Phân lập, tuyển chọn vi khuẩn sinh chất chống oxi hóa và khảo sát khả năng ứng dụng trong y học (tóm tắt)

Vì vậy, việc nghiên cứu vi khuẩn sinh chất COXH và khả năng ứng dụng là hướng tiếp cận mới về nguồn và phương phức cung cấp chất COXH so với cách thức truyền thống là chiết xuất từ thực

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HCM

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

VŨ THANH THẢO

Phân lập, tuyển chọn vi khuẩn sinh chất chống oxi hóa và khảo sát khả năng

ứng dụng trong y học

Chuyên ngành: Vi sinh vật học

Mã số chuyên ngành: 62424001

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

Tp Hồ Chí Minh năm 2016

Công trình được hoàn thành tại: ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HCM, TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

Người hướng dẫn khoa học:

1 PGS TS Trần Cát Đông

2 GS.TS Nguyễn Văn Thanh

Phản biện 1:

PGS.TS Nguyễn Thúy Hương Phản biện 2:

PGS.TS Nguyễn Ngọc Vinh Phản biện 3:

TS Đái Thị Xuân Trang

Phản biện độc lập 1:

PGS.TS Nguyễn Thúy Hương

Phản biện độc lập 2:

TS Đái Thị Xuân Trang

Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án họp tại

………

………

vào lúc giờ ngày tháng năm

Có thể tìm hiểu luận án tại thư viện:

- Thư viện Khoa học Tổng hợp Tp.HCM

- Thư viện Trường Đại học Khoa học Tự Nhiên

GIỚI THIỆU LUẬN ÁN

1 Mở đầu

Chất chống oxi hóa (COXH) có vai trò quan trọng trong việc làm giảm

nguy cơ mắc ung thư và bệnh tim mạch Các chất này tác động thông qua

việc trung hòa hay dập tắt sự tấn công của các tác nhân oxi hóa lên các đại

phân tử quan trọng như ADN, protein, màng lipid Hàng năm có rất nhiều

công trình nghiên cứu trên đối tượng là chất COXH để hiểu rõ hơn về cơ

chế hoạt động, tạo ra sản phẩm mới cũng như tìm kiếm các nguồn cung cấp

mới Tuy nhiên, hầu hết các nghiên cứu được tiến hành với nguồn cung cấp

chất COXH từ thực vật Các nguồn này hiển nhiên rất phong phú về khả

năng cung cấp các chất COXH, nhưng chúng cũng là một dạng sản phẩm

nông nghiệp, do đó sẽ ảnh hưởng đến quỹ đất cũng như chịu nhiều ảnh

hưởng của các yếu tố thời tiết, khí hậu

Việc sử dụng nguồn cung cấp chất COXH là vi khuẩn có một số ưu thế

so với từ thực vật Vi khuẩn có thể được lên men ở qui mô lớn với các cơ

chất rẻ tiền mà không sử dụng nhiều quỹ đất, cũng như không phụ thuộc

thời tiết, khí hậu Vi khuẩn sản xuất chất COXH có thể được sử dụng qua

đường tiêu hóa dưới dạng sinh khối sống, không qua chiết xuất, khi vào cơ

thể sẽ sản xuất hoạt chất tại chỗ do đó qui trình sản xuất chế phẩm sẽ đơn

giản hơn, thân thiện với môi trường và tránh được các vấn đề liên quan đến

bảo quản, hấp thu trên đường tiêu hóa Nhưng đến nay chưa có nhiều công

trình nghiên cứu về việc sử dụng vi khuẩn làm nguồn cung cấp chất

COXH

Do đó mục tiêu của luận án là phân lập và tuyển chọn vi khuẩn sinh chất

COXH và khảo sát tiềm năng ứng dụng như probiotic cung cấp chất

COXH Các nội dung thực hiện cụ thể như sau:

1 Phân lập và sàng lọc các chủng vi khuẩn có khả năng sinh chất chống oxi hóa ở khu vực phía Nam

2 Khảo sát đặc điểm sinh chất chống oxi hóa của các chủng vi khuẩn

3 Đánh giá đặc điểm để ứng dụng làm probiotic và độc tính của các chủng

4 Đánh giá khả năng ứng dụng probiotic như nguồn cung cấp chất chống oxi hóa

5 Khảo sát quy trình lên men để sản xuất sinh khối làm nguyên liệu probiotic cung cấp chất COXH

2 Tính cấp thiết của đề tài

Chất COXH được cung cấp từ thực vật, động vật, vi sinh vật hoặc tổng hợp Trong đó, vi sinh vật là nguồn cung cấp chất COXH tiềm năng vì có thể thu lượng sinh khối lớn trong thời gian ngắn, không cần nhiều quỹ đất, không chịu ảnh hưởng của điều kiện thời tiết…

Bên cạnh đó, việc sử dụng vi khuẩn dưới dạng probiotic nhằm cung cấp một hiệu ứng có lợi cho sức khỏe đã có từ rất lâu, gần đây cùng với sự phát triển của công nghệ sinh học, rất nhiều nghiên cứu cũng như sản phẩm probiotic đã ra đời, mang lại nhiều lợi ích về kinh tế và xã hội Nhưng đến nay trong nước chưa có nhiều công trình nghiên cứu về vi khuẩn sinh chất COXH cũng như việc sử dụng chúng như nguồn cung cấp chất COXH Vì vậy, việc nghiên cứu vi khuẩn sinh chất COXH và khả năng ứng dụng là hướng tiếp cận mới về nguồn và phương phức cung cấp chất COXH so với cách thức truyền thống là chiết xuất từ thực vật hay tổng hợp

3 Những đóng góp mới của luận án

Đây là nghiên cứu đầu tiên về việc phân lập vi khuẩn sinh chất COXH cũng như sử dụng bào tử vi khuẩn làm nguồn cung cấp chất COXH tại Việt

Nam Nghiên cứu này mở ra một hướng tiếp cận mới về nguồn và phương

thức cung cấp chất COXH với những đóng góp mới cụ thể như sau

- Phân lập và định danh được các chủng vi khuẩn sinh chất COXH giúp

cung cấp vật liệu sinh học cho hiện tại và tương lai

- Chứng minh khả năng sinh chất COXH và triển vọng ứng dụng trong

y học của sáu chủng Bacillus

- Khảo sát được quy trình lên men thu sinh khối bào tử ổn định với các

thông số lên men phù hợp, sử dụng nguyên liệu có giá thành thấp, sẵn

có tại Việt Nam

4 Bố cục của luận án

Luận án gồm 149 trang, mở đầu 2 trang, tổng quan tài liệu 28 trang, vật

liệt và phương pháp 28 trang, kết quả và bàn luận 76 trang, kết luận và kiến

nghị 2 trang Luận án có 54 bảng, 14 hình, 2 sơ đồ, 5 đồ thị, 156 tài liệu

tham khảo, gồm 10 tài liệu tiếng Việt, 146 tài liệu tiếng Anh, 20 phụ lục thể

hiện các kết quả thực nghiệm

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Các dạng oxi hoạt động: sự tạo thành các dạng oxi hoạt động, tác

động của các dạng oxi hoạt động và các bệnh liên quan

1.2 Chất COXH: khái niệm, phân loại, vai trò của chất chống oxi hoá đối

với sức khoẻ, nguồn thu nhận chất COXH, thực phẩm chức năng chứa chất

COXH tại Việt Nam

1.3 Vi khuẩn sinh chất COXH: nghiên cứu trong nước và trên thế giới,

một số chất chống oxi hoá từ vi khuẩn

1.4 Lên men sản xuất sinh khối: các yếu tố liên quan đến việc chọn cơ

chất môi trường lên men, các yếu tố ảnh hưởng tạo sinh khối ở vi sinh vật

1.5 Probiotic và ứng dụng trong y học: khái niệm, tiêu chí về probiotic,

ứng dụng

1.6 Các vấn đề cần nghiên cứu

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng

Vi khuẩn (VK) phân lập từ mẫu đất, cát và nước ở 13 tỉnh Trung và Nam

bộ như Đà Nẵng, Quảng Ngãi, Bình Định, Gia Lai, Khánh Hoà, Ninh Thuận, Bình Thuận, Đồng Nai, Tp Hồ Chí Minh, Tây Ninh, Tiền Giang, Đồng Tháp, An Giang

2.2 Vật liệu

Vi sinh vật và động vật thử nghiệm: chủng chuẩn ATCC do PTN Vi sinh

Công nghệ Dược cung cấp, B indicus HU36 sinh carotenoid do dự án Colorspore cung cấp, chuột nhắt trắng Swiss albino do viện Pasteur Nha Trang cung cấp

Hóa chất: do Sigma, Merck cung cấp

Môi trường: TSA, TSB do Himedia cung cấp, MHA do Merck cung cấp Thiết bị: kính hiển vi BX41 (Olympus), máy luân nhiệt TCX3000

(Techne), máy quang phổ UV-Vis GeneQuant 1300 (GE HealthCare), bể tán siêu âm Vibra cell (Sonic), nồi lên men 10 L Biostat B Plus (Sartorius)

2.3 Phân lập và sàng lọc vi khuẩn sinh chất COXH 2.3.1 Phân lập chủng vi khuẩn

Thu thập mẫu đất, cát và nước: 13 tỉnh từ Đà Nẵng đến Đồng Tháp Phân lập: phân lập các chủng vi khuẩn trên môi trường TSA, lưu lại các

chủng có hình thái khuẩn lạc và màu sắc khác nhau

2.3.2 Sàng lọc vi khuẩn sinh chất chống oxi hoá

Chủng sinh chất COXH ngoại bào và nội bào được sàng lọc bằng phương pháp bản mỏng DPPH (Huang, 2006)

2.4 Khảo sát khả năng sinh chất chống oxi hóa của các chủng vi khuẩn

Xác định hoạt tính COXH: xác định bằng phương pháp đánh bắt gốc tự

do DPPH, chọn các chủng có hoạt tính đánh bắt DPPH >50%

Xác định khả năng sinh chất COXH: xác định IC50 của chất COXH

ngoại bào và các phân đoạn chất COXH nội bào bằng phương pháp đánh

bắt DPPH, tạo phức với ion sắt II, bảo vệ carotenoid trong hệ nhũ tương

với acid linoleic (Brand-Williams, 1995; Antolovich, 2002)

Định danh: Dựa trên giải trình tự 16S rADN (Frank, 2008)

2.5 Khảo sát đặc điểm probiotic của các chủng Bacillus

Khả năng sinh enzym ngoại bào của VK: khả năng sinh enzym caseinase,

gelatinase, amylase, lipase (Kumar, 2012)

Khả năng đối kháng với VK gây bệnh (chủng ATCC): E coli, P

aeruginosa, P vulgaris, S aureus, S feacalis, S marcescens, S dysenteria,

S paratyphi A (CLSI, 2012)

Khả năng chịu acid dịch vị và muối mật: Khả năng sống sót của VK sau

30 phút, 90 phút ở pH 2 và pH 3; sau 1 giờ, 3 giờ ở muối mật 0,3% và 0,5%

(Barbosa, 2005)

Thử nghiệm tính nhạy cảm kháng sinh: phương pháp pha loãng kháng

sinh trong thạch theo M7-A9 và M45-A (CLSI) Sử dụng 14 kháng sinh đại

diện cho các nhóm penicilin, cephem, glycopeptid, aminoglycosid,

macrolid, tetracyclin, quinolon, phenicol, ansamycin

Khảo sát sự hiện diện của các gen mã hóa độc tố: Hbl (A, B, C, D) gây

tiêu huyết; Nhe (A, B, C) gây tiêu chảy, Ces mã hóa cereulid synthetase,

bceT thuộc nhóm enterotoxin T, cytK, độc tố tương tự β-toxin của C

perfringens (Phelps, 2002; Lindback, 2004; Stenfors, 2010)

2.6 Thử nghiệm tính an toàn của chủng

Độc tính cấp: theo dõi trong 72 giờ đầu và đến 14 ngày Đối tượng: BT2.4,

DQ11, DQ40, GL2.1, GL4.5, HR04 và KP3 Đối chứng: PBS Liều: 5.108

và 5.109 bào tử/g thể trọng (Dược Điển Việt Nam IV, 2009)

Xác định liều LD50 Giải phẫu đại thể: tìm bất thường trong nội tạng

Độc tính bán cấp: 60 ngày Đối tượng: BT2.4, DQ11, DQ40, GL2.1,

GL4.5, HR04 và KP3 Đối chứng: PBS Liều: 106 và 107 bào tử/g thể trọng

- Theo dõi: biểu hiện bất thường

- Xét nghiệm: bất thường thông số sinh hóa/ công thức máu

- Vi phẫu: bất thường mô học nội tạng

2.7 Đánh giá khả năng ứng dụng cung cấp chất COXH

- Thời gian: 30 ngày Đối tượng: BT2.4, DQ11, DQ40, GL4.5, HR04 và KP3 Đối chứng: PBS, vitamin E Liều: 106 bào tử/g thể trọng

- Sau 30 ngày: nhóm sinh lý: chuột ở các lô được tiêm phúc mô dầu; nhóm gây hoại tử gan với CCl4: chuột được tiêm phúc mô CCl4/dầu liều 1ml/kg thể trọng 24 giờ sau tiêm, chuột được giải phẫu

- Quan sát đại thể nội tạng chuột: biểu hiện bất thường

 Chỉ số COXH: thay đổi, bất thường về chỉ số COXH tổng (FRAP), SOD, catalase, GSH-Px, MDA (Ohkawa, 1979; Flohe, 1984; Marklund, 1974; Goth, 1991; Benzie, 1999)

 Xét nghiệm: thay đổi, bất thường enzym gan AST và ALT

 Vi phẫu: bất thường mô gan

2.8 Khảo sát quy trình lên men để sản xuất sinh khối 2.8.1 Khảo sát điều kiện nhiệt độ và pH: nhiệt độ: 30C, 37C, 42C, pH: 5, 6, 7, 8, 9

2.8.2 Tối ưu môi trường tạo sinh khối sinh chất COXH

Sàng lọc các yếu tố ảnh hưởng: ảnh hưởng của 11 yếu tố gồm nguồn

carbon, nitơ và khoáng chấttheo ma trận Plackett-Burman

Tối ưu hóa thành phần môi trường lên men: 3 yếu tố ảnh hưởng chính

đến sinh khối và lượng chất COXH được tối ưu theo RSM

Kích thích tạo bào tử

Thành phần khoáng bổ sung kích thích tạo bào tử: khoáng ảnh hưởng đến việc tạo bào tử được xác định dựa vào ma trận Plackett-Burman Thời điểm bổ sung khoáng kích thích tạo bào tử: đầu pha lũy thừa, giữa pha lũy thừa, đầu pha ổn định, giữa pha ổn định

2.8.3 Khảo sát điều kiện thu nhận bào tử trên nồi lên men 10 lít

Khảo sát các thông số lên men: tỷ lệ cấy truyền: 1, 5, 10% thể tích môi

trường lên men; tốc độ khuấy: 250, 400, 600 vòng/phút; lượng oxi cung

cấp: 50, 75, 100%

Khảo sát quá trình lên men mẻ - bổ sung cơ chất: các thông số lên men

mẻ bổ sung cơ chất được tính toán từ thí nghiệm lên men mẻ

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1 Phân lập và sàng lọc vi khuẩn sinh chất COXH

3.1.1 Thu thập và phân lập vi khuẩn sinh chất COXH

Số mẫu thu thập được là 204 mẫu Các mẫu được phân lập trên môi

trường TSA và thu được 367 chủng vi khuẩn

Các chủng vi khuẩn phân lập được có nhiều màu sắc khác nhau, trong

đó màu trắng là chủ yếu Trong số chủng vi khuẩn phân lập được có 30 cầu

khuẩn, 252 trực khuẩn Gram dương và 85 trực khuẩn Gram âm

3.1.2 Sàng lọc vi khuẩn sinh chất COXH

Trong số 367 chủng phân lập, 139 chủng có khả năng sinh chất COXH,

trong đó 15 chủng có khả năng sinh chất COXH cả ngoại bào và nội bào:

BT2.4, BD1.1, DT5.3, DT6.1, QN1.1, QN1.2, DQ11, HR04, PT6.1,

TN12.2, TN13.1, HM2.7, GL7, CR5.2, KP3

3.2 Khảo sát khả năng sinh chất COXH của các chủng

3.2.1 Định lượng hoạt tính COXH

Xác định hoạt tính COXH của các chủng: 47/139 chủng có khả năng đánh

bắt DPPH  50%

Khả năng COXH của các phân đoạn:

Chất COXH ngoại bào: BD1.1, BT2.4, DN5.2, DQ11, DQ40, DT6.1,

GL7, HR04, KP3, PT6.1, QN1.1, QN1.2, TN13.1 có hoạt tính cao với IC50

trong khoảng 0,17-0,78 mg/ml

Chất COXH nội bào: Phân đoạn ethylacetat: hoạt tính COXH thấp Phân đoạn chloroform: BD5.1, BD6.8, BD8.2, BT2.4, CR3, DN1.1, DN4.1, DQ11, DQ15.2, DQ32, DQ35.1, DQ35.3, DQ8.2, DT11.3, DT15.1, DT5.1, DT6.1, GL7, GL2.1, GL4.5, HR04, KP3, NT3.2, NT7.1, PT3.7, QN7.2, TG3.1, TG4.1, TN1.1, TN1.3, TN12.3, TN2.4 có hoạt tính cao với IC50 khoảng 0,43-0,82 mg/ml Phân đoạn ethanol: BD1.1, DN5.2, DQ11, DQ40, DQ8.2, DT11.3, DT14.1, DT5.1, GL6, GL2.3, KP3, PT6.1, QN1.1, QN2.2, TG6.1, TN1.1, TN13.1, TN2.4 có hoạt tính cao với IC50 khoảng 0,21-0,99 mg/ml Các phân đoạn chất COXH nội bào và chất COXH ngoại bào có khả năng COXH theo các cơ chế khác nhau

3.2.2 Định danh vi khuẩn sinh chất COXH tốt

47 chủng: 10 chủng là VK Gram âm, 4 chủng Staphylococcus, 2 chủng

Micrococcus luteus, 1 chủng Lysinibacillus macroides, 30 chủng Bacillus

Trong 30 chủng Bacillus có 9 chủng là Bacillus cereus bị loại bỏ trong các nghiên cứu tiếp theo, 21 chủng Bacillus còn lại gồm B subtilis, B

marisflavi, B licheniformis, B amyloliquefaciens, B megaterium, B fusiformis, B pumilus là các loài Bacillus an toàn được chọn cho các

nghiên cứu tiếp theo về đặc tính probiotic của chủng

3.3 Khảo sát đặc điểm probiotic của các chủng Bacillus

Khả năng sinh enzym ngoại bào: 16/21 chủng có khả năng sinh enzym

amylase và protease, không có chủng nào sinh enzym lipase

Khả năng đối kháng với VK gây bệnh: BT2.4 và HR04 có khả năng đối

kháng với E coli, Salmonella và Shigella Hầu hết các chủng có khả năng đối kháng với S marcescens, S aureus

Khả năng chịu acid dịch vị và muối mật: BD6.8, BT2.4, DQ11, DQ40,

GL2.1, GL4.5, HR04 và KP3 có khả năng sống sót lớn hơn 50% ở pH 2

trong 90 phút và muối mật 0,5% trong 3 giờ

Thử nghiệm nhạy cảm kháng sinh: 18 chủng nhạy cảm và nhạy cảm trung

gian với 14 kháng sinh thử nghiệm trong đó có 7 chủng tiềm năng được

chọn trong thử nghiệm khả năng chịu acid dịch vị và muối mật

Xác định sự hiện diện của các gen mã hóa độc tố: 21 chủng vi khuẩn thử

nghiệm âm tính với các gen mã hóa độc tố

Tổng hợp các đặc tính probiotic, 7/21 chủng có các đặc tính tốt được

chọn để tiếp tục nghiên cứu gồm BT2.4, DQ11, DQ40, GL2.1, GL4.5,

HR04 và KP3

3.4 Thử nghiệm tính an toàn

Độc tính cấp: liều LD50 qua đường uống của bảy chủng BT2.4, DQ11,

DQ40, GL2.1, GL4.5, HR04 và KP3 cao hơn 5.1012 bào tử/kg thể trọng

Độc tính bán cấp: lô uống bào tử BT2.4, DQ11, DQ40, GL4.5, HR04,

KP3: liều 107 bào tử/g thể trọng tương đương 5.1011 CFU/người 50 kg

không thể hiện bất kỳ biểu hiện độc tính nào trên chuột thử nghiệm Lô

GL2.1: liều 107 bào tử/g thể trọng có hiện tượng lách to, tăng hoạt động tạo

huyết ở lách, chủng này bị loại trong các thử nghiệm tiếp theo

3.5 Đánh giá khả năng cung cấp chất COXH

Khả năng cung cấp chất COXH được xác định thông qua khả năng hạn

chế stress OXH khi gây độc gan bằng CCl4 của sáu chủng Bacillus: BT2.4,

DQ11, DQ40, GL4.5, HR04

Quan sát đại thể:

Lô PBS: gan chuột có màu đỏ hồng tự nhiên, không có điểm xuất huyết,

gan không xơ cứng Lô PBS/CCl4: gan có màu thâm đen, gan bị xơ cứng

Lô BT2.4/CCl4, DQ11/CCl4, DQ40/CCl4: mức độ xơ cứng của gan giảm

so với lô PBS Lô GL4.5/CCl4, HR04/CCl4, KP3/CCl4 và VitE/CCl4: gan

chuột có sự thay đổi về màu sắc, tuy nhiên vẫn có màu hồng, các điểm màu

trắng giảm, gan không bị xơ cứng

Quan sát vi thể

Ở điểu kiện bình thường: Lô uống bào tử và lô VitE: vi phẫu mô gan không khác biệt so với lô PBS

Khi bị stress do CCl4: Lô PBS/CCl4: phần lớn các tế bào gan to bất thường có nhân không điển hình và bị hoại tử, bị viêm nặng ở khoang cửa

và tiểu thùy gan Lô BT2.4/CCl4, DQ11/CCl4 và DQ40/CCl4: tế bào gan có nhân không điển hình và các tế bào bị hoại tử cũng xuất hiện, tuy nhiên mức độ tổn thương gan thấp hơn nhiều so với lô PBS Lô GL4.5/CCl4, HR04/CCl4, KP3/CCl4 và VitE/CCl4 chỉ xuất hiện một số tế bào gan bị tổn thương, hầu hết các tế gan bình thường, chứng tỏ việc sử dụng bào tử VK hoặc vitamin E có tác dụng hạn chế tổn thương gan do CCl4

Enzym gan

Ở điều kiện bình thường: hoạt tính enzym AST và ALT không có sự khác biệt giữa sử dụng bào tử VK và vitamin E so với lô PBS

Khi bị stress do CCl4: Lô PBS/CCl4: hoạt tính AST và ALT ở lô tăng lên lần lượt là 3,4 lần và 5,0 lần so với lô PBS Điều này chứng tỏ khi tiêm CCl4 gan bị tổn thương Lô BT2.4/CCl4, DQ11/CCl4, DQ40/CCl4 và GL4.5/CCl4, VitE/CCl4: hoạt tính AST và ALT giảm có ý nghĩa thống kê

so với lô PBS/CCl4 Lô HR04/CCl4 và KP3/CCl4: hoạt tính AST được giữ

ổn định so với lô sinh lý PBS, hoạt tính enzym ALT giảm có ý nghĩa thống

kê so với lô PBS/CCl4, kết hợp với kết quả vi phẫu mô gan cho thấy đây là các lô tế bào gan ít bị hoại tử và tổn thương do đó hạn chế tốt sự gia tăng

enzym gan

Các chỉ dấu COXH

Chỉ số COXH tổng: giúp xác định khả năng COXH của hệ thống được thể

hiện thông qua giá trị FRAP

Ở điều kiện bình thường: bào tử vi khuẩn và vitE có tác dụng làm tăng mức COXH tổng có ý nghĩa khi so sánh với lô PBS

Khi bị stress do CCl4 gây ra: chỉ số COXH tổng ở lô PBS/CCl4 giảm có

ý nghĩa thống kê so với lô PBS; ở lô sử dụng bào tử, mức COXH tổng ở

các lô thử nghiệm đều cao hơn có ý nghĩa so với lô PBS/CCl4, và khi so

sánh các lô thử nghiệm với nhau, lô uống bào tử Bacillus có tác dụng bảo

vệ tương tự vitamin E ở cả gan và huyết thanh

Enzym COXH nội sinh:

Điều kiện bình thường: bào tử và vitamin E làm tăng mức dự trữ enzym

so với lô PBS

Khi bị stress OXH do CCl4: hoạt tính SOD, CAT, GSH-Px giảm có ý

nghĩa ở lô PBS/CCl4 so với PBS Ở lô sử dụng bào tử và vitamin E: hoạt

tính của enzym cao hơn hoặc bằng lô sinh lý PBS và khác biệt có ý nghĩa

so với lô PBS/CCl4 ở cả gan và huyết thanh

Lượng MDA:

Điều kiện bình thường: bào tử và vitamin E làm giảm lượng MDA so

với lô PBS

Khi bị stress OXH do CCl4: lượng MDA ở lô PBS/CCl4 tăng có ý nghĩa

so với lô PBS Ở lô sử dụng bào tử và vitamin E: lượng MDA thấp hơn

hoặc bằng lô PBS và khác biệt có ý nghĩa so với lô PBS/CCl4

Như vậy việc sử dụng bào tử của các chủng vi khuẩn có tác dụng hạn

chế stress OXH do tăng chỉ số COXH tổng FRAP, tăng hoạt tính của

enzym COXH nội sinh của động vật thử nghiệm và ức chế quá trình

peroxid hóa lipid tạo ra MDA so với lô chứng PBS tiêm CCl4, điều này

chứng tỏ khả năng cung cấp chất COXH cho vật chủ khi sử dụng bào tử vi

khuẩn

Dựa vào khả năng sinh chất COXH ngoại bào, nội bào, khả năng cung

cấp chất COXH thông qua việc hạn chế stress OXH và bảo vệ gan khi gây

độc gan với CCl4 của sáu chủng vi khuẩn như trong Bảng 1, chủng KP3

được chọn để nghiên cứu các điều kiện nuôi cấy nhằm thu được lượng sinh khối lớn để ứng dụng làm probiotic cung cấp chất COXH

Bảng 1 So sánh các đặc điểm về COXH, enzym gan của sáu vi khuẩn Chủng Khả năng sinh

chất COXH

Hoạt tính enzym gan

Khả năng cung cấp chất COXH

BT2.4 Hoạt tính phân đoạn

ethanol thấp

Cải thiện AST,ALT Cải thiện các chỉ số

COXH DQ11 Hoạt tính tốt ở các

phân đoạn

Cải thiện AST, ALT Cải thiện các chỉ số

COXH DQ40 Hoạt tính phân đoạn

chloroform thấp

Cải thiện AST, ALT Cải thiện các chỉ số

COXH GL4.5 Hoạt tính COXH

ngoại bào thấp

Cải thiện AST, ALT Hầu như không khác

biệt so với lô VitE HR04 Hoạt tính tốt ở các

phân đoạn

Giữ AST ở mức sinh

lý, cải thiện ALT

Cải thiện các chỉ số COXH KP3 Hoạt tính tốt ở các

phân đoạn

Giữ AST ở mức sinh

lý, cải thiện ALT

Hầu như không khác biệt so với lô VitE

3.6 Khảo sát quy trình lên men để sản xuất sinh khối

3.6.1 Khảo sát điều kiện nhiệt độ và pH

KP3 phát triển tốt nhất ở pH 8 và nhiệt độ 37 oC với mật độ 4,35±0,10.108 CFU/ml

3.6.2 Tối ưu hóa môi trường thu nhận sinh khối và chất COXH

Sàng lọc các yếu tố ảnh hưởng chính đến sinh khối và chất COXH:

Mật rỉ, amoni citrat, MnCl2: ảnh hưởng dương và phần trăm đóng góp cao và ảnh hưởng có ý nghĩa giá trị thống kê đến việc tạo sinh khối và hàm lượng chất COXH

Tối ưu hóa công thức môi trường theo RSM: 

Bảng 2 Nồng độ 3 yếu tố khảo sát trong mô hình RSM - CCD

Mức Yếu tố Phạm vi

-1 0 +1

A Mật rỉ (g/l) 5 – 15 5 10 15

B Amoni citrat (g/l) 0,5 – 2 0,5 1,25 2

C MnCl2 (mM) 5– 20 5 12,5 20

Dữ liệu phân tích thống kê tính toán được giá trị p của mô hình sinh

khối là 0,0114, mô hình chất COXH là 0,0247 <0,05, chứng tỏ mô hình có

ý nghĩa thống kê

Các yếu tố B2-amoni citrat, C2-MnCl2 và sự phối hợp giữa mật rỉ và

amoni citrat ảnh hưởng có ý nghĩa thống kê với giá trị p<0,05, có ý nghĩa

thống kê, các yếu tố còn lại ảnh hưởng không có ý nghĩa thống kê

Phương trình hồi quy về lượng sinh khối và chất COXH của KP3:

Sinh khối (x10 8 CFU/ml) = -5,64 + 0,49*A*B - 5,49*B 2 - 0,023*C 2

Chất COXH (mg/l)= -25,73 + 1,72*A*B - 20,89 B 2 - 0,085 C 2

Với hàm mục tiêu là sinh khối cực đại, phần mềm Design Expert 7.0.0

dự đoán các thông số tối ưu của môi trường là: mật rỉ 7,2 g/l,; amoni citrat

1,7 g/l và MnCl2 là 16,58 mM (bổ sung 1ml/l) với mật độ tế bào khoảng

1,96.109 CFU/ml

Khảo sát đường cong tăng trưởng trên môi trường tối ưu:

Sinh khối: pha lũy thừa: 0-8 giờ, pha ổn định 8-26 giờ, pha suy vong sau

26 giờ Chất COXH: ổn định từ 17-26 giờ, giảm sau 26 giờ Chất COXH có

thể thu nhận cùng thời điểm với sinh khối đạt cực đại

Kích thích tạo bào tử

Sàng lọc các yếu tố ảnh hưởng tới sự hình thành bào tử: CaCl2 0,5 g/l và

FeSO4.7H2O 35 μM (bổ sung 1 ml/l) ảnh hưởng tích cực đến sự hình bào

của KP3

Khảo sát thời điểm bổ sung khoáng

Thời điểm bổ sung khoáng lúc 8 giờ là tốt nhất giúp mật độ bào tử tăng 3 lần đạt 2,22.109 bào tử/ml và tỉ lệ bào tử tăng lên 99%

So sánh việc tối ưu hóa môi trường

Bảng 3 Kết quả so sánh các thí nghiệm trước và sau khi tối ưu Môi trường TSB Plackett-Burman RSM-CCD Bổ sung khoáng

*x109 CFU/ml, **: mg/l Công thức môi trường tối ưu của KP3: glucose 10 g/l, đậu không dầu 19,75 g/l, amoni citrat 1,7g/l, mật rỉ 7,2 g/l, pepton từ thịt 11,13 g/l, MnCl2 16,58 mM (1 ml/l), K2HPO4 4,58 g/l, CaCl2 0,01 g/l, NaCl 4,04 g/l, FeSO4.7H2O 1 μM (1ml/l) , MgSO4.7H2O 0,38 g/l sau 8 giờ nuôi cấy bổ sung CaCl2 0,5 g/l và FeSO4.7H2O 35 μM (1 ml/l)

3.6.3 Khảo sát qui trình thu nhận bào tử KP3 trên nồi lên men

Thông số lên men thu bào tử KP3: tỷ lệ cấy truyền 5%, tốc độ khuấy 400

vòng/phút và pO2 50%, thời điểm thu nhận bào tử là 32-34 giờ

Đánh giá việc nuôi cấy trên nồi lên men

Quá trình nuôi cấy trên nồi lên men gặp một số vấn đề như sau: mật độ

tế bào giảm nhanh sau 12 giờ nuôi cấy, lượng bào tử thu được thấp 1,41.109

bào tử/ml, tỉ lệ bào tử thấp khoảng 40%; pH giảm từ giờ thứ 1 đến giờ thứ 5

từ pH 8 về pH 5,6, sau đó pH tăng lên 9 vào giờ thứ 22, do hàm lượng glucose giảm và có sự chuyển đổi sang sử dụng cơ chất là pepton và đậu không dầu Do đó, chiến lược lên men bổ sung cơ chất mật rỉ được thử nghiệm nhằm cân bằng pH, duy trì tăng trưởng của vi khuẩn

Khảo sát quá trình lên men mẻ - bổ sung cơ chất: Thí nghiệm lên men mẻ

- bổ sung cơ chất nhằm mục tiêu tăng mật độ bào tử bằng việc bổ sung cơ

chất mật rỉ với tốc độ bổ sung cơ chất không đổi Thông số lên men được

tính toán dựa vào thí nghiệm lên men theo mẻ

Bảng 4 Thông số lên men mẻ - bổ sung cơ chất

1 Tốc độ tăng trưởng cực đại (1/giờ) 0,97a

2 Hiệu suất sử dụng cơ chất (g/g) 0,60a

3 Nồng độ mật rỉ trong dung dịch bổ sung (g/l) 500b

4 Thể tích lên men khởi đầu (L) 3

5 Sinh khối trước giai đoạn bổ sung cơ chất (g/l) 2,1c

7 Thời điểm bổ sung cơ chất Giờ thứ 3-4

Trong quá trình bổ sung mật rỉ, pH ổn định quanh giá trị pH 7, duy trì

pha lũy thừa từ giờ thứ 1-9, đạt mật độ VK cực đại 1,12.1010; mật độ bào tử

sau 34 giờ nuôi cấy là 4,46.109 BT/ml tăng lên 3,1 lần so với lên men theo

mẻ là 1,44.109 BT/ml, và tăng lên gấp 2,1 lần so với lên men trên erlen

2 3 4 5

6

Brix

Đồ thị 1 Kết quả diễn biến các thông số KP3 trong lên men fed-batch

Ứng dụng quy trình lên men thu bào tử của KP3

Quy trình lên men đề xuất

6,65 L MT tối ưu

Tiệt trùng 121 o C

45 phút

Chuẩn

bị MT

Chủng B subtilis KP3

Cấy ria TSA, 37 oC, 24 giờ Nhân

giống

Sinh khối ướt giàu bào tử

Làm sạch bào tử bằng phương pháp Nicholson

Xử lý sau lên men

Lên men ở 37 o C, DO 50%, pH 8, 400 vòng/phút

Bổ sung mật rỉ trong 8 giờ từ khi pH tăng men Lên

Bổ sung khoáng tạo bào

tử ở giờ thứ 10 Thu bào tử sau 34 giờ nuôi cấy

Tăng sinh/ 350ml TSB

37 o C, 200 vòng/phút, 9 giờ

Tăng sinh/ 20ml TSB

37 o C, 200 vòng/phút, 9 giờ

Sơ đồ 1 Quy trình lên men thu nhận bào tử Bacillus subtilis KP3

Ứng dụng quy trình lên men thu bào tử KP3: môi trường tối ưu bổ sung cơ

chất, tiến hành lên men 3 mẻ, mỗi mẻ 7 L

Bảng 5 Kết quả ứng dụng quy trình lên men thu bào tử KP3

Mẻ lên men

Bào tử sau lên men x10 12 CFU

Bào tử sau làm sạch x10 12 CFU (%)

Chất COXH (mg/10 12 bào tử)

Sau khi lên men theo mẻ trên quy mô 7 L, số lượng bào tử thu được sau khi lên men là 36,12.1012 bào tử, số lượng bào tử thu nhận sau khi làm sạch

là 33,16.1012 bào tử với hiệu suất làm sạch là 91,81% Lượng chất COXH

tổng có trong sinh khối tế bào khoảng 71,82 mg/1012 bào tử

3.6 Bàn luận

Vi khuẩn sinh chất COXH

- Phân lập và sàng lọc đối tượng nghiên cứu

Nghiên cứu đã tiến hành thu thập 204 mẫu đất, cát và nước biển ở 13

tỉnh từ Đà Nẵng đến Đồng Tháp, đã phân lập được 367 chủng VK Các

chủng phân lập gồm trực khuẩn Gram dương, Gram âm và cầu khuẩn,

trong đó trực khuẩn Gram dương chiếm 68,7% Đây là các chủng vi khuẩn

được phân lập từ các nơi có điều kiện khắc nghiệt như nhiệt độ cao, hạn

hán, các vùng nước mặn và là các chủng có tiềm năng sinh chất COXH

Các chủng phân lập từ các nơi này có khả năng sinh chất COXH phù hợp

với các nghiên cứu trước Nghiên cứu của Bùi Minh Giao Long (2010) và

Trần Hữu Tâm (2014) đã phân lập được các chủng vi khuẩn sinh carotenoid

từ các vùng biển ở Việt Nam, hay nghiên cứu của Wang (2011) đã phân lập

chủng B simplex XJ25 ở sa mạc Gurban, Trung Quốc

367 chủng phân lập đã được sàng lọc hoạt tính COXH bằng phương

pháp bản mỏng DPPH Đây là một phương pháp sàng lọc nhanh, giúp xác

định các chủng có khả năng sinh chất COXH trong thời gian ngắn và cho

kết quả tương đối chính xác, vì vậy phương pháp này có thể áp dụng với

một lượng lớn chủng vi khuẩn

- Khả năng sinh chất chống oxi hóa

139 chủng vi khuẩn có tiềm năng sinh chất COXH đã được sàng lọc

bằng phương pháp bản mỏng DPPH Trong đó, 47 chủng sinh chất COXH

nội bào hoặc ngoại bào lớn hơn 50% Hầu hết các chủng vi khuẩn có chất

COXH ngoại bào có hoạt tính cao hơn 50% đều sinh chất COXH nội bào

tan trong nước hoặc chloroform như chủng BT2.4, DN1.1, DQ11, GL12.5,

HR04, KP3, BD1.1, PT6.1, QN1.1, QN1.2, DQ40, DT14.1, DT6.1,

TN12.2, TN13.1 Kết quả này cho thấy tiềm năng sinh chất COXH của vi

khuẩn vì các nghiên cứu trước đây các nghiên cứu chủ yếu chỉ tập trung vào chất COXH ngoại bào hoặc chất COXH nội bào của vi khuẩn

Các chất COXH trong cơ thể gồm các chất tan trong nước và tan trong dầu Trong đó, chúng có chức năng tại các vị trí tương ứng, giúp cơ thể có thể chống lại các cơ chế OXH khác nhau Chất COXH thân dầu ngoài việc tham gia vào hoạt động COXH, chúng còn tích lũy bên trong màng tế bào

và lipoprotein, một số ở bề mặt hoặc sâu trong cấu trúc của lipid như vitamin E và carotenoid Các chất COXH thân nước như acid ascorbic và acid uric đánh bắt các gốc tự do trong pha lỏng, chủ yếu hoạt động trong các dịch sinh học [97, 98] Các nghiên cứu về chất COXH từ vi khuẩn theo hai hướng: 1 chiết chất COXH từ dịch nuôi cấy vi khuẩn như exopolysaccharid, S7-02…, đây là các chất COXH thân nước; 2 ly giải tế bào và sử dụng dịch ly giải để xác định hoạt tính COXH, với cách này có thể thu được các chất COXH thân nước cũng như thân dầu trong tế bào và thường có hiệu quả cao hơn so với việc chiết tách Do đó, việc khảo sát chất COXH ngoại bào và các phân đoạn chất COXH nội bào khác nhau giúp cung cấp dữ liệu cho việc ứng dụng chất COXH từ vi khuẩn Các vi khuẩn có khả năng cung cấp các chất chống OXH cả ở dạng thân nước và thân dầu sẽ có ưu thế hơn trong việc lựa chọn để sử dụng Đây cũng là một điểm mới trong nghiên cứu này khi đã sàng lọc được các chủng sinh chất COXH thân nước và thân dầu như KP3, HR04, DQ11

- Định danh

Định danh bằng giải trình tự 16S rADN, so sánh với ngân hàng gen của NCBI BLAST, kết quả cho thấy trong số 47 chủng vi khuẩn có hoạt tính

cao: 10 chủng là vi khuẩn Gram âm, 4 chủng Staphylococcus, 2 chủng

Micrococcus luteus, 30 chủng Bacillus (trong đó có 9 chủng Bacillus cereus) và 1 chủng Lysinibacillus macroides

Các chủng Gram âm có hoạt tính COXH cao như Chryseobacterium

vietnamense GL6, Acinetobacter bereziniae TG6.1, Citrobacter youngae