Nghiên cứu đặc tính kháng thuốc và mối liên hệ di truyền của các chủng campylobacter spp , salmonella spp phân lập từ người và động vật (tóm tắt)

là hai trong những tác nhân vi khuẩn hàng đầu gây bệnh tiêu chảy trên thế giới và là tác nhân phổ biến gây bệnh viêm ruột kết có nguồn gốc từ vật nuôi và có phổ vật chủ khá rộng, gồm ng

1

MỞ ĐẦU

Campylobacter spp., Salmonella spp là hai trong những tác

nhân vi khuẩn hàng đầu gây bệnh tiêu chảy trên thế giới và là tác nhân phổ biến gây bệnh viêm ruột kết có nguồn gốc từ vật nuôi và có phổ vật chủ khá rộng, gồm người, động vật, bò sát…Trong khi tình hình nhiễm ngày càng gia tăng ở khắp nơi trên thế giới, tình hình kháng thuốc của hai loại vi khuẩn này cũng không ngừng tăng lên, đặc biệt

với fluoroquinolone (FQ), erythromycin riêng với Campylobacter và Cephalosporin thế hệ 3 riêng với Salmonella.Tình hình kháng kháng

sinh đã được báo cáo ở nhiều nước [1, 4, 24], nhưng thông tin ở nước

ta còn giới hạn và cần cập nhật

Nhằm tình hiểu thêm tình hình kháng thuốc ở bệnh tiêu chảy và mối liên quan di truyền đối với hai loại vi khuẩn trên, chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu đặc tính kháng thuốc và mối liên hệ di truyền

của các chủng Campylobacter spp và Salmonella spp phân lập từ

người và động vật”, nhằm:

1 Mô tả đặc điểm kháng thuốc và cơ chế kháng thuốc ở

Campylobacter và Salmonella phân lập ở người và động vật

(heo, heo rừng, gà, vịt, cầy hương)

2 Khảo sát mối liên quan về mặt di truyền của Campylobacter và Salmonella phân lập ở người và động vật

0,5-5 µm và rộng 0,2-0,8 µm) Chúng di động với một tiêm mao nằm

ở một đầu hay hai đầu của tế bào tạo nên một kiểu di động xoắn ốc

Campylobacter là vi khuẩn vi hiếu khí nhưng đôi khi là hiếu khí tùy ý

C jejuni và C coli là những vi sinh vật vi hiếu khí và ưa nhiệt Nhiệt

độ phát triển tốt nhất là 42 C và đòi hỏi nồng độ oxy từ 3-15% và nồng độ CO2 là 3-5% Ưa nhiệt được xem là đặc điểm giúp chúng thích nghi với môi trường trong ruột của động vật và chim

1.1.2 Bệnh học, chẩn đoán và điều trị

Bệnh do Campylobacter là một bệnh nhiễm lây từ động vật sang

người Bệnh thường được biết đến là bệnh viêm dạ dày - ruột xảy ra ở người do sử dụng thức ăn hay nước bị nhiễm khuẩn Liều nhiễm gây

bệnh thấp, trung bình khoảng 10cfu/ml - 500cfu/ml, Campylobacter

không phải là vi sinh vật thường được tìm thấy trong ruột người nên khả năng lây truyền giữa người và người thường thấp

Chần đoán và điều trị: Bệnh cảnh lâm sàng của nhiễm

Campylobacter là tiêu chảy, đau bụng, sốt, đau đầu, suy nhược Tuy

nhiên, các biểu hiện này khó phân biệt với nhiễm trùng đường ruột do

những vi khuẩn khác như Salmonella, Shigella và E.coli 0157:H7

Phương pháp nuôi cấy vi sinh truyền thống luôn là tiêu chuẩn vàng

trong chẩn đoán bệnh Nuôi cấy C jejuni và C coli cần điều kiện vi

hiếu khí và nhiệt độ ủ là 42oC để kìm hãm sự phát triển của một số

loài Campylobacter không chịu nhiệt Ngoài ra, để phát hiện nhanh

trong mẫu phân, người ta có thể sử dụng các phương pháp như PCR hay ELISA vì những phương pháp này có độ nhạy và độ chính xác cao

Hiện nay, macrolide được xem như kháng sinh tối ưu điều trị

nhiễm Campylobacter Ngoài ra, FQ (Ciprofloxacin) cũng thường

được sử dụng để điều trị là do triệu chứng bệnh giống với triệu chứng

của bệnh viêm dạ dày - ruột do các vi khuẩn khác như Salmonella, Shigella [85]

1.1.3 Tình hình nhiễm Campylobacter spp ở Việt Nam và trên

thế giới

- Ở Việt Nam: Trong một nghiên cứu đoàn hệ kéo dài 1 năm trên trẻ

em dưới 1 tuổi ở khu vực TP HCM cho thấy Campylobacter chiếm tỷ

3

lệ đến 20% chỉ sau rotavirus và norovirus [14] Gần đây hơn trong một khảo sát kéo dài 1 năm tại 3 bệnh viện lớn điều trị trẻ em cho thấy

cùng với Shigella và Salmonella, Campylobacter cũng là nhóm gây

bệnh đáng chú ý trong nhóm vi khuẩn gây tiêu chảy [31] Khảo sát trên động vật, được xem là nguồn gốc của nhiễm khuẩn

Campylobacter, cho thấy tỷ lệ nhiễm vi khuẩn trên gia cầm - gia súc ở

vùng đồng bằng sông Mekong là 31.9%, 23.9% và 53.7% lần lượt trên

gà, vit, heo [24] và tỷ lệ kháng kháng sinh rất cao Trước đó khảo sát vào năm 2007 cho thấy trên 100 mẫu thịt gà (ức) từ các chợ ở Hà Nội

thì 31% nhiễm với đa số là C jejuni (45.2%) và C.coli (25.8%)

Tương tự trong khảo sát của Viện Dinh Dưỡng Hà Nội cho thấy

28.3% nhiễm C jejuni [58, 89]

- Trên thế giới: Ở các nước đang phát triển vùng nhiệt đới, bệnh do

Campylobacter chưa phải là vấn đề nghiêm trọng ở người lớn nhưng

là bệnh dịch ở trẻ em, đặc biệt là trẻ nhỏ hơn hai tuổi [16] Tình trạng

nhiễm Campylobacter không triệu chứng bệnh xảy ra phổ biến ở cả

người lớn và trẻ em.Tuy nhiên, vì ở các nước đang phát triển không có

các chương trình giám sát quốc gia về bệnh nhiễm Campylobacter nên

không có các số liệu về tần suất bệnh trong dân số Mặc dù thiếu các

dữ liệu nhưng các nghiên cứu bệnh - chứng dựa trên cộng đồng ở các

nước đang phát triển được ước tính tỉ lệ nhiễm Campylobacter ở trẻ

em dưới 5 tuổi là từ 40.000 đến 60.000 ca/ 100.000 dân Tỉ lệ phân

lập Campylobacter ở các nước đang phát triển là từ 5 đến 20% [16,

32, 111]

1.1.4 Tình hình kháng kháng sinh của Campylobacter spp

- Ở Việt Nam: Trong khoảng thời gian 1996 – 1999, chỉ có 7% mẫu

Campylobacter phân lập được từ trẻ em dưới 5 tuổi ở Việt Nam kháng

với FQ [34] Theo một nghiên cứu mới nhất ở Cần Thơ, Việt Nam, tỉ

lệ Campylobacter phân lập từ thịt gà ở Cần Thơ kháng FQ đã tăng lên

đến 64% đối với C jejuni và lên đến 100% đối với C coli [114]

- Trên thế giới: Trong thập kỉ qua, tình hình kháng FQ ở

Campylobacter tăng nhanh cùng với tỉ lệ phân lập được chúng trên

khắp thế giới Ở Châu Âu có khoảng 17% - 99% các chủng

Campylobacter phân lập từ người và động vật kháng với FQ [10, 76, 86] Campylobacter kháng FQ cũng trở nên phổ biến ở cả Châu Phi và

kị khí tùy ý, hình que, oxidase âm, không tạo bào tử và có khả năng di

động Salmonella có kích thước chiều rộng từ 0.7-1.5μM và chiều dài

Salmonella thường lây lan qua đường tiêu hóa Đa số các trường

hợp mắc bệnh là do ăn uống phải thực phẩm, nước uống bị nhiễm khuẩn không được nấu chín, hoặc do ăn phải thức ăn tươi được rửa bằng nguồn nước bị nhiễm khuẩn như nước sông, ao hồ, cống rãnh

Salmonella có thể hiện diện ở các môi trường sau: nước, sữa nhiễm

khuẩn, thịt nhiễm khuẩn, sò, ốc, hến

Nhiễm Salmonella có thể có nhiều bệnh cảnh lâm sàng khác nhau,

phụ thuộc mối tương tác giữa vi khuẩn và vật chủ Kết quả của mối

5

tương tác giữa chủng Salmonella và vật chủ phụ thuộc vào nhiều yếu

tố khác nhau như týp huyết thanh của vi khuẩn, liều nhiễm, khả năng miễn dịch và hệ vi sinh vật đường ruột của vật chủ

Chần đoán và điều trị: các triệu chứng của nhiễm trùng dạ dày ruột

do Salmonella thường tương tự như các triệu chứng tiêu chảy do các

tác nhân gây bệnh khác Trẻ em tiêu chảy thường bị mất nước và rối loạn điện giải Chẩn đoán chính xác chỉ có thể có được bằng cách phân lập tác nhân gây bệnh Ở bệnh nhân bị nhiễm trùng dạ dày ruột, việc cấy phân hoặc mẫu phết trực tràng là dương tính ở hầu hết người

bị nhiễm Tiêu lỏng và nôn ói nhiều lần làm cơ thể người bệnh bị mất nước nhanh chóng, đặc biệt là ở trẻ sơ sinh, trẻ nhỏ ở vùng khí hậu nóng và có kèm sốt Phác đồ điều trị tiêu chảy theo khuyến cáo của Tổ chức y tế thế giới là bù nước và chất điện giải bằng dung dịch oresol, cho uống kèm viên kẽm [27] Riêng việc điều trị bằng kháng sinh vẫn

đang là vấn đề tranh cãi Ngoài FQ (ciprofloxacin), Cephalosporin

cũng thường được sử dụng để điều trị là do triệu chứng bệnh giống với triệu chứng của bệnh viêm dạ dày - ruột do các vi khuẩn khác như

E.coli, Shigella…[85]

1.2.3 Tình hình nhiễm Salmonella spp ở Việt Nam và trên thế

giới

- Ở Việt Nam: một số ít các nghiên cứu dịch tễ về những tác nhân

gây tiêu chảy ở Hà Nội trên bệnh nhi dưới 5 tuổi cho thấy bệnh nhiễm

trùng dạ dày ruột do Salmonella spp đang tăng nhanh từ 0% năm

2004 lên 3,6% năm 2007 [63] và 7% năm 2008 [62] Các dữ liệu này

cho thấy Salmonella đang là một trong những tác nhân vi khuẩn chính

gây tiêu chảy ở Hà Nội Các nghiên cứu trên động vật cho thấy tỉ lệ

nhiễm Salmonella trên thịt (heo, bò, gà) và hải sản (tôm) ở đồng bằng

Sông Cửu Long là khá cao, dao động từ 21% đến 69,9% [107]

- Trên thế giới: hàng năm, trên thế giới có khoảng 93,8 triệu ca

nhiễm trùng dạ dày ruột do Salmonella, với tỉ lệ tử vong là 155.000

ca Trong đó khoảng 80,3 triệu ca là do ngộ độc thực phẩm [91] Ở Hoa Kỳ, ước tính hàng năm có khoảng 1,4 triệu ca ngộ độc thực phẩm

gây ra bởi Salmonella [97, 129] Hai týp huyết thanh gây bệnh ở người phổ biến nhất là S Enteritidis và S Typhimurium [27] S

Enteritidis là týp huyết thanh phổ biến toàn cầu, đặc biệt là châu Âu

(chiếm 80% số ca bệnh) và châu Á (38% số ca bệnh) Đại dịch S

Enteritidis được ghi nhận lần đầu vào cuối thập niên 80 thế kỉ trước và

có nguồn gốc từ trứng gia cầm bị nhiễm khuẩn [56]

1.2.4 Tình hình kháng kháng sinh của Salmonella spp

- Ở Việt Nam: theo một nghiên cứu giữa trường Đại học Úc kết hợp

với Đại học Khoa Học Tự Nhiên thành phố Hồ Chí Minh, Việt Nam,

tỉ lệ phân lập Salmonella trên thực phẩm tươi sống ở các chợ trên 50%

(91 mẫu dương/180 mẫu), có tỉ lệ kháng kháng sinh khá cao, đặc biệt

số chủng Salmonella đa kháng chiếm 50,5% [128] Nghiên cứu của Hùng và cộng sự (04/2015) phân lập Salmonella từ 145 bệnh nhân

tiêu chảy cấp tại Bệnh viện Nhiệt đới Trung ương Hà Nội và Bệnh viện 103 cho kết quả tỉ lệ kháng kháng sinh rất cao: 100% với ampicillin; 88,89% với chloramphenicol và 66,67% với trimethoprim

- sulfamethoxazole [3]

- Trên thế giới: nghiên cứu phân lập và kiểm tra mức độ kháng

thuốc Salmonella ở 3.570 trẻ em bị tiêu chảy ở Gaza, Palestine cho

thấy tỉ lệ kháng thuốc ampicillin, trimethoprim - sulfamethoxazole, chloramphenicol, cephalexin lần lượt là 62%, 35%, 35% và 26% [6]

Một nghiên cứu tương tự ở Tehran, Iran, Salmonella có tỉ lệ kháng

nalidixic acid là 42,3% và ceftazidime là 23,4% [65]

1.2.5 Phương pháp phân loại Campylobacter spp và Salmonella spp

Sử dụng phương pháp MLST (Multilocus sequence typing) bằng cách khuếch đại 7 phân đoạn gen giữ nhà (house keeping genes) Các phân đoạn gen từ mỗi một loci trong 7 loci được giải trình tự và các

7

alen sẽ được cho một con số dựa vào thứ tự thời gian chúng được xác định Bảy alen tại 7 loci gen này hình thành nên một kiểu trình tự trọn vẹn - sequence type (ST) mà cũng được cho một con số dựa vào thời

điểm chúng được xác định Alen đầu tiên được xác định ở locus aspA

sẽ là aspA1 và trình tự ST đầu tiên sẽ là ST-1… Cũng như sử dụng

thuật toán BURST (Based Upon Related Sequence Types - một thuật toán chuyên phân tích dữ liệu về trình tự MLST) để xác định clonal complex (CC); các mẫu phân lập được xác định thuộc clonal complex nhất định nếu mỗi mẫu phân lập có chung ít nhất 4 trong 7 alen so với kiểu trình tự (ST) trung tâm giả định của clonal complex đó (clonal

complex mang tên của kiểu trình tự trung tâm)

CHƯƠNG 2 - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU:

- Campylobacter spp

- Salmonella spp

2.1.1 Phân lập từ người

Chủng Campylobacter spp và Salmonella spp trong nghiên cứu

này được phân lập từ 1500 mẫu phân của các bệnh nhi bị tiêu chảy cấp nhập viện và được điều trị tại bệnh viện: Bệnh viện Bệnh Nhiệt Đới, Bệnh viện Đa Khoa Trung ương Huế, Bệnh viện Đa khoa tỉnh Khánh Hòa, Bệnh viện Đa khoa tỉnh Đồng Tháp và Bệnh viện Đa Khoa tỉnh Đắk Lắk Các bệnh nhi tham gia nghiên cứu đều nhập viện

vì bệnh tiêu chảy, thường trú tại các tỉnh và thành phố nêu trên

2.1.2 Phân lập từ gia súc (heo, heo rừng, cầy hương) và gia cầm (gà, vịt)

Chủng Campylobacter spp và Salmonella spp trong nghiên cứu

này được phân lập từ mẫu thu thập theo phương pháp vớ dậm của thú

y từ 250 trang trại và các hộ chăn nuôi cá thể tại tỉnh Đồng Tháp, tỉnh Đắk Lắk (gồm 274 mẫu) (Nghiên cứu này là một phần của dự án khảo sát về bệnh lây từ động vật - VIZIONS của đơn vị chủ quản)

2.1.3 Qui trình thực nghiệm

Qui trình phân lập, định danh và phân tích kiểu gen của các

chủng Campylobacter, Salmonella được tóm tắc theo Sơ đồ 2.1

Sơ đồ 2.1 Qui trình thực hiện nghiên cứu

CHƯƠNG 3 - KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.1 KẾT QUẢ PHÂN LẬP THEO VÙNG

Việc phân lập, định danh Campylobacter spp và Salmonella spp

được tiến hành từ đầu năm 2012 đến cuối năm 2013 ở người tại 5 Bệnh viện (Bệnh viện Đa khoa Trung ương Huế, Bệnh viện Đa khoa tỉnh Khánh Hoà, Bệnh viện Đa khoa tỉnh Đắk Lắk, Bệnh viện Đa khoa tỉnh Đồng Tháp và Bệnh viện Bệnh Nhiệt Đới thành phố Hồ Chí Minh) và ở động vật tại 2 tỉnh (Đồng Tháp, Đắk Lắk) và thu được kết

quả chi tiết theo Bảng 3.1 và Bảng 3.2

Tổng số

Người 1/150

(0,67%)

3/150 (2%)

1/150 (0,67%)

40/1000 (4%)

1/50 (2%)

46/1500 (3,07%)

(53,33%)

(53,33%) Heo rừng 5/14

(21,67%)

25/45 (55,56%)

(30,91%) Cầy

(11,07%)

77/285 (27,02%)

1/150 (0,67%)

40/1000 (4%)

1/50 (2%)

151/1774 (8,51%)

Bảng3.2 Kết quả phân lập Salmonella spp theo vùng

Tổng số

Người 4/150

(2,67%)

12/150 (8%)

13/150 (8,67%)

64/1000 (6,4%)

25/50 (50%)

118/1500 (7,87%)

38/45 (84,44%) Heo rừng 4/14

4/14 (28,57%)

42/45 (93,33%)

4/5 (80%) Tổng số 52/289

(17,99%)

133/285 (46,67%)

13/150 (8,67%)

64/1000 (0,64%)

25/50 (50%)

287/1774 (16,18%)

Kết quả ở cho thấy tỉ lệ cấy dương tính Campylobacter từ các mẫu

ở động vật cao gấp gần 12,5 lần so với tỉ lệ cấy dương tính

Campylobacter từ các mẫu ở người Bảng 3.1 Sự khác biệt này có ý

nghĩa thống kê p<0,005, một lần nữa xác định động vật như gia cầm

(gà vịt), gia súc (heo) là nguồn chứa tự nhiên vi khuẩn

Campylobacter

Qua phân tích số liệu ở cho thấy tỉ lệ cấy dương tính Salmonella từ

các mẫu ở động vật cao gấp gần 8 lần so với tỉ lệ cấy dương tính

Salmonella từ các mẫu ở người (p< 0,005) Bảng 3.2

Tương tự như các nghiên cứu khác trên thê giới, kết quả phân lập của nghiên cứu này cho thấy gia súc và gia cầm là nguồn chứa vi

khuẩn Campylobacter, Salmonella trong tự nhiên Trong khuôn khổ

giới hạn của nghiên cứu này chúng tôi không khảo sát từ môi trường như nước hay thực phẩm thịt sống, sữa…

11

Biểu đồ 3.2 Tỷ lệ kháng kháng sinh của Salmonella spp

Nguyên nhân của hiện tương kháng kháng sinh cao có thể do việc lạm dụng kháng sinh trong điều trị bệnh nhân làm gia tăng áp lực thuốc hay sử dụng kháng sinh quá rộng rãi trong chăn nuôi trong mục đích tăng trọng vật nuôi Điều đáng lưu ý là các chủng phân lập ở người trong nghiên cứu này đều nhạy cảm hoàn toàn với chloramphenicol, gentamicin và erythromycin Điều này có thể gợi ý

là sau một thời gian dài được ngưng sử dụng các kháng sinh này (giảm

áp lực thuốc), đặc biệt là với chloramphenicol thì vi khuẩn có thể trở lại nhạy cảm Cần lưu ý rằng, nếu vi khuẩn kháng với các kháng sinh

thuộc họ FQ, tức có đột biến ở gen gryA hay “vùng qui định kháng

quinolone” (Quinolone resistance determining region - QRDR) thì tính kháng này sẽ ổn định và di truyền từ thế hệ này sang thế hệ khác Một khi đã bị kháng FQ thì chỉ còn cách sử dụngkháng sinh mới khác Ngược lại, tình hình kháng erythromycin có thể được đảo ngược nếu

dừng sử dụng thuốc [13, 95, 96, 103] Các chủng Salmonella phân lập

từ người trong nghiên cứu này đều nhạy cảm hoàn toàn với

ciprofloxacin trong khi đó, Salmonella ở động vật bắt đầu kháng với

loại thuốc nêu trên Nhìn chung, tỷ lệ kháng kháng sinh thường sử dụng ở động vật trong nghiên cứu này cao hơn tỷ lệ ở người nhưng thấp hơn khu vực khác và các tỉnh phía Bắc

3.3 Tính đa kháng kháng sinh của Campylobacter spp

Bảng 3.8 Kết quả kháng các nhóm kháng sinh của Campylobacter

24/24 (100%)

3/5 (60%)

23/25 (92%)

48/51 (94,12%) Cephalosporin

(CRO, CAZ)

40/46 (86,96%)

24/24 (100%)

3/5 (60%)

25/25 (100%)

51/51 (100%) Macrolide

(AZM, Ery)

3/46 (6,52%)

8/24 (33,33%)

0/5 (0%)

3/25 (12%)

1/51 (1,96%)

FQ, Cephalosporin 32/46

(69,57%)

16/24 (66,67%)

3/5 (60%)

20/25 (0%)

47/51 (92,16%)

FQ, Macrolide 1/46

(2,17%)

1/24 (4,17%)

0/5 (0%)

0/25 (0%)

0/51 (0%) Cephalosporin,

Macrolide

0/46 (0%)

0/24 (0%)

0/5 (0%)

0/25 (0%)

0/51 (0%)

FQ, Cephalosporin,

Macrolide

2/46 (4,35%)

7/24 (29,17%)

0/5 (0%)

3/25 (12%)

1/51 1,96% Qua kết quả trình bày cho thấy tỷ lệ kháng riêng rẽ từng nhóm FQ hay cephalosporins ở người khá cao lần lượt 82% và 86% ở động vật lại còn cao hơn từ 60% đến 94% khiến tỷ lệ cùng kháng cả hai nhóm

là khoảng 70% đến 94% Ngược lại, kháng macrolide ở người vẫn còn

thấp khoảng 2% còn động vật <10% chỉ có các chủng Campylobacter

phân lập từ heo kháng macrolide >30%

Tình hình đa kháng kháng sinh trên Campylobacter từ động vật

luôn được theo dõi Gần đây nhất, khảo sát tại Trung Quốc do các nhà nghiên cứu ở Trường Đại Học Nông Nghiệp Đại Học Bắc Kinh phối

hợp với Đại Học Thú Y Iowa Hoa Kỳ cho thấy C jejuni và C coli đề

kháng với FQ rất cao > 95% Với macrolides tình hình còn tệ hơn với

C coli có 73% chủng từ gà và 54% chủng từ heo đã kháng

erythromycine Các tác giả đã phát hiện có một sự gia tăng rất có ý

nghĩa của tỷ lệ C coli kháng macrolide từ 2008 - 2014 trong khi tỷ lệ kháng của C jejuni từ gà có giảm bớt Nguyên nhân có thể do sử dụng