VSV gây bệnh, cản trở sự lây lan và tồn tại của sinh vật gây bệnh, là giải pháp có tác dụng phòng bệnh rất cao

- Biện pháp canh tác đơn giản, dễ thực hiện, dễ dàng kết hợp với các biện pháp khác, không gây hại đến MT [3, 7, 11]

- Nếu sử dụng không hợp lý, không đúng liều lượng sẽ cho hiệu quả thấp, gây độc cho người và gia súc cũng như ô nhiễm MT

- Phần lớn thuốc hóa học có khả năng tiêu diệt nấm bệnh nhưng đồng thời

cũng tiêu diệt các sinh vật có ích, làm phá vỡ cân bằng sinh học, gây khó khăn cho việc áp dụng biện pháp sinh học Mặt khác, chúng có thể để lại dư lượng trên nông sản quá mức cho phép

- Nếu sử dụng liên tục một loại thuốc trừ bệnh ở một vùng dẫn đến có thể làm cho vi sinh vật gây bệnh thích nghi với thuốc và nhờn thuốc [3, 7, 11]

• Biện pháp sinh học

Biện pháp sinh học trong phòng trừ dịch hại rất đa dạng dựa trên nguyên tắc chung là sử dụng sinh vật có ích để hạn chế sinh vật có hại [5] Trong phạm vi đề tài này chúng tôi chỉ giới thiệu biện pháp sinh học bằng việc sử dụng các chế phẩm sinh học có nguồn gốc từ các VSV

Chế phẩm sinh học có ưu điểm không độc cho cây, người và gia súc, không gây ô nhiễm MT Chúng có tác dụng duy trì sự cân bằng hệ sinh thái trong MT không làm thay đổi kết cấu của đất, còn góp phần tăng độ phì nhiêu cho đất [3, 7,

11, 18] Chế phẩm sinh học làm tăng khả năng phân hủy, chuyển hóa các chất hữu

cơ bền vững, các phế thải sinh học, phế thải công nghiệp, nông nghiệp góp phần làm sạch MT Các chế phẩm sinh học là những sản phẩm dạng bột, viên, lỏng…có nguồn gốc trực tiếp từ sinh khối VSV hoặc từ các sản phẩm trao đổi chất của VSV

Các chế phẩm sinh học rất đa dạng nhưng dựa vào mục đích có thể chia thành 3 nhóm: nhóm dùng cho sản xuất phân bón hữu cơ sinh học, phân hữu cơ vi sinh, chất kích thích tăng trưởng bón cho cây trồng; nhóm dùng cho cải tạo đất, xử lý phế thải nông nghiệp và nhóm dùng để phòng trừ sâu bệnh hại Đây là nhóm được sử dụng khá rộng rãi và được ứng dụng sớm nhất trong lĩnh vực cây trồng Hiện nay, trên thị trường Việt Nam có một số chế phẩm sinh học đang được sử dụng phổ biến như: chế phẩm score 250EC (difenoconazole) trừ bệnh đốm đen, phấn trắng, thán thư, gỉ sắt, giác ban trên rau, đốm vòng cà chua và hành Bayleton 250EC (triadimefon) trừ phấn trắng trên rau họ thập tự hay bavistin 50FL (SC), carben 50 SC, zoom 50SC (carbendazim) phòng trừ bệnh đốm lá trên dưa chuột, mốc xám trên cà chua, bệnh phấn trắng trên bầu bí…

Tóm lại, để hướng đến một nền nồng nghiệp sạch bền vững thì các nước trên thế giới nói chung và ở Việt Nam nói riêng cần tăng cường sử dụng các chế phẩm

sinh học, phân bón hữu cơ trong canh tác cây trồng thay dần cho việc sử dụng hóa chất bảo vệ thực vật Đặc biệt đáng chú ý là những chế phẩm có nguồn gốc từ XK

đã đóng góp vai trò rất lớn trong phòng trừ bệnh hại cây trồng trong nông nghiệp hiện nay

Trong các loại rau màu thì cà chua là loại cây chủ mang những đặc điểm rất

thích hợp cho sự gây bệnh của Fusarium

1.1.2 Cây cà chua (Lycopersicon esculentum (L) Mill.)

1.1.2 1 Đặc điểm sinh học

Cây cà chua có tên khoa học là Lycopersicon esculentum (L) Mill., thuộc họ

Cà (Solanaceae), là loại rau ăn quả có nguồn gốc từ Nam Mỹ

Cây cà chua là cây dài ngày, có rễ chùm, ăn sâu và phân nhánh mạnh, khả năng phát triển rễ phụ rất lớn Thân tròn, thẳng đứng, mọng nước, phủ nhiều lông, khi cây lớn gốc thân dần dần hóa gỗ Thân mang lá và phát hoa Lá thuộc lá kép lông chim lẻ, mỗi lá có 3 - 4 đôi lá chét, ngọn lá có 1 lá riêng gọi là lá đỉnh Rìa lá chét đều có răng cưa nông hay sau tùy giống Phiến lá thường phủ lông tơ Hoa mọc thành chùm, lưỡng tính, tự thụ phấn là chính Trái thuộc loại mọng nước, có hình dạng thay đổi từ tròn, bầu dục đến dài Vỏ trái có thể nhẵn hay có khía Màu sắc của trái thay đổi tùy giống và điều kiện thời tiết Hạt cà nhỏ, dẹp, nhiều lông, màu vàng sáng hoặc hơi tối Hạt nằm trong buồng chứa nhiều dịch bào kìm hãm sự nảy mầm của hạt Vòng đời của cây cà chua từ lúc để hạt làm giống là 65 – 80 ngày, được chia làm các giai đoạn sau:

- Cây giống: lá mầm xuất hiện đầu tiên sau 6 – 10 ngày, sau đó các lá các lá chét bắt đầu mọc trong đoạn này thân chưa phân nhánh nhưng hệ rễ phát triển mạnh mẽ khoảng 30 cm trong 2 tuần

- Giai đoạn tăng trưởng của cây cà chua: kéo dài trong 4 tuần, giai đoạn này cây tăng vọt về chiều cao, có thể xuất hiện 4- 5 cành trên thân Số lượng lá cây phát triển nhiều, tán lá rộng Giai đoạn này bắt đầu tích lũy chất dinh dưỡng để chuẩn bị

ra hoa

- Giai đoạn ra hoa và tạo quả: hoa được thụ phấn quả sẽ trưởng thành sau 50 –

55 ngày sau thụ tinh Quả chín và có thu hoạch sau đó 2 tuần

Trong vòng đời phát triển của cây cà chua thì giai đoạn cây giống và giai đoạn

ra hoa tạo quả là cây dễ bị nhiễm bệnh

Cây cà chua có thể sinh trưởng trên nhiều loại đất khác nhau như đất sét, đất

cát, đất pha cát, có độ pH = 6 – 6.5 Đất có độ ẩm cao và ngập nước kéo dài sẽ làm

giảm khả năng sinh trưởng của cây Độ ẩm đất thích hợp cho cà chua là 60 – 70% (Barehyi, 1971), độ ẩm không khí là 78 – 81% Tuy nhiên, khi độ ẩm không khí quá cao (> 90%) dễ làm hạt phấn bị trương nứt, hoa bị rụng (Tạ Thu Cúc, 1983) Nhiệt

độ thích hợp cho cà chua để đạt năng suất cao, chất lượng tốt là khoảng 21 – 240C

và thời tiết khô Nhiệt độ dưới 120C kéo dài sẽ gây thiệt hại nghiêm trọng, nhiệt độ trên 270C kéo dài sẽ hạn chế ra hoa, đậu quả Các tế bào phôi và hạt sẽ bị hủy hoại khi nhiệt độ trên 380C Trước và sau thụ phấn nếu nhiệt độ ban đêm quá 210C thì

khả năng đậu quả kém

1.1.1.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến năng suất và chất lượng cây cà chua

Các yếu tố ảnh hưởng đến năng suất và chất lượng cà chua có thể chia làm 2 nhóm chính: nhóm nguyên nhân phi sinh vật và nhóm nguyên nhân sinh vật

 Nguyên nhân phi sinh vật là những yếu tố tự nhiên, điều kiện ngoại cảnh không phù hợp

- Đất trồng là nguồn cung cấp chủ yếu các chất dinh dưỡng và nước cho cây trồng Cũng như các cây trồng khác, cà chua cần ít nhất 20 nguyên tố dinh dưỡng cho quá trình sinh trưởng và phát triển bình thường của nó Trong các nguyên tố đa lượng thì cà chua cần nhiều kali hơn cả, sau đó đến đạm và lân Nếu đất thiếu đạm

cà chua sẽ bị bệnh, bị biến đổi màu sắc lá, héo úa, cây cằn cỗi Trường hợp đất thiếu lân làm chậm sự phát triển của cây, đặc biệt là trong quá trình hình thành các cơ quan Cây có thể bị chết nếu đất thiếu kali do các mô của cây bị chết dần Nhưng ngược lại, nếu thừa kali thì sẽ làm cho sự hình và chín của quả sớm hơn nhưng quả nhỏ, cây sinh trưởng kém Mặt khác, nếu thiếu các nguyên tố vi lượng cũng gây ra các triệu chứng bệnh cây Thiếu bo các điểm sinh trưởng của cây sẽ bị chết

+ Nước: đất trồng thiếu nước thì cây bị khô héo, dễ gây ra hiện tượng rụng hoa, quả nhất là trong trường hợp thiếu nước đột ngột Ngược lại khi đất thừa nước, nạn ngập úng ảnh hưởng nghiêm trọng đến tình trạng thiếu dưỡng khí trong đất, gây

cản trở cho sự hoạt động của bộ rễ Thừa nước còn ảnh hưởng đến sự hoạt động của tập đoàn vi sinh vật đất, đẩy mạnh hoạt động của vi sinh vật yếm khí, tích lũy các khí độc, nhất là H2S gây độc rễ cây, làm rễ mất khả năng hút nước và chất dinh dưỡng Cây dần dần bị cằn cọc, khô vàng, héo lụi và chết Độ ẩm thay đổi một cách đột ngột, từ khô hạn chuyển sang mưa ẩm, độ ẩm đất tăng lên quá cao cũng dẫn đến tình trạng làm nứt rạn quả Ngoài ra, còn có những trường hợp do cấu tượng của đất

có cấu trúc quá chặt, làm đất dối, đất dễ đóng váng đều ảnh hưởng không tốt đến sự sinh trưởng của cây, đặc biệt là sự phát triển của bộ rễ [3,7, 11]

- Nhiệt độ: cây muốn sinh trưởng và phát triển tốt đòi hỏi phải có nhiệt độ thích hợp Nói chung, cây ở giai đoạn còn non đang sinh trưởng mạnh, chống chịu nhiệt độ kém hơn ở giai đoạn già và giai đoạn tĩnh Mô tế bào chứa nhiều nước chống chịu nhiệt độ kém hơn mô chứa ít nước Nhiệt độ MT quá cao kéo dài có thể làm cho chậm lớn, quả chín không đồng đều, chín ép quá sớm Trong vụ xuân hè, cà chua trồng muộn gặp tiết trời khô hạn và nóng dễ bị hiện tượng cuốn lá hàng loạt, lá thô dày, quả non bị quắt Cà chua có nhiệt độ tối ưu để đảm bảo sự sinh trưởng và phát triển tốt nhất là 21 -240C, nếu nhiệt độ ban đên thấp hơn ngày 4 – 50

C thì cây cho nhiều hoa Nếu nhiệt độ MT quá thấp có thể làm cho lá cây bị rụng, thụ phấn kém, phấn hoa chết Mặt khác, nhiệt độ quá thấp làm thay đổi áp lực thẩm thấu của

tế bào, một số lượng nước trong tế bào thoát ra ngoài mang theo một số chất hòa tan Sau đó, gây đóng băng ở trong các gian bào làm cho cây có hiện tượng bị héo

và tế bào bị hóa nâu, thân, cành có thể bị nứt hoặc sưng u [5]

- Ánh sáng và tia phóng xạ:

+ Ánh sáng: trong điều kiện thiếu ánh sáng sự sinh trưởng của cây bị cản trở Hoạt động quang hợp của lá bị giảm sút, lá cây có màu xanh nhợt nhạt, uốn cong, vươn quá dài, mềm yếu Ngoài ra, cấu tạo bên trong của lá bị biến đổi: vách tế bào mỏng, chống chịu kém, thân yếu Cường độ chiếu sáng tối thiểu để cây tăng trưởng

là 2.000 – 3.000 lux

+ Tia phóng xạ: tác động của tia phóng xạ cũng có thể gây ra những trạng thái bệnh lý của cây làm kìm hãm sinh trưởng, thậm chí tác động với liều lượng cao tia rơnghen, tia α, β… cây có thể bị chết rụi, hoặc nhẹ hơn cây có thể bị rụng lá, hay lá

non không mọc ra được

- Các khí độc trong không gian và chất độc hóa học Trong không khí nhất là các vùng công nghiệp tập trung thường có nhiều khí độc, khói bụi được gió đưa đi xa bao trùm lên cây cối gây ra những tác hại nhất định Bụi khói nhà máy có thể gây tình trạng làm tắc lỗ khí khổng ở lá dẫn tới sự phá hủy chế độ trao đổi khí, lá khô chết và rụng, hoa thụ phấn kém Trong khói nóng thường có các khí độc SO2, H2S, CO2 gây độc làm táp lá khô úa Hay sử dụng thuốc trừ cỏ không đúng kỹ thuật, xử lý đất không đảm bảo đều có thể gây ra các hiện tượng kìm hãm sự sinh trưởng, dị hình các cơ quan rễ, thân lá

 Nguyên nhân sinh vật:

Hàng năm, trên thế giới các vi nấm gây bệnh thực vật như đạo ôn, khô vằn, thối cổ rễ, mốc sương… đã gây tổn thất nặng nề cho mùa màng, chúng chiếm 83% trong số các bệnh ở cây trồng [29] Cà chua trồng trong điều kiện nóng và ẩm ở nước ta dễ mắc nhiều bệnh gây hại đáng kể như héo tươi, virus, khó phòng trị Đặc biệt, ở giai đoạn cây non, cà chua dễ bị các loài vi nấm trong đất (như

Phytophthora, Fusarium, Rhizoctonia…) tấn công gây bệnh

Nấm Rhizoctonia có thể tồn tại trong đất hoặc xác cây trồng trong nhiều năm

dưới dạng hạch nấm Chúng có sợi màu vàng, sau chuyển thành vàng nâu Hạch nấm thường tồn tại trên vết bệnh, bau đầu có màu trắng sau chuyển thành màu nâu Nấm này có thể gây hại trên nhiều loại cây trồng ở các mùa vụ khác nhau

Nấm Sclerotium sống trong đất, sợi nấm màu trắng đâm tia, các sợi nấm màu

trắng đâm tia, các sợi nấm này nảy sinh sản nhiều hạch nhỏ Hạch nấm tồn tại trong đất và có thể xâm nhập trực tiếp với mô cây và gây bệnh cho cây Nấm này gây bệnh trên nhiều loại cây trồng Đặc biệt, chúng gây hại trên cây cà chua và cây lạc ở miền Bắc Việt Nam vào thời điểm trước khi thu hoạch, lúc đó đất trồng quá ẩm ướt

Fusarium là một trong những vi nấm gây thiệt hại đến năng suất và chất lượng cây cà chua Cây bị nhiễm bệnh, lá héo rũ cụp xuống, rễ kém phát triển và bị thối

dần tới cây héo vàng xẹp xuống rồi chết Bệnh do Fusarium có thể lan rộng trên

đồng ruộng

1.1.1.3 Vai trò c ủa cây cà chua

Đầu thế kỷ XVIII, cà chua trở nên phong phú và đa dạng tại các nước Châu

Mỹ và Châu Âu nhưng cuối thế kỉ XVIII, cà chua mới được dùng làm thực phẩm ở Nga và Italia Cho đến cuối thế kỉ XIX, cà chua mới thực sự trở thành loại thực phẩm không thể thiếu trong bữa ăn hàng ngày Ngày nay, cà chua trở thành một trong những loại rau quả được trồng rộng rãi trên toàn thế giới nhờ có giá trị dinh dưỡng cao

Trong thành phần dinh dưỡng của cà chua có chứa nhiều gluxit, nhiều axit hữu

cơ và nhiều loại vitamin cần thiết cho cơ thể con người Cà chua cung cấp năng lượng và khoáng chất, làm tăng sức sống, giúp cân bằng tế bào, khai vị, giải nhiệt, chống hoại huyết, chống nhiễm khuẩn, chống nhiễm độc, lợi tiểu, dễ tiêu hóa Vỏ quả cà chua chứa nhiều chất chống oxy hóa (các hợp chất phenolique, vitamin C và lycopene) Dịch quả cà chua dùng để uống chống suy nhược, ăn không ngon miệng, giảm hàm lượng cholesteron chống xơ cứng động mạch, thống phong, thấp khớp, thừa urê trong máu, sỏi niệu đạo và mật, táo bón, viêm ruột Đặc biệt, sử dụng cà chua hay những sản phẩm từ cà chua có thể chống ung thư tuyến tiền liệt, ung thư

vú Ngoài ra, cà chua còn dùng làm mỹ phẩm, chữa trứng cá Lá cà chua còn được dùng để xua đuổi muỗi và ong bò vẽ

Tuy nhiên, cà chua xanh có thể tiết ra trong tế bào những hợp chất alcaloides tập hợp lại gọi chung là “Solanine” Đây là một chất độc hại nguy hiểm cho cơ thể, giảm khả năng hấp thụ canxi của xương Nhưng hàm lượng solanine sẽ giảm dần khi trái chín Đồng thời, chất solanine sẽ bị phân hủy bởi nhiệt độ khi chế biến

Ở nước ta, việc phát triển trồng cà chua còn có ý nghĩa quan trọng về mặt luân canh, tăng vụ và tăng năng suất trên đơn vị diện tích nên là loại rau được khuyến khích phát triển Tuy nhiên, việc trồng cà chua chưa được phát triển mạnh như

mong muốn do có nhiều tác nhân gây bệnh Trong đó, Fusarium là đối tượng gây

hại phổ biến nhất, làm giảm khả năng sinh trưởng, phát triển và năng suất cây trồng Theo nhiều nghiên cứu của các nhà khoa học thì một trong những tác nhân có khả

năng phòng trừ Fusarium có hiệu quả đó chính là xạ khuẩn

1.2 X ạ khuẩn

Xạ khuẩn có vị trí hệ thống học như sau:

Giới Bacteria Ngành Actinobacteria

Lớp Actinobacteria

Họ Actinomycetaceae

Xạ khuẩn (Actinomycetes, tiếng Hi Lạp: Aktis, aktinos là “tia”, mykes là

“nấm”) XK là những vi khuẩn hình tia, có khuẩn ty phân nhánh, không vách ngăn, thuộc loại Gram (+), sống hiếu khí, hoại sinh và thường gặp ở trong đất và nước [28, 42,43] Chúng mang đặc điểm giống vi khuẩn nhưng cũng rất gần gũi với nấm (Das et al., 2008)

1.2.1 Đặc điểm sinh học của xạ khuẩn

 V ề hình thái

Khác với các VSV khác, khuẩn lạc XK thường ở dạng thô ráp, chắc, xù xì,

dạng phấn, không trong suốt, có nếp tỏa ra theo hình tia phóng xạ Kích thước KL thay đổi tùy loài xạ khuẩn và điều kiện nuôi cấy Đường kính của mỗi khuẩn lạc XK

chỉ chừng 0,5 – 2 mm nhưng cũng có những KL đạt tới 1 cm hoặc lớn hơn Khuẩn

lạc XK có nhiều màu sắc khác nhau: đỏ, da cam, vàng, nâu, xám, trắng…[5, 9,10,14, 17, 28] Khuẩn lạc có cấu trúc 3 lớp: lớp vỏ ngoài có dạng sợi bện chặt, lớp trong tương đối xốp, lớp giữa có cấu trúc tổ ong

Hệ sợi của XK chia ra thành khuẩn ty cơ chất và khuẩn ty khí sinh Đường kính của khuẩn ty thay đổi trong khoảng từ 0,2 – 1,0 µm đến 2 - 3µm Đa số xạ khuẩn có khuẩn ty không có vách ngăn và không tự đứt đoạn Khuẩn ty có màu sắc phong phú màu trắng, vàng, da cam, lam, tím…[38] Khuẩn ty cơ chất phát triển

một thời gian thì dài ra trong không khí thành những khuẩn ty khí sinh Sau một

thời gian phát triển, trên đỉnh của khuẩn ty khí sinh sẽ xuất hiện các cuống BT và chuỗi BT Cuống BT có thể có nhiều hình dạng khác nhau tùy loài: thẳng, lượn sóng, xoắn, móc, vòng…

 V ề cấu trúc

Thành tế bào XK gồm 3 lớp: lớp màng ngoài dày khoảng 60 – 120 AO

, khi già

có thể là 150 AO, lớp giữa rắn và chắc hơn, dày khoảng 50AO, lớp trong dày 50 AO

được cấu tạo chủ yếu từ các lớp glycopeptit gồm các gốc N–axetylglucozamin (NAG) liên kết với các axit N–axetylmuramic (NAM) bởi các liên kết β 1, 4 – glycozit Thành tế bào có tác dụng duy trì hình dáng của khuẩn ty và bảo vệ tế bào

Màng tế bào XK dày khoảng 7,5 – 10 nm, chứa nhiều enzim tham gia quá trình trao đổi chất và quá trình vận chuyển các chất qua màng Màng tế bào được

cấu tạo chủ yếu bởi hai thành phần photpholipit và protein [4,5, 43, 50, 51]

Nhân chưa phân hóa hình thái, chúng thuộc loại tế bào tiền nhân Một trong

những đặc điểm đáng lưu ý của XK là chúng không bền vững về mặt di truyền và thường xảy ra sự tái sắp xếp lại các phần tử ADN Điều này gây ra một số hiện tượng lạ như: tạo ra tính đa hình thái, tính kháng thuốc

Ngoài ra, trong tế bào chất của XK còn có hạt mezoxom và các hạt poliphotphat (hình cầu, bắt màu với thuốc nhuộm Suodan III), các hạt polisaccarit (bắt màu với dung dịch Lugol) Chúng có vai trò làm tăng diện tích tiếp xúc của màng sinh chất do đó làm tăng cường hoạt tính enzym, tăng chuyển điện tử…[4]

 V ề sinh sản

XK sinh sản vô tính bằng bào tử BT được hình thành trên các nhánh phân hóa

của khuẩn ty khí sinh gọi là cuống sinh BT Sự hình thành BT của XK theo 2 phương thức: kết đoạn và cắt khúc

- Kết đoạn: Hạt cromatin trong cuống sinh BT được phân chia thành nhiều hạt phân bố đồng đều dọc theo sợi cuống sinh BT Sau đó tế bào chất tập trung bao bọc quang mỗi hạt cromatin gọi là tiền BT Tiền BT hình thành màng tạo thành BT nằm trong cuống sinh BT Bào tử thường có hình cầu hoặc ôvan và được giải phóng khi màng cuống sinh BT bị phân giải hoặc bị tách ra [51]

- Cắt khúc: Hạt cromatin phân chia phân bố đồng đều dọc theo cuống sinh BT Sau đó, giữa các hạt hình thành vách ngăn ngang, mỗi phần đều có tế bào chất BT hình thành theo kiểu này thường có hình viên trụ hoặc hình que [38]

Ngoài hình thức sinh sản bằng BT, xạ khuẩn còn có hình thức sinh sản sinh dưỡng Các đoạn khuẩn ty gãy ra MT phát triển thành hệ khuẩn ty

Như vậy, có thể nói những đặc điểm sinh học của XK là cơ sở rất quan trọng

để tiến hành định danh XK

1.2.3 Các đặc điểm phân loại xạ khuẩn

XK là nhóm VSV gây nhiều khó khăn trong phân loại Tuy nhiên hiện nay, tùy theo phương pháp phân loại XK người ta dựa vào những tiêu chuẩn sau:

 Theo phương pháp truyền thống: dựa vào các đặc điểm hình thái, tính

chất nuôi cấy, đặc điểm sinh lý – sinh hóa, miễn dịch học Trong các đặc điểm hóa phân loại thì dựa vào thành phần hóa học của thành tế bào là đặc điểm quan trọng

nhất để phân loại XK

Thành t ế bào: XK có một thành tế bào riêng biệt, những biến đổi trên thành

tế bào của XK là điều thuận lợi cho các tiêu chuẩn phân loại Thành tế bào XK được

cấu tạo từ peptidoglycan Trong khi, vi khuẩn Gram (–) có lớp peptidoglycan mỏng

(5 – 20% khối lượng khô của thành tế bào VK) với cấu trúc thông thường thì XK

lớp peptidoglycan dày (30 – 95% khối lượng khô của thành tế bào XK) với cấu trúc

biến đổi mang tính phân loại [2] Thành tế bào XK có chứa một số loại đường ngoài các glucosamine và axit muramic peptidoglycan Thành phần đường này sẽ cung cấp thông tin để phân loại XK (Lechevalier et al., 1970) [28, 32]

Ngoài ra chúng còn có các đặc điểm khác như thành phần đường, menaquinone, photpholipit, axit béo của tế bào và tỷ lệ G+X trong ADN cũng mang tính đặc trưng cho loài và có ý nghĩa quan trọng trong phân loại XK

 Phương pháp hiện đại: tất cả các loài VSV đều có cùng một cách tổng hợp

protein nhờ các riboxom ARNr thành phần cơ bản có trong mọi tế bào VSV Vai trò và chức năng của chúng là giống nhau ở tất cả các riboxom Cấu trúc không gian

của phân tử ARNr rất giống nhau giữa các loài VSV khác nhau

Theo các nhà khoa học thì dung lượng phát sinh loài của phân tử ARNr 23S là

lớn hơn so với phân tử ARNr 16S Tuy nhiên, trình tự đã được xác định hoàn chỉnh

của gen ARNr 23S là rất ít trong khi đó trình tự của gen ARNr 16S là khá phong phú và được công bố rộng rãi trên ngân hàng gen quốc tế

Chính vì vậy, việc dựa vào trình tự gen mã hóa ARNr 16S để làm sáng tỏ mối quan hệ phát sinh chủng loại của VSV được xem là phương pháp lý tưởng nhất, phổ

biến nhất được dùng để định loại XK Hiện nay, người ta đã phân loại được không dưới 10 bộ, 35 họ, 110 chi và 1000 loài Trong đó có khoảng 478 loài đã được công

bố thuộc chi Streptomyces hơn 500 loài thuộc tất cả các chi còn lại và được xếp vào

nhóm xạ khuẩn hiếm [4]

1.2.4 Các ch ất có hoạt tính sinh học từ xạ khuẩn

XK có khả năng sản sinh ra nhiều sản phẩm trao đổi chất quan trọng như chất kháng sinh, vitamin nhóm B, các loại enzym và một số axit hữu cơ

 Các enzym

Ở xạ khuẩn, người ta đã thu nhận được các loại enzym như sau:

- Enzym amylaza: thu nhận từ các loài S aureofaciens, S diastochromogens,

…Là enzym thủy phân tinh bột thành đường Vì tinh bột cũng là một trong những sản phẩm chủ yếu của thực vật nên amylaza giữ một vị trí quan trọng trong việc phân giải các sản phẩm với thành phần chủ yếu là tinh bột Chúng có vai trò trong việc làm sạch MT và được ứng dụng nhiều trong công nghệ sản xuất rượu, bia, bánh

mì…

- Enzym xenlulaza: thu nhận từ các loài S antibioticus, Streptomyces sp 0143,

…Đây là enzym xúc tác phản ứng phân giải lignoxenlulozơ thành glucozơ Lignoxenlulozơ là thành phần chủ yếu của thành tế bào thực vật gồm xenlulozơ (30 – 40%), hemixenlulozơ và lignin (15 – 30%) Enzym này được ứng dụng rộng rãi

xử lý phế phải MT, phân giải các phế liệu rẻ tiền từ rơm rạ, mạt cưa, đay gai để tạo

ra các sản phẩm có giá trị

- Enzym proteaza: được dùng nhiều trong công nghiệp chất tẩy rửa, sữa, bia và các lĩnh vực công nghiệp khác như công nghiệp dược, thuộc da, xử lý chất thải, công nghiệp thực phẩm, có tác dụng làm mềm thịt… Các chế phẩm được bán trên

thị trường như: chế phẩm Pronaza của Nhật (thu nhận từ S griseus), chế phẩm có

tên M – zim của Mỹ (thu nhận từ S fradiae) Enzym proteaza được thu nhận từ S rimosus, S kinoluteus, S verticillatus var zynogenes, S fradiae,…

- Enzym kitinaza: thu nhận từ S griseus,… Là enzym phân giải kitin trong vỏ

côn trùng, nấm, vỏ tôm cua Chúng có vai trò quan trọng trong việc sản xuất thuốc

diệt trừ nấm bệnh hại cây trồng, kể cả những côn trùng gây hại trong nông, lâm, ngư nghiệp [2, 15]

IAA bao gồm S olivochromoferus 1/247 có khả năng tạo thành 33 µg IAA/ml canh trường, S olivochromoferus 1/294 có khả năng tạo thành 9µg IAA/ml canh

trường,… [12, 13]

 Các chất kháng sinh

Một trong những đặc điểm quan trọng nhất của XK là khả năng hình thành kháng sinh Trong số 8000 kháng sinh hiện nay thì trên thế giới có trên 80% là có nguồn gốc từ XK

Theo định nghĩa của viện sĩ Outchinnikov (1987), chất kháng sinh là những

chất có nguồn gốc từ thiên nhiên và các sản phẩm cải biến của chúng bằng con đường hóa học có khả năng ức chế hoặc tiêu diệt VSV khác một cách ngay ở nồng

độ thấp (10-3 – 10-2 microgam/ml)

Các nhóm kháng sinh thường gặp của xạ khuẩn là:

1.3.1 Lược sử nghiên cứu chất kháng sinh

Thuật ngữ “chất kháng sinh” lần đầu tiên được Pasteur và Joubert (1877) sử

dụng để mô tả hiện tượng kìm hãm khả năng gây bệnh của vi khuẩn Bacillus anthracis trên động vật nhiễm bệnh nếu tiêm vào các động vật này một số loại VK

hiếu khí lành tính khác Tuy nhiên, những phát hiện này không có ý nghĩa thực tiễn

vì các nhà khoa học chưa có trong tay những thứ thuốc công hiệu

Liên tiếp sau đó,Babes (1885) đã nêu ra định nghĩa hoạt tính kháng khuẩn của một chủng là đặc tính tổng hợp được các hợp chất hoá học có hoạt tính kìm hãm các chủng đối kháng Nicolle (1907) là người đầu tiên phát hiện ra hoạt tính kháng

khuẩn của Bacillus subtilis có liên quan đến quá trình hình thành bào tử của loại

trực khuẩn này Gratia và đồng nghiệp (1925) đã tách được từ nấm mốc một chế phẩm có thể sử dụng để điều trị hiệu quả các bệnh truyền nhiễm trên da do cầu khuẩn

Đến tháng 10 năm 1928, tại viện St

Mary, London, Alexander Fleming – nhà sinh

vật học người Anh đã phát hiện ra penixillin

Trong khi tiến hành thí nghiệm, ông đã quan

sát thấy những KL nấm mốc Penicillium

notatum ức chế mạnh, thậm chí làm tan cả

khuẩn lạc của tụ cầu khuẩn Staphylococus

aureus Ông đã cấy nấm này vào MT dịch thể

và phát hiện thấy dịch nuôi cấy có khả năng

Hình 1.2: Penicillium notatum ức chế

sự phát triển của Staphylococus aureus

ức chế hoặc tiêu diệt VK gây bệnh Fleming đã đặt tên cho chất kháng khuẩn này là penixillin Một thập kỷ sau, penixillin đã được nghiên cứu và sản xuất với số lượng lớn và trở thành một “loại thuốc thần kì” Năm 1945 A.Fleming, E Chain và H W Florey đã được nhận giải thưởng Nobel vì đã khám phá ra giá trị to lớn của penixillin mở ra kỉ nguyên mới trong y học – kỉ nguyên kháng sinh [1, 6, 9, 10,15, 16]

Năm 1939, Rene’ Jules Dubos đã phát hiện ra gramixydin và tiroxydin từ quá

trình nuôi cấy Bacillus brevis Trong những năm 1940 – 1959 được coi là thời kỳ

hoàng kim của việc nghiên cứu chất kháng sinh Hàng loạt chất kháng sinh đã được phát hiện ra và có ứng dụng trong y học Vào năm 1944, Waksman phát hiện ra streptomycin Năm 1947, Ehrlich phát hiện ra chloramphenicol Năm 1948, Duggar phát hiện ra clotetraxyclin Năm 1952, Gurre phát hiện ra erythromycin Trong giai đoạn từ năm 1960 – 1970 là bước ngoặc đánh dấu sự bùng nổ của ngành công nghiệp về kháng sinh Trong những năm 1993 – 2002, số lượng các tác nhân kháng khuẩn đã tăng lên từ 90 – 120 Trong khoảng thời gian đó, năm 1999, kháng sinh lospomal HA – 92 ra đời, được tách chiết từ xạ khuẩn Streptomyces CDRLL – 312

Nó có tác dụng ngăn chặn cholesterol, tăng sức đề kháng đối với các chất độc của chuột, có hoạt tính mạnh chống các nấm gây bệnh

Tại Nhật Bản (năm 2003), kháng sinh yatakemycin đã được tách chiết từ xạ

khuẩn Streptomyces sp TP – A0356 bằng phương pháp sắc kí cột Kháng sinh này

có khả năng kiềm hãm sự phát triển của nấm Aspergillus và Candida albicans, có

khả năng chống lại các tế bào ung thư có giá trị Mic là 0,01 – 0,3 mg/ml [1,16,39 ]

Tại Hàn Quốc (năm 2007) phân lập được loài xạ khuẩn Streptomyces sp C684

sinh kháng sinh laidlomycin có thể tiêu diệt cả những tụ cầu đã kháng methicillin và các cầu khuẩn kháng vancomycin [1, 16, 39]

Ngày nay, cùng với sự phát triển mạnh mẽ của sinh học hiện đại với sự hỗ trợ của nhiều ngành khoa học khác đã làm cho tốc độ tìm kiếm các chất kháng sinh diễn ra nhanh chóng và đạt được nhiều thành tựu rực rỡ Nhiều trung tâm nghiên cứu khoa học về y học, dược phẩm và nông nghiệp tại nhiều nước trên thế giới vẫn liên tục phát hiện được hàng loạt chất kháng sinh có giá trị ứng dụng trong thực

tiễn Để sản xuất chất kháng sinh con người không chỉ tìm kiếm những chủng VSV sinh chất kháng sinh trong tự nhiên mà còn sử dụng nhiều phương pháp như dùng

kỹ thuật di truyền và công nghệ gen, gây đột biến định hướng, chọn dòng gen sinh tổng hợp, tạo và dung hợp tế bào trần để cải biến chúng, tạo ra những chủng mới có

hoạt tính kháng sinh cao Đồng thời, tìm kiếm các loại kháng sinh mới và quý trong thời gian ngắn nhất Đặc biệt, trong gian đoạn hiện nay với sự xuất hiện ngày càng nhiều của những VK đa kháng thuốc và sự thiếu hụt của các nhóm kháng sinh mới đòi hỏi các ngành công nghiệp sản xuất kháng sinh phải cải biến những chất kháng sinh cũ và thúc đẩy công tác nghiên cứu để tìm ra những chất kháng sinh mới phù hợp

1.3.2 Cơ chế tác động của chất kháng sinh

Cơ chế tác động của chất kháng sinh là những cách thức mà chất kháng sinh tác động lên các vị trí đích khác nhau trong tế bào qua đó ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của VSV Cơ chế tác động của chất kháng sinh phụ thuộc vào bản chất hóa học và nồng độ của chất kháng sinh Nhìn chung cơ chế tác động của chất kháng sinh được biểu hiện theo các hướng cơ bản sau: [1,12]

o

Hình 1.3 Vị trí tác động của kháng sinh

 Ức chế sự tổng hợp thành tế bào

Thành tế bào của VSV có chức năng duy trì hình dạng đặc trưng cho tế bào

và để chịu áp suất thẩm thấu cao ở bên trong nên đây là thành phần cần thiết cho

sự tồn tại của VSV Cơ chế tác động của kháng sinh lên thành tế bào VSV do can thiệp vào sự hình thành peptidoglycan qua các giai đoạn sau:

Giai đoạn 1: tổng hợp uridindiphosphat (UDP) axetyl muramyl pentapepid

Phản ứng cuối của giai đoạn này thành lập dipeptid D-alanin Cycloserin ức chế giai đoạn này do cấu trúc tương tự nên cạnh ranh với D-alanin để gắn vào enzym

Giai đoạn 2: phản ứng kết hợp UDP – axetyl muramyl pentapeptid và UDP –

axetyl glucosamin thành một chuỗi nhờ transglucosidase Các kháng sinh vancomycin, bacitracine ức chế transglucosidase, ức chế sự tổng hợp tiền chất của peptidoglycan

Giai đoạn 3: hoàn tất đường nối ngang của hai peptidoglycan kế cận Phản

ứng cần sự có mặt của enzym transpeptodase, penicillin ức chế enzym này

 Ức chế sự tổng hợp protein

Kháng sinh thuộc nhóm này gồm có chloramphenicol, erythromycins, lincomycins, tetracyclines, và các aminoglycozit

Nhóm aminoglycozit ức chế tổng hợp protein theo 2 cách:

+ Ức chế tác động của hỗn hợp khởi đầu RNAm-f-meth-RNAt, gắn với receptor chuyên biệt trên ribosom 30S gây biến dạng ribosom dẫn đến đọc sai mã ở tiểu đơn vị 30S nên mang vào những acid amin không đúng làm protein mất hoạt tính

+ Chloramphenicol gắn với receptor trên tiểu phần 50S của ribosom ức chế enzim peptidyltransferase, ngăn cản việc gắn kết các axit amin mới vào chuỗi peptit mới

Các kháng sinh nhóm macrolide và lincoxinamid gắn với tiểu phần 50S của ribosom, ngăn cản sự dịch chuyển của ribosom từ codon này tới codon kế tiếp, kết quả là quá trình dịch mã bị cản trở và sự tổng hợp protein bị dừng lại

 Ức chế quá trình tổng hợp axit nucleic

Axit nucleic (ADN, ARN) là những đại phân tử sinh học không thể thiếu đối với sự sống của tế bào Sự có mặt của một số chất kháng sinh đã cản trở quá trình tổng hợp axit nucleic bằng cách ức chế sự tổng hợp các nucleotit, ức chế quá trình sao chép hoặc dùng quá trình phiên mã

Nhóm các các quinolon và fluoroquinolon ức chế mạnh sự tổng hợp ADN do

ức chế ADN – gyraza nên không thể mở vòng ADN để sao chép

Nhóm rifampin gắn với enzym ARN polymeraza ngăn cản quá trình sao mã

tạo thành mARN (ARN thông tin)

Nhóm các trimethoprinm tác động vào enzyme xúc tác quá trình tạo nhân purin làm ức chế quá trình tạo axit nucleic [1, 16,12]

 Phá hủy màng tế bào

Màng sinh chất là nơi trao đổi các chất giữa tế bào VK với MT bên ngoài Màng sinh chất có tính chọn lọc để kiểm soát các thành phần bên trong tế bào Các kháng sinh colistin, polymyxin, amphotericin có khả năng phá hủy màng sinh chất bằng cách gắn với ergosterol hay cholesterol là thành phần của màng sinh chất Chúng gây tổn thương màng, tạo nên các lỗ trên màng, khi đó các phân tử lớn

và các ion sẽ thoát ra ngoài dẫn tới gây chết tế bào Màng sinh chất của hầu hết vi khuẩn không có sterol nên chúng có khả năng đề kháng với amphoterixin B Tuy nhiên, chúng có thể bị phá hủy bởi polymixin và các kháng sinh loại polyen Kháng sinh này có tác dụng như những chất tẩy loại cation làm xáo trộn tính thẩm thấu của màng sinh chất khiến các ion như Mg2+, K+, Ca2+ thoát ra khỏi tế bào

Tóm lại các chất kháng sinh từ XK có đặc điểm chung là có tác dụng ngay cả

ở nồng độ rất thấp với hoạt tính mạnh và phổ kháng khuẩn khá rộng Đặc điểm nổi bật của kháng sinh có nguồn gốc từ xạ khuẩn là khả năng bền với nhiệt và tác dụng

lên vi sinh vật mang tính chọn lọc

1.3 4 Các chất kháng sinh có khả năng kháng nấm từ xạ khuẩn

đậu Kasugamyxin chỉ có tác dụng mạnh đối với P oryzae khi dùng trong môi trường axit Còn đối với VK kể cả Pseudomonas thì tác dụng ở pH trung tính Đây

là đặc điểm cần lưu ý để pha chế khi sử dụng cho từng đối tượng [21]

 Polioxin

Polioxin là nhóm kháng sinh thuộc họ nucleotit peptidylpyrimidin, có nguồn

gốc từ xạ khuẩn Streptomyces cacaoi var asoensis sinh ra (Isono và cs, 1965)

Chúng có đặc tính là không độc với vật nuôi và cây trồng, không tác dụng với VK

và nấm men nhưng có tác dụng kháng nấm mạnh Chúng có khả năng ức chế sự tổng hợp kitin thành tế bào của nấm gây hại trên các loại cây trồng như cải, cà chua, lúa…( Hori và cs, 1974) Polioxin gây phồng lên một cách bất thường ở đầu ống mầm BT và đầu hệ sợi của nấm (Eguchi và cs, 1968)

sự sinh trưởng của P oryzae mà chúng còn có khả năng ức chế VK, nấm, thậm chí

có thể chống u, chống virut (Tanaka và cs 1961, Hairai, Shimomura, 1965) Đối với bệnh đạo ôn trên cây khoai tây, Blastixidin S ức chế mạnh mẽ sự phát triển của hệ

sợi P oryzae

Hìn h 1.5: Cấu trúc của polioxin

Hình 1.6: Cấu trúc của blastixidin S

 Validamyxin

Validamyxin là chất kháng sinh do chủng xạ khuẩn Streptomyces hygroscopicus var limoneus sinh ra Chủng này có thể sinh ra 5 thành phần có cấu trúc tương tự nhau và được định tên từ Validamyxin là B – F, cùng với validoxylamine A (Iwasa và cs, 1971) Chúng có tác dụng tiêu diệt nấm gây bệnh

khô vằn ở lúa do Rhizoctonia spp gây ra

Đặc biệt, validamyxin A có thể đặc trị đối với bệnh thối thân, thối rễ, đốm đen trên nhiều loại hạt (Wakae, Matssura, 1975)

1.3 5 Tình hình nghiên cứu và sử dụng các kháng sinh có nguồn gốc từ xạ khuẩn trên thế giới và Việt Nam

 Trên thế giới

Hiện tượng cây trồng bị nhiễm nấm đã trở nên phổ biến và tăng lên đáng kể trong nhiều thập kỉ qua Các nhà bệnh học thực vật trên toàn thế giới đã bỏ ra nhiều năm để điều tra tình hình sử dụng chất kháng sinh từ XK trong việc ngăn chặn các bệnh ở thực vật

Bộ Nông nghiệp, Hải sản và thực phẩm Anh (MAFF) đã đưa ra chỉ định tất

cả các chất kháng sinh dùng trong y học không được phép sử dụng trong nông nghiệp [9, 44]

Ở Hà Lan, 2 chất kháng sinh được phép sử dụng là streptomycin và validamyxin

Năm 1954, Trung Quốc đã phân lập được Streptomyces.sp 5406 có khả năng

sinh chất kháng sinh phòng chống bệnh thối rễ và đã áp dụng trên 6 triệu ha trồng

Hình 1.7: Cấu trúc validamyxin A

bông và đã thu được kết quả khả quan [29]

Năm 2002, Ấn Độ đã phân lập chủng Streptomyces sp.201 có khả năng sinh

kháng sinh mới là z – methylheptyl iso – nicotinate Chất kháng sinh này có khả

năng kháng được nhiều loại nấm gây bệnh như Fusarium oxysporum, F solani gây

hại trên rau màu

Tại Nhật Bản năm 2003, kháng sinh yatakemycin đã được tách chiết từ xạ

khuẩn Streptomyces sp TP – A0356 Hơn nữa, Nhật Bản cũng đã có những chế

phẩm chống các bệnh đạo ôn, khô vằn rất có hiệu quả như blastidin S, kasugamyxin, validamyxin [39] Năm 2011, tác giả Bảo – Xin Zhang và công sự đã

tìm ra chất kháng mới milbemycins từ chủng XK đột biến S bingchenggensis X-4

có khả năng phòng trừ sâu bọ [29] Nhiều nước khác như Hàn Quốc, Thái Lan, Mỹ

cũng đã rất thành công trong việc nghiên cứu và sử dụng chất kháng sinh từ XK để phòng và trị nấm gây bệnh cây trồng

Không những trong lĩnh vực nông nghiệp mà trên lĩnh vực y học và nhiều lĩnh vực khác, kháng sinh từ XK có vai trò hết sức quan trọng Từ 1940 – 1958, Waksman đã phát hiện ra 22 hợp chất kháng sinh khác nhau từ XK, trong đó 3 loại: actinomycin, neomycin và streptomycin đã được sử dụng rộng rãi trong điều trị một

số bệnh ở người Năm 1952, ông đã tìm ra được kháng sinh vacomycin từ XK từ đất tại Ấn Độ và Indonesia Kháng sinh này có tác dụng điều trị các bệnh nhiễm trùng

do VK [51] Trong những năm gần đây, năm 2010, Alexander DC và cộng sự đã

tìm ra được A54145 thuộc nhóm kháng sinh lipopeptit sản xuất bởi S fradiae ức

chế sự hoạt động của một số VK gây hại trên da động vật và con người [32]

 Trong nước

Nhìn chung, những nghiên cứu chất kháng sinh từ XK đã bắt đầu được quan tâm bởi các nhà khoa hoc

Năm 1994, tác giả Lê Gia Hy đã có công trình nghiên cứu xạ khuẩn thuộc chi

Streptomyces sinh chất kháng sinh chống nấm gây bệnh đạo ôn và thối cổ rễ phân lập ở Việt Nam [15]

Năm 1995, tác giả Lê Thanh Bình đã thực hiện đề tài nghiên cứu cơ chế kháng

kháng sinh của một số chủng XK (Streptomyces) với kháng sinh do chúng tổng hợp

ra và ứng dụng trong việc phân lập, tạo giống VSV

Năm 2000, tác giả Biền Văn Minh đã nghiên cứu khả năng sinh chất kháng sinh của một số chủng XK phân lập từ đất Bình – Trị - Thiên

Năm 2004, tác giả Đỗ Thu Hà đã nghiên cứu XK sinh chất kháng sinh chống

nấm phân lập từ đất Quảng Nam – Đà Nẵng

Năm 2006, tác giả Bùi Thị Việt Hà đã thực hiện đề tài nghiên cứu XK sinh

chất kháng sinh chống nấm gây bệnh thực vật ở Việt Nam Tác giả Nguyễn Hoàng Minh Huy cũng đã tiến hành khảo sát đặc điểm và vai trò của chủng xạ khuẩn S dicklowii [9, 12]

Năm 2008, tác giả Bùi Thị Hà đã tiến hành nghiên cứu XK thuộc chi Streptomyces sinh chất kháng sinh chống nấm gây bệnh trên cây chè ở Thái Nguyên [10]

Năm 2011, tác giả Nguyễn Huỳnh Minh Quyên tiến hành điều tra, nghiên cứu một số hoạt chất có khả năng kháng vi sinh vật và kháng dòng tế bào ung thư từ XK [19]

Hiện nay, ở nước ta cũng sử dụng nhiều loại chất kháng sinh từ XK như: validamyxin chống bệnh khô vằn, polioxin chống bệnh đen lá, streptomyxin chống bệnh bạc lá hại lúa…Mặc dù đã thu được những hiệu quả nhất định song việc sử dụng chất kháng sinh trong bảo vệ thực vật ở nước ta còn hạn chế do người nông dân đã quen với việc sử dụng các hóa chất bảo vệ thực vật Bên cạnh đó giá thành của các chế phẩm sinh học chưa phù hợp với điều kiện sản xuất của người nông dân Vì vậy, cần phối hợp thống nhất trong việc nghiên cứu, sản xuất các chế phẩm sinh học với việc tuyên truyền kiến thức cho người nông dân Cần xây dựng phương pháp canh tác mới nhằm đem lại hiệu quả cao trong phòng chống dịch bệnh, nâng cao năng suất cây trồng, đồng thời bảo vệ MT và sức khỏe con người

Chương 2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

- Các hóa chất khác: cao thịt, cao nấm men, pepton do hãng Merck sản xuất

KH2PO4, K2HPO4, MgSO4.7H2O, KNO3, CaCO3, FeSO4.7H2O, tinh bột tan, gelatin, CMC, xenlulozơ do Trung Quốc sản xuất

2.1.3 Các môi trường sử dụng trong nghiên cứu

+ Môi trường Gauze-1 (g/l): phân lập, giữ giống và nghiên cứu xạ khuẩn Tinh bột tan : 20 g

K2HPO4 : 0,5 g FeSO4 : 0,01 g MgSO4.7H2O : 0,5 g KNO3 : 0,5 g

(Môi trường giữ giống có thêm: pepton 5 g; cao nấm men 10 g)

+ Môi trường Gauze-2 (g/l): nghiên cứu XK Nước chiết thịt : 30 ml Pepton : 5 g

 Cách t ạo nước chiết thịt:

- Thịt bò tươi lọc sạch gân, mỡ bạc nhạc đem xay hoặc thái nhỏ Cứ 500 g

thịt thêm 1000 ml nước cất

- Đun nóng từ từ, giữ ở 500

C trong 1giờ Sau đó đun sôi 30 phút

- Để nguội và lắng trong dung dịch vừa đun

- Lọc bằng vải hoặc giấy lọc

+ Môi trường ISP – 4 (g/l): nghiên cứu XK Tinh bột tan : 10 g K2HPO4 : 1 g

Nước cất : đủ 1000 ml Dung dịch khoáng : 1ml

+ Môi trường ISP – 1 (g/l): nghiên cứu XK

+ Môi trường Potato Glucose Agar (PDA) (g/l): nuôi cấy , giữ giống nấm

Fusarium

Agar : 20g (nếu làm môi trường đặc) Nước cất : đủ 1000 ml

 Cách chế dịch khoai tây:

- Khoai tây gọt vỏ, rửa sạch

- Cân 300g, thái nhỏ, thêm 1000ml nước

- Đun sôi, nhỏ lửa trong 30 phút, lọc lấy dịch trong

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phân l ập xạ khuẩn

 L ấy mẫu

Sử dụng dụng cụ vô trùng gạt bỏ 5 cm lớp đất mặt và tiến hành lấy đất sâu 5cm Đựng mẫu trong túi nilon, buộc kín miệng, đánh số, ghi địa điểm lấy mẫu, thời

gian lấy mẫu Bảo quản mẫu trong thùng xốp chứa nước đá được vận chuyển về phòng thí nghiệm và giữ trong tủ lạnh ở nhiệt độ 4°C

 Phân lập XK bằng phương pháp sấy khô (Nonomura et al, 1969)

- Từ dịch huyền phù ở độ pha loãng 10-4 nhỏ 0,1 ml lên bề mặt môi trường Gauze – 1 đã chuẩn bị sẵn trong các hộp Petri Dùng que gạt vô trùng trang đều dịch huyền phù trên mặt môi trường cho 3 hộp, nuôi ở nhiệt độ phòng Sau 7 - 14 ngày mang các hộp Petri ra quan sát

- Các KL với hình thái khác nhau được chọn và cấy truyền sang MT Gauze

-1 mới để thuần khiết lần thứ hai

2.2.2 Bảo quản giống bằng dầu khoáng

- Khử trùng dầu khoáng 20% bằng cách hấp ở nhiệt độ 1210C trong 2 giờ Sau

đó, sấy khô ở 1700C trong 1 – 2 giờ, rồi để nguội