Khảo sát sự biểu hiện hệ protein của một số giống lúa kháng rầy ở ĐBSCL bằng phương pháp điện di hai chiều

Trong phạm vi cho phép, để tài “Khảo sát sự biểu hiện hệ protein của một số giống lúa kháng rầy Ở ĐBSCL bằng kỹ thuật điện di hai chiều” sử đụng hai phương pháp điện di protein SDS PAGE

BỘ GIÁO DỤC ĐÀO TẠO

_ TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÀN THƠ

VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIÊỄN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHAO SAT SU BIEU HIEN HE PROTEIN CUA MOT SO

GIONG LUA KHANG RAY O BONG BANG SONG CUU LONG BANG PHUONG PHAP DIEN DI HAI CHIEU

MSSV: 2064705 LOP: CNSHTT K32

Can Tho, Thang 11/2010

PHAN KY DUYET

DUYET CUA HOI DONG BAO VỆ LUẬN VĂN

Can Ti ho, ngay tháng nam 2010 CHU TICH HOI DONG

Lời cảm tạ

Mười hai năm học tập phan dau để bước vào cánh cửa đại học, bốn năm miệt mài rèn luyện để có được chút thành tích đầu tay trong những năm nghiên cứu khoa học đầu đời Để

có được thành công ngày hôm nay, ngoài sự cố găng của bản thân, không thể thiếu tình yêu

và sự động viên từ mẹ và gia đình, sự khoan dung và lòng nhiệt tình từ quý thầy cô, sự chan hòa và thân ái của tình cảm bạn bè

Con xin dâng lên Mẹ và gia đình những tình cảm và lòng biết ơn sâu sắc nhất

Con xin gửi lời tri ân đến thầy Trần Nhân Dũng, thấy đã ân cần dìu dắt em từng bước

đi đấu tiên của cuộc đời nghiên cứu khoa học, hết lòng hướng dẫn, động viên và quan tâm em trong suốt khóa luận tốt nghiệp

Mãi không quên ơn cô cô vấn Ngô Thị Phương Dung, thây Trần Nguyên Tuấn cùng quý Thầy Cô Viện Nghiên Cứu và Phát Triển Công nghệ sinh học đã hết lòng thương yêu, tạo

điều kiện để chúng em toàn tâm toàn ý học tập và nghiên cứu

Em xin gửi lời cảm ơn và sự kinh trọng đến chị Nguyễn Thị Xuân Dung, người đã chỉ dạy cho em những kinh nghiệm quý báu trong suốt thời gian làm luận văn, luôn ở bên em, động viên và giúp đỡ để em không nản lòng Anh Trần Văn Bé Năm, anh Nguyên Vũ Linh, anh Phạm Văn Một đã hết lòng hỗ trợ em thực hiện thật tốt luận văn

Luôn ghỉ nhớ những tình cảm, lời dạy và những kiến thức quỷ báu từ quý Thây Cô

đã truyền đạt cho em trong suốt quá trình học tập

Lòng thâm cảm ơn toàn thể các bạn lớp Công nghệ sinh học Tiên tiễn khóa 32 (DA0666T1) vì tỉnh thân tương thân tương ải, các bạn đã ở bên, động viên tôi trong những lúc khó khăn Thân gửi đến các bạn lời chúc sức khỏe và sự thành công trên con đường phía

TÓM LƯỢC

Lúa là cây lương thực quan trọng và có nhiễu sâu bệnh hại, nghiêm trọng nhất là dich ray néu (Nilaparvata lugens Stal) 5 giong hia cé cap khang ray tit 0,7-1,0

được chọn làm thí nghiệm để đò tìm marker protein có liên quan đến khả Hãng

kháng rấy nâu Sau khi ly trích protein bằng dung dịch SDS có bồ sung

TCA/Acetone và chạy điện di hai chiêu, chất lượng và nông độ protein cho kết quả trên gel hai chiêu khác biệt rất rõ rệt, trơng quan về di truyền giữa các giống đễu trên 60% Qua phân tích gel hai chiếu nhận thấy có i† nhất 4-6 điểm protein đêu năm trong vùng pH từ 4-7,5 xuất hiện ở tất cả các giống (44.2 kDa, pI 5.2; 28.9

kDa, pI 6.6; 23.8 kDa, pI 6.8; 18.4 kDa, pI 5.1) rất có thể là những protein liên

quan mật thiết đến tính kháng rây

Từ khóa: điện di hai chiếu, ly trích, marker protein, rầy nâu

MỤC LỤC

KÝ TÊN HỘI ĐÒNG - St 1E 2 1113111151111 111111 111111155111 E111E.Te CÁM TTẠ G1 TT TH TT TT Hà Tà Trà rà TOM LUƯỢC - - 5333 E11 1911 TT TT TT TT Tà TT Tà TT ng i MỤC LLỤC -. SE 11 3 111112171 111111211111 1111.TETET1TEETEEET.TxTrkrD ii DANH SACH BANG 0.ccccecccccccccscssscsssssesessssssessesessesvsvesvesessesvssssvsvssvsssevssvavsssesesseavaseess V DANH SÁCH HÌNH - %1 EE1E 1 EEE1EE12101111711171111117117.171 11111 0 vi CAC TU VIET TAT oie ccccccccccccccscssescssescsesessesessssesssesvesesnssestssesssseavssessnasananeas vii CHUONG 1 GIOT THIEU .cccssssssssssssscnsssossssasesssscsssssasosssnsesosssssscsscssssonsssossessenes 1 CHƯƠNG 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIIỆU .-5 5-5 s52 essesessssesssssessssesesse 2 2.1 Giới thiệu chung về cây lúa -L- 2h EY St grrkrkrrrree 2 2.2 RẦy nÂâu - - L- -L 11E1 S11 KH 1TR Sự SH TT TT Tà TT TT Tà TT TT TH TH grkp 2

2.2.1 Phân ÏOạI - c c c ghe 2

2.2.2 Đặc điểm hình thái và sinh học . ¿2 1t SE vEEEEEErErkrkrkrrrerrrrerrree 2 2.2.3 Tác hại của rầy nâu - - tt T1 SE T391 3 E1 TT TT TT nhryt 3 2.2.4 Các loại hình sinh học của rầy nâu trên thế giới ¿5+ cv exsvzsrrrse 4

2.3 Giống lúa kháng rầy nÂâu - tk 1t 3E ST HT ng nh rưưyp 5

2.3.1 Sự biểu hiện tính kháng rầy nâu của các giống lúa - 5: + 5xx 2xx £srx2 5 2.3.2 Sự biểu hiện của các protein liên quan đến tính kháng rầy nâu 7 2.4 Phân tích protein kháng rầy bằng phương pháp SDS PAGE

Va Gién di hai CHICU .cccccccssseecccseecuseeccceuseecevsesesessus cesses cessuuasessesecsssuesevsssuuens 9

CHƯƠNG 3 PHƯƠNG PHÁP VÀ PHƯƠNG TIỆN s so ssesescssseses 11 3.1 Địa điểm và thời gian thực hiện + - S133 3 ng re 11 3.2 Phương tiện và thiết bị, hóa chất - - vn ng nh rrryt 11

3.3 Các giống lúa kháng rầy ¿L1 TT TT HH TT HT ng ngưng 11

3.4 Các bước tiến hành thí nghiệm .0 0.ccccccesescecsssessessesssscsensscsssssseevevevaes 12

3.4.1 Thí nghiệm l1: Hiệu chỉnh quy trình ly trích DrOf€in -. ««ssss + sss+s+ss+s 12 3.4.2 Thí nghiệm 2: Kiểm tra chất lượng protein trích được và ghi nhận

sự khác biệt (nếu có) của hệ protein giữa các giống bằng SDS-PAGE 14

3.4.3 Thí nghiệm 3: Tiến hành điện di hai chiỀu . ¿2 2S S2 32x seez 14 CHƯƠNG 4 KÉT QUÁ VÀ THẢO LUẬN .-° s5 <sseescsesesesssessesseses 16

4.1 Hiệu chỉnh quy trình ly (rích DTO{eÏn -o co o9 +5 953686666 6565886966565 16

4.2 Thí nghiệm 2: Phố điện di protein trích được từ các giống

115800 (600011777 17 4.3 Thí nghiệm 3: Kết quả điện di hai chiều s-s-=sese sescseseseseseses 18

So sánh hai giống đối chứng . 5 tà E1 1E SH TT TT HT 19

MTL638 vs đối chứng âm và đối chứng dương - - sẻ sEvE‡EsEeErErsreesreei 20 MTL643 vs đối chứng âm và đối chứng đương 5 - + sxssEvEeEsvsrrrrrsreesrees 21 MTL649 vs đối chứng âm và đối chứng dương 5s +tsxssEvEeEsvsrrrrrereesrees 23 MTL651 vs đối chứng âm và đối chứng dương ¿s2 vs ve rksrees 24 MTL657 vs đối chứng âm và đối chứng dương ¿+ s2 vs vvrvrxrerksrers 26 CHƯƠNG 5 KET LUẬN VÀ ĐÈ NGHỊ, .- 5 5-5 cscscsesssessesesesesssesss 32

TÀI LIỆU THAM KHẢO 2 S33 E1cEE171E1EEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEErkrrkekeii 34 PHỤ LLỤC -. - 5S 1111 1 E11 1 E11 11 1111111111131 1111111111 1111 111111711111

Phụ lục 1: Xác định hàm lượng protein bằng phương pháp Bradford

Phu luc 2: Dién di SDS PAGE

Phụ lục 3: Trích ly mẫu

Phụ lục 4: Điện di chiều thứ nhất IEF

Phụ lục 5: Điện di chiều thứ hai SDS PAGE cho 2D

Phụ lục 6: Phương pháp tính trọng lượng phân tử trên gel SDS PAGE

Phụ lục 7: Cấp kháng rầy của các giống lúa

Phụ lục 8: Nguồn gốc các giống lúa đã dùng

Phụ lục 9: Hình gel điện di sản phẩm PCR của các giống lúa với cặp môi

DANH SACH BANG

Bang 1 Nồng độ protein thu được qua các phương pháp ly trích khác nhau 16 Bảng 2 So sánh độ tương đồng (%) giữa các giống so với đối chứng âm và

đối chứng dương trên gel điện di hai chiỀu 2- 2= ©2+eeecSeerrerxrere 27

DANH SÁCH HÌNH

Hình 1 Vòng đời của rầy nâu .¿- ¿E113 333333 k SE E11 TT TT Tàn Henu 3 Hình 2 Phổ điện đi SDS PAGE kiểm tran nồng độ protein qua các phương pháp

ly trích khác nhau 2 n9 993309 11v ng ng gen 16

Hình 3 Phổ điện đi SDS PAGE hệ protein của các giống lúa kháng rây 18

Hình 4 So sánh hai giống đối chứng âm và đương . - : 5: St S*ttEEskekerrsesees 19

Hình 5 So sánh MTL638 với đối chứng âm .- - ¿5+ E22 E*x*E£E£EEEEE 32k: 20 Hình 6 So sánh MTL638 với đối chứng dương . - - 5 sẻ sE‡E‡E+EvEzEeEererererees 21 Hình 7 So sánh MTL643 với đối chứng âm .- ¿523 +E+E2E*E£E+E+EEEEEzzrkrxrerkri 21 Hình 8 So sánh MTL643 với đối chứng đương . - - 5 sx+sEvESEsverrrrrersrersrees 22 Hình 9 So sánh MTL649 với đối chứng âm - - 5 2s E3 E333 Sư vo 23

Hình 10 So sánh MTL649 với đối chứng dương ¿5-6 SE vEzEvEsErreserees 24

Hình 11 So sánh MTL651 với đối chứng âm . ¿- ¿6 + Sẻ *E*+šE‡E‡ESEvEzEsEsrsrzrerees 24 Hình 12 So sánh MTL651 với đối chứng đương . 5: 2 + + + vE2Ek££xzse xe: 25 Hình 13 So sánh MTL657 với đối chứng âm - - - 2+ 232v £vE vs eererkes 26 Hình 14 So sánh MTL657 với đối chứng dương . + 3xx vxsvrkeererkei 26

Hình 15 Giản đồ phả hệ các giống lúa thông qua điện di hai chiểu -. - 27

Hình 16 Vùng protein Rubisco của giỗng MTL638 và MTL651 (trái sang phải) 29

Loai hinh sinh hoc

Cetyl trimethyl ammonium bromide Deoxyribonucleic acid

Đồng bằng sông Cửu Long Nghiệm thức

Polymerase chain reaction

Sodium dodecyl sulfate Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase

Tricloroacetic acid

Chuyén nganh Céng nghé sinh hoc vii Vién NC & PT Céng nghé sinh hoc

CHUONG I GIỚI THIỆU

Ray nâu, Nilaparvata lugens Stal., là một trong những loài côn trùng hại lúa

nghiêm trọng ở châu Á, nhất là tại Việt Nam Rầy nâu gây hại chủ yếu ở phần thân lúa,

chúng chích hút chất đinh dưỡng trong các mạch gỗ của thân, làm cho cây lúa giảm khả năng quang hợp, thiếu chất, thân khô héo, lúa bị gay hai trên diện rộng gọi là hiện tượng cháy rầy (hopper burn) Ngoài ra, việc chích hút của rầy còn lan truyền các loại virus gây bệnh vàng lùn, lùn xoăn lá có tính lây lan cao, khả năng phòng trừ khó Vì thường tồn tại với mật số đông nên tác hại của rầy nâu là vô cùng nghiêm trọng Sử dụng thuốc hóa học là phương pháp truyền thống để ngăn chặn rầy nâu nhưng đắt tiền và

gây ảnh hưởng xấu đến môi trường Cách đơn giản và hiệu quả nhất trong công tác quản

lý dịch hại rầy nâu hiện nay là trồng xen canh các giống lúa kháng rầy (Zhe, 2009) Để phát triển các giỗng kháng rầy, các nhà khoa học trên thế giới đã sưu tập được khoảng

trên dưới 20 gen kháng từ nhiều nguồn khác nhau Những nghiên cứu trong thời gian

gần đây chủ yếu tập trung nhiều vào việc fìm hiểu cơ chế tương tác giữa giống lúa kháng rầy và các biotype rây nâu, tập quán chich hut va sinh ly hoc cia ray (Bo, 2009), tác động gây hại của ray nau trên các giống lúa (Sogawa, 1982) Sự hiểu biết về

sự biến đổi bên trong cây lúa trước tác hại của rầy nâu hỗ trợ nhiều trong việc ứng

dụng các gen kháng rây vào công tác phòng trừ rầy nâu Hiện nay, sự am hiểu về cơ chế kháng rầy ở mức độ phân tử còn nhiều hạn chế Những thông tin về sự biểu hiện

hệ protein ở một số giỗng lúa kháng rầy vẫn còn rất khiêm tốn Trong phạm vi cho phép, để tài “Khảo sát sự biểu hiện hệ protein của một số giống lúa kháng rầy Ở ĐBSCL bằng kỹ thuật điện di hai chiều” sử đụng hai phương pháp điện di protein SDS PAGE và 2-D (điện di hai chiều) để khảo sát sự hiện diện của các protein kháng rây,

do marker protein lién quan dén tinh khang ray và xem mức độ biêu hiện cũng như sự

đa dạng của chúng giữa các giống lúa kháng rầy có cấp kháng cao

Mục tiêu của đề tài

e_ Xây dựng quy trình ly trích protein phù hợp để thực hiện điện di hai chiều

e Khảo sát sự biểu hiện hệ protein và dò tìm các marker có thể liên quan đến tính

khang ray trong từng giống lúa

CHUONG II LUOC KHAO TAI LIEU

2.1 Giới thiệu chung về cây lúa

Cây lúa thuộc họ Hoda thao (Gramineae), chi Oryzae Trong chi Oryzae cé nhiéu loài, sống một năm hoặc nhiều năm Người ta cho rằng tô tiên của chi lúa Øzyzae là một loài cây hoang dại trên siêu lục địa Gondwana cách đây ít nhất 130 triệu năm và phát tán rộng khắp các châu lục trong quá trình trôi dạt lục địa Trong đó chỉ có hai loại lúa trồng 1a Oryza sativa, phd bién 6 chau A, và Oryza giaberrima có hạt nhỏ, năng suất thấp, chỉ

trồng trên diện tích nhỏ ở Tây Phi Tô tiên của lúa châu Á Ó szfivz là một loại lúa hoang

phố biến (Oryza rufipogon) dường như có nguồn gốc tại khu vực xung quanh chân núi Himalaya, với Ó safiva thứ inđica ở phía An D6 va O sativa tha japonica 6 phia Trung Quốc Hiện nay đây là giỗng lúa chính được gieo trồng làm cây lương thực trên khắp thế giới Lúa có 2n=24 nhiễm sắc thể, với tông số DNA có quy mô ước khoảng 430 megabp

2.2 Rầy nâu

2.2.1 Phân loại:

Tên tiếng Anh: Rice planthopper

Tén khoa hoc: Nilaparvata lugens Stal

- Trứng hình bầu dục giống quả chuối, nằm trong nõn bẹ, gân lá

- Rây non mới nở có màu vàng trăng, ở tuôi 2 — 3 trở lên có màu nâu vàng, bò ngang

Chuyên ngành Công nghệ sinh học 2 Viện NC & PT Công nghệ sinh học

1.1.Ray truong thanh canh dai 1.2 Trimg xếp hình nải chuối 1.3 Rầy non tuôi ]

màu trắng, các tuổi sau có màu vàng nâu 1.4 Rây trưởng thành cánh ngắn

Hình 1 Vòng đời của rây nầu

N guỗn - hiip:7/www.nonsnshiep.vn/nonegnghiepvn/7Upload/Imase/2008/6/19/ray.ipg

Cả rầy non và trưởng thành đều chích hút dịch cây Chúng tập trung ở gốc và thân lúa làm cho cây còi cọc, sinh trưởng kém, lúa vàng Mật độ cao gây cháy ray thanh dam, vat Khi d6 ray trưởng thành cánh dài phát triển mạnh để di chuyên, phân tán

e_ Điều kiện phái sinh và phát triển

Nhiệt độ 20 — 30°C và âm độ bão hoà là điều kiện thuận lợi cho rầy nâu sinh sống

và phát triển Thông thường, nếu trước thời gian nào đó có nhiệt độ và âm độ không khí cao, lượng mưa nhiều, sau đó trời hửng nắng thì rầy nâu dễ phát sinh thành dịch Giai đoạn lúa tré - chín thường bị rầy hại nặng

Hàng năm ray phat sinh 7 - 8 lứa, trong đó có 4 lứa quan trọng: lứa rầy 2-3 phá hại vào tháng 4 - 5 (đối với vụ chiêm xuân, đặc biệt vùng chiêm trũng) và lira 5 - 6 phát sinh vào tháng 7 - 9

2.2.3 Tác hại của rầy nâu

e Tác hại trực tiếp:

Ray cám và rây trưởng thành chích hút nhựa cây lúa gây ra hiện tượng cháy rầy khi mật số

cao Ray nau gia tăng mật số nhanh, (bột phát) gây hai nặng cho cây lúa khi thực hiện canh tác

lúa liên tục trong năm, dùng giống nhiễm rây, gieo sạ mật độ dày, bón dư thừa phân đạm hoặc dùng thuốc trừ sâu không đúng cách

Chuyên ngành Công nghệ sinh học 3 Viện NC & PT Công nghệ sinh học

e Tac hai gian tiếp

Là môi trường truyền virus gây bệnh vàng lùn, lùn xoắn lá, lúa cỏ cho cy hia Phan ray nau chứa nhiêu đường hấp dẫn nhiều nắm hoại sinh như bồ hóng, làm gốc lúa đen, giảm độ quang

hợp của cây

e Đặc điểm truyền bệnh

Ray nâu chích hút nhựa cây lúa gây bệnh vàng lùn, lùn xoắn lá rồi mang mầm bệnh virus

nay trong cơ thê đề truyền sang cho cây lúa khỏe mạnh khi chúng đến chích hút cây lúa đó Cây lúa càng non càng dễ bị nhiễm bệnh, về sau có thể không trỗ bông được, năng suất giảm

nghiêm trọng hoặc mắt trăng Cây lúa già bị nhiễm bệnh thì năng suất giảm ít hơn

2.2.4.Các loại hình sinh học của rầy nâu trên thế giới

Các giống lúa phản ứng không giống nhau đối với tác hại của rầy nâu Một phân do sự

cách biệt địa lý sinh thái đã hình thành nên các quân thể rầy nâu có độc tính khác nhau (Nguyễn Văn Đĩnh và Trần Thị Liên, 2006) Qua việc nghiên cứu tính thay đôi của côn trùng,

Ikeda va Vaughan (2006) cho rằng hiện nay có 4 biotype:

- _ Biotype 1 phân bố rộng ở Đông và Đông Nam A;

- _ Biotype 2 có nguồn gốc ở Philipin phát sinh sau khi sử dụng rộng rãi các giống có gen Bph 1,

- Biotype 3 phát sinh tại các phòng thí nghiệm ở Nhật Bản và Philipin

- Biotype 4 chi thay 6 ving Nam A

Những loại hình sinh học của rầy nâu vùng Nam Á không được biết rõ hoàn toàn,

có một loài khác không tên đã được phát hiện vào năm 1977, chiếm ưu thế về số lượng

(Jennings et al., 1979) Gần đây những giống lúa ở Philipin với sự kháng đơn gene với

biotype 1 nhu IR26, IR156 dugc phat triển tiếp tục ở những khu vực có sự dẫn nước

quanh năm, khoảng 2 đến 3 năm trước khi một biotype mới đã vượt qua tính kháng này, nhưng ở mặt nào đó, số thế hệ côn trùng sẽ ảnh hưởng tới sự phụ thuộc khác nhau

vào sự khác biệt xuất hiện trong quân thể, đó là tỉ lệ đột biến của côn trùng, kích thước

quân thể và những giống chủ (Jennings et al., 1979)

2.3 Giống lúa khang ray nâu

Chuyên ngành Công nghệ sinh học 4 Viện NC & PT Công nghệ sinh học

Đặc tính tự nhiên của giống kháng rầy nâu là hàm lượng asparagine trong lá thấp,

mỏ hạt đỏ và vòi nhụy cái tím với cơ chế không ưa, tức là tạo ra sự không hấp dẫn côn trùng (Trần Dinh Long, 1997) Các loài hoang dại có quan hệ voi chi Oryza cé thé cung cấp nguồn gene quý để cải tiến giống lúa Người ta đã chuyển những tính trạng quý tìm được ở lúa hoang dại vào lúa trồng bằng nhiều phương pháp như lai hữu tính, công nghệ nhiễm sắc thê, công nghệ nuôi cấy tế bào, dung hợp tế bào trần, công nghệ gen

Nguồn gen kháng rầy nâu được Pathak và cộng sự tìm ra từ năm 1967 tại viện lúa quốc tế (IRRI, và chương trình cải tiễn giống lúa kháng rầy nâu của IRRI đã được bắt đầu từ năm 1968 Trong 17 gen kháng rầy nâu được phân lập trên thế giới hiện nay, có 8

gen lặn và 9 gen trội Gen liên kết được công bố là bph-2 với Bph-1, và bph-3 với Bph-4

Có 7 gen được tìm thấy trên các quân thể lúa hoang đang được khai thác ở Châu Á và ở Việt Nam (Bùi Chí Bửu, 2004)

2.3.1 Sự biểu hiện tinh khang ray nâu của các giống lúa

Cơ chế về sự biểu hiện của các gene kháng rầy còn khá ít ỏi, hiện nay người ta vẫn đang tiến hành những nghiên cứu cụ thê hơn để nắm bắt rõ cơ chế phân tử của tính kháng rầy nâu, qua đó đề ra phương án phòng trừ phù hợp Một số nghiên cứu từng được thực hiện đã đưa ra một số kết quả đáng tin cậy về cơ chế kháng rầy nâu bên cạnh các nhân tố

di truyền Các cơ chế này có thể được nhóm lại như sau:

Cơ chế dinh dưỡng

Bằng phương pháp nuôi trên môi trường dinh dưỡng nhân tạo, người ta đã xác định được tác động của các hợp chất đường và acid amin trong môi trường dinh dưỡng lên sự phát triển và biểu hiện của rầy nâu Rây nâu chích hút làm giảm lượng đường dự trữ ở các

giống lúa mẫn cảm với rây (Loka Reddy et al., 2004) Khi nghiên cứu thành phần dinh dưỡng của một giống lúa kháng rầy Hàn Quốc, Jung và Im (2005) thấy rằng tại phần mô libe của giống kháng này có hàm lượng đường tương tự với giống lúa nhiễm, tuy nhiên

lượng đường bị rầy chích hút ở giống kháng ít hơn so với giống nhiễm Điều này chứng tỏ rằng mùi vị của lúa cũng là một yếu tố mang kháng rây, thành phần thứ yếu này đã gây cản trở quá trình tiêu hóa cũng như quá trình tiêu thụ thức ăn của rầy

Từ những năm 1970, amino acid asparagine được xem là nhân tố kích thích quá

trình tiêu thụ thức ăn của rầy nâu (Sosawa và Pathak., 1970) Trên môi trường dinh

Chuyên ngành Công nghệ sinh học 5 Viện NC & PT Công nghệ sinh học

dưỡng nhân tạo, nếu thiếu một trong ba loại amino acid có chứa lưu huynh nhu cysteine, histindine và methionine thì sẽ làm chậm thời gian sinh trường của 4u trùng rầy và giảm sức sống Hơn nữa, nếu thiếu cả ba loại amino acid trên thì sẽ gây chết rầy trong thời kì đầu tăng trưởng (Koyama, 1985)

Mùi hương và các hóa chất thứ cấp

Saxena và Okech (1985) bằng phương pháp hóa hơi đã chiết xuất các chất tạo mùi

từ các giống chuẩn nhiễm như TNI1 và một số giống kháng (Mudgo, ASD7, Rathu Heenati, Babawee, Ptb33, ARC6650) Sau một loạt các thí nghiệm đã cho thấy những chất bay hơi thu được từ các giống lúa kháng đã làm giảm sự đẻ trứng của rầy cái và giảm sức tiêu thụ thức ăn của cả đàn rây, tăng tỉ lệ chết của rầy trưởng thành và ấu trùng rây Những hợp chất hóa học thứ cấp do giống lúa kháng tiết ra đóng vai trò quan trọng trong

cơ chế kháng Ví dụ, khi cho nhiễm rây nâu lên giống lúa kháng Trung Quốc thứ B5 (có

gene kháng bphl4, bph1l5), gene Y342 mã hóa cho protein P450 được kích hoạt P450 là một loại protein trong cơ thể côn trùng có khả năng tạo thành các loại hormone và

pheromone, nhưng vai trò chính yếu của P450 là khả năng phân giải các loại thuốc diệt

côn trùng và các chất hút được từ cây trồng (Yang et al., 2006); tuy nhiên, vẫn chưa có bằng chứng cụ thể rằng các chất hóa học có tác hại đến rầy nâu do giống kháng B5 tiết ra

có sẵn hay phải được rầy nâu kích hoạt Oxalic acid do giống kháng Mudgo (mang gen bph]) tiết ra có tác dụng ngăn chặn sự chích hút của rầy nâu; tuy nhiên, vẫn chưa có nghiên cứu cụ thế xem hàm lượng oxalic acid trong giống kháng Mudgo cao hơn những giống nhiễm như TN1 (Yoshihara et al., 7980) Nghiên cứu của Stevenson et al (1996) va các nghiên cứu khác trên giống kháng Ratthu Heenati cho rằng các chất hóa học thứ cấp

do giống kháng tiết ra có tác dụng làm giảm sức hấp dẫn của cây lúa đối với côn trùng hơn là gây độc chúng

Bè mặt cây lúa có tác dụng giảm sự tác động của rầy nâu

Trước đây, các nghiên cứu về tương tác giữa bề mặt cây lúa và sự xâm hai cua ray nâu còn giới hạn (nghiên cứu của Woodhead va Padgham , 1988) Woodhead va Padgham

(1988) đã chiết xuất chất sáp trên bề mặt lớp cuticle của giống IR22 (chuẩn nhiễm), IR46

(mang gene bph1) va IR62 (bph3), sau d6 ho thay rang thanh phân sáp này có tác động

Chuyên ngành Công nghệ sinh hoc 6 Viện NC & PT Công nghệ sinh học

ngăn ngừa sự phá hoại của rầy nâu Một nghiên cứu khác chứng tỏ bề mặt của cây lúa có tác động ngăn chặn sự chích hút của rầy nâu được tiến hành bởi Zhang và cộng sự vào năm 2004 Họ so sánh mức độ chích hút của rầy nâu trên hai giỗng B5 (chuẩn kháng) và MH63 (chuẩn nhiễm), thấy rằng ở giống B5, rây thích chích hút ở phần thân trên (nơi ít

có sáp), còn giống MH63 rầy luôn bám vào phần thân dưới

2.3.2 Sự biểu hiện của các protein liên quan đến tính kháng rầy nâu

Tính kháng côn trùng ở thực vật là tính trạng đa gen chịu ảnh hưởng của tác động

môi trường, thường biểu hiện khá phức tạp, tương tự sự biểu hiện của gen kháng rầy, dựa

theo nguyên tắc các gen và môi trường tương tác với nhau do đó mức độ kháng còn tùy thuộc điều kiện ngoại cảnh và gen điêu khiến Một số nghiên cứu gần đây ngoài việc nhận diện gen kháng rây, đã chú trọng nhiều hơn đến việc nghiên cứu chức năng của từng gen kháng, mức độ biểu hiện của chúng ở thời điểm cây con cho đến khi thành cây trưởng thành Bo et al (2009) đã lập bản đô và nhân gen kháng Bph14, tạo dòng thành công cây lúa mang gen kháng Bph14 phục vụ nghiên cứu Bph14 mã hóa cho một protein xoắn, có trình tự giàu leucine và có điểm gắn nucleotide (CC-NB-LRR protein) Nghiên cứu cho

thay trình tự giàu leucine chuyên biệt này có thể có chức năng nhận diện sự xâm nhập của

rầy nâu và sau đó khởi động phản ứng tự bảo vệ ở thực vật Gen Bph74 chủ yếu biểu hiện

ở các bó mạch thân, nơi rầy nâu thường chích hút Khi bị rầy nâu xâm hại, sự biểu hiện

của gen này khởi động chu trình dẫn truyền acid salicylic, kích thích các tế bào mạch gỗ tạo thành mô sẹo và sản xuất chất ức chế trypsin, qua đó làm rây chán ăn, giảm sức sống

và kém phat trién

Một trong những gen kháng rầy đã từng được dùng rộng rãi trong công tác chọn giống là gen trội Bph3 Gen Bph3 được cho rằng giúp cây lúa tạo ra phản ứng làm rầy chán ăn Giống Rathu Heenati không có bắt kì thành phần hóa học nào giúp xua đuổi ray,

và cũng chỉ có mùi vị giống như những giống lúa nhiễm rây khác Tuy nhiên, sự kháng

rầy của giống này sẽ xảy ra khi ray bắt đầu chích hút thân và lá lúa (Jairin, 2007) Trong

nghiên cứu của Jairin (2007) cho thấy chỉ có một số ít rầy có thê sống sót trên cây lúa giống Rathu Heenati ở giai đoạn tăng trưởng Những con rây sống sót đều nhẹ cân, phát

triển chậm và ít sinh sản Mặt khác, giống Rathu Heenati dễ bị rầy xâm nhiễm ở giai đoạn

trô hoa và ra hạt

Chuyên ngành Công nghệ sinh học 7 Viện NC & PT Công nghệ sinh học

Chen et al (2004) da thuc hién nghién ctru về mật độ gây hại của rầy nâu trên các giống lúa đã được đánh giá cấp kháng rây, dùng phương pháp điện di hai chiều để xác định marker protein quy định tính kháng rây nâu Kết quả cho thấy một protein (được tác giả đặt là P40) có pI 6.3, trọng lượng phân tử 40 kDa tăng hoặc giảm đáng kế sau khi

giống chuẩn nhiễm được gây nhiễm rây trong vòng 48 giờ, và không thay đôi ở giống

chuẩn kháng Từ các biểu hiện sinh lý của các giống lúa sau khi được gây nhiễm rây, kết luận bước đầu cho thấy protein có kí hiệu P40 có thể có liên quan đến sự tương tác giữa rầy nâu và lúa Tuy nhiên, những nghiên cứu sâu hơn vẫn chưa được công bố

Theo Alagar et al (2009) đã nghiên cứu sự biểu hiện của một số enzyme và protein

có liên quan đến chức năng bảo vệ ở thực vật được kích hoạt trong điều kiện bị ray nau chích hút ở các giống lúa kháng cao đến kháng vừa (trong đó có giédng PTB33) Nghién cứu cho thấy sự hoạt động mạnh của các enzyme peroxidase, polyphenol oxidase, phenylalanine ammonia lyase, phenol tổng và beta-1,3-glucanase sau 1 ngày bị nhiễm rầy Hoạt động của enzyme chitinase được thê hiện mạnh sau 3 ngày nhiễm rây và kéo dài hơn 1 tuân so với đối chứng âm TNI1 Nghiên cứu cho rằng các enzyme và protein này có

thê đóng góp vào cơ chế kháng rầy nâu ở lúa, đặc biệt khi bị rây chích hút (Alagar, 2009)

Nhiêu nghiên cứu được công bố cho rằng phản ứng kháng với côn trùng gây hại

của thực vật bao gdm su can bang vé ham lượng các amino acid của dịch dinh dưỡng vận

chuyên trong mô libe (Doughlas, 1993) Sự đa dạng của các amino acid trong dịch dinh

dưỡng chính là nói về hàm lượng nitơ cần thiết đối với cơ thể côn trùng, trong trường hợp

rầy nâu là asparagine và glutamine (Yamaya, 2002) Chính vì vậy mà việc bón phân đạm

không đúng cách chính là làm giảm sức kháng đối với rầy nâu của lúa và khiến rây có

thời gian thay đôi độc tính

Dé tim hiéu cơ chế biểu hiện về mặt điêu hòa gen trong cơ thê cây lúa giúp kháng lại ray nau, nhiéu nghién ctru da duoc thuc hién, Wang et al (2008) ding microarray va tìm ra 160 gen hoạt động đột ngột thay đổi mức biểu hiện khi có sự xâm nhập của ray nau Wei et al sir dung phương pháp phân tích hệ protein để phân tích phản ứng kháng của lúa khi bị rầy nâu chích hút Nhìn chung, các nghiên cứu đều cho rằng sự biểu hiện của các protein này đều nằm trong một chuỗi những phản ứng khác nhau, trong đó có quá

trình tổng hợp nên các chất sây mùi hấp dẫn côn trùng và phản ứng khi cây có biểu hiện

Chuyên ngành Công nghệ sinh học 8 Vién NC & PT Công nghệ sinh học

bị thương tốn (oxidative stress response), ít nhất thì hai quá trình này có mức biếu hiện tăng một cách rất đáng kể khi bị ray nâu xâm nhập (Jena, 2010) Tuy nhiên, nghiên cứu về mặt biểu hiện protein cũng như thông tin về những loại protein cụ thể nào có liên quan đến phản ứng kháng rây nâu ở lúa hiện vẫn còn rất ít ỏi (Jena, 2010)

2.4 Phân tích protein kháng ray bằng phương pháp SDS PAGE và điện di hai chiều

Hệ protein cung cấp đầy đủ thông tin về sự hoạt động của tế bào sống hơn so với

hệ gen Trong khi hệ gen luôn ôn định và giống nhau ở moi té bao sinh dưỡng của một sinh vật, thì hệ protein biến đỗi liên tục, phản ánh sự thay đối trong môi trường của tế bào, đồng thời phản ánh được những biến đôi bên trong và bên ngoài của tế bào Một bộ gen được giải mã hoàn chỉnh có thể không cung cấp đủ thông tin về toàn bộ chức năng của tế

bào nhưng với phân tích hệ protein có thê đáp ứng được điều đó (Wei, 2008)

Tế bào thực vật thường có hàm lượng protease và các phức hợp trao đôi chất sẽ

gây cán trở rất nhiều cho quá trình ly trích, phân tách và định danh protein Phương pháp

ly trích protein tốt sẽ giúp ích rất nhiều cho công tác phân tích sự biêu hiện hệ protein thực vật (Wei, 2008)

Phương pháp SDS PAGE (sodium dodecylsulfate polyacrylamide gel

electrophoresis)

Các protein có thê được điện di trong điều kiện biến tính hay không biến tính

Phương pháp SDS PAGE là phương pháp thông dụng nhất để điện di protein trong điều kiện biến tính Được sử dụng rộng rãi trong các lĩnh vực hóa sinh, sinh học phân tử để phân tích hỗn hợp protein theo trọng lượng phân tử của chúng thông qua điện di trên gel polyacrylamide

Để đưa các protein trong mẫu về cùng một vạch xuất phát đồng thời tạo sự phân tách tốt người ta dùng phương pháp điện di không liên tục (discontinuous electrophoresis) hay điện di 2 lớp

- Lớp gel tập trung (Stacking gel): nằm ở trên, giúp tập trung protein lại tạo thành một băng, lớp gel tập trung này có kích thước lỗ rất lớn (4% acrylamide) cho phép protein di

chuyên nhanh và tập trung lại đưới tác động của điện trường

Chuyên ngành Công nghệ sinh học 9 Viện NC & PT Công nghệ sinh học

- Lop gel phan tich (Separating gel): nam ở dưới, giúp các protein từ một hỗn hợp protein xuất phát ban đầu phân tách nhau theo trọng lượng phân tử Thông thường lớp gel này có thành phan polyacrylamide chiếm từ 10-15% tùy thuộc vào trọng lượng protein can nghiên cứu Theo nguyên tắc protein có trọng lượng phân tử càng cao thì phần trăm nồng

độ gel càng nhỏ và ngược lại

Phương pháp điện di hai chiều

Phương pháp điện di hai chiều (2DGE) giúp chúng ta phân tách được hỗn hợp các protein nhờ vào sự khác nhau về điểm đăng điện của ching (pI) khi điện di chiều thứ

nhất, và khi điện di chiều thứ hai, các protein này lại tiếp tục được tách ra lần nữa nhờ vào

sự khác nhau về khối lượng phân tử

Có nhiều phương pháp để phân tách protein ngoài phương pháp điện di hai chiều,

nhưng 2DGE vẫn cho kết quả phân tách protein với độ phân giải tốt nhất

Phương pháp này có ưu điểm lớn là từ một lượng mẫu rất nhỏ, chúng ta có thê kiểm tra sự biểu hiện của hàng ngàn protein cùng một lúc Sau khi các protein được phân

tách trên bản gel, có thê được chụp lại và phân tích bằng máy tính Khi tìm ra các điểm

protein thích hợp và định lượng được chúng, ta có thê so sánh hai hay nhiều mẫu protein

khác nhau hoặc có thê tạo một cơ sở dữ liệu vê các điêm protemn đó

Chuyên ngành Công nghệ sinh học 10 Viện NC & PT Công nghệ sinh học

CHƯƠNG III PHƯƠNG PHÁP VÀ PHƯƠNG TIỆN

3.1 Địa điễm và thời gian thực hiện

Từ tháng 6 đến tháng 11 năm 2010 tại phòng thí nghiệm Sinh học phân tử và phòng Công nghệ Enzyme của Viện Nghiên cứu và Phát triên Công Nghệ Sinh Học, Trường Đại Học

Cần Thơ

3.2 Phương tiện và thiết bị, húa chất

Một số dụng cụ như: ống nghiệm, bình tam giác, ống nhỏ giọt, beaker, ống đong, phéu, bình định mức, prpet, buret, chày, cối

Một số thiết bị như: Máy ly tâm lạnh (Eppendort, Đức), máy do quang phé (Pharmacia

LKB - Ultrospec, Denmark), thiết bị điện di hai chiều (Bio- Rad, USA), thiết bị điện di

dimg Protean IT (Bio-Rad, USA)

Acrylamide 30% (BioRad), Tris-HCl (Merck), Amonium persulphat (APS) (Sigma), SDS (Sodium dodecyl sulfate) (Merck), N,N,N’,N’-tetramethyl-ethylenediamine

(TEMED) (Merck), Glycine (Merck), Coomassie R-250 (Merck)

Methanol (Trung Quéc), Acid acetic (Trung Quéc), Tricloroacetic acid (Merck) , Acid phosphoric (Merck), Protein chuan (Fermentas), acetone (Trung Quốc)

2D-clean up kit (Bio-rad), IPG strip 7cm, pH 3-10 (Bio-Rad)

3.3 Các giống lúa khang ray

5 giống lúa kháng rây có cấp kháng từ 0.7 đến 1.3 do Viện nghiên cứu phát triển ĐBSCL

lai tạo được chọn làm đối tượng nghiên cứu Hai giống IR 50404 và PTB33 được dùng

làm đối chứng âm, dương

Đề tài bao gồm 3 thí nghiệm

3.4.1 TN 1: Hiệu chỉnh quy trình ly trích protein

Thực hiện ly trích protein bằng phương pháp SDS có bố sung TCA/Acetone, chia làm hai nghiệm thức lớn: tủa ammoniumsulphate và tủa acetone 100% lạnh

Chuyên ngành Công nghệ sinh học 12 Viện NC & PT Công nghệ sinh học

có 0.07% B-mercaptoethanol dén khi mau mat

Tricloroacetic

có

acid 0.07% B-

Sau khi rửa trong dung dich TCA/acetone đến khi mẫu mất màu, chia làm 6

nghiệm thức (NT) như sau:

NT 1: dung dịch trích 1, ly tâm và thâm tích

NT 2: dung dịch trích 1, tủa bằng amonium sulphate

NT 3: dung dịch trích 1, tủa bằng acetone 100% lạnh

NT 4: dung dịch trích 2, ly tâm và thâm tích

NT 5: dung dịch trích 2, tủa bằng amonium sulphate

NT 6: dung dịch trích 2, tủa bằng acetone 100% lạnh

Đề tủa vừa khô thì hòa tủa với dung dịch đệm (Tris-HCI 7.5, 50mM), ly tâm 5000v/p thu dịch trích protein

v_ Đo nông độ protein bằng phương pháp Bradford (1976) ( phụ lục 1)

Y Chay điện di SDS-PAGE (Leammili, 1970) (phụ lục 2) để kiểm tra chất lượng

protein trích được

Sau khi kiểm tra trên gel SDS PAGE, ghi nhận những giống có sự khác biệt rõ tệt

(khác biệt ở nhiều băng) để quan sát trong Thí nghiệm 2 (điện di hai chiêu)

3.4.2 TN 2: Kiém tra chất lượng protein trích được và ghỉ nhận sự khác biệt

(nếu có) của hệ protein giữa các giống bằng SDS-PAGE

Đồ gel điện di polyacrylamide nồng độ 10% để kiêm tra sự khác biệt các băng protein giữa các giống khác nhau, qua đó kết luận sơ bộ mức độ biểu hiện protein trong từng giống, độ đậm nhạt, có hay không có những băng đặc trưng

3.4.3 TN 3: Tiến hành điện di hai chiều

- Điện di chiều thứ nhat IEF (Isoelectric Focusing) (phu luc 3 va 4)

+ Su dung cac thanh dién di (IPG Strip, Bio-Rad) cé gradient pH từ 3-10

+ Tién hanh dién di

Chuyên ngành Công nghệ sinh hoc 14 Viện NC & PT Công nghệ sinh học

- Dién di chiéu thir hai SDS-PAGE

+ Gel phan tich 10% acrylamide dé chay SDS-PAGE cho dién di hai chiéu va khong can gel tap trung

v Chụp hình gel và phân tích kết quả bằng phan mém PDQuest

Chuyên ngành Công nghệ sinh học 15 Viện NC & PT Công nghệ sinh học

CHUONG 4 KET QUA VA THAO LUAN

4.1 Thí nghiệm 1: Hiệu chỉnh quy trình ly trích protein lá lúa

Bảng 1: Nông độ protein thu được qua các phương pháp ly trích khác nhau

Kết quả đo OD kiểm tra nồng độ protein cho thay nồng độ protein ở nghiệm thức 6

là cao nhất, kế đến là nghiệm thức 2 Tuy nhiên, để biết được chất lượng protein thu

được có tương ứng với nồng độ hay không cần thêm bước kiểm tra trên gel SDS PAGE

1 : thang chuan (kDa) ; 2 : NT1 °3:NT2;4:NT3;5:NT4;6:NT5;7: NT6

Hình 2 : Pho dién di SDS kiém tra nông độ protein

Tuy pheba githig Eib33rquàncđónhbœúg paapily ttich &hdeotbiawao, nhung thé

tích dung dịch protein thấp, chưa tới 200 pl, khong da dé chay dién di hai chiéu Mat

Chuyên ngành Công nghệ sinh hoc 16 Viện NC & PT Công nghệ sinh học

khác, protein thu được bằng phương pháp này rất dễ bị ảnh hưởng nếu nồng độ acetone trong dung dịch tủa còn quá cao Bên cạnh đó, nồng độ protein và kết quả kiểm tra trên

hinh gel cho thay NT 3.4 cho kết quả trên gel đẹp nhất, các band rõ và có độ phân giải

khá tốt, nồng độ protein tương đối cao (563.8 g/ml) , thé tich dung dịch protein thu được cao (2.5 ml), có thê cô cạn lại để làm tăng nồng độ Theo Ragnar Flengsrud (2009) thì việc ly trích protein thực vật rất khó khăn do hàm lượng protein trong thực vật thấp

hơn trong động vật và vi sinh vật rất nhiều Bên cạnh đó, đối tượng ly trích là lá tươi nên

sự hiện diện của các protease, phenoloxidase, oxidase và các hợp chất tạo màu làm giam

hiệu suất của quá trình ly trích protein rat nhiéu (Méchin et al., 2007)

Bằng phương pháp ly trích protein cải tiến, hiệu suất hàm lượng protein thô thu được (giống Ptb33) vào khoảng 0.0704% (tính bằng công thức : hàm lượng protein thu được sau khi ly trích trên khối lượng lúa đầu vào), cao hơn gấp 4 lần so với phương pháp

ly trích thông thường của Lâm Phan Tùng Anh (2009) Theo Wei (2008), việc nghiên

mẫu trong nitơ lỏng cho thật mịn giúp tế bào thực vật tiếp xúc tốt với dung dịch trích và

do đó hiệu suất protein thu được cao hơn, mặt khác, dùng dung dịch TCA/acetone lạnh

để rửa mẫu giúp hòa tan bớt các thành phần gây nhiễm protein như sắc tố, các hợp chất

có chứa phenol, ngoài ra còn giúp bất hoạt các protease gây biến tính protein (Wei, 2008)

Vậy quy trình ly trích protein từ lá lúa có hiệu chỉnh là phương pháp TCA/acetone

có bô sung dung dịch trích theo phương pháp SDS, ly tâm rồi thâm tích

2 Thí nghiệm 2: Phố điện di hệ protein của các giống lúa kháng ray bang phương pháp SDS PAGE

Chuyên ngành Công nghệ sinh học 17 Viện NC & PT Công nghệ sinh học

0: thang chuẩn (kDa); 1: MTL638; 2: MTL643; 3: MTL649; 4: MTL651; 6: MTL657;

7: PTB33 (đối chứng đương); 8: IR50404 (đối chứng âm)

Hình 3 : Phố điện di SDS PAGE hệ protein của các giống lúa kháng rầy

Nhìn chung, hệ protein của các giống lúa biểu hiện tương đối đồng đều về nồng độ

và trọng lượng phân tử, nông độ protein trích được cao và có độ tỉnh sạch khá tốt do các

băng thê hiện đậm và rõ nét Nhận thấy các protein tập trung chủ yếu ở các vùng có trọng

lượng phân từ từ 57-30 kDa và 18,4-14,4 kDa, đây có thể là vùng dễ tìm thấy sự xuất

hiện của các protein khác biệt, hai giống ở giếng 1 và giếng 2 protein phân bố đều hơn các giống còn lại Ngoài ra, tại băng có trọng lượng phân tử từ 50-56 kDa, các protein còn tập trung thành một khối lớn chứng tỏ còn nhiều protein và hàm lượng của chúng tại vùng này rất cao, chưa thể phân tách rõ rệt Đây cũng là nhược điểm của phương pháp điện di SDS PAGE Tuy nhiên, với kết quả điện di bước đầu cho thấy nồng độ và chất lượng

protein trích được là khá tốt, thích hợp đề tiếp tục điện di hai chiều

3 Thí nghiệm 3: Kết quả điện di hai chiều protein của các giống lúa kháng rầy

So với kết qua dién di SDS PAGE, sau khi dién di hai chiéu, protein cua cac gidng lua

biểu hiện sự khác biệt rất rõ rệt, đặc biệt là ở vùng có khối lượng phân tử 57-30 kDa và

Chuyên ngành Công nghệ sinh học 18 Viện NC & PT Công nghệ sinh học