Nghiên cứu hoạt tính sinh học của một số chất phân lập từ các chủng vi nấm nội sinh thuộc họ cam (rutaceae) và họ gừng (zingiberaceae) (tóm tắt)

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM TRƯỜNG ĐH KHOA HỌC TỰ NHIÊN VÕ THỊ NGỌC MỸ LUẬN ÁN TIẾN SĨ NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP CÁC CHỦNG VI NẤM NỘI SINH CÓ KHẢ NĂNG TẠO HỢP CHẤT CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC TỪ CÂY T

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM TRƯỜNG ĐH KHOA HỌC TỰ NHIÊN

VÕ THỊ NGỌC MỸ

LUẬN ÁN TIẾN SĨ

NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP CÁC CHỦNG VI NẤM NỘI SINH CÓ KHẢ NĂNG TẠO HỢP CHẤT CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC TỪ CÂY THUỘC HỌ CAM (RUTACEAE) VÀ

Công trình được hoàn thành tại: Bộ Môn Vi Sinh – Kí Sinh Trùng, Khoa

Dược, Trường Đại Học Y- Dược Tp.HCM

Người hướng dẫn khoa học:

Phản biện 1: PGS TS Nguyễn Tiến Thắng

Có thể tìm hiểu luận án tại thư viện:

- Thư viện Khoa học Tổng hợp Tp.HCM

- Thư viện Trường Đại học Khoa học Tự Nhiên

hệ chặt chẽ với cây chủ, chúng sử dụng các chất dinh dưỡng trong cây để tồn tại, tạo ra các sản phẩm trao đổi chất có hoạt tính sinh học như các hormon sinh trưởng, các chất kháng sinh có khả năng bảo vệ cây khỏi các vi sinh vật gây bệnh Nhiều tài liệu cho thấy, khi sống cộng sinh trong mô thực vật, vi nấm nội sinh đã sinh ra nhiều hoạt chất kháng khuẩn và kháng nấm

Họ Cam (Rutaceae) và họ Gừng (Zingiberaceae) ở Việt Nam rất đa dạng, trong đó cam, chanh, quýt, bưởi là những cây trồng phổ biến, có nhiều ứng dụng trong dược phẩm, thực phẩm… Từ những đặc tính trên cho thấy, tiềm năng đây là những họ chứa hệ vi nấm nội sinh phong phú, sinh nhiều chất biến dưỡng và có ý nghĩa trong việc điều trị bệnh Tuy vậy, cho đến nay, ở Việt Nam nói riêng và trên thế giới nói chung vẫn chưa có nhiều nghiên cứu

về vi nấm nội sinh trên các loài cây thuộc hai họ thực vật này Do đó, việc nghiên cứu tìm kiếm các chủng vi nấm nội sinh có khả năng tạo ra các chất biến dưỡng có lợi và có khả năng sinh các hoạt chất sinh học với hy vọng dùng để điều trị bệnh cho người là một công việc hết sức thú vị và được nhiều nhà nghiên cứu quan tâm Từ đó chúng tôi thực hiện luận án: “Nghiên cứu phân lập các chủng vi nấm nội sinh có khả năng tạo hợp chất có hoạt tính sinh học từ cây thuộc họ Cam (Rutaceae) và họ Gừng (Zingiberaceae)” với mục tiêu chính là tìm ra được các chủng vi nấm nội sinh có khả năng sinh các hoạt chất sinh học cao từ các cây thuộc họ Cam (Rutaceae) và họ Gừng (Zingiberaceae)

2 Tính cấp thiết của đề tài: Hiện nay, thực vật và các hoạt chất chiết từ

thực vật đang được sử dụng rộng rãi trong điều trị nhiều loại bệnh Theo Balick và cộng sự năm 1996, trong 119 loại hợp chất hóa học, ít nhất 90 loại

có nguồn gốc từ thực vật, đây là các hợp chất đang được sử dụng ở nhiều quốc gia Trước thực tế này, một vấn đề được đặt ra là các hoạt chất sinh học quí giá trong cây là do chính cây sinh ra hay là do mối liên hệ tương sinh với các vi nấm nội sinh có ích trong mô thực vật Trên thế giới có nhiều nghiên cứu về các hoạt chất kháng khuẩn, kháng nấm được sinh từ vi nấm nội sinh,

và chúng chủ yếu thuộc về nhiều nhóm, bao gồm: alkaloid, peptid, steroid, terpenoid, phenol, quinine và flavonoid… Điều này mang lại nhiều hứa hẹn giải quyết được vấn đề kháng thuốc ở vi khuẩn vì các chất kháng sinh này là các hợp chất mới và có hoạt tính cao

3 Những đóng góp mới của luận án: Đây là những nghiên cứu đầu

tiên về A terreus phân lập được từ họ Cam (Rutaceae) và họ Gừng

(Zingiberaceae) trong nước và trên thế giới Nghiên cứu này mở ra một hướng tiếp cận mới về nguồn và phương thức cung cấp hoạt chất kháng khuẩn và chống oxy hóa, với những đóng góp mới cụ thể như sau:

- Phân lập và định danh được 16/32 chủng vi nấm nội sinh từ họ Cam

(Rutaceae) và họ Gừng (Zingiberaceae) trong đó có 4 chủng A.terreus có

khả năng sinh hoạt chất sinh học cao

- Khảo sát được điều kiện nuôi cấy tối ưu của chủng A terreus R-TN3 Nuôi cấy và chiết được chất chiết thô có hoạt tính kháng S aureus và MRSA của chủng A terreus R-TN3

- Chiết được hợp chất Y có hoạt tính kháng khuẩn Đã xác định được giá

trị MIC của hợp chất Y có hoạt tính kháng S aureus và MRSA Hợp chất Y

đã được xác định có khả năng ức chế 4 dòng tế bào ung thư thử nghiệm (ung thư vú MCF-7, ung thư cổ tử cung Hela, ung thư gan Hep G2 và ung thư phổi NCI-H460)

- Đã tách được hợp chất tinh khiết X1 và X2 có hoạt tính chống oxy hóa cao và giải phổ để tìm ra cấu trúc hợp chất Đây là các hợp chất mới chưa được công bố trên bất cứ công trình nào trong nước và trên thế giới Hai hợp chất này có khả năng ức chế 4 dòng tế bào ung thư thử nghiệm, bao gồm các dòng tế bào: ung thư vú MCF-7, ung thư cổ tử cung Hela, ung thư gan Hep G2 và ung thư phổi NCI-H460 Hợp chất X1 cũng đã được chứng minh có khả năng ức chế tế bào ung thư thông qua khả năng cảm ứng apoptosis trên dòng tế bào ung thư phổi NCI-H460 ở các điều kiện khảo sát

4 Bố cục luận án: Luận án gồm 124 trang, đặt vấn đề 2 trang, tổng

quan tài liệu 26 trang, vật liệu và phương pháp nghiên cứu 21 trang, kết quả nghiên cứu 51 trang, bàn luận 11 trang, kết luận và kiến nghị 3 trang Luận

án có 66 bảng, 24 hình, 6 sơ đồ, 15 biểu đồ, 91 tài liệu tham khảo, gồm 10 tài liệu tiếng Việt, 79 tài liệu tiếng Anh và 2 tài liệu tham khảo từ internet, 6 phụ lục thể hiện các kết quả thực nghiệm

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tổng quan về vi nấm nội sinh: Khái niệm vi sinh vật nội sinh, vi

nấm nội sinh, đặc điểm vi nấm nội sinh, trình bày quan hệ giữa vi nấm nội sinh và thực vật, nguyên tắc cơ bản để chọn thực vật ly trích vi nấm nội sinh,

sự đa dạng của vi nấm nội sinh, một số vi nấm nội sinh sinh hoạt chất sinh học

1.2 Tổng quan về Aspergillus: Trình bày vị trí phân loại, đặc điểm hình thể, đặc điểm sinh thái và phân bố của Aspergillus Phân loại và mô tả đặc

điểm hình thể, đặc điểm sinh thái và phân bố của A terreus, các điều kiện

1.4 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước: Trình bày các nghiên

cứu ở ngoài nước và trong nước

1.5 Tổng quan về các phương pháp chiết và phân tách hoạt chất sinh học

- Các phương pháp chiết, tách phân đoạn: Khái niệm về các phương

pháp chiết như chiết lỏng – lỏng, chiết lỏng rắn, chiết pha rắn Các phương pháp sắc ký như phương pháp sắc ký lớp mỏng, phương pháp sắc kí cột cổ điển

- Các phương pháp khảo sát hoạt tính sinh học như phương pháp

khuếch tán, tự sinh đồ hay phương pháp pha loãng

- Các phương pháp xác định cấu trúc hóa học hợp chất: Phổ hồng

ngoại (IR), phổ tử ngoại khả kiến (UV-vis), khối phổ (MS), phổ cộng hưởng

từ hạt nhân (NMR)

- Các phương pháp thử độc tính tế bào: Phương pháp xác định khả

năng ức chế tế bào và phương pháp xác định khả năng cảm ứng apoptosis:

Kỹ thuật nhuộm huỳnh quang, thử nghiệm DNA phân mảnh, thử nghiệm caspase – 3

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 VẬT LIỆU

2.1.1 Nguồn mẫu phân lập: Các cây thuộc họ Gừng (Zingiberaceae) và

họ Cam (Rutaceae)

2.1.2 Vi sinh vật thử nghiệm: E.coli ATCC 25922; P.aeruginosa

ATCC 27853; S.aureus ATCC 29213; MRSA ATCC 43300; S faecalis ATCC 29212; C albicans ATCC 10231

2.1.3 Môi trường nuôi cấy: PDA, PSB,TSB,TSA, SDA, CDA

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1 Phân lập vi nấm nội sinh từ thực vật

2.2.2 Sàng lọc vi nấm nội sinh có khả năng sinh hoạt chất kháng khuẩn, kháng nấm: Sử dụng phương pháp khuếch tán từ khoanh thạch thử

2.2.3 Sàng lọc vi nấm nội sinh có khả năng sinh hoạt chất chống oxy

hóa: Hoạt hóa vi nấm và chuẩn bị mẫu thử; xác định hoạt chất chống oxy

hóa của các chất do vi nấm nội sinh sản sinh bằng phương pháp nhuộm

DPPH nhanh

2.2.4 Phương pháp định danh vi nấm: Các vi nấm nội sinh sẽ được

định danh theo khóa phân loại của Guy St Germain, năm 1995

2.2.5 Chọn chủng vi nấm nội sinh có khả năng sinh hoạt chất sinh học: Sử dụng phương pháp khuếch tán từ khoanh thạch thử

2.2.6 Khảo sát ảnh hưởng của pH môi trường lên sự sinh hoạt chất

kháng khuẩn của A terreus R-TN3: A terreus R-TN3 được nuôi trên môi

trường PDB với pH môi trường được điều chỉnh trong khoảng từ 4, 5, 6, 7, 8

2.2.7 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy lên sự sinh hoạt chất

kháng khuẩn của A terreus R-TN3: Chủng vi nấm nội sinh được nuôi

trong môi trường PDB ở 37 oC và nhiệt độ phòng (25 – 30 oC)

2.2.8 Khảo sát ảnh hưởng của nguồn carbon, nitrogen, độ thông khí lên sự sinh hoạt chất kháng khuẩn: Thiết kế mô hình thực nghiệm D –

Optimal bằng phần mềm Design-Expert 6.0.6 với các thành phần môi trường

và điều kiện nuôi cấy (xi) được xác định dựa vào đường kính vòng ức chế

trên MRSA, S.aureus

2.2.9 Khảo sát ảnh hưởng của dầu lên sự sinh hoạt chất kháng

khuẩn của A terreus R-TN3: Nuôi cấy A terreus R-TN3 trên môi trường

đã được bổ sung 1 % dầu mè, dầu hướng dương, dầu đậu nành, dầu bắp, dầu olive

2.2.10 Khảo sát các điều kiện nuôi cấy tối ưu: Thiết kế mô hình thực

nghiệm bằng phần mềm Design - Expert 6.0.6 Tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy bằng phần mềm BC Pharsoft và nuôi cấy 3 lô kiểm chứng

2.2.11 Nuôi cấy chủng A terreus R-TN3 trong môi trường tối ưu: A

terreus R-TN3 được nuôi cấy trên môi trường tối ưu đã khảo sát ở điều kiện

nuôi cấy tĩnh, nhiệt độ phòng (25 – 30 oC)

2.2.12 Chiết hoạt chất kháng khuẩn từ dịch nuôi cấy A terreus

R-TN3: Sử dụng các phương pháp để chiết hoạt chất sinh học của cao chiết thô

như: Phương pháp khuếch tán qua đĩa giấy; Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của chất chiết thô; Phương pháp tự sinh đồ và phương pháp vi pha loãng

2.2.13 Tách các phân đoạn cho hoạt tính sinh học từ chất chiết thô

2.2.13.1 Sắc ký lớp mỏng: Chất chiết thô từ môi trường nuôi A terreus

R-TN3 được hòa trong MeOH với nồng độ 8 mg/ml, chấm dung dịch chất thử lên bản mỏng và phát hiện kết quả bằng phương pháp soi dưới đèn

UV254, UV365, thuốc thử VS

2.2.13.2 Sắc kí cột cổ điển: Hệ dung môi được dùng để triển khai cột là

chloroform - methanol với tỷ lệ thay đổi theo hướng methanol tăng dần Triển khai cột, hứng các phân đoạn và kiểm tra các phân đoạn bằng sắc ký lớp mỏng Xác định phân đoạn cho hoạt tính kháng khuẩn bằng phương pháp

tự sinh đồ Xác định phân đoạn cho hoạt tính chống oxy hóa bằng phương pháp định tính nhanh bằng DPPH

2.2.14 Xác định cấu trúc hóa học của hợp chất: Các chất thu được qua

sắc ký cột được xác định cấu trúc dựa trên các phương pháp phổ: Phổ khối phun mù điện tử (ESI-MS); phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều (1H-NMR, 13C-NMR, DEPT) và hai chiều (HMBC, HSQC, COSY, NOESY)

2.2.15 Thử độc tính tế bào: Phương pháp thử độc tính tế bào in vitro

được Viện Ung thư Quốc gia Hoa Kỳ xác nhận là phép thử độc tính tế bào chuẩn nhằm sàng lọc, phát hiện các chất có khả năng kìm hãm hoặc diệt tế

bào ung thư ở điều kiện in vitro

2.2.16 Phân tích thống kê dữ liệu: Số liệu được xử lý thống kê bằng

phần mềm Microsoft Excel, trong bộ Microsoft Office phiên bản 2003

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.1 KẾT QUẢ

3.1.1 Kết quả sàng lọc hoạt tính khảng khuẩn, kháng nấm: Qua sàng

lọc, chúng tôi thu được 10/82 chủng vi nấm nội sinh trên cây họ Gừng (Zingiberaceae) và 11/64 chủng vi nấm nội sinh trên cây họ Cam (Rutaceae)

có khả năng sinh hoạt chất kháng khuẩn, kháng nấm Trong đó, các chủng sinh chất có hoạt tính cao và ổn định, phổ kháng khuẩn rộng là: R - TN3, N - GL1, Q - TL3, T2-CL1

3.1.2 Kết quả sàng lọc hoạt tính chống oxy hóa: Kết quả sàng lọc các

chủng có hoạt tính chống oxy hóa thu được 18/146 chủng có hoạt tính từ trung bình đến mạnh ở họ Cam (Rutaceae) và họ Gừng (Zingiberaceae)

3.1.3 Kết quả định danh các chủng vi nấm nội sinh có hoạt tính sinh học: Qua quá trình sàng lọc và thử hoạt tính sinh học các chủng vi nấm nội

sinh, chúng tôi thu được cả xạ khuẩn và vi nấm sống nội sinh trong cây Vì các chủng xạ khuẩn nội sinh này có khả năng sản sinh các hoạt chất sinh học nên chúng tôi tiến hành thu nhận và định danh Kết quả định danh được 16/32 chủng có khả năng sinh hoạt chất từ trung bình đến mạnh và thu được kết quả sau:

3.1.4 Chọn lọc chủng vi nấm nội sinh có hoạt tính cao: Tiến hành

khảo sát khả năng phát triển và sinh hoạt chất sinh học của các chủng A terreus

3.1.4.1 Khảo sát khả năng sinh hoạt chất kháng khuẩn của các chủng

A terreus: Tiến hành nuôi các chủng A terreus trên môi trường PDA, thử

hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm trên 5 chủng vi khuẩn thử nghiệm là S aureus, S feacalis, Pseudomonas, E coli, MRSA và 1 chủng vi nấm C albicans vào ngày thứ 7 nuôi cấy

Bảng 3.7 Tác động kháng khuẩn của các chủng A terreus

1 T2– CL1 10,33 ± 1,33 d 12,0 ± 1,54 c

3.1.4.2 Khả năng sinh hoạt chất chống oxy hóa của các chủng A terreus: Sau khi cấy hoạt hóa trên CDA, tiến hành pha dịch treo nuôi trên

PDB trong 7 ngày; sau đó định tính khả năng sinh hoạt chất chống oxy hóa

Dựa vào kết quả ở Bảng 3.7 cho thấy trong 4 chủng A terreus nghiên

cứu, chủng R – TN3 sinh hoạt chất chống oxy hóa mạnh nhất, ba chủng còn lại gồm T2 – CL1, Q – TL3, N – GL1 sinh hoạt chất chống oxy hóa ở mức trung bình (Phụ lục 3)

3.1.4.3 Khảo sát đặc tính cao chiết

 Khảo sát hệ dung môi tối ưu: Chạy sắc ký với 8 hệ dung môi khảo

sát thu được kết quả hệ dung môi CHCl3:CH3COOH với tỷ lệ 9:1 phân tách

nhiều hoạt chất nhất ở cả 4 chủng A terreus.

 Phương pháp khuếch tán qua đĩa giấy: Các cao chiết thô sau khi

được hòa tan bằng dung môi với nồng độ thích hợp được tẩm lên đĩa giấy đặt lên môi trường đã trải dịch khuẩn thử nghiệm

Bảng 3.10 Tác động kháng khuẩn của cao chiết thô các chủng A terreus

S aureus 16,67±1,72 b 9,67±1,72 c 18,67±1,72 a 17,67±1,72 ab MRSA 16,0±1,54 a 17,0±1,54 a 17,33±1,54 a 13,67±1,54 ba,b,c,ab: Trong cùng 1 cột các số có cùng mẫu tự không khác biệt nhau ở mức 0,05

Cao chiết thô của chủng R-TN3 cho kết quả kháng tối đa đối với 2 chủng

MRSA và S.aureus Các cao chiết thô của các chủng T2-CL1, Q-TL3,

N-GL1 cho kết quả kháng trung bình

 Phương pháp tự sinh đồ: Các bản mỏng sắc ký đã phân tách thành

các hoạt chất được đặt trên đĩa môi trường trải khuẩn thử nghiệm nhằm tìm

ra phân đoạn có hoạt tính kháng khuẩn (Bảng 3.10)

Bảng 3.11 Tác động kháng khuẩn của các phân đoạn thu được từ các

Từ kết quả Bảng 3.10 cho thấy chủng R-TN3 có 3 phân đoạn kháng trong

đó phân đoạn 13 cho hoạt tính kháng khuẩn cao nhất đối với MRSA và S aureus

3.1.5 Khảo sát điều kiện nuôi cấy của chủng A terreus R-TN3

3.1.5.1 Khảo sát ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy với chủng A terreus R-TN3: Khảo sát ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy lên sự sinh hoạt chất kháng khuẩn của chủng A terreus R-TN3

Bảng 3.13 Ảnh hưởng của pH môi trường khác nhau đối với sự sinh hoạt

chất kháng khuẩn của A terreus R-TN3

hợp nhất cho sự sinh hoạt chất kháng khuẩn của chủng A terreus R-TN3

3.1.5.2 Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ đối với chủng A terreus R-TN3

Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ lên sự sinh hoạt chất kháng khuẩn của

chủng A terreus R-TN3 Nhiệt độ được khảo sát trong thí nghiệm là nhiệt độ

phòng và nhiệt độ 37 oC Kết quả được trình bày ở Bảng 3.13

Bảng 3.14 Ảnh hưởng của nhiệt độ đối với sự sinh hoạt chất kháng khuẩn

kháng khuẩn mạnh hơn Vậy chọn nhiệt độ phòng là nhiệt độ thích hợp để

tiến hành nuôi cấy chủng A terreus R-TN3

3.1.5.3 Khảo sát ảnh hưởng của nguồn carbon, nitrogen, độ thông khí

Khảo sát ảnh hưởng của nguồn carbon, nitrogen và độ thông khí lên sự

sinh hoạt chất kháng khuẩn của chủng A terreus R-TN3 Lượng bào tử đầu

vào là 104 CFU/ml, nuôi cấy ở điều kiện nhiệt độ phòng Thành phần môi trường và điều kiện nuôi cấy được xác định dựa vào đường kính vòng ức chế

của MRSA và S aureus vào các thời điểm 5, 7, 9, 12 ngày

Bảng 3.15 Các mức khảo sát của biến độc lập

Rỉ đường 2,7 %

Khoai tây 20 % Cao thịt 1 % Cao nấm men 1 % Dịch đậu nành 10 %

Lắc Tĩnh

Từ 23 môi trường có thành phần và điều kiện thông khí khác nhau, ở môi trường có hàm lượng khoai tây 20 %, rỉ đường 2,7 % hoặc saccharose 1 %,

trong điều kiện tĩnh, A terreus R-TN3 cho tác động kháng MRSA, S aureus

tốt và ổn định; thời gian thích hợp để thu nhận hoạt chất kháng khuẩn từ dịch nuôi cấy là ngày thứ 7 nuôi cấy

3.1.5.4 Ảnh hưởng của dầu: Để khảo sát ảnh hưởng của dầu lên sự sinh

hoạt chất kháng khuẩn của A terreus R-TN3, các dầu thực vật như dầu mè,

dầu hướng dương, dầu nành, dầu bắp, dầu olive (nồng độ 1 %) được bổ sung vào môi trường khoai tây-rỉ đường với thành phần gồm khoai tây 20 %, rỉ đường 2,7 %, nuôi cấy trong điều kiện tĩnh Thực hiện song song với chứng

là môi trường khoai tây 20 %, rỉ đường 2,7 % không bổ sung dầu

Kết quả cho thấy ở môi trường khoai tây-rỉ đường không bổ sung dầu thì chủng A terreus R-TN3 có khả năng sinh hoạt chất kháng khuẩn cao nhất Điều này cho thấy dầu ảnh hưởng không tốt hoặc có khả năng kiềm hãm sự

sinh hoạt chất kháng khuẩn của A terreus R-TN3 (Bảng 3.16)

Bảng 3.17 Ảnh hưởng của các loại dầu thực vật đối với sự sinh hoạt chất

kháng khuẩn của A terreus R-TN3

3.1.6 Thiết kế và tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy

3.1.6.1 Thiết kế mô hình thực nghiệm

Mô hình thực nghiệm được thiết kế bằng phần mềm Design-Expert 6.0.6 gồm 26 môi trường Dữ liệu môi trường, đường kính vòng ức chế và sinh khối được trình bày trong Bảng 3.17

Bảng 3.18 Môi trường nuôi cấy A terreus R-TN3 được thiết kế bằng

3.1.6.2 Tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy

Kết quả tối ưu hóa bằng phần mềm BC Pharsoft bao gồm các thông số tối

ưu của điều kiện nuôi cấy và giá trị dự đoán của các tính chất sản phẩm

Bảng 3.25 Thành phần công thức tối ưu

ml môi trường nuôi cấy

Kiểm chứng công thức tối ưu bằng thực nghiệm,so sánh với kết quả dự đoán: Tiến hành nuôi cấy 3 lô với các điều kiện tối ưu trong cùng một điều

kiện và xác định các thông số yi Kết quả phân tích phương sai 2 yếu tố không lặp những số liệu trong bảng cho thấy: Quy trình nuôi cấy có tính lặp lại, tính chất sản phẩm giữa 3 lô khác nhau không có ý nghĩa thống kê (p=0,87 > 0,05) Kết quả dự đoán của phần mềm khác nhau không có ý nghĩa thống kê (p > 0,05) Do đó, phần mềm BC Pharsoft đã dự đoán đúng điều kiện nuôi cấy tối ưu cũng như tính chất của dịch nuôi cấy

3.1.7 Khảo sát dung môi chiết tối ưu: Nuôi cấy chủng A terreus

R-TN3 trên môi trường tối ưu, sau đó tiến hành chiết 2 lần (1:1) với dung môi

Bảng 3.27 Hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết

S aureus MRSA

Methanol 16,67 ± 0,94 a 12,0 ± 1,22 b Ethyl acetat 17,33 ± 0,94 a 17,33 ± 1,22 a Chloroform 13,33 ± 0,94 b 10,33 ± 1,22 c

a,b,c,d: Trong cùng 1 cột các số có cùng mẫu tự không khác biệt nhau ở mức 0,05 Dựa vào Bảng 3.26 cho thấy hoạt chất kháng khuẩn phân bố chủ yếu trong chất chiết với ethyl acetat, tuy nhiên dịch chiết methanol và n-

hexan vẫn cho hoạt tính kháng khuẩn tương đối cao trên S aureus, MRSA

Chọn dung môi ethyl acetat làm dung môi chiết tối ưu

3.1.8 Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của chất chiết từ môi trường nuôi nấm và từ sinh khối

Chất chiết từ môi trường nuôi cấy A terreus R-TN3 và từ sinh khối Các

chất chiết được khảo sát hoạt tính kháng khuẩn bằng phương pháp khuếch tán qua đĩa giấy

Bảng 3.28 Tác động kháng khuẩn của các chất chiết của A terreus R-TN3

Chiết từ dịch nuôi cấy 17,33 ± 0,93 a 17,33 ± 0,93 a

a,b: Trong cùng 1 cột các số có cùng mẫu tự không khác biệt nhau ở mức

0,05 Chất chiết từ môi trường nuôi nấm A terreus R-TN3 có tác động kháng khuẩn đối với S.aureus và MRSA Chất chiết từ sinh khối nấm A terreus R-TN3 không có tác động kháng khuẩn đối với S.aureus và MRSA

3.1.9 Nuôi cấy và chiết hoạt chất kháng khuẩn từ A terreus R-TN3:

Dịch nuôi cấy sau 7 ngày có màu nâu xám được chiết với EtOAc để cho chất chiết thô – EtOAc (chất CT – EtOAc) Chất CT – EtOAc đã hút ẩm đến khối lượng không đổi: Màu nâu đen, có mùi thơm, thể chất dẻo Kết quả nuôi cấy từ 1 lít môi trường nuôi cấy tối ưu, thu được khoảng 415 mg cao thô Để có đủ lượng cao thô để có thể cô lập được hợp chất tinh khiết cho việc chạy phổ xác định cấu trúc, chúng tôi đã tiến hành nuôi cấy trên 50 lít môi trường

3.1.10 Xác định hoạt tính sinh học của cao chiết thô

3.1.10.1 Xác định hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết thô

Cao chiết thô sau khi được hòa tan bằng dung môi với nồng độ thích hợp được tẩm lên đĩa giấy đặt lên môi trường đã trải dịch khuẩn thử nghiệm bằng phương pháp khuếch tán qua đĩa giấy Kết quả cho thấy cao chiết thô có tác

động kháng khuẩn khá cao đối với S aureus và MRSA

3.1.10.2 Định tính sơ bộ thành phần của cao chiết thô

Thực hiện các phản ứng định tính hóa học nhằm sơ bộ xác định nhóm hợp chất tự nhiên của cao chiết thô Kết quả trên cho thấy cao chiết thô của

chủng A.terreus R-TN3 có chứa tinh dầu, carotenoid, courmarin,

anthraglycosid

3.1.11 Khảo sát thành phần hóa học của chất CT– EtOAc từ dịch

nuôi cấy A terreus R-TN3

3.1.11.1 Xác định vị trí hoạt chất kháng khuẩn trên bản mỏng

Trên sắc ký đồ SKLM chất chiết thô với hệ dung môi CHCl3 –

CH3COOH (9:1), được phát hiện bằng cách soi UV ở bước sóng 254 nm,

365 nm và phun thuốc thử VS cho tổng cộng 17 vết, đường kính vòng ức chế được thể hiện ở Bảng 3.31

Bảng 3.35 Kết quả chạy cột của phân đoạn 1

16 n-hexan : chloroform 5:5 Khóa cột, kết tinh

Kết quả chạy cột 3g phân đoạn X1 thu được chất X2 có hoạt tính chống oxy hóa cao và hợp chất Y có hoạt tính kháng khuẩn cao Tiến hành tinh sạch hợp chất X2 và Y để giải cấu trúc và thử độc tế bào ung thư để xác định hoạt tính sinh học của hợp chất X2 và Y